Summary
Descrevemos o desenvolvimento de um modelo de mouse SOP, como magro com diidrotestosterona pelota para estudar a fisiopatologia da síndrome do ovário Policístico e a prole dessas barragens, como síndrome do ovário Policístico.
Abstract
Hyperandrogenemia desempenha um papel crítico na função reprodutiva e metabólica em mulheres e é a marca da síndrome do ovário policístico. Desenvolvimento de um modelo de rato de SOP, como magro que imita as mulheres com SOP é clinicamente significativa. Neste protocolo, descrevemos um modelo deste tipo. Inserindo um comprimento de 4 mm de pelota de pó de cristal DHT (dihidrotestosterona) (comprimento total da pelota é 8 mm), e substituí-lo mensalmente, somos capazes de produzir um modelo do rato de SOP, como com dobra de soro níveis 2 DHT mais elevado do que os ratos não implantados com DHT (n-DHT). Observamos uma disfunção metabólica e reprodutiva sem alterar o peso corporal e composição corporal. Enquanto exibindo um elevado grau de infertilidade, um pequeno subconjunto destes ratos fêmeas de SOP, como posso engravidar e sua prole puberdade atrasada e testosterona aumentada de adultos. Este modelo de rato magra como SOP é uma ferramenta útil para estudar a fisiopatologia da síndrome do ovário Policístico e a prole dessas barragens, como síndrome do ovário Policístico.
Introduction
Hiperandrogenismo é a marca da síndrome do ovário policístico (SOP) de acordo com os critérios do NIH e do excesso de andrógenos e síndrome do ovário Policístico (SOP-AE) da sociedade. Mulheres com SOP têm dificuldade em engravidar e tem aumentado o risco de complicações de gravidez1. Mesmo se elas engravidam, sua prole feminina tem um resultados de saúde adversos2,3. Modelos animais foram desenvolvidos utilizando várias estratégias4,5,6,7,8,9,10,11 , 12 e exibindo muitas características da síndrome do ovário Policístico (anovulação, e ou tolerância deficiente de glicose e insulina) com aumento de peso e obesidade associada com hiperplasia dos adipócitos de tamanho e peso do aumento dos adipócitos. Existem duas estratégias principais para produzir modelos animais que são usados para estudar a síndrome do ovário Policístico. Um é o tratamento com níveis elevados de andrógenos diretamente (injeção/inserção de andrógenos exógenos) ou indiretamente (por exemplo, bloqueando a conversão de andrógeno em estrógeno com inibidor de aromatase) após nascimento13. Outra é por hyperexposure fetal de andrógenos durante gestação14,15 estudar a prole. Por exemplo, a prole fêmea de macaco rhesus16,17, ovelha18e roedores expostos a níveis masculinos de andrógeno durante o período intra-uterino desenvolve traços de SOP, como mais tarde na vida. Estes modelos aprimorado significativamente nossa compreensão de efeitos de andrógeno elevado, programação fetal e uterinos efeitos ambientais. No entanto, estes modelos têm suas próprias limitações: 1) animais desenvolvem obesidade e, por conseguinte, é difícil separar os efeitos da hyperandrogenemia de obesidade induzida reprodutivos e disfunções metabólicas; 2) antes da gravidez, as mulheres com SOP já apresentam níveis elevados de andrógenos, assim oócitos foram expostos a andrógeno em excesso antes de fertilização; 3) as doses farmacológicas de testosterona (T) ou dihidrotestosterona (DHT) usado após o nascimento ou durante a gestação podem não refletir o ambiente de andrógeno de SOP. Foram medidos os níveis de testosterona e DHT no fluido folicular ovariano e/ou soro, e a testosterona e os níveis DHT são 1.5 para 3,9 vezes maior em mulheres com SOP5,19,20,21 ,22,23 , quando comparadas com mulheres não afetadas. Criamos um rato adulto modelo23,24,25 que desenvolve disfunção metabólica e reprodutiva dentro de duas semanas a contar do início da exposição crônica de DHT de inserção de um pellet com 4 mm de comprimento de pó de cristal DHT (comprimento total da pelota é 8mm). Este modelo produz níveis séricos DHT que são cerca de 2 dobras superior (designado 2xDHT) do que o de ratos controle sem tratamento de DHT. Os ratos 2xDHT não apresentam alterações de estradiol basal soro, testosterona, LH e não desenvolver obesidade e mostrar o peso ovariano semelhante, os níveis séricos de colesterol, ácidos graxos livres, leptina, TNFa e IL-623,24, 25 , relativo a controla mesmo até 3,5 meses após a inserção de DHT23,24,25. Além disso, pelo acasalamento de fêmeas que já desenvolveram características da síndrome do ovário Policístico, podemos estudar o impacto de um ambiente de hiperandrogénicas materna sobre a saúde reprodutiva e metabólico da prole15.
Neste novo paradigma (relevante para os critérios NIH e sociedade AE-SOP) modela a doença através da produção relativamente semelhantes níveis de andrógenos para aqueles das mulheres com SOP 2 - a 3 vezes mais testosterona ou níveis DHT, quando comparados com mulheres não afetadas. No entanto, este modelo é mantido por DHT exógena contínua e não de hiperandrogenismo endógeno programado uma vez DHT é retirado. O objetivo geral deste artigo é se concentrar em 1) como fazer a pelota DHT; 2) como gerar um SOP-incline-se como um modelo do rato; 3) estratégias para avaliar a prole fêmea dessas barragens. Outras medições e avaliação dos fenótipos não são abordados neste manuscrito, mas podem ser encontradas em5,15,23,24,25,26.
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Protocol
Aqui, apresentamos protocolos detalhados para inserção e preparação de sedimento DHT e para testes metabólicos e reprodutivos. Os ratos utilizados neste estudo foram um fundo misto (C57/B6, CD1, 129Sv) e foram mantidos com comida e água ad libitum em um ciclo de luz/escuridão h 14/10 a 24 ° C na instalação de animal Broadway edifício de investigação para o Johns Hopkins University School of Medicina. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidado Animal do Johns Hopkins University.
1. criar o modelo de SOP, como Mouse
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Preparação de pelota DHT
- Tubulação de silastic autoclave para esterilizar. Corta tubos de silastic para um comprimento de 15 mm com uma lâmina de barbear;
- Sele um lado injetando silicone adesivo médico dentro do tubo com uma agulha cega de 20g, ligada a uma seringa de 3 mL. Êmbolo deve ser retirado a seringa e, em seguida, adesivo inserida no reservatório. O êmbolo é reinserido e adesivo empurrado para baixo, até que começa a emergir da agulha. A agulha cega é feita por um corte do lado da ponta afiada da agulha 20g com qualquer tesoura forte. O comprimento de silício no tubo deve ser superior a 2 mm para permitir a filtragem de pós-produção;
- Secar durante a noite; Verifique se há bolhas de ar no lado selado. Aqueles com nenhuma bolha de ar são utilizados para pelotas DHT. Outras podem ser usadas para pelotas de controle não-DHT.
- Use luvas, máscara, óculos e jaleco antes de fazer a DHT-sedimento em uma capa para evitar a exposição DHT para a pele.
- Pó DHT despeje em um plástico peso barco e pressione o lado aberto do adesivo tampado tubos (produzidos na 1.1) em pó a DHT.
- Pó DHT pode ser tamped para baixo com um clipe de papel grande que é alisado. Continue até DHT atinge uma altura de 4 mm (ou comprimento desejado). Verificar o comprimento do DHT com uma régua e selar o lado aberto com silício, seco durante a noite.
- Corte cada lado selado para fazer o comprimento de silicone de 2 mm de comprimento. O comprimento total do pellet será de 8 mm.
- Selo de ambos os lados do tubo silastic vazio como pelota de controle (não-DHT).
- Manter pelotas em um tubo cônico de 50 mL, embrulhado com papel alumínio (para evitar a exposição à luz) em temperatura ambiente até o uso. As pelotas DHT mantenham plena eficácia pelo menos 3 meses de armazenagem.
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Substituição e inserção de DHT
- Até 20 DHT pelotas ou pelotas de controle estão submergidas separadamente em um tubo cónico de 50 mL com 30 mL 0,9% soro fisiológico estéril por 24 h a 37 °C para equilibrio apenas antes da inserção.
- Antes da cirurgia, as superfícies e luvas são desinfetadas com clidox e as superfícies de trabalho são cobertas com papel absorvente apoiado plástico limpo (bloco cirúrgico). Todos os instrumentos que entram em contacto com animais são descontaminados antes de entrar a facilidade animal em autoclave. Instrumentos poderão seco e fresco antes da utilização.
- ratos fêmeas de 2 meses de idade são utilizados (4 – 5 ratos/gaiola). Os ratos são injectados intraperitonealmente com xilazina (3,5 mg/kg bw) e cetamina (78,8 mg/kg bw) utilizando uma seringa de insulina. Cálculos para mistura e dosagem de anestesia está na tabela 1.
- Após anestesia adequada é alcançada, como medido pela perda do reflexo de dedo do pé e retardou a respiração, o mouse vai ser preparado para a cirurgia.
- Desinfectar a pele da área com betadine usando gaze esterilizada e limpar com álcool 70%. A área será pintada novamente com betadine.
- Corte um buraco de cerca de 5 mm comprimento com tesoura debaixo da pele perto do pescoço. Usando um bisturi 10 G, faça um pequeno túnel (15 mm) na direção rostral. A pelota é inserida dorsalmente com o bisturi.
- A abertura é então selada com adesivo cirúrgico. Manualmente aproximada a ferida bordas com fórceps e traços de escovagem suaves para aplicar uma fina camada de adesivo líquido para as bordas da ferida aproximadas. Camadas finas de acúmulo 3 de adesivo para garantir que o adesivo é uniformemente distribuído sobre a ferida. O adesivo deve estender a 1 cm de cada lado das bordas da ferida aposto. Suturas ou grampos cirúrgicos também podem ser usados para fechar o buraco. Colocar ratos de volta na gaiola, alojada individualmente, com uma almofada de calor para a recuperação. Substitua a pelota em 4 semanas para manter um nível constante de exposição de andrógeno. A pelota original será removida e sedimento novo será inserido conforme descrito em A1.15 na posição semelhante.
- Testar o simbolo estral após 3 dias de inserção de DHT. Fase do ciclo estral é avaliada pela citologia vaginal. Células vaginais são coletadas por 16 dias consecutivos usando uma pipeta p10 esguinchar solução salina estéril (cerca de 10 µ l) na cavidade vaginal e depois retirar o soro fisiológico com a ponta da pipeta estéril mesmo. Células vaginais sobram da parede vaginal misturam com soro fisiológico e são coletadas.
- Espalhe a solução salina com células numa lâmina rotulada. Cada slide pode conter seis amostras. Slides são etiquetados para indicar qual amostra é colocada em cada um dos seis locais.
- Após o soro fisiológico completamente secou no slide, colocar slides em um recipiente com 100% de etanol para consertar as células. Slides devem ser fixados para pelo menos 5 min, mas podem permanecer no fixador indefinidamente até utilização posterior.
- Coloque slides em soluções de coloração para 1 min para tampão B e slides C. Wash com água da torneira e seco à temperatura ambiente.
- Examine a morfologia celular sob um microscópio de luz objetiva de 10 X. Morfologia da célula para distinguir (P) de proestro, estro (E), metestrus (M) e diestro (D) é descrita em referências de28,de27,29.
- Contagem dos dias em cada fase e dividido pelo número total de dias para calcular o tempo por cento em cada estágio.
- Teste tolerância à glicose em 21 dias após a inserção de DHT pelo jejum os ratos durante a noite (16 h) e injeção de 2 g/kg de peso corporal de 20% dextrose intraperitonealmente. Por exemplo, se um peso de corpo do rato é 25g, este rato será injetado com 250 µ l de dextrose 20% com uma seringa de insulina 50 cc (0,5 mL). Níveis de glicose são avaliados pelas tiras de glicosímetro e teste por amostragem de sangue da veia da cauda em 0, 15, 30, 60, 90, 120 min. Isto é descrito em detalhe em outro lugar30.
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Coleta de sangue
- Colher o sangue em vários dias após a inserção de DHT (limitar volume de coleção para 100 µ l de esteroide e 30ul para ensaio de LH/FSH) entre 9 e 10:00 por submandibular veia sangrando com lanceta. Isto é descrito em11.
- Centrifugar o sangue a 6.000 x g a 4 ˚C por 10 min e recolher a camada de soro em outro tubo de 1,5 mL que pode ser armazenado a-80 °C até ensaio.
2. avaliar reprodutiva perfis da prole feminina de DHT cronicamente inserido barragens
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Acasalamento
- O rato fêmea a ser testado é movido para a gaiola com um macho fértil comprovada (que anteriormente teve filhotes com um rato fêmea) 15 dias após a inserção da pelota.
- Documente o peso do corpo da barragem toda semana para determinar se o mouse está grávido. Barragem de aumentos de peso de mais de 3 g em uma semana indica gravidez.
- Colete sangue de barragens na segunda semana depois observamos aumento de peso de barragens superior a 3 g na semana anterior.
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Puberdade, avaliada pela abertura vaginal e do primeiro estro
- Verificar a abertura vaginal por inspeção visual todos os dias depois que filhotes são desmamados em 21 dias pós-parto (PND), medir a distância anogenital e gravar a idade da abertura vaginal.
- Uma vez que a vagina se abre, colete células vaginais diariamente, conforme descrito em 1.2.8–1.2.11 para verificar o simbolo estral.
- Observar a morfologia celular como 1.2.12 descrito, e o primeiro estro é definido como a data que todas as células são células epiteliais cornificadas.
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Corpo peso e orelha punch
- Mergulhe a ponta da lanceta na pasta de tatuagem e marcar cada filhote com tatuagem no dedo, conforme descrito na referência12 no PND 7 e pesar ratos a cada 7 dias até 70 dias de idade.
- Ratos de soco de orelha para numerá-los usando o sistema na Figura 1 entre 12 a 16 PND. Para distinguir o sexo, examine o lado ventral do corpo, as fêmeas terá mamilos visíveis.
- Coletar o sangue no 21, 26, 70 PND após o nascimento, conforme descrito acima no 1.3.1
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Ensaio hormonal
- Os níveis DHT no soro sanguíneo são medidos por ambos os ensaio imunoenzimático (ELISA) e pelo conjunto de cromatografia líquida de massa espectrometria (LC-MS)23,24,31,32. T é medido por LC-MS, ou um rato/mouse ELISA validado pelo Universidade de Virgínia ligante ensaio núcleo no centro de pesquisa em reprodução23,24.
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Representative Results
Os níveis DHT de soro e teste de tolerância à glicose
Os níveis DHT foram medidos de soro coletado por ambos ELISA e por LC-MS de acordo com o protocolo 1.24 – 1,25 e 2.9, 3.0. Os valores absolutos DHT são diferentes entre a espectrometria de massa e ELISA, no entanto, a dobra relativa (cerca 2 vezes) de DHT vs inserção n-DHT é semelhante de ambos os ensaios e através dos experimentos de15,23,24 ( Figura 2A). Níveis DHT são significativamente aumentados de preconceito através de gravidez em camundongos tanto DHT e n-DHT, no entanto, os níveis DHT são 2 dobras superiores nos ratos DHT em comparação com os ratos n-DHT em ambos pré-gestacional (um dia antes de acasalamento) e gestacional (cerca de 14 dias) pontos de tempo (Figura 2B). Desde que os níveis absolutos de DHT diferem entre ELISA e LC-MS, podemos calcular os níveis relativos (dobre mudança: nível DHT com inserção de n-DHT DHT inserção vs) dentro de ensaios. Camundongos fêmeas com DHT mostraram prejudicada a tolerância à glicose em relação à n-DHT (Figura 3) em 2 semanas após a inserção de DHT, de acordo com o protocolo 1.23.
Prole fêmea peso corporal e puberdade
Enquanto geralmente inférteis, algumas barragens engravidar e ter filhotes (cerca de 30% taxa de gravidez, para testes de fertilidade de 10 barragens receberá normalmente 3 barragens grávidas, se referem ao protocolo 2.1). Podemos, portanto, avaliar efeitos andrógenos crônica em barragens sobre a prole fêmea. Prole feminina de DHT inserido barragens é chamados de DHT-filhas, e aqueles de barragens não-DHT inserido são chamados filhas n-DHT. Não observamos nenhuma diferença entre não-DHT e DHT-filhas para a idade da abertura vaginal. No entanto, o primeiro cio de DHT-filhas está significativamente atrasado (dia 35 para filha n-DHT; dia 42 para DHT-filha). Isto é associado com peso reduzido ao PND 35 e 42 em DHT-filhas em relação as filhas n-DHT (Figura 4; se referem ao protocolo 2.4-2.7).
Níveis hormonais e simbolo estral em prole feminina
Os níveis de testosterona não são alterados no PND 21, mas são reduzidos em 26PND. No entanto, testosterona é aumentada em 70 PND (Figura 5, referem-se ao protocolo 2.9 – 3.0). Filhas DHT adultas mostraram interrompeu estral simbolo comparado com filhas de adultos não-DHT, experimentando tempos significativamente mais no m e menos tempo em P e E (figura 6A, B; de acordo com o método no protocolo 1.17 – 1,22).
Figura 1: identificação de rato. Dentro de uma gaiola, é ouvido um soco em uma posição diferente para representar o número de rato. Mouse #1 a 3 é um soco na orelha direita, e #4 a 6 é um soco na orelha esquerda vista dorsalmente. Se o rato é um soco nas orelhas na posição #1 e #4, é #7; em 2 e 5, é #8; em 3 e 6 é #9; no meio da orelha esquerda é #10; na posição 1 e 10 é #11; etc. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: soro DHT níveis. Níveis DHT de soro. (A) os níveis de DHT de soro são medidos por ELISA e espectrometria de massa. Embora os valores absolutos são diferentes, os dois ensaios mostrou semelhantes dobram as diferenças entre DHT e n-DHT tratados ratos. (B) mudança de soro DHT dobra em relação aos níveis de DHT não nos pontos de tempo do preconceptional e gestacional. N-DHT (barras abertas) e ratos fêmeas DHT-implantado (barras pretas), antes (um dia antes de acasalamento) e durante a gravidez (cerca de 14 dias de gestação). Os valores são média ±S.E.M. N = 5-8 por grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: teste de tolerância à glicose (GTT). N-DHT e DHT implantado ratos foram jejuou durante a noite e glicose (2G/kg BW) foi injetado intraperitonealmente e glicemia de cauda foi medida em pontos de tempo diferentes. DHT tratados ratos mostraram níveis de glicose significativamente aumentada entre 30 a 120 min em comparação com ratos Tratado de não-DHT. Os valores são média ±S.E.M. N = 4-12, por grupo. * P < 0.05 clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: pre-gravidez materna DHT tratamento resultou em peso reduzido em prole feminina em 35 e 42 PND. Peso corporal (eixo y) foi medido em dias pós-natal como mostrado (eixo x). Descendentes de DHT-expostos: barra preta; sem prole – DHT: bar aberto. Os valores são média ±S.E.M. N = 9-14 por grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: soro DHT níveis. Sangue foi coletado pela manhã no PND 21, 26, 70 de manhã. DHT sérica (eixo y) da descendência feminina das filhas de n-DHT (barras abertas) e DHT-filhas (barras pretas). Os valores são média ±S.E.M. N = por grupo de 5-11. Esta figura foi modificada da referência2clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: crônico materno andrógeno em excesso leva ao simbolo perturbado em filhas adultas. (A) representação de estral simbolo da prole feminina. (B) a porcentagem de tempo gasto em cada fase estral (eixo y) durante 15 dias (eixo x) medidos pelo exame citológico de células vaginais. Os valores são média ±S.E.M. N = 5-9 por grupo. Estágio do ciclo estral (eixo y). M: conheci/diestro; P: proestro; E: o cio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Cocktail de xilazina/cetamina.
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Discussion
Hiperandrogenismo é uma característica fundamental da síndrome do ovário Policístico. A DHT sérica (duas vezes mais alto nos ratos DHT do que nos ratos não-DHT) usada neste protocolo é inferiores aos relatados por outros pesquisadores em estudos anteriores e é calibradas para imitar proporcionalmente as mulheres com SOP5,19, 20,21. Ao contrário de outros modelos, este modelo DHT 2 vezes não altera o peso corporal e composição de corpo inteiro, em comparação com os ratos n-DHT até 3,5 meses após inserção de DHT23,24. Estes ratos adultos de DHT implantado são mantidos pela contínua DHT exógeno. Embora não seja alterada a composição do corpo inteiro, alteração da estrutura e função dos adipócitos tem sido observadas em magra SOP mulheres20. Um exame cuidadoso das diferentes depósitos é garantido. Temos observado simbolo estral prejudicado dentro de uma semana após a inserção de DHT15 e reduzida fertilidade durante um mês 3 fertilidade avaliação23.
O pequeno subconjunto de DHT tratados ratos fêmeas que foram capazes de engravidar e ter descendência constituiu uma oportunidade para avaliar o impacto das hyperandrogenemia pré-gestacional, gestacional e de enfermagem no desenvolvimento fetal. A fim de obter um experimento controlado corretamente, várias fêmeas reprodutoras são necessárias estabelecer-se-que exige que pelo menos 10 pares de acasalamento. DHT-filhas só são expostas a DHT durante a gestação e antes 21 PNA. DHT-filhas mostraram peso reduzido em comparação com as filhas de não-DHT, indicando que a obesidade ou excesso de peso não é uma variável de confundimento nos efeitos fisiológicos observados15.
Em estudos iniciais, nós validado os níveis DHT de soro ao longo do tempo. Achamos que não há diferenças significativas no soro DHT no 1, 2, 3 e 4 semanas23,24. Os níveis DHT declinados após 4 semanas, portanto, nós substituímos pelota DHT em 4 semanas. Não observamos redução efeitos da DHT, mesmo que eles tenham sido armazenados à temperatura ambiente por 3 meses. É importante incubar pelotas em soro fisiológico durante 24 h antes da inserção. Esta etapa é fundamental para mesmo liberação de DHT da pelota (liberação de DHT lentamente através do tubo silastic). Estral simbolo pode ser examinado após 3 dias de inserção de DHT, e esfregaço vaginal pode também ser examinado diretamente na solução salina sem seca e mancha sob um microscópio de luz depois que estão familiarizados com a célula tipos27.
Fenótipo metabólico pode ser avaliado, ou após, 2 semanas (14 dias) de inserção de DHT. No entanto, os efeitos da DHT no metabolismo no final da quarta semana (28 dias) são ligeiramente atenuados, embora sem atenuação é observada por disfunção reprodutiva. Portanto, avaliamos a função de metabolismo, normalmente no final de 2, 3, 5, 6, 7 semanas (14, 21, 35, 42 e 49 dias, 2 vezes o total de inserção). A produção de esteroides pellets de liberação lenta no laboratório é uma maturidade técnica que tem sido amplamente adotada por diferentes laboratórios33,34. Representa uma alternativa econômica para produtos comercialmente disponíveis, que pode exceder US $50/pelota (90 dias DHT de Pelotas, 5mg/pelota, IRA, at-161). O produto comercial tem a vantagem de não precisar ser substituído por até 90 dias, enquanto a pelota descrita neste relatório precisa ser substituído a cada 28 dias. Para estudos em grande escala, os investigadores podem encontrá-lo mais econômico para produzir seus próprios pelotas mesmo com o trabalho extra necessário para substituir pelotas em 4 semanas.
Como observado por outros, modelos com implantação de DHT crônica após o nascimento não mostram aumento de LH pulsátil frequência e este podem apontar diferentes mecanismos patológicos de andrógeno elevado induzido função reprodutiva entre desenvolvimento e início tardio adquiriu hiperandrogenismo. Com este protocolo, somos capazes de investigar a prole fêmea de cronicamente hiperandrogénicas barragens. Nós pode aproveitar este modelo para tentar compreender inteiramente o reprodutivo (por exemplo, o desenvolvimento folicular, ovulação (alaranjado) e fertilidade) e consequências metabólicas (por exemplo, metabolismo de glicose ou lipídios, composição corporal, depósito de tecido adiposo distribuição). Nosso protocolo adiciona nova ferramenta para investigar elevados androgênica induzida reprodutiva e disfunção metabólica; e dissocia-se a fisiopatologia causada pelo andrógeno elevado daqueles que poderia ser devido à obesidade. Este modelo pode ser usado para explorar os efeitos específicos de tecido de androgênios elevados nas fêmeas. Além disso, a metodologia aqui relatada para produção de pellets DHT pode ser facilmente aplicada ao estudo de outros hormônios esteroides.
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Disclosures
Nada de divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (R00-HD068130 subsídios para S.W.) e o centro de pesquisas de Diabetes de Baltimore: pilotos e viabilidade Grant (S.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crystalline 5α-DHT powder | Sigma-Aldrich | A8380-1G | |
| Dow Corning Silastic tubing | Fisher Scientific | 11-189-15D | 0.04in/1mm inner diameter x0.085 in/2.15 mm outer diameter |
| Medical adhesive silicone | Factor II, InC. | A-100 | |
| Goggles, lab coats, gloves and masks. | |||
| 10 µL pipette tips without filter | USA Scientific | 11113700 | |
| Microscope slide for smear | Fisher Scientific | 12-550-003 | |
| Diff Quik for staining cells | Fisher Scientific | NC9979740 | |
| Lancet | Fisher Scientific | NC9416572 | |
| 3 mL Syring | Becton, Dickinson and Company (BD), | 30985 | |
| attached needle: 20 G | BD | 305176 | |
| Ruler: any length than 10 cm with milimeter scale. | |||
| Xylazine | Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise | NDC13985-704-10 | 100 mg/mL |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira, Inc | NDC 0409-2051-05 | 100 mg/mL |
| Surgical staple | AutoClip® System, Fine Science Tool | 12020-00 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | 1/2 CC, low dose U-100 insulin syringe |
| Trocar | Innovative Research of America | MP-182 | |
| Microscope | Carl Zeiss Primo Star | 415500-0010-001 | Germany |
| Ear punch | Fisher Scientific | 13-812-201 | |
| Testosterone rat/mouse ELISA kit | IBL | B79174 | |
| DHT ELISA kit | Alpha Diagnostic International | 1940 | |
| One touch ultra glucometer | Life Scan, Inc. | ||
| One touch ultra test stripes | Life Scan, Inc. | ||
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-402-18 | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Clidox | Fisher Scientific | NC0089321 | |
| surgical underpad | Fisher Scientific | 50587953 | Manufacturer: Andwin Scientific 56616018 |
| Betadine Antiseptic Solution | Walgreens | ||
| 3M Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) | 3M Science. Applied to Life |
References
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