Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Genetische opneming van levende L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) en de toepassing ervan op eiwit Woordherkomst en-opbouw

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58383
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, Sogang University

Summary

Hier presenteren we een protocol voor de genetische opneming van L-dihydroxyphenylalanine levende van eenvoudige grondstoffen en de toepassing ervan op eiwit-vervoeging.

Abstract

L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) is een aminozuur gevonden in de biosynthese van catecholamines in dieren en planten. Wegens zijn bepaalde biochemische eigenschappen heeft het aminozuur meerdere toepassingen in biochemische toepassingen. Dit verslag beschrijft een protocol voor de genetische opneming van levende DOPA en de toepassing ervan op eiwit-vervoeging. DOPA is levende door een tyrosine fenol-lyase (TPL) van catechol en pyruvaat ammoniak en het aminozuur wordt direct opgenomen in eiwitten door de genetische methode met behulp van een geëvolueerd aminoacyl-tRNA / aminoacyl-tRNA synthetase-paar. Deze directe opneming systeem omvat efficiënt DOPA met weinig opneming van andere natuurlijke aminozuren en betere eiwit opbrengst dan bij de vorige genetische opneming systeem voor DOPA. Eiwit-vervoeging met DOPA-bevattende eiwitten is efficiënt en site-specifieke en toont het nut ervan voor verschillende toepassingen. Dit protocol biedt eiwit wetenschappers met gedetailleerde procedures voor de efficiënte biosynthese van mutant eiwitten bevattende DOPA op gewenste sites en hun vervoeging voor industriële en farmaceutische toepassingen.

Introduction

DOPA is een aminozuur die betrokken zijn bij de biosynthese van catecholamines in dieren en planten. Dit aminozuur wordt gesynthetiseerd uit Tyr door tyrosine hydroxylase en moleculaire zuurstof (O2)1. Omdat DOPA een precursor van dopamine is en de bloed - hersen-barrière kan doordringen, is het gebruikt bij de behandeling van de ziekte van Parkinson2. DOPA wordt ook gevonden in Mossel hechting eiwitten (MAPs), die verantwoordelijk voor de adhesieve eigenschappen van mosselen in natte omstandigheden3,4,5,6,7 zijn. Tyr is aanvankelijk gecodeerd op de posities waar DOPA wordt gevonden in kaarten en vervolgens wordt omgezet in DOPA door tyrosinases8,9. Wegens zijn interessante biochemische eigenschappen, is DOPA gebruikt in een verscheidenheid van toepassingen. De dihydroxyl groep van DOPA chemisch gevoelig is voor oxidatie, en het aminozuur wordt gemakkelijk omgezet in L-dopaquinone, een voorloper van melanines. Vanwege de hoge electrophilicity, zijn L-dopaquinone en derivaten daarvan gebruikt voor crosslinking en vervoeging met thiolen en aminen10,11,12,13. 1,2-quinones kunnen ook functioneren als een dieen voor cycloadditie reacties en zijn gebruikt voor bioconjugation door stam-bevorderd oxidatie-gecontroleerde cyclooctyne-1,2-Chinon (SPOCQ) cycloadditie14. Bovendien, de dihydroxyl-groep kan chelaat metaalionen zoals Fe3 + en Cu2 +, en eiwitten bevattende DOPA hebben gebruikt voor drug delivery en metaalion sensing15,16.

DOPA is genetisch eiwitten omgezet met behulp van een orthogonale aminoacyl-tRNA (aa-tRNA) en het aminoacyl-tRNA synthetase (jaarlijkse activiteitenverslagen) paar17 en gebruikt voor eiwit conjugatie en crosslinking10,11, 12,,13. In dit verslag, worden experimentele resultaten en protocollen voor de genetische opneming van DOPA levende van goedkope grondstoffen en de toepassingen voor de bioconjugation beschreven. DOPA is levende met behulp van een TPL en vanaf catechol en pyruvaat ammoniak in Escherichia coli. De levende DOPA is het direct opgenomen in eiwitten met een geëvolueerd aa-tRNA en jaarlijkse activiteitenverslagen paar DOPA uit te spreken. Daarnaast is het levende eiwit met DOPA site-specifically geconjugeerd met een fluorescente sonde en kruisverwijzende voor de productie van eiwitten oligomeren. Dit protocol zal nuttig zijn voor eiwit wetenschappers, biosynthesize mutant eiwitten bevattende DOPA en conjugaat van de eiwitten met de biochemische sondes of drugs voor industriële en farmaceutische toepassingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. plasmide bouw

  1. Bouwen van een plasmide expressie (pBAD-dual-TPL-GFP-WT) die uitdrukt van de TPL-gen van Citrobacter freundii onder de controle van een constitutief promotor en de groen fluorescente proteïne (GFP) gen met een zijn6-label onder de controle van de araBAD de promotor. Voor pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG, vervangen door het codon voor de site (E90) van DOPA met een amber codon (TAG), een plaats-geleide mutagenese-protocol gebruiken. De details voor de bouw van deze plasmide werd beschreven in onze eerdere verslag18.
  2. Een tRNA/jaarlijkse activiteitenverslagen-uiten plasmide (pEVOL-DHPRS2)18,19 voor de genetische opneming van DOPA te construeren. pEVOL is een vector van de speciale plasmide uiting van twee exemplaren van de jaarlijkse activiteitenverslagen van genen met onafhankelijke initiatiefnemers en de gedetailleerde informatie van de plasmide wordt beschreven in een vorige verslag19.
  3. Gebruik verkrijgbare plasmide voorbereiding kits te verkrijgen van hoge zuiverheid plasmide Ani. Controleren de zuiverheid van de geprepareerde ANI's met behulp van agarose de Elektroforese van het gel, indien nodig.

2. cultuur voorbereiding

  1. Electroporation
    1. Gebruik de electro-bevoegde E. coli DH10β stam voor dit experiment. Voeg 1 µL van elke plasmide DNA (pEVOL-DHPRS2 en pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG) tot 20 µL van bevoegde cellen. Meng ze zachtjes zodat een homogeen mengsel, met behulp van een precisiepipet.
    2. Breng het mengsel naar de electroporation cuvettes. Plaats de cuvette electroporation aanwezig. Duw de cuvette in de zaal om stevige cuvette-kamer contact.
    3. Schok van de meetcel, met behulp van 25 µF en 2,5 kV voor 0,1 cm cuvettes.
    4. Voeg 1 mL voorverwarmde super optimale Bouillon (SOC), met 2% (g/v) trypton, 0,5% (w/v) gist extract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2en 20 mM glucose, naar de meetcel, en de cellen overbrengen in een cultuur-buis. Redden de cellen door ze aan het broeden gedurende 1 uur bij 37 ° C met schudden.
    5. Verspreiden van 10-100 µL van de geredde cellen in een lysogenie Bouillon (LB) agarplaat met 35 µg/mL chlooramfenicol en 100 µg/mL ampicilline. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 16 uur.
  2. Starter cultuur voorbereiding
    1. Inoculeer een enkele getransformeerde kolonie in 5 mL LB opslagmedium met antibiotica. Incubeer de kolonie om 12 uur bij 37 ° C met schudden.

3. expressie en zuivering van GFP-E90DOPA door een biosynthetische systeem

  1. Expressie van GFP-E90DOPA door een biosynthetische systeem
    1. De starter cultuur (2 mL) tot 100 mL van PA-5052 middellange20 (50 mM nb2HPO4, 50 mM KH2PO4, 25 mM [NH4]2dus4, 2 mM MgSO4, 0,1% [w/v] traceren metalen, 0,5% [w/v] van glycerol Transfer 0,05% [w/v] glucose en aminozuren 5% [w/v] [pH 7.25]) met 35 µg/mL chlooramfenicol, 100 µg/mL ampicilline, 100 mM pyruvaat, catechol 10 mM, 25 mM ammoniak, en 300 µM dithiothreitol (DTT) gevolgd door een incubatie bij 30 ° C met schudden.
    2. Voeg 2 mL 0,2% (m/v) L-arabinose wanneer de optische dichtheid (OD) bij 550 nm bereikt 0.8. Incubeer het monster voor 12 h bij 30 ° C met schudden.
    3. Spin down de cellen bij 11.000 x g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en bevriezen van de cel pellet bij-80 ° C.
  2. Lysis van de cel
    1. Ontdooi de cel pellet op ijs en resuspendeer de cellen in 10 mL lysis-buffermengsel met 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), 10 mM imidazool en 300 mM NaCl.
    2. Bewerk de geresuspendeerde cellen op ijs voor 10 min. gebruik 80% ultrasoonapparaat amplitude met een puls van 25 ultrasone trillingen ten s op en 35 s af.
    3. Spin down de cel lysate bij 18.000 x g bij 4 ° C gedurende 15 min. overdracht de bovendrijvende substantie aan een verse buis voor de zuivering en gooi de pellet.
  3. De chromatografie van de affiniteit van de ni-NTA
    1. Ni-NTA (nitrilotriacetic zuur) hars (300 µL van hars schorsing voor een 100 mL-cultuur) toevoegen aan het supernatant en binding van de eiwitten met de hars van de Ni-NTA bij 4 ° C door zachtjes schudden de schorsing gedurende 1 uur.
    2. Spoel de suspensie aan een kolom van polypropyleen en wassen van de hars 3 x met 5 mL was buffer met 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), 20 mM imidazool en 300 mM NaCl.
    3. Elueer de eiwitten 3 x met 300 µL van elutie buffer met 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), 250 mM imidazool en 300 mM NaCl.
    4. De eiwitconcentratie bepalen door het meten van de absorptie bij 280 nm. Het uitsterven coëfficiënt (24,630 M-1cm-1) voor GFP-E90DOPA op 280 nm werd berekend door een calculator van de coëfficiënt van eiwit-uitsterven, (bijvoorbeeld, https://web.expasy.org/protparam/) en het onafhankelijk gemeten uitsterven coefficiennt (2630 M-1cm-1) voor DOPA. Als een alternatieve methode, gebruikt u de Bradford eiwit assay21 voor een bepaling van de eiwitconcentratie.

4. de oligomerisatie van gezuiverde GFP-E90DOPA

  1. Voeg 1 µL van natrium Perjodaat in H2O (6 mM) (1.0 equiv. aan GFP-E90DOPA) tot een oplossing van 20 µL van GFP-E90DOPA (300 µM) in een fosfaatbuffer met 50 mM nb2HPO4 (pH 8.0) en 300 mM NaCl.
  2. Laat de oligomerisatie reactie te gaan bij 25 ° C gedurende 48 uur.
  3. Analyseer het reactiemengsel door elektroforese van het gel van natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide) (SDS-PAGE) zoals beschreven in stap 6.

5. de vervoeging van GFP-E90DOPA met een alkyn sonde door SPOCQ

  1. Voeg 1 µL van de Cy5.5-linked azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO)22 in H2O (4,0 mM) (10 equivalent aan GFP-E90DOPA) tot een oplossing van 20 µL van GFP-E90DOPA (20 µM) in een fosfaatbuffer met 50 mM nb2HPO4 (pH 8.0) en 300 mM NaCl.
  2. Voeg 1 µL van natrium Perjodaat in H2O (400 µM) (1.0 equiv. aan GFP-E90DOPA) aan het reactiemengsel.
  3. De reactie van de SPOCQ om door te gaan bij 25 ° C gedurende 1 h staan. Als een lichtgevoelige sonde wordt gebruikt, omvatten het reactievat met aluminiumfolie.

6. de zuivering van de gelabelde GFP

  1. Verdun het reactiemengsel SPOCQ door toevoeging van een fosfaatbuffer, met 50 mM nb2HPO4 (pH 8.0) en 300 mM NaCl, maximaal 500 µL.
  2. De verdunde oplossing overbrengen in een kolom van de spin centrifugaal filter. Centrifugeer de spin kolom bij 14.000 x g bij 4 ° C gedurende 15 minuten en gooi de doorstroming. Herhaal deze stap 3 x te verwijderen van de overtollige Cy5.5-ADIBO.
  3. Het gezuiverde monster uit de kolom van de spin naar een 1.5-mL microcentrifuge buis overbrengen.
  4. Anderzijds voert een zuivering door dialyse tegen de dezelfde buffer.
  5. Winkel de gezuiverde GFP bij 4 ° C.

7. SDS-pagina analyse en fluorescentie Gel scannen

  1. SDS-pagina analyse EiwitSteekproeven voorbereiden door 5 µL van eiwit monster buffer toe te voegen (Zie Tabel van materialen) en 2 µL van DTT (1,00 M) naar 13 µL van gezuiverde of ruw, label GFP (13.6 µM of 0.38 mg/mL). Gebruiken voor een analyse van oligomere GFP, een hogere concentratie van GFP (67.8 µM of 1.9 mg/mL). Het denatureren van de proteïnen door ze aan het broeden bij 95 ° C gedurende 10 min.
  2. Plaats van een 4% - 12% Bis-Tris SDS-pagina gel cassette (gekocht, premade gel cassettes) naar de cel van elektroforese en voeg een actieve buffer (Zie Tabel van materialen). Laad de eiwitsteekproeven en een molecuulgewicht marker. Voer de elektroforese gedurende 35-40 minuten bij 200 V.
    Opmerking: Vermijd eventuele blootstelling van de eiwitsteekproeven aan het licht door het uitvoeren van alle processen in het donker, te minimaliseren foto-bleken van de fluorescente sonde.
  3. Gebruik een fluorescentie-scanner voor fluorescentie imaging. Wikkel een eiwit gel van elektroforese en plaats deze op een fluorescentie-scanner. Scan de gel met behulp van de instelling van een passende golflengte. Voor Cy5.5, selecteert u de Cy5 modus waarin de scannersoftware.
  4. Vlek de gel met een commerciële eiwit kleuring reagens.

8. MALDI-TOF MS analyse door de spijsvertering van de trypsine

  1. Incubeer 100 µL van gezuiverde GFP-E90DOPA (2,2 mg/mL of 80 µM) in een buffer met 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1% (g/v) SDS, en 25 mM DTT bij 60 ° C gedurende 1 uur.
  2. Voeg 1 µL van Iodoacetamide in H2O (IAA, 4.0 M) (500 equiv. aan GFP-E90DOPA) aan de gezuiverde oplossing voor GFP-E90DOPA (80 µM) in de dezelfde buffer. Incubeer het mengsel bij 25 ° C gedurende 30 minuten met bescherming tegen licht.
  3. Het verteren van het GFP-E90DOPA monster door trypsine (1:100 protease-naar-substraat-eiwitverhouding [w/w]) toe te voegen en het reactiemengsel bij 37 ° C gedurende 4 uur uit te broeden.
  4. Zuiveren het verteerd peptide monster met behulp van een demineralisatie standaardmethode met C18 spin kolommen.
  5. Analyseer de verteerd peptiden door de gerapporteerde protocol voor laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) met behulp van alpha-cyano-4-hydroxycinnamic zuur (CHCA) als een matrix-23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het systeem van de expressie voor de directe integratie van DOPA levende uit een TPL is afgebeeld in Figuur 1. De genen voor het geëvolueerd aa-tRNA en jaarlijkse activiteitenverslagen paar in een plasmide geplaatst en het GFP-gen (GFP-E90TAG) met een amber codon op positie 90 bevindt zich in een ander plasmide te evalueren van de opneming van DOPA door GFP fluorescentie. De TPL-gen is geplaatst in de dezelfde expressie plasmide met het GFP-gen en constitutively uitgedrukt om te maximaliseren van het rendement van de DOPA biosynthese. Met behulp van dit systeem van expressie, werden optimale omstandigheden voor DOPA biosynthese vertoond. De groei-media die worden gebruikt voor dit experiment bevatte 25 mM ammoniak en 100 mM pyruvaat, met verschillende concentraties van catechol (0 - 10 mM). De concentratie van catechol was van cruciaal belang voor de DOPA biosynthese, terwijl ammoniak en pyruvaat concentraties meer dan 25 mM en 100 mM, respectievelijk beïnvloedde niet de biosynthese en opneming van DOPA. De optimale concentratie van catechol was 10 mM, en een concentratie van meer dan 10 mM aanzienlijk daalde de groei van de bacteriële cel als gevolg van de cytotoxiciteit. In deze optimale conditie was DOPA levende door TPL van de grondstoffen en de levende die dopa werd direct opgenomen in GFP. De uitgesproken mutant GFP (GFP-E90DOPA) werd gezuiverd en geanalyseerd door SDS-PAGE(Figuur 2). De full-length GFP werd gezuiverd en de opneming van de DOPA werd bevestigd door MALDI-TOF MS analyse (Figuur 2B). Het eiwit werd verteerd met trypsine, het fragment van de peptide bevattende DOPA werd geanalyseerd en het resultaat liet de exclusieve opneming van DOPA met geen detecteerbare Tyr of andere natuurlijke aminozuur opname. De efficiëntie van de opneming van DOPA levende door TPL was vergelijkbaar met de efficiëntie van de opneming met 3 mM DOPA, die de maximale concentratie van DOPA vanwege haar cytotoxiciteit19. Hoewel 10 mM catechol matige toxiciteit toonde, was de celdichtheid na 16u van cultuur tijd drie-tot verviervoudiging hoger dan in het bijzijn van 3 mM DOPA. De opbrengst gezuiverde eiwit biosynthese verdrievoudigd hoger lag dan die uit het experiment met behulp van 3 mM DOPA (Figuur 3).

De mutant met DOPA GFP werd gebruikt voor eiwit-vervoeging. DOPA kan worden geoxideerd in L-dopaquinone door milde oxidanten, en de elektrofiele chinonen reageert met gespannen alkynen en nucleofiel, zoals thiolen en amines, en kan worden gebruikt voor bioconjugation (Figuur 4). GFP-E90DOPA werd getest op SPOCQ cycloadditie door te reageren met natrium Perjodaat, gevolgd door een behandeling met Cy5.5-ADIBO-22. Deze reactie SPOCQ was geanalyseerd door SDS-pagina en fluorescentie imaging (Figuur 5A). De intense fluorescentie-band werd waargenomen met een behandeling van natrium, Perjodaat en Cy5.5-ADIBO, terwijl geen fluorescentie-band werd getoond in control reacties met GFP-WT of zonder een natrium Perjodaat behandeling, bevestiging van de efficiëntie en de specificiteit van de vervoeging reactie met het genetisch opgenomen DOPA. Bovendien, werd de DOPA-bevattende GFP gebruikt voor eiwit oligomerisatie. L-dopaquinone reageert met Lys of Cys in hetzelfde eiwit, resulterend in de oligomere eiwitten. GFP-E90DOPA werd behandeld met natrium Perjodaat, de oligomerisatie werd uitgevoerd voor de 48 h en de reactie was geanalyseerd door SDS-PAGE in vergelijking met een controlemonster zonder een natrium Perjodaat behandeling (Figuur 5B). De analyse toonde een duidelijke oligomerisatie patroon met gelijkelijk verdeelde eiwit bands voor het monster periodate-behandeld, terwijl de controlemonster het intact eiwit zonder enige andere bands toonde.

Figure 1
Figuur 1 : Directe opname van DOPA levende van catechol en pyruvaat ammoniak. DOPA is levende door geïnfecteerd uitgedrukt TPL van catechol en pyruvaat ammoniak in groeimedium. Het paar geëvolueerd tRNA/jaarlijkse activiteitenverslagen voor DOPA is mede uitgedrukt in op te nemen de levende DOPA het doel protein, GFP. De TPL-gen werd onder een constitutief promotor geplaatst om te beginnen met de DOPA biosynthese voordat de expressie GFP inducerende. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : SDS-pagina en MALDI-TOF MS analyses van GFP-E90DOPA uitgedrukt door het ontworpen biosynthetic systeem. (A) GFP-E90DOPA was uitgedrukt door het ontworpen biosynthetic systeem in aanwezigheid van 10 mM catechol, pyruvaat van 100 mM en 25 mM ammoniak, en vervolgens gezuiverd door de chromatografie van de affiniteit van de Ni-NTA. GFP-WT was ook geanalyseerd voor vergelijking. De monsters werden gescheiden door Bis-Tris 4% - 12% SDS-pagina, en de gel was bevlekt met Coomassie briljant blauw R-250. (B) MALDI-TOF MS analyse van het fragment van de peptide bevattende DOPA uit de al vertering van GFP-E90DOPA. De peptide-fragment uit GFP-WT bevat de residuen 86-96 (SAMPEGYVQER). Het Glu in het fragment uit GFP-WT vervangen door DOPA in het peptide fragment uit GFP-E90DOPA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Vergelijking van een directe integratie van levende DOPA met een algemene genetische opneming van DOPA. Deze panelen weergeven GFP-E90DOPA uitgedrukt door het ontworpen biosynthetic systeem en de genetische opneming in de aanwezigheid van 3 mM DOPA zonder extra pyruvaat, ammoniak en catechol (A) de opbrengsten werden verkregen uit gezuiverde GFP-E90DOPA, en (B) de cel dichtheden waren gemeten bij 16 h na de inductie proteïne. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Reactie regeling van de bioconjugation van GFP-E90DOPA. GFP-E90DOPA wordt geoxideerd om te converteren van DOPA naar dopaquinone. De reactie van de dopaquinone-bevattende eiwitten met een gespannen alkyn behaalt site-specific eiwit labeling. Eiwit zelf Woordherkomst en-opbouw voor de productie van eiwitten oligomeren zorgt ervoor dat de incubatie van de dopaquinone-bevattende eiwitten met een hoge concentratie voor een lange tijd (48 uur). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Bioconjugation van mutant eiwitten bevattende DOPA. (A) SPOCQ reacties van een DOPA-bevattende eiwitten met een gespannen alkyn, ADIBO-Cy5.5. GFP-WT en GFP-E90DOPA werden behandeld met natrium Perjodaat en reageerde met ADIBO-Cy5.5 voor 60 min. De reacties werden geanalyseerd door SDS-pagina en Coomassie gebeitste (boven) en fluorescentie (onder) beelden worden getoond. (B) oligomerisatie van GFP-E90DOPA. De DOPA-bevattende GFP werd behandeld met natrium Perjodaat en gedurende 48 uur geïncubeerd. Het reactiemengsel werd geanalyseerd door SDS-PAGE. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit protocol, worden de biosynthese en directe opneming van DOPA beschreven. De bacteriële cel gebruikt bij deze methode kan een extra aminozuur te synthetiseren en gebruik het als een onnatuurlijke bouwsteen voor eiwitsynthese. De genetische opneming van onnatuurlijke aminozuren is een belangrijke technologie voor de ontwikkeling van onnatuurlijke organisme met een uitgebreide genetische code. Echter, deze methode heeft technisch onvolledig en is wordt gewijzigd om de efficiëntie van de opneming en minimaliseren van de verstoring naar endogene vertaalsystemen. Onlangs zijn aanzienlijke vooruitgang in de methode bereikt door het opnieuw toewijzen van codonen24,25 voor onnatuurlijke aminozuren en engineering orthogonale translationeel onderdelen26,27,28 ,29. Naast deze verbeteringen, biedt het systeem beschreven hier een ander vermogen aan een onnatuurlijke organisme met een uitgebreide genetische code: biosynthese van een onnatuurlijke aminozuur. Dit vermogen geeft de onnatuurlijke systeem meer onafhankelijkheid als een organisme met een uitgebreide genetische repertoire. Bovendien bevat de DOPA matige toxiciteit op de bacteriële stam gebruikt bij deze methode, en op 3 mM DOPA, celgroei aanzienlijk verminderd, wat in een laag eiwit opbrengst resulteerde. Met behulp van het directe opneming systeem, toxiciteit werd verminderd en eiwit opbrengst verdrievoudigd.

De jaarlijkse activiteitenverslagen van mutant gebruikt voor de genetische opneming van DOPA heeft gematigd efficiëntie en trouw en Tyr bevat met een lage concentratie van DOPA. 18 daarom, de biosynthese van DOPA in bacteriecellen moet efficiënt genoeg is om te voorkomen dat Tyr opneming. De biosynthese van de DOPA door TPL van catechol, ammoniak en pyruvaat is een reversibele reactie en hoge concentraties van de grondstoffen nodig zijn voor een efficiënte biosynthese. Nochtans, catechol niet worden gebruikt meer dan 10 mM want het is giftig voor de in dit protocol gebruikte bacteriële stam. De concentratie van DTT is ook belangrijk in dit protocol. DOPA toont de giftigheid wanneer het wordt omgezet in L-dopaquinone en DTT is toegevoegd in groeimedium om te verminderen de oxidatie-tarief. Toen de DTT concentratie meer dan 300 µM, zien we een afname van de celgroei. Dus, voor een optimale biosynthese en opneming van DOPA, de onderdelen (met name catechol en DTT) voor kweekmedium moeten worden gebruikt in de juiste concentraties zoals beschreven in dit protocol.

Dit protocol beschrijft ook toepassingen van DOPA-bevattende eiwitten voor site-specific eiwit-vervoeging. L-dopaquinone gegenereerd door de oxidatie van DOPA efficiënt reageert met een gespannen alkyn gekoppeld aan een biochemische sonde. Deze reactie cycloadditie is meestal sneller dan nucleofiele additie reacties door aminen of thiolen. Niettemin, de oxidatie van DOPA moet plaatsvinden in aanwezigheid van zowel een DOPA-bevattende eiwitten en een gespannen alkyn, tot een minimum beperken van de nucleofiele additie door nucleofiel in het eiwit. De volgorde van de toevoeging van de reagentia voor deze reactie is daarom van cruciaal belang.

Vele onnatuurlijke aminozuren zijn beschikbaar voor eiwit-vervoeging, en sommigen van hen bereiken een snelle reactiesnelheid en uitstekende vervoeging efficiëntie30,31,32,33. Deze aminozuren bevatten biorthogonal functionele groepen zoals aziden alkynen, gespannen alkenen of alkynen en tetrazines. Hoewel ze nuttig voor site-specific eiwit-vervoeging zijn, zijn velen van hen dure of commercieel ontoegankelijk zijn, die hun toepassingen, met name in die grote eiwitten beperkt. Daarom zal de biosynthese van DOPA van goedkope grondstoffen en zijn directe opneming voor farmaceutische en industriële toepassingen waarbij grootschalige mutant eiwitten bevattende een biochemische sonde of een drug (antilichaam-drug nuttig zijn conjugaat, ADC).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd gesteund door de Global Frontier Research Program (NRF-2015M3A6A8065833), en de fundamentele wetenschap Research Program (2018R1A6A1A03024940) door de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door de regering van Korea.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Plasmid Construction
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmid pEvol-DHPRS2 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).
DH10β Invitrogen C6400-03 Expression Host
Plasmid Mini-prep kit Nucleogen 5112 200/pack
Agarose Intron biotechnology 32034 500 g
Ethidium bromide Alfa Aesar L07482 1 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser  BIO-RAD 165-2100
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2089 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium Wako 018-10372 25 g
Chloramphenicol Alfa Aesar B20841 25 g
Agar SAMCHUN 214230 500 g
SOC medium Sigma S1797 100 mL
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
L(+)-Arabinose, 99% Acros 104981000 100 g
Pyrocatechol, 99% SAMCHUN P1387 25 g
Ammonium sulfate, 99% SAMCHUN A0943 500 g
pyruvic acid, 98% Alfa Aesar A13875 100 g
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% SAMCHUN S0891 1 kg
Potassium phophate, monobasic, 99% SAMCHUN P1127 1 kg
Magnesium sulfate, anhydrous, 99% SAMCHUN M0146 1 kg
D(+)-Glucose, anhydrous, 99% SAMCHUN D0092 500 g
Glycerol, 99% SAMCHUN G0269 1 kg
Trace metal mix a5 with co Sigma 92949 25 mL
L-Proline, 99% SAMCHUN P1257 25 g
L-Phenylalanine, 98.5% SAMCHUN P1982 25 g
L-Tryptophane JUNSEI 49550-0310 25 g
L-Arginine, 98% SAMCHUN A1149 25 g
L-Glutamine, 98% JUNSEI 27340-0310 25 g
L-Asparagine monohydrate, 99% SAMCHUN A1198 25 g
L-Methionine JUNSEI 73190-0410 25 g
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% SAMCHUN H0604 25 g
L-Threonine, 99% SAMCHUN T2938 25 g
L-Leucine JUNSEI 87070-0310 25 g
Glycine, 99% SAMCHUN G0286 25 g
L-Glutamic acid, 99% SAMCHUN G0233 25 g
L-Alanine, 99% SAMCHUN A1543 25 g
L-Isoleucine, 99% SAMCHUN I1049 25 g
L-Valine, 99% SAMCHUN V0088 25 g
L-Serine SAMCHUN S2447 25 g
L-Aspartic acid SAMCHUN A1205 25 g
L-Lysine monohydrochloride, 99% SAMCHUN L0592 25 g
3.2 Cell lysis
Imidazole, 99% SAMCHUN I0578 1kg
Sodium phosphate monobasic, 98% SAMCHUN S0919 1 kg
Sodium Chloride, 99% SAMCHUN S2907 1 kg
Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 milliliters SONIC & MATERIALS VCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 25 mL
Polypropylene column QIAGEN 34924 50/pack, 1 mL capacity
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA 
Sodium periodate, 99.8& Acros 419610050 5 g
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) 
Cy5.5-ADIBO  FutureChem FC-6119 1mg
6. Purification of Labeled GFP
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters MILLIPORE UFC500396 96/pack, 500ul capacity
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % Sigma 10708984001 10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X Thermofisher NP0007 10 mL
MES running buffer Thermofisher NP0002 500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels Thermofisher NO0321 12 well
Coomassie Brilliant Blue R-250 Wako 031-17922 25 g
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System Syngene G BOX Chemi XT4
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% SAMCHUN T1351 500 g
Hydrochloric acid, 35~37% SAMCHUN H0256 500 mL
Dodecyl sulfate sodium salt, 85% SAMCHUN D1070 250 g
Iodoacetamide Sigma I6125 5 g
Trypsin Protease, MS Grade Thermofisher 90057 5 x 20 µg/pack
C-18 spin columns Thermofisher 89870 25/pack, 200 µL capacity
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF
Acetonitirile, 99.5% SAMCHUN A0125 500 mL
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma C2020 10 g
Trifluoroacetic acid, 99% SAMCHUN T1666 100 g
MTP 384 target plate ground steel BC targets Bruker 8280784
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer Bruker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagatsu, T., Levitt, M., Udenfriend, S. Tyrosine hydroxylase: The initial step in norepinephrine biosynthesis. Journal of Biological Chemistry. 239, 2910-2917 (1964).
  2. Pinder, R. M. Possible dopamine derivatives capable of crossing the blood-brain barrier in relation to parkinsonism. Nature. 228 (5269), 358 (1970).
  3. Waite, J. H., Tanzer, M. L. Polyphenolic substance of mytilus edulis: novel adhesive containing L-DOPA and hydroxyproline. Science. 212 (4498), 1038-1040 (1981).
  4. Lee, H., Scherer, N. F., Messersmith, P. B. Single-molecule mechanics of mussel adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 12999-13003 (2006).
  5. Papov, V. V., Diamond, T. V., Biemann, K., Waite, J. H. Hydroxyarginine-containing polyphenolic proteins in the adhesive plaques of the marine mussel Mytilus edulis. Journal of Biological Chemistry. 270 (34), 20183-20192 (1995).
  6. Waite, J. H., Qin, X. Polyphosphoprotein from the adhesive pads of Mytilus edulis. Biochemistry. 40 (9), 2887-2893 (2001).
  7. Nicklisch, S. C., Waite, J. H. Mini-review: The role of redox in DOPA-mediated marine adhesion. Biofouling. 28 (8), 865-877 (2012).
  8. Silverman, H. G., Roberto, F. Understanding marine mussel adhesion. Marine Biotechnology. 9 (6), 661-681 (2007).
  9. Lee, B. P., Messersmith, P. B., Israelachvili, J. N., Waite, J. H. Mussel-inspired adhesives and coatings. Annual Review of Materials Research. 41, 99-132 (2011).
  10. Umeda, A., Thibodeux, G. N., Zhu, J., Lee, Y., Zhang, Z. J. Site-specific protein cross-linking with genetically incorporated 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine. ChemBioChem. 10 (8), 1302-1304 (2009).
  11. Umeda, A., Thibodeux, G. N., Moncivais, K., Jiang, F., Zhang, Z. J. A versatile approach to transform low-affinity peptides into protein probes with cotranslationally expressed chemical cross-linker. Analytical Biochemistry. 405 (1), 82-88 (2010).
  12. Xu, J., Tack, D., Hughes, R. A., Ellington, A. D., Gray, J. J. Structure-based non-canonical amino acid design to covalently crosslink an antibody-antigen complex. Journal of Structural Biology. 185 (2), 215-222 (2014).
  13. Burdine, L., Gillette, T. G., Lin, H. J., Kodadek, T. Periodate-triggered cross-linking of DOPA-containing peptide-protein complexes. Journal of the American Chemical Society. 126 (37), 11442-11443 (2004).
  14. Borrmann, E., et al. Strain-promoted oxidation-controlled cyclooctyne-1,2-quinone cycloaddition (SPOCQ) for fast and activatable protein conjugation. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 257-261 (2015).
  15. Ayyadurai, N., et al. Development of a selective, sensitive, and reversible biosensor by the genetic incorporation of a metal-binding site into green fluorescent protein. Angewandte Chemie International Edition. 50 (29), 6534-6537 (2011).
  16. Kim, B. J., Cheong, H., Hwang, B. H., Cha, H. J. Mussel-inspired protein nanoparticles containing iron(III)-DOPA complexes for pH-responsive drug delivery. Angewandte Chemie International Edition. 54 (25), 7318-7322 (2015).
  17. Alfonta, L., Zhang, Z., Uryu, S., Loo, J. A., Schultz, P. G. Site-specific incorporation of a redox-active amino acid into proteins. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14662-14663 (2003).
  18. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chemical Communications. 54 (24), 3002-3005 (2018).
  19. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
  20. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).
  21. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  22. Jang, S., Sachin, K., Lee, H. J., Kim, D. W., Lee, H. S. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2256-2261 (2012).
  23. Gobom, J., et al. Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid affinity sample preparation. A protocol for MALDI-MS peptide analysis in proteomics. Analytical Chemistry. 73 (3), 434-438 (2001).
  24. Mukai, T., et al. Highly reproductive Escherichia coli cells with no specific assignment to the UAG codon. Scientific Reports. 5, 9699 (2015).
  25. Lajoie, M. J., et al. Genomically recoded organisms expand biological functions. Science. 342 (6156), 357-360 (2013).
  26. Bryson, D. I., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases. Nature Chemical Biology. 13 (12), 1253-1260 (2017).
  27. Guo, J., Melancon, C. E., Lee, H. S., Groff, D., Schultz, P. G. Evolution of amber suppressor tRNAs for efficient bacterial production of proteins containing nonnatural amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 48 (48), 9148-9151 (2009).
  28. Lee, S., et al. A facile strategy for selective phosphoserine incorporation in histones. Angewandte Chemie International Edition. 52 (22), 5771-5775 (2013).
  29. Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M., Chin, J. W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature. 464 (7287), 441-444 (2010).
  30. Lang, K., Chin, J. W. Bioorthogonal reactions for labeling proteins. ACS Chemical Biology. 9 (1), 16-20 (2014).
  31. Lang, K., Chin, J. W. Cellular Incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  32. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angewandte Chemie International Edition. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  33. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. Journal of the American Chemical Society. 134 (6), 2898-2901 (2012).

Tags

Biochemie kwestie 138 DOPA genetische opneming biosynthese tyrosine fenol-lyase eiwit-vervoeging stam-bevorderd oxidatie-gecontroleerde cyclooctyne-1,2-Chinon (SPOCQ) cycloadditie
Genetische opneming van levende L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) en de toepassing ervan op eiwit Woordherkomst en-opbouw
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, S., Lee, H. S. Genetic… More

Kim, S., Lee, H. S. Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation. J. Vis. Exp. (138), e58383, doi:10.3791/58383 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter