Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Genetiske indarbejdelse af Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) og dens anvendelse på Protein konjugation

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58383
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, Sogang University

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for den genetiske indarbejdelse af L-dihydroxyphenylalanine biosynthesized fra simple udgangsmaterialer og dens anvendelse på protein konjugering.

Abstract

L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) er en aminosyre, der findes i biosyntesen af katekolaminer i dyr og planter. På grund af dens særlige biokemiske egenskaber har aminosyren flere anvendelser i biokemiske anvendelser. Denne rapport beskriver en protokol til den genetiske indbygning af biosynthesized DOPA og dens anvendelse på protein konjugering. DOPA er biosynthesized af en tyrosin phenol-lyase (TPL) fra catechol, pyruvat og ammoniak, og aminosyre er direkte indarbejdet i proteiner af den genetiske indarbejdelse metode ved hjælp af en udviklet aminoacyl-tRNA og aminoacyl-tRNA syntetase par. Denne direkte iblanding system inkorporerer effektivt DOPA med lille inkorporering af andre naturlige aminosyrer og med bedre protein udbytte end den tidligere genetiske indarbejdelse system for DOPA. Protein konjugering med DOPA-indeholdende proteiner er effektiv og lokationsspecifikke og viser sin anvendelighed til forskellige applikationer. Denne protokol giver protein forskere med detaljerede procedurer for effektiv biosyntesen af mutant proteiner der indeholder DOPA på ønskede sites og deres konjugering for industrielle og farmaceutiske anvendelser.

Introduction

DOPA er en aminosyre, der er involverede i biosyntesen af katekolaminer i dyr og planter. Denne aminosyre er syntetiseret fra Tyr af tyrosin hydroxylase og molekylær ilt (O2)1. Fordi DOPA er en forløber for dopamin og kan præge blod - hjerne barrieren, har det været brugt i behandlingen af Parkinsons sygdom2. DOPA er også fundet i mussel vedhæftning proteiner (kort), som er ansvarlige for de klæbende egenskaber af muslinger i våde forhold3,4,5,6,7. Tyr er oprindeligt kodet på positioner hvor DOPA er fundet i MAPs og omdannes derefter til DOPA af tyrosinases8,9. På grund af sin interessante biokemiske egenskaber, er DOPA blevet brugt i en lang række applikationer. Dihydroxyl gruppen af DOPA er kemisk udsat for oxidation, og aminosyre er let omdannes til L-dopaquinone, en forløber for melaninas. På grund af sin høje electrofilia, har L-dopaquinone og derivater deraf været brugt til crosslinking og konjugering med dithioler og aminer10,11,12,13. 1,2-quinones kan også fungere som en Dien for cycloaddition reaktioner og har været brugt til bioconjugation af stamme-forfremmet oxidation-kontrollerede cyclooctyne-1,2-Quinon (SPOCQ) cycloaddition14. Derudover gruppen dihydroxyl kan Chelat metalioner som Fe3 + og Cu2 +, og proteiner der indeholder DOPA har været udnyttet til medicinafgivelse og metal-ion sensing15,16.

DOPA har været genetisk indarbejdet i proteiner ved hjælp af en ortogonal aminoacyl-tRNA (aa-tRNA) og aminoacyl-tRNA syntetase (aaRS) par17 og anvendes til protein konjugering og crosslinking10,11, 12,13. I denne betænkning, er eksperimentelle resultater og protokoller for den genetiske indarbejdelse af DOPA biosynthesized fra billige råvarer og dets applikationer til bioconjugation beskrevet. DOPA er biosynthesized ved hjælp af en TPL og start fra catechol, pyruvat og ammoniak i Escherichia coli. Biosynthesized DOPA er direkte indarbejdet i proteiner at give udtryk for en udviklet aa-tRNA og aaRS par for DOPA. Derudover er biosynthesized protein som indeholder DOPA site-specifically konjugeret med et fluorescerende sonde og crosslinked at producere protein oligomerer. Denne protokol vil være nyttigt for protein forskere, at biosynthesize mutant proteiner der indeholder DOPA og konjugat proteiner med biokemiske sonder eller narkotika for industrielle og farmaceutiske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. plasmid konstruktion

  1. Konstruere et udtryk plasmid (pBAD-dobbelt-TPL-normal god landbrugspraksis-WT), der udtrykker TPL-genet fra Citrobacter freundii under kontrol af en konstitutive promoter og grønt fluorescerende proteiner (NGL) genet med en hans6-tag under kontrol af den araBAD promotor. PBAD-dual-TPL-normal god landbrugspraksis-E90TAG, Erstat codon for webstedet (E90) af DOPA med en rav codon (TAG), ved hjælp af en site-directed mutagenese protokol. Detaljer for opførelsen af denne plasmid blev beskrevet i vores tidligere rapport18.
  2. Konstruere en tRNA/aaRS-udtrykker plasmid (pEVOL-DHPRS2)18,19 for genetiske indarbejdelse af DOPA. pEVOL er en speciel plasmid vektor udtrykker to kopier af aaRS gener med uafhængige projektledere, og de detaljerede oplysninger af plasmidet er beskrevet i en tidligere betænkning19.
  3. Bruge kommercielt tilgængelige plasmid forberedelse kits til at opnå høj renhed plasmid DNAs. Kontrollere renhed prepped DNAs ved hjælp af Agarosen gelelektroforese, hvis nødvendigt.

2. kultur forberedelse

  1. Elektroporation
    1. Brug electro-kompetente E. coli DH10β stamme til dette eksperiment. Tilføje 1 µL af hver plasmid DNA (pEVOL-DHPRS2 og pBAD-dual-TPL-normal god landbrugspraksis-E90TAG) til 20 µL af kompetente celler. Bland dem forsigtigt for at gøre en homogen blanding, ved hjælp af en pipette.
    2. Overfør blandingen til elektroporation kuvetter. Sted kuvette i elektroporation kammer. Skubbe kuvette ind i kammeret til at gøre fast kuvette-afdeling kontakte.
    3. Chok kuvette, ved hjælp af 25 µF og 2,5 kV for 0,1-cm kuvetter.
    4. Der tilsættes 1 mL af forvarmet super optimal bouillon (SOC), der indeholder 2% (w/v) trypton, 0,5% (w/v) gær extract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2og 20 mM glucose, til kuvette, og overføre cellerne til en kultur tube. Redde cellerne ved at inkubere dem i 1 timer ved 37 ° C under omrystning.
    5. Sprede 10-100 µL af de reddede celler på en lysogeny bouillon (LB) agar plade der indeholder 35 µg/mL chloramphenicol og 100 µg/mL ampicillin. Inkuber celler ved 37 ° C i 16 h.
  2. Starteren kultur forberedelse
    1. Podes en enkelt transformerede koloni i 5 mL af LB medium indeholdende antibiotika. Inkuber koloni i 12 timer ved 37 ° C under omrystning.

3. proteinekspression og -oprensning af normal god landbrugspraksis-E90DOPA af en biosyntetiske System

  1. Udtryk for normal god landbrugspraksis-E90DOPA af en biosyntetiske system
    1. Overføre starter kultur (2 mL) til 100 mL af PA-5052 medium20 (50 mM Na2HPO4, 50 mM KH2PO4, 25 mM [NH4]2så4, 2 mM MgSO4, 0,1% [w/v] spore metaller, 0,5% [w/v] glycerol, 0,05% [w/v] glukose, og 5% [w/v] aminosyrer [pH 7,25]) indeholdende 35 µg/mL chloramphenicol, 100 µg/mL ampicillin, 100 mM pyruvat, 10 mM catechol, 25 mM ammoniak og 300 µM dithiothreitol (DTT) efterfulgt af en inkubation ved 30 ° C under omrystning.
    2. Tilsættes 2 mL 0,2% (w/v) L-arabinose når det optiske densitet (OD) ved 550 nm når 0,8. Inkuber prøven i 12 timer ved 30 ° C under omrystning.
    3. Spin ned celler på 11.000 x g i 5 min, supernatanten fjernes, og fryse celle pellet ved-80 ° C.
  2. Celle lysis
    1. Tø celle pellet på is og resuspend celler i 10 mL af lysisbuffer indeholdende 50 mM NaH2PO4 (pH 8.0), 10 mM imidazol og 300 mM NaCl.
    2. Der sonikeres de resuspenderede celler i isbad i 10 min. Brug 80% sonikering amplitude med en puls af 25 s på og 35 s off.
    3. Spin ned celle lysate på 18.000 x g ved 4 ° C i 15 min. overførsel supernatanten til en frisk tube til rensning og kassér pelleten.
  3. Ni-NTA affinitet kromatografi
    1. Tilføje Ni-NTA (nitrilotrieddikesyre syre) harpiks (300 µL af harpiks suspension for en 100-mL kultur) til supernatanten og binde proteiner til Ni-NTA harpiks ved 4 ° C ved forsigtigt ryste suspension for 1 h.
    2. Overføre suspension til en polypropylen kolonne og vaske harpiks 3 x med 5 mL af wash buffer indeholdende 50 mM NaH2PO4 (pH 8.0), 20 mM imidazol og 300 mM NaCl.
    3. Elueres proteiner 3 x med 300 µL af eluering buffer indeholdende 50 mM NaH2PO4 (pH 8.0), 250 mM imidazol og 300 mM NaCl.
    4. Bestemme proteinkoncentration ved måling af absorbans ved 280 nm. Extinction koefficient (24,630 M-1cm-1) for normal god landbrugspraksis-E90DOPA på 280 nm blev beregnet ved en protein extinction koefficient lommeregner (fx, https://web.expasy.org/protparam/) og uafhængigt målte udryddelsen coefficiennt (2630 M-1cm-1) til DOPA. Som en alternativ metode, skal du bruge Bradford protein assay21 til en bestemmelse af proteinkoncentration.

4. oligomerisering af renset normal god landbrugspraksis-E90DOPA

  1. Tilføj 1 µL af natrium periodate i H2O (6 mM) (1,0 ækvivalent til normal god landbrugspraksis-E90DOPA) til en løsning af 20 µL af normal god landbrugspraksis-E90DOPA (300 µM) i en fosfat buffer indeholdende 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) og 300 mM NaCl.
  2. Tillad oligomerisering reaktionen fortsætte ved 25 ° C i 48 timer.
  3. Analysere reaktionsblandingen ved sodium dodecyl sulfat-polyacrylamid gelelektroforese) (SDS-PAGE) som beskrevet i trin 6.

5. konjugation af normal god landbrugspraksis-E90DOPA med en alkyn sonde af SPOCQ

  1. Tilføj 1 µL af den Cy5.5 i forbindelse med azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO)22 i H2O (4,0 mM) (10 ækvivalent til normal god landbrugspraksis-E90DOPA) til en løsning af 20 µL af normal god landbrugspraksis-E90DOPA (20 µM) i en fosfat buffer indeholdende 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) og 300 mM NaCl.
  2. Tilføj 1 µL af natrium periodate i H2O (400 µM) (1,0 ækvivalent til normal god landbrugspraksis-E90DOPA) til reaktionsblandingen.
  3. Tillad SPOCQ reaktionen fortsætte ved 25 ° C i 1 time. Hvis et lysfølsomt sonde bruges, dække reaktion fartøj med aluminiumsfolie.

6. rensning af mærket af normal god landbrugspraksis

  1. Fortynd SPOCQ reaktionsblanding ved at tilføje en fosfat buffer, som indeholder 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) og 300 mM NaCl, op til 500 µL.
  2. Den fortyndede opløsning overføres til en centrifugal filter spin kolonne. Centrifugeres kolonnen spin på 14.000 x g ved 4 ° C i 15 min og kassér gennemstrømnings. Gentag dette trin 3 x for at fjerne eventuelle overskydende Cy5.5-ADIBO.
  3. Overføre renset prøven fra kolonnen spin til en 1,5 mL microcentrifuge tube.
  4. Alternativt, udføre en rensning af dialyse mod den samme buffer.
  5. Gemme den renset normal god landbrugspraksis ved 4 ° C.

7. SDS-PAGE analyse og fluorescens Gel Scanning

  1. Forberede SDS-PAGE analyse ved at tilføje 5 µL af protein prøvebuffer protein prøver (Se Tabel af materialer) og 2 µL af DTT (1,00 M) til 13 µL af renset eller rå, mærket normal god landbrugspraksis (13.6 µM eller 0.38 mg/mL). En analyse af oligomere normal god landbrugspraksis, bruge en højere koncentration af normal god landbrugspraksis (67.8 µM eller 1,9 mg/mL). Denaturere proteiner af inkubere dem ved 95 ° C i 10 min.
  2. Placer en 4% - 12% Bis-Tris SDS-PAGE gel kassette (købes, premade gel kasetter) til cellen elektroforese og tilføje en kørende buffer (Se Tabel af materialer). Indlæse protein prøver og en molekylvægt markør. Køre elektroforese i 35-40 min. ved 200 V.
    Bemærk: Undgå enhver udsættelse af protein prøver at lyse ved at gennemføre alle processer i mørke, at minimere foto-blegning af fluorescerende sonden.
  3. Bruge et fluorescens scanner til fluorescens billeddannelse. Wrap et protein gel fra elektroforese og placere den på et fluorescens scanner. Skan gel ved hjælp af en passende bølgelængde indstilling. Cy5.5, Vælg den Cy5 tilstand i scannersoftwaren.
  4. Pletten gelen kommercielle protein farvning reagens.

8. MALDI-TOF MS analyse af Trypsin fordøjelsen

  1. Inkuber 100 µL af renset normal god landbrugspraksis-E90DOPA (2,2 mg/mL eller 80 µM) i en buffer, som indeholder 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0,1% (w/v) SDS, og 25 mM DTT ved 60 ° C i 1 time.
  2. Tilføj 1 µL af Iodoacetamide i H2O (IAA, 4.0 M) (500 ækvivalent til normal god landbrugspraksis-E90DOPA) til den rensede normal god landbrugspraksis-E90DOPA løsning (80 µM) i den samme buffer. Inkuber blanding ved 25 ° C i 30 min med beskyttelse mod lys.
  3. Fordøje eksemplet normal god landbrugspraksis-E90DOPA ved at tilføje trypsin (1: 100 protease-til-substrat-protein forholdet [w/w]) og inkuberes reaktionsblanding ved 37 ° C i 4 timer.
  4. Rense fordøjet peptid prøven ved hjælp af en standard udvanding metode med C18 spin kolonner.
  5. Analysere de fordøjede peptider ved den rapporterede protokol for matrix assisted laser desorption/Ionisation time of flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) ved hjælp af alpha-cyano-4-hydroxycinnamic syre (CHCA) som en matrix23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Expression system til den direkte iblanding af DOPA biosynthesized fra en TPL er vist i figur 1. Gener for udviklet aa-tRNA og aaRS parret er placeret i et plasmid, og normal god landbrugspraksis genet (normal god landbrugspraksis-E90TAG) indeholdende en rav codon startposition 90 er beliggende i en anden plasmid at vurdere integrationen af DOPA af normal god landbrugspraksis fluorescens. TPL-genet er placeret i den samme udtryk plasmid indeholdende normal god landbrugspraksis-genet og constitutively givet udtryk for at maksimere udbyttet af DOPA biosyntesen. Bruger dette udtryk system, blev optimale betingelser for DOPA biosyntesen screenet. Vækst medier anvendt til dette eksperiment indeholdt 25 mM ammoniak og 100 mM pyruvat, med varierende koncentrationer af catechol (0 - 10 mM). Catechol koncentrationen var afgørende for DOPA biosyntesen, mens ammoniak og pyruvat koncentrationer over 25 mM og 100 mM, henholdsvis, påvirkede ikke biosyntese og indarbejdelse af DOPA. Den optimale koncentration af catechol var 10 mM, og en koncentration af mere end 10 mM faldt betydeligt den bakterielle cellevækst på grund af dens cytotoksicitet. I denne optimale tilstand var DOPA biosynthesized af TPL fra dets råvarer og biosynthesized DOPA blev direkte indarbejdet i normal god landbrugspraksis. De udtrykte mutant normal god landbrugspraksis (NGL-E90DOPA) blev renset og analyseret af SDS-PAGE (fig. 2A). Fuld længde af normal god landbrugspraksis var renset, og DOPA inkorporeringen blev bekræftet af MALDI-TOF MS analyse (figur 2B). Protein er fordøjet med trypsin, peptid fragment indeholdende DOPA blev analyseret, og resultatet viste eksklusive indarbejdelse af DOPA med ingen påviselige Tyr eller andre naturlige aminosyre indarbejdelse. Indarbejdelse effektiviteten af DOPA biosynthesized af TPL lignede indarbejdelse effektivitet med 3 mM DOPA, som er den maksimale koncentration af DOPA på grund af dens cytotoksicitet19. Selv om 10 mM catechol viste moderat giftighed, var celle tæthed efter 16 h kultur tid tre-firdoblet højere end i nærværelse af 3 mM DOPA. Oprenset protein udbyttet af biosyntesen var tredoblet højere end fra eksperimentet ved hjælp af 3 mM DOPA (figur 3).

Mutant normal god landbrugspraksis indeholdende DOPA blev brugt til protein konjugering. DOPA kan oxideres til L-dopaquinone af mild oxidanter, og den elektrofil Quinon reagerer med anstrengte Alkyner og nukleofiler, såsom dithioler og aminer, og kan bruges til bioconjugation (figur 4). Normal god landbrugspraksis-E90DOPA blev testet for SPOCQ cycloaddition ved at reagere med natrium periodate, efterfulgt af en behandling med Cy5.5-ADIBO22. Denne SPOCQ reaktion blev analyseret af SDS-PAGE og fluorescens imaging (figur 5A). Intens fluorescens bandet blev observeret med en behandling af natrium, periodate og Cy5.5-ADIBO, mens ingen fluorescens band blev vist i kontrol reaktioner med normal god landbrugspraksis-WT eller uden en natrium periodate behandling, bekræftelse af effektiviteten og specificiteten af det konjugation reaktion med genetisk indbygget DOPA. Derudover blev DOPA-indeholdende NGL brugt til protein oligomerisering. L-dopaquinone reagerer med Lys eller Cys i den samme protein, hvilket resulterer i oligomere proteiner. Normal god landbrugspraksis-E90DOPA blev behandlet med natrium periodate og oligomerisering blev foretaget for 48 h, og reaktionen blev analyseret af SDS-PAGE i forhold til en kontrolprøve uden en natrium periodate behandling (figur 5B). Analysen viste et klart oligomerisering mønster med jævnt fordelt protein bands for periodate-behandlet prøven, mens stikprøven, der viste den intakte protein uden nogen andre bands.

Figure 1
Figur 1 : Direkte iblanding af DOPA biosynthesized fra catechol, pyruvat og ammoniak. DOPA er biosynthesized af heterologously udtrykt TPL fra catechol, pyruvat og ammoniak i vækstmediet. Udviklet tRNA/aaRS parret for DOPA er co udtrykt at indarbejde biosynthesized DOPA i target proteinet, normal god landbrugspraksis. TPL gen var henført under en konstitutiv promotor for at starte DOPA biosyntesen før inducerende normal god landbrugspraksis udtryk. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : SDS-PAGE og MALDI-TOF MS analyser af normal god landbrugspraksis-E90DOPA udtrykt i designet biosyntetiske systemet. (A) NGL-E90DOPA var udtrykt af den designet biosyntetiske system 10 mM catechol, 100 mM pyruvat og 25 mM ammoniak, og derefter renset ved Ni-NTA affinitet kromatografi. Normal god landbrugspraksis-WT blev også analyseret for sammenligning. Prøverne blev adskilt af Bis-Tris 4-12% SDS-PAGE og gelen var plettet med Coomassie strålende blå R-250. (B) MALDI-TOF MS analyse af peptid fragment indeholdende DOPA fra den tryptic fordøjelse af normal god landbrugspraksis-E90DOPA. Peptid fragment fra normal god landbrugspraksis-WT indeholder restkoncentrationer 86-96 (SAMPEGYVQER). Glu i fragmentet fra normal god landbrugspraksis-WT er erstattet med DOPA i peptid fragment fra normal god landbrugspraksis-E90DOPA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Sammenligning af en direkte inkorporering af biosynthesized DOPA med en generel genetiske inkorporering af DOPA. Disse paneler viser normal god landbrugspraksis-E90DOPA udtrykt ved den designet biosyntetiske system og genetiske indarbejdelse i overværelse af 3 mM DOPA uden yderligere pyruvat, ammoniak og catechol. (A) protein udbyttet stammer fra renset normal god landbrugspraksis-E90DOPA, og (B) celle tætheder blev målt på 16 h efter induktion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Reaktion ordningen af bioconjugation af normal god landbrugspraksis-E90DOPA. Normal god landbrugspraksis-E90DOPA oxideres til at konvertere DOPA til dopaquinone. Reaktion af dopaquinone-holdige proteiner med en anstrengt alkyn opnår lokationsspecifikke protein mærkning. Inkubation af dopaquinone-holdige proteiner i høj koncentration i lang tid (48 h) forårsager protein selvstændig konjugation at producere protein oligomerer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Bioconjugation af mutant proteiner der indeholder DOPA. (A) SPOCQ reaktioner af en DOPA-indeholdende protein med en anstrengt alkyn, ADIBO-Cy5.5. Normal god landbrugspraksis-WT og normal god landbrugspraksis-E90DOPA blev behandlet med natrium periodate og reagerede med ADIBO-Cy5.5 til 60 min. Reaktionerne blev analyseret af SDS-PAGE og Coomassie farvede (øverst) og fluorescens (bunden) billederne er vist. (B) oligomerisering af normal god landbrugspraksis-E90DOPA. Den DOPA-indeholdende normal god landbrugspraksis var behandlet med natrium periodate og inkuberes i 48 timer. Reaktionsblandingen blev analyseret af SDS-PAGE. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol, er biosyntese og direkte iblanding af DOPA beskrevet. Den bakterielle celle i denne metode kan syntetisere en yderligere aminosyre og bruge det som en unaturlig byggesten for proteinsyntese. Den genetiske indarbejdelse af unaturlige aminosyrer har været en nøgleteknologi til udvikling af unaturlige organisme med en udvidet genetiske kode. Dog, denne metode har været teknisk ufuldstændige og ændres for at forbedre indarbejdelse effektivitet og minimere undertrykkelse af netbårne til endogene maskinoversættelsessystemer. For nylig, betydelige fremskridt i metoden, der er opnået af omfordeler kodon24,25 for unaturlige aminosyrer og teknik ortogonale translationel komponenter26,27,28 ,29. Ud over disse forbedringer, systemet beskrevet her tilbyder en anden evne til en unaturlig organisme med en udvidet genetiske kode: biosyntesen af en unaturlig aminosyre. Denne funktion giver den unaturlige system mere uafhængighed som en organisme med et udvidet genetiske repertoire. Desuden viser DOPA moderat toksicitet på bakteriel stammen brugt i denne metode, og på 3 mM DOPA, cellevækst reduceret betydeligt, hvilket resulterede i lavt proteinindhold udbytte. Ved hjælp af direkte iblanding system, toksicitet blev reduceret og protein udbytte steget tredoblet.

AaRS mutant anvendt til den genetiske indarbejdelse af DOPA har moderat effektivitet og troskab og inkorporerer Tyr på en lav koncentration af DOPA. 18 derfor skal biosyntesen af DOPA i bakterieceller blive effektiv nok til at forhindre Tyr indarbejdelse. DOPA biosyntesen af TPL fra catechol, ammoniak og pyruvat er en reversibel reaktion, og høje koncentrationer af de udgangsmaterialer, som er nødvendige for en effektiv biosyntesen. Dog kan ikke catechol bruges over 10 mM da det er giftigt for den bakterielle stamme, der anvendes i denne protokol. DTT koncentration er også vigtige i denne protokol. DOPA viser dets giftighed, når det er konverteret til L-dopaquinone, og DTT er tilføjet i vækstmediet at reducere oxidation sats. Vi observeret et fald i cellevækst, når DTT koncentrationen var over 300 µM. Derfor, for en optimal biosyntese og indarbejdelse af DOPA, komponenter (især catechol og DTT) til næringssubstratet bør anvendes i passende koncentrationer som beskrevet i denne protokol.

Denne protokol beskriver også anvendelser af DOPA-indeholdende proteiner for lokationsspecifikke protein konjugering. L-dopaquinone genereret ved oxidation af DOPA effektivt reagerer med en anstrengt alkyn knyttet til en biokemiske sonde. Denne cycloaddition reaktion er normalt hurtigere end nukleofil tilføjelse reaktioner af aminer eller dithioler. Ikke desto mindre bør oxidation af DOPA udføres både en DOPA-indeholdende protein og en anstrengt alkyn, at minimere nukleofil tilføjelsen af nukleofiler i proteinet. Rækkefølgen for tilsætning af reagenserne til denne reaktion er derfor kritisk.

Mange unaturlige aminosyrer er tilgængelige for protein konjugation, og nogle af dem opnå en hurtig reaktion hastighed og fremragende konjugation effektivitet30,31,32,33. Disse aminosyrer indeholder biorthogonal funktionelle grupper som azider, Alkyner, anspændt alkener eller Alkyner og tetrazines. Selv om de er nyttige for lokationsspecifikke protein konjugering, er mange af dem dyrt eller kommercielt utilgængelige, hvilket begrænser deres applikationer, især i dem, der kræver store proteiner. Biosyntesen af DOPA fra billige råvarer og dens direkte iblanding vil derfor være nyttigt for farmaceutiske og industrielle applikationer, der kræver omfattende mutant proteiner der indeholder en biokemiske sonde eller et lægemiddel (antistof-stof konjugat, ADC).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af den globale grænse Research Program (NRF-2015M3A6A8065833), og den grundlæggende videnskab forskningsprogram (2018R1A6A1A03024940) gennem National Research Foundation af Korea (NRF) finansieret af Korea regering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Plasmid Construction
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmid pEvol-DHPRS2 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).
DH10β Invitrogen C6400-03 Expression Host
Plasmid Mini-prep kit Nucleogen 5112 200/pack
Agarose Intron biotechnology 32034 500 g
Ethidium bromide Alfa Aesar L07482 1 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser  BIO-RAD 165-2100
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2089 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium Wako 018-10372 25 g
Chloramphenicol Alfa Aesar B20841 25 g
Agar SAMCHUN 214230 500 g
SOC medium Sigma S1797 100 mL
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
L(+)-Arabinose, 99% Acros 104981000 100 g
Pyrocatechol, 99% SAMCHUN P1387 25 g
Ammonium sulfate, 99% SAMCHUN A0943 500 g
pyruvic acid, 98% Alfa Aesar A13875 100 g
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% SAMCHUN S0891 1 kg
Potassium phophate, monobasic, 99% SAMCHUN P1127 1 kg
Magnesium sulfate, anhydrous, 99% SAMCHUN M0146 1 kg
D(+)-Glucose, anhydrous, 99% SAMCHUN D0092 500 g
Glycerol, 99% SAMCHUN G0269 1 kg
Trace metal mix a5 with co Sigma 92949 25 mL
L-Proline, 99% SAMCHUN P1257 25 g
L-Phenylalanine, 98.5% SAMCHUN P1982 25 g
L-Tryptophane JUNSEI 49550-0310 25 g
L-Arginine, 98% SAMCHUN A1149 25 g
L-Glutamine, 98% JUNSEI 27340-0310 25 g
L-Asparagine monohydrate, 99% SAMCHUN A1198 25 g
L-Methionine JUNSEI 73190-0410 25 g
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% SAMCHUN H0604 25 g
L-Threonine, 99% SAMCHUN T2938 25 g
L-Leucine JUNSEI 87070-0310 25 g
Glycine, 99% SAMCHUN G0286 25 g
L-Glutamic acid, 99% SAMCHUN G0233 25 g
L-Alanine, 99% SAMCHUN A1543 25 g
L-Isoleucine, 99% SAMCHUN I1049 25 g
L-Valine, 99% SAMCHUN V0088 25 g
L-Serine SAMCHUN S2447 25 g
L-Aspartic acid SAMCHUN A1205 25 g
L-Lysine monohydrochloride, 99% SAMCHUN L0592 25 g
3.2 Cell lysis
Imidazole, 99% SAMCHUN I0578 1kg
Sodium phosphate monobasic, 98% SAMCHUN S0919 1 kg
Sodium Chloride, 99% SAMCHUN S2907 1 kg
Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 milliliters SONIC & MATERIALS VCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 25 mL
Polypropylene column QIAGEN 34924 50/pack, 1 mL capacity
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA 
Sodium periodate, 99.8& Acros 419610050 5 g
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) 
Cy5.5-ADIBO  FutureChem FC-6119 1mg
6. Purification of Labeled GFP
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters MILLIPORE UFC500396 96/pack, 500ul capacity
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % Sigma 10708984001 10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X Thermofisher NP0007 10 mL
MES running buffer Thermofisher NP0002 500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels Thermofisher NO0321 12 well
Coomassie Brilliant Blue R-250 Wako 031-17922 25 g
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System Syngene G BOX Chemi XT4
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% SAMCHUN T1351 500 g
Hydrochloric acid, 35~37% SAMCHUN H0256 500 mL
Dodecyl sulfate sodium salt, 85% SAMCHUN D1070 250 g
Iodoacetamide Sigma I6125 5 g
Trypsin Protease, MS Grade Thermofisher 90057 5 x 20 µg/pack
C-18 spin columns Thermofisher 89870 25/pack, 200 µL capacity
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF
Acetonitirile, 99.5% SAMCHUN A0125 500 mL
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma C2020 10 g
Trifluoroacetic acid, 99% SAMCHUN T1666 100 g
MTP 384 target plate ground steel BC targets Bruker 8280784
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer Bruker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagatsu, T., Levitt, M., Udenfriend, S. Tyrosine hydroxylase: The initial step in norepinephrine biosynthesis. Journal of Biological Chemistry. 239, 2910-2917 (1964).
  2. Pinder, R. M. Possible dopamine derivatives capable of crossing the blood-brain barrier in relation to parkinsonism. Nature. 228 (5269), 358 (1970).
  3. Waite, J. H., Tanzer, M. L. Polyphenolic substance of mytilus edulis: novel adhesive containing L-DOPA and hydroxyproline. Science. 212 (4498), 1038-1040 (1981).
  4. Lee, H., Scherer, N. F., Messersmith, P. B. Single-molecule mechanics of mussel adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 12999-13003 (2006).
  5. Papov, V. V., Diamond, T. V., Biemann, K., Waite, J. H. Hydroxyarginine-containing polyphenolic proteins in the adhesive plaques of the marine mussel Mytilus edulis. Journal of Biological Chemistry. 270 (34), 20183-20192 (1995).
  6. Waite, J. H., Qin, X. Polyphosphoprotein from the adhesive pads of Mytilus edulis. Biochemistry. 40 (9), 2887-2893 (2001).
  7. Nicklisch, S. C., Waite, J. H. Mini-review: The role of redox in DOPA-mediated marine adhesion. Biofouling. 28 (8), 865-877 (2012).
  8. Silverman, H. G., Roberto, F. Understanding marine mussel adhesion. Marine Biotechnology. 9 (6), 661-681 (2007).
  9. Lee, B. P., Messersmith, P. B., Israelachvili, J. N., Waite, J. H. Mussel-inspired adhesives and coatings. Annual Review of Materials Research. 41, 99-132 (2011).
  10. Umeda, A., Thibodeux, G. N., Zhu, J., Lee, Y., Zhang, Z. J. Site-specific protein cross-linking with genetically incorporated 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine. ChemBioChem. 10 (8), 1302-1304 (2009).
  11. Umeda, A., Thibodeux, G. N., Moncivais, K., Jiang, F., Zhang, Z. J. A versatile approach to transform low-affinity peptides into protein probes with cotranslationally expressed chemical cross-linker. Analytical Biochemistry. 405 (1), 82-88 (2010).
  12. Xu, J., Tack, D., Hughes, R. A., Ellington, A. D., Gray, J. J. Structure-based non-canonical amino acid design to covalently crosslink an antibody-antigen complex. Journal of Structural Biology. 185 (2), 215-222 (2014).
  13. Burdine, L., Gillette, T. G., Lin, H. J., Kodadek, T. Periodate-triggered cross-linking of DOPA-containing peptide-protein complexes. Journal of the American Chemical Society. 126 (37), 11442-11443 (2004).
  14. Borrmann, E., et al. Strain-promoted oxidation-controlled cyclooctyne-1,2-quinone cycloaddition (SPOCQ) for fast and activatable protein conjugation. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 257-261 (2015).
  15. Ayyadurai, N., et al. Development of a selective, sensitive, and reversible biosensor by the genetic incorporation of a metal-binding site into green fluorescent protein. Angewandte Chemie International Edition. 50 (29), 6534-6537 (2011).
  16. Kim, B. J., Cheong, H., Hwang, B. H., Cha, H. J. Mussel-inspired protein nanoparticles containing iron(III)-DOPA complexes for pH-responsive drug delivery. Angewandte Chemie International Edition. 54 (25), 7318-7322 (2015).
  17. Alfonta, L., Zhang, Z., Uryu, S., Loo, J. A., Schultz, P. G. Site-specific incorporation of a redox-active amino acid into proteins. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14662-14663 (2003).
  18. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chemical Communications. 54 (24), 3002-3005 (2018).
  19. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
  20. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).
  21. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  22. Jang, S., Sachin, K., Lee, H. J., Kim, D. W., Lee, H. S. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2256-2261 (2012).
  23. Gobom, J., et al. Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid affinity sample preparation. A protocol for MALDI-MS peptide analysis in proteomics. Analytical Chemistry. 73 (3), 434-438 (2001).
  24. Mukai, T., et al. Highly reproductive Escherichia coli cells with no specific assignment to the UAG codon. Scientific Reports. 5, 9699 (2015).
  25. Lajoie, M. J., et al. Genomically recoded organisms expand biological functions. Science. 342 (6156), 357-360 (2013).
  26. Bryson, D. I., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases. Nature Chemical Biology. 13 (12), 1253-1260 (2017).
  27. Guo, J., Melancon, C. E., Lee, H. S., Groff, D., Schultz, P. G. Evolution of amber suppressor tRNAs for efficient bacterial production of proteins containing nonnatural amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 48 (48), 9148-9151 (2009).
  28. Lee, S., et al. A facile strategy for selective phosphoserine incorporation in histones. Angewandte Chemie International Edition. 52 (22), 5771-5775 (2013).
  29. Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M., Chin, J. W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature. 464 (7287), 441-444 (2010).
  30. Lang, K., Chin, J. W. Bioorthogonal reactions for labeling proteins. ACS Chemical Biology. 9 (1), 16-20 (2014).
  31. Lang, K., Chin, J. W. Cellular Incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  32. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angewandte Chemie International Edition. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  33. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. Journal of the American Chemical Society. 134 (6), 2898-2901 (2012).

Tags

Biokemi spørgsmålet 138 DOPA genetiske indarbejdelse biosyntese tyrosin phenol-lyase protein konjugering stamme-forfremmet oxidation-kontrollerede cyclooctyne-1,2-Quinon (SPOCQ) cycloaddition
Genetiske indarbejdelse af Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) og dens anvendelse på Protein konjugation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, S., Lee, H. S. Genetic… More

Kim, S., Lee, H. S. Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation. J. Vis. Exp. (138), e58383, doi:10.3791/58383 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter