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Biochemistry

Genetiche incorporazione di Biosynthesized L-diidrossifenilalanina (DOPA) e la sua applicazione alla proteina coniugazione

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58383
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, Sogang University

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per la costituzione genetica di L-diidrossifenilalanina biosynthesized da semplici materiali di partenza e la sua applicazione alla coniugazione di proteina.

Abstract

L-diidrossifenilalanina (DOPA) è un aminoacido presente nella biosintesi delle catecolamine in animali e piante. Grazie alle sue particolari proprietà biochimiche, l'amminoacido ha molteplici usi in applicazioni biochimiche. Questo rapporto descrive un protocollo per la costituzione genetica di biosynthesized DOPA e sua applicazione alla coniugazione di proteina. DOPA biosynthesized da una tirosina fenolo-liasi (TPL) da catecolo, piruvato e ammoniaca, e l'aminoacido è direttamente incorporato nelle proteine con il metodo di incorporazione genetico utilizza un'evoluta amminoacil-tRNA e coppia di aminoacyl-tRNA sintetasi. Questo sistema di incorporazione diretta in modo efficiente incorpora DOPA con piccolo incorporazione di altri amminoacidi naturali e con migliore rendimento di proteine rispetto al precedente sistema di costituzione genetica per DOPA. Coniugazione di proteine con proteine contenenti DOPA è efficiente e site-specific e dimostra la sua utilità per varie applicazioni. Questo protocollo fornisce agli scienziati di proteina con procedure dettagliate per la biosintesi efficiente delle proteine mutanti contenenti DOPA nei siti desiderati e loro coniugazione per applicazioni industriali e farmaceutiche.

Introduction

DOPA è un aminoacido coinvolto nella biosintesi delle catecolamine in animali e piante. Questo aminoacido è sintetizzato da Tyr idrossilasi della tirosina e ossigeno molecolare (O2)1. Perché DOPA è un precursore della dopamina e può permeare la barriera emato - encefalica, è stato utilizzato nel trattamento della malattia di Parkinson2. DOPA si trova anche in proteine di adesione di cozza (mappe), che sono responsabili per le proprietà adesive di cozze in condizioni di bagnato3,4,5,6,7. Tyr è inizialmente codificato nelle posizioni dove DOPA si trova nelle mappe e viene quindi convertito in DOPA da tirosinasi8,9. Grazie alle sue interessanti proprietà biochimiche, DOPA è stato utilizzato in una varietà di applicazioni. Il gruppo di dihydroxyl della DOPA è chimicamente incline all'ossidazione e l'aminoacido è facilmente convertito in L-dopachinone, un precursore di melanine. A causa della sua elevata electrophilicity, L-dopaquinone e suoi derivati sono stati utilizzati per la reticolazione e la coniugazione con tioli e ammine10,11,12,13. 1,2-chinoni possono anche funzionare come un diene per reazioni di cicloaddizione e sono stati utilizzati per bioconjugation dal ceppo-promosso ossidazione controllata cyclooctyne-1,2-chinone (SPOCQ) cicloaddizione14. Inoltre, il gruppo di dihydroxyl possa chelare ioni metallici come Fe3 + e Cu2 +, e proteine contenenti DOPA sono stati utilizzati per la consegna della droga e dello ione del metallo rilevamento15,16.

DOPA è stato incorporato nelle proteine utilizzando un ortogonale aminoacyl-tRNA (aa-tRNA) e amminoacil-tRNA sintetasi (aaRS) coppia17 geneticamente e utilizzato per proteina coniugazione e reticolazione10,11, 12,13. In questo rapporto, i risultati sperimentali e protocolli per la costituzione genetica di DOPA biosynthesized da materie prime a buon mercato e le sue applicazioni per bioconjugation sono descritti. DOPA biosynthesized utilizzando un TPL e a partire da catecolo, piruvato e ammoniaca in Escherichia coli. Biosynthesized DOPA è direttamente incorporato nelle proteine esprimendo una coppia di aa-tRNA e aaRS evoluta per DOPA. Inoltre, la proteina biosynthesized contenenti DOPA site-specifically è coniugata con una sonda fluorescente e reticolati per produrre oligomeri di proteina. Questo protocollo sarà utile per gli scienziati di proteina, di provitamina proteine mutanti contenenti DOPA e coniugato le proteine con sonde biochimici o farmaci per applicazioni industriali e farmaceutiche.

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Protocol

1. plasmide costruzione

  1. Costruire un plasmide di espressione (pBAD-dual-TPL-GFP-WT) che esprime il gene TPL dal freundii del citrobatterio sotto il controllo di un promotore costitutivo e il gene della proteina fluorescente verde (GFP) con un suo6-tag sotto il controllo della promotore araBAD. Per pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG, sostituire il codone per il sito (E90) di DOPA con un codone ambrato (TAG), utilizzando un protocollo di mutagenesi sito-diretta. I dettagli per la costruzione di questo plasmide è stato descritto nella nostra precedente relazione18.
  2. Costruire un tRNA/aaRS-esprimendo plasmide (pEVOL-DHPRS2)18,19 per la costituzione genetica di DOPA. pEVOL è un vettore plasmidico speciale esprimendo due copie dei geni aaRS con promotori indipendenti, e le informazioni dettagliate del plasmide sono descritto in una precedente relazione19.
  3. Utilizzare kit di preparazione del plasmide commercialmente disponibile per ottenere elevata purezza del plasmide DNAs. Verificare la purezza del DNAs preparata utilizzando l'elettroforesi del gel dell'agarosi, se necessario.

2. cultura preparazione

  1. Elettroporazione
    1. Uso electro-competenti DH10β ceppo di e. coli per questo esperimento. Aggiungere 1 µ l di ogni plasmide DNA (pEVOL-DHPRS2 e pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG) a 20 µ l di cellule competenti. Mescolare delicatamente per ottenere un impasto omogeneo, utilizzando una pipetta.
    2. Trasferire il composto nella cuvette di elettroporazione. Disponga la provetta nella camera di elettroporazione. Spinge la cuvetta nella camera di fare impresa cuvette-camera contattare.
    3. La cuvetta, utilizzando 25 µF di scossa e 2,5 kV per le provette 0,1 cm.
    4. Aggiungere 1 mL di brodo super ottima preriscaldata (SOC), contenente il 2% (p/v) tryptone, 0,5% (p/v) di lievito estratto, 10 millimetri di NaCl, 2.5 mM KCl, 10mm MgCl2e 20 millimetri di glucosio, per la provetta e trasferire le cellule in una provetta di cultura. Salvare le cellule di incubarle per 1h a 37 ° C con agitazione.
    5. Diffusione di 10-100 µ l delle cellule hanno salvate su una piastra di agar di brodo (LB) di Lisogenesi contenenti cloramfenicolo di 35 µ g/mL e 100 µ g/mL ampicillina. Incubare le cellule a 37 ° C per 16 h.
  2. Preparazione di cultura Starter
    1. Inoculare una singola Colonia trasformata in 5 mL di terreno LB contenenti antibiotici. Incubare la Colonia per 12 h a 37 ° C con agitazione.

3. espressione e purificazione di GFP-E90DOPA da un sistema biosintetico

  1. Espressione della GFP-E90DOPA da un sistema biosintetico
    1. Trasferire la coltura starter (2 mL) per 100 mL di PA-5052 medio20 (Na2HPO4, 50mm KH2PO4, 25mm [NH4]2così4, 2mm MgSO4, 0,1% [p/v] risalire metalli, glicerolo 0,5% [p/v], 0.05% [p/v] glucosio e aminoacidi 5% [p/v] [pH 7,25]) contenente 35 cloramfenicolo µ g/mL, 100 µ g/mL ampicillina, piruvato di 100mm, catecolo 10mm, ammoniaca 25 mM e 300 µM ditiotreitolo (DTT) seguita da un'incubazione a 30 ° C con agitazione.
    2. Aggiungere 2 mL di 0,2% (w/v) L-arabinosio quando la densità ottica (OD) a 550 nm raggiunge 0,8. Incubare il campione per 12 ore a 30 ° C con agitazione.
    3. Rotazione verso il basso le cellule a 11.000 x g per 5 min, scartare il surnatante e congelare il pellet cellulare a-80 ° C.
  2. Lisi delle cellule
    1. Scongelare il pellet cellulare sul ghiaccio e risospendere le cellule in 10 mL di tampone di lisi contenente 50 mM NaH2PO4 (pH 8.0), imidazolo di 10 mM e 300 mM NaCl.
    2. Sottoporre ad ultrasuoni le cellule sedimento in ghiaccio per 10 min ampiezza di sonicazione 80% uso con un impulso di 25 s s on e 35 fuori.
    3. Rotazione verso il basso il lysate a 18.000 x g a 4 ° C per 15 min. trasferimento del surnatante in una nuova provetta per la purificazione delle cellule e scartare il pellet.
  3. Cromatografia di affinità NI-NTA
    1. Aggiungere la Ni-NTA (acido nitrilotriacetico) resina (300 µ l della sospensione di resina per una cultura di 100 mL) al supernatante e legano le proteine alla resina Ni-NTA a 4 ° C agitando delicatamente la sospensione per 1 h.
    2. Trasferire la sospensione in una colonna in polipropilene e lavare la resina 3 x con 5 mL di tampone di lavaggio contenente 50 mM NaH2PO4 (pH 8.0), imidazolo di 20 mM e 300 mM NaCl.
    3. Eluire le proteine 3 x con 300 µ l di tampone di eluizione contenente 50 mM NaH2PO4 (pH 8.0), imidazolo di 250 mM e 300 mM NaCl.
    4. Determinare la concentrazione di proteina misurando l'assorbanza a 280 nm. Il coefficiente di estinzione (24.630 M-1cm-1) per GFP-E90DOPA a 280 nm è stata calcolata una calcolatrice di coefficiente di estinzione della proteina (ad esempio, https://web.expasy.org/protparam/) e l'estinzione misurata in modo indipendente coefficiennt (2630 M-1cm-1) per DOPA. Come metodo alternativo, utilizzare il dosaggio proteina di Bradford21 per una determinazione della concentrazione proteica.

4. oligomerizzazione di purificato GFP-E90DOPA

  1. Aggiungere 1 µ l di Sodio Metaperiodato in H2O (6 mM) (1.0 equiv. a GFP-E90DOPA) ad una soluzione di 20 µ l di GFP-E90DOPA (300 µM) in un tampone fosfato 50 mM Na2HPO4 (pH 8.0) e 300 mM NaCl.
  2. Consentire la reazione di oligomerizzazione di procedere a 25 ° C per 48 h.
  3. Analizzare la miscela di reazione di elettroforesi dodecilica del gel del solfato-poliacrilammide di sodio) (SDS-PAGE), come descritto nel passaggio 6.

5. coniugazione del GFP-E90DOPA con una sonda di alchini di SPOCQ

  1. Aggiungere 1 µ l di azadibenzocyclooctyne CY 5.5-collegato (CY 5.5-ADIBO)22 in H2O (4,0 mM) (10 equiv. a GFP-E90DOPA) ad una soluzione di 20 µ l di GFP-E90DOPA (20 µM) in un tampone fosfato 50 mM Na2HPO4 (pH 8.0) e 300 mM NaCl.
  2. Aggiungere 1 µ l di Sodio Metaperiodato in H2O (400 µM) (1.0 equiv. a GFP-E90DOPA) alla miscela di reazione.
  3. Consentire la reazione di SPOCQ di procedere a 25 ° C per 1 h. Se viene utilizzata una sonda sensibile alla luce, coprire il recipiente di reazione con carta stagnola.

6. purificazione della GFP con etichetta

  1. Diluire la miscela di reazione SPOCQ aggiungendo un tampone fosfato, contenente 50 mM Na2HPO4 (pH 8.0) e 300 mM NaCl, fino a 500 µ l.
  2. Trasferire la soluzione diluita a una colonna di spin di filtro centrifugo. Centrifugare la colonna di spin a 14.000 x g a 4 ° C per 15 min e gettare il flusso continuo. Ripetere questo passaggio 3 x al fine di rimuovere qualsiasi eccesso CY 5.5-ADIBO.
  3. Trasferire il campione purificato dalla colonna spin ad un tubo per microcentrifuga da 1,5 mL.
  4. In alternativa, eseguire una purificazione mediante dialisi contro lo stesso buffer.
  5. Memorizzare la GFP purificata a 4 ° C.

7. fluorescenza e analisi SDS-PAGE Gel scansione

  1. Preparare i campioni della proteina per analisi SDS-PAGE aggiungendo 5 µ l di tampone di proteina (Vedi Tabella materiali) e 2 µ l di DTT (1,00 M) a 13 µ l di purificato, o grezza, etichettato GFP (13,6 µM o 0,38 mg/mL). Per un'analisi di GFP oligomerici, utilizzare una maggiore concentrazione di GFP (67,8 µM o 1,9 mg/mL). Denaturare le proteine di incubarle a 95 ° C per 10 min.
  2. Mettere un vassoio del 4% - 12% Bis-Tris SDS-PAGE gel (gel acquistati, premade cassette) alla cella di elettroforesi e aggiungere un buffer in esecuzione (Vedi Tabella materiali). Caricare i campioni della proteina e un marcatore di peso molecolare. Eseguire l'elettroforesi per 35-40 min a 200 V.
    Nota: Evitare l'esposizione dei campioni proteici alla luce da svolgere tutti i processi al buio, per ridurre al minimo lo sbiancamento foto della sonda fluorescente.
  3. Utilizzare uno scanner di fluorescenza per l'imaging di fluorescenza. Avvolgere un gel di proteina da elettroforesi e metterlo su uno scanner di fluorescenza. Scansione il gel utilizzando un'impostazione di lunghezza d'onda appropriata. Per CY 5.5, selezionare la modalità di Cy5 fornita nel software dello scanner.
  4. Macchia il gel con una proteina commerciale colorazione reagente.

8. MALDI-TOF MS analisi di digestione della tripsina

  1. Incubare 100 µ l di purificato GFP-E90DOPA (2,2 mg/mL o 80 µM) in un tampone contenente 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0,1% (p/v) SDS e 25 mM DTT a 60 ° C per 1 h.
  2. Aggiungere 1 µ l di Iodoacetamide in H2O (IAA, 4.0 M) (500 equiv. a GFP-E90DOPA) alla soluzione di GFP-E90DOPA purificata (80 µM) nello stesso buffer. Incubare la miscela a 25 ° C per 30 min con protezione dalla luce.
  3. Digerire il campione di GFP-E90DOPA con l'aggiunta di tripsina (rapporto di 1: 100 della proteasi della proteina substrato [w/w]) e incubare a 37 ° C per 4 h, la miscela di reazione.
  4. Purificare il campione digerito peptide utilizzando un metodo standard di dissalazione con C18 colonne di spin.
  5. Analizzare i peptidi digeriti dal protocollo segnalato per matrix-assisted laser desorbimento/ionizzazione time-of-flight spettrometria di massa (MALDI-TOF MS) utilizzando acido alfa-ciano-4-idrossicinnamico (CHCA) come una matrice23.

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Representative Results

Il sistema di espressione per l'incorporazione diretta di DOPA biosynthesized da un TPL è illustrato nella Figura 1. I geni per la coppia di aa-tRNA e aaRS evoluto sono collocati in un plasmide, e il gene GFP (GFP-E90TAG) contenenti un codone ambrato alla posizione 90 si trova in un altro plasmide per valutare l'incorporazione di DOPA di fluorescenza di GFP. Il gene TPL è collocato nel plasmide stessa espressione che contiene il gene GFP e costitutivamente espresso per massimizzare la resa della biosintesi della DOPA. Utilizzando questo sistema di espressione, le condizioni ottimali per la biosintesi DOPA sono state schermate. Il media di crescita utilizzati per questo esperimento contenuta 25mm ammoniaca e piruvato di 100 mM, con concentrazioni variabili di catecolo (0 - 10 mM). La concentrazione di catecolo è stato fondamentale per la biosintesi DOPA, mentre le concentrazioni di ammoniaca e piruvato oltre 25 mM e 100 mM, rispettivamente, non ha colpito la biosintesi e l'incorporazione della DOPA. La concentrazione ottima di catecolo era 10 mM, e una concentrazione di oltre 10 mM ha fatto diminuire significativamente la crescita della cellula batterica a causa sua citotossicità. In questa condizione ottima, DOPA era biosynthesized da TPL da suoi materiali di partenza e il biosynthesized che dopa fu direttamente incorporata di GFP. Il mutante espresso GFP (GFP-E90DOPA) è stato purificato e analizzato da SDS-PAGE (Figura 2A). Il full-length GFP è stata purificata, e l'incorporazione di DOPA è stata confermata da analisi MALDI-TOF MS (Figura 2B). La proteina è digerita con tripsina, il frammento del peptide contenente DOPA è stato analizzato e il risultato ha dimostrato l'incorporazione esclusiva di DOPA con nessun rilevabile Tyr o altri incorporazione di aminoacido naturale. L'efficienza di incorporazione della DOPA biosynthesized da TPL era simile all'efficienza di incorporazione con 3 mM DOPA, che è la concentrazione massima di DOPA a causa sua citotossicità19. Anche se catecolo 10 mM hanno mostrato tossicità moderata, la densità delle cellule dopo 16 ore di tempo della coltura era tre-quattro volte più elevati di quanto in presenza di 3 mM DOPA. La resa di proteina purificata dalla biosintesi era tre volte superiore a quello dell'esperimento utilizzando 3 mM DOPA (Figura 3).

Il mutante GFP contenenti DOPA è stato usato per coniugazione della proteina. DOPA può essere ossidata in L-dopachinone dagli ossidanti miti, e il chinone elettrofila reagisce con alchini sforzate e nucleofili, quali i tioli e ammine e può essere utilizzato per bioconjugation (Figura 4). GFP-E90DOPA è stato testato per cicloaddizione SPOCQ reagendo con Sodio Metaperiodato, seguita da un trattamento con Cy 5.5-ADIBO22. Questa reazione SPOCQ è stata analizzata da SDS-PAGE e fluorescenza imaging (Figura 5A). La band di fluorescenza intensa è stata osservata con un trattamento di Sodio Metaperiodato e CY 5.5-ADIBO, mentre nessuna fascia di fluorescenza è stata mostrata in reazioni di controllo con GFP-WT o senza un Sodio Metaperiodato trattamento, confermando l'efficienza e la specificità della reazione di coniugazione con la DOPA geneticamente incorporato. Inoltre, la GFP contenenti DOPA è stata utilizzata per oligomerizzazione di proteina. L-dopachinone reagisce con Lys o Cys della proteina stessa, con conseguente proteine oligomeriche. GFP-E90DOPA è stato curato con Periodato di sodio e l'oligomerizzazione è stato effettuato per 48 h, e la reazione è stata analizzata da SDS-PAGE in confronto con un campione di controllo senza un Sodio Metaperiodato trattamento (Figura 5B). L'analisi ha mostrato un modello di oligomerizzazione chiaro con bande proteiche equidistanti per l'esempio periodate-trattati, mentre il campione di controllo ha mostrato la proteina intatta senza qualsiasi altre band.

Figure 1
Figura 1 : Diretto incorporazione di DOPA biosynthesized da catecolo, piruvato e ammoniaca. DOPA è biosynthesized da TPL heterologously espressi da catecolo, piruvato e ammoniaca nel mezzo di crescita. La coppia di tRNA/aaRS evoluta per DOPA è co-espressa per incorporare il biosynthesized DOPA la proteina bersaglio, GFP. Il gene TPL è stato disposto sotto un promotore costitutivo al fine di avviare la biosintesi DOPA prima di indurre l'espressione di GFP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Analisi SDS-PAGE e MALDI-TOF MS di GFP-E90DOPA espresso dal sistema progettato biosintetico. (A) GFP-E90DOPA è stato espresso dal sistema biosintetico progettato in presenza di catecolo 10 mM, 100 mM piruvato e ammoniaca 25 mM e quindi purificato mediante cromatografia di affinità Ni-NTA. GFP-WT inoltre è stata analizzata per il confronto. I campioni sono stati separati da Bis-Tris 4% - 12% SDS-PAGE, e il gel è stato colorato con Coomassie Brilliant Blue R-250. (B) analisi MALDI-TOF MS del frammento del peptide contenente DOPA dalla digestione trittica di GFP-E90DOPA. Il frammento del peptide da GFP-WT contiene i residui 86-96 (SAMPEGYVQER). Il Glu nel frammento da GFP-WT viene sostituito con DOPA nel frammento del peptide da GFP-E90DOPA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Confronto tra un'incorporazione diretta di biosynthesized DOPA con un'incorporazione di genetica generale di DOPA. Questi pannelli mostrano GFP-E90DOPA espresso dal sistema biosintetico progettato e l'incorporazione di genetica in presenza di 3 mM DOPA senza ulteriore piruvato, ammoniaca e catecolo. (A) la proteina rendimenti sono stati ottenuti da purificato GFP-E90DOPA e (B) la densità delle cellule sono stati misurati a 16 h dopo l'induzione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Schema di reazione di bioconjugation di GFP-E90DOPA. GFP-E90DOPA è ossidato per convertire DOPA in Dopachinone. La reazione della proteina contenente dopachinone con un alchino sforzata raggiunge il contrassegno della proteina site-specific. L'incubazione della proteina contenente dopachinone ad un'alta concentrazione per lungo tempo (48 ore) provoca il auto-coniugazione proteina per produrre oligomeri di proteina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Bioconjugation di proteine mutanti contenenti DOPA. (A) SPOCQ reazioni di una proteina con un alchino sforzata, ADIBO-CY 5.5 DOPA-contenente. GFP-WT e GFP-E90DOPA sono stati trattati con Sodio Metaperiodato e ha reagito con ADIBO-CY 5.5 per 60 min. Le reazioni sono state analizzate da SDS-PAGE e macchiato di Coomassie (in alto) e vengono mostrate immagini di fluorescenza (in basso). (B) oligomerizzazione di GFP-E90DOPA. La GFP contenenti DOPA è stata trattata con Sodio Metaperiodato e incubati per 48 h. La miscela di reazione è stata analizzata da SDS-PAGE. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

In questo protocollo, la biosintesi e l'incorporazione diretta della DOPA sono descritti. La cellula batterica utilizzata in questo metodo può sintetizzare un aminoacido ulteriore e usarlo come un innaturale building block per la sintesi proteica. La costituzione genetica di amminoacidi non naturali è stata una tecnologia chiave per lo sviluppo dell'organismo innaturale con un codice genetico espanso. Tuttavia, questo metodo è stato tecnicamente incompleto e viene modificato per migliorare l'efficienza di incorporazione e minimizzare i perturbazione a sistemi di traduzione endogeno. Recentemente, sono stati raggiunti significativi progressi nel metodo riassegnando i codoni24,25 per amminoacidi non naturali e ingegneria componenti ortogonali traslazionale26,27,28 ,29. Oltre a questi miglioramenti, il sistema descritto qui offre un'altra funzionalità ad un organismo innaturale con un codice genetico espanso: biosintesi di un amminoacido innaturale. Questa funzionalità offre il sistema innaturale maggiore indipendenza come un organismo con un esteso repertorio genetico. Inoltre, DOPA presenta una moderata tossicità sul ceppo batterico utilizzato in questo metodo e a 3 mM DOPA, la crescita delle cellule significativamente ridotta, che ha provocato la resa povera in proteine. Utilizzando il sistema di incorporazione diretta, è stata ridotta tossicità e resa proteica è triplicato.

Il mutante aaRS utilizzato per la costituzione genetica di DOPA ha fedeltà ed efficienza moderata e incorpora Tyr ad una concentrazione bassa di DOPA. 18 pertanto, la biosintesi del DOPA in cellule batteriche deve essere abbastanza efficace per prevenire l'incorporazione di Tyr. La biosintesi DOPA di TPL da catecolo, ammoniaca e piruvato è una reazione reversibile, e le alte concentrazioni di materiali di partenza sono necessari per un efficiente biosintesi. Tuttavia, catecolo non può essere utilizzato oltre 10 mM perché è tossico per il ceppo batterico utilizzato nel presente protocollo. La concentrazione di DTT è anche importante in questo protocollo. DOPA Mostra la sua tossicità quando viene convertito in L-dopachinone e DTT viene aggiunto nel terreno di crescita per ridurre il tasso di ossidazione. Abbiamo osservato una diminuzione nella crescita delle cellule quando la concentrazione di DTT era oltre 300 µM. Di conseguenza, per un'ottimale biosintesi e l'incorporazione di DOPA, i componenti (soprattutto catecolo e DTT) per mezzo di coltura dovrebbero essere utilizzati in concentrazioni appropriate come descritto in questo protocollo.

Questo protocollo descrive anche applicazioni di proteine contenenti DOPA per coniugazione di proteina site-specific. L-dopachinone generato dall'ossidazione del DOPA in modo efficiente reagisce con un alchino sforzata collegato ad una sonda biochimica. Questa reazione di cicloaddizione è solitamente più veloce di reazioni di addizione nucleofila di ammine o tioli. Tuttavia, l'ossidazione del DOPA dovrebbe essere effettuata in presenza di una proteina di DOPA-contenente sia un alchino sforzata, per minimizzare l'addizione nucleofila di nucleofili nella proteina. Pertanto, l'ordine di aggiunta dei reagenti per questa reazione è fondamentale.

Molti amminoacidi non naturali sono disponibili per la coniugazione di proteina, e alcuni di loro raggiungere un tasso di reazione veloce e coniugazione eccellente efficienza30,31,32,33. Questi aminoacidi contengono gruppi funzionali biortogonali come azoturi, alchini, sforzate alcheni o alchini e tetrazine. Anche se sono utili per coniugazione di proteina site-specific, molti di loro sono costosi o commercialmente inaccessibile, che limita le loro applicazioni, specialmente in quelli che richiedono di proteine su larga scala. Di conseguenza, la biosintesi della DOPA da materie prime a buon mercato e la sua incorporazione diretta sarà utile per applicazioni industriali e farmaceutiche che richiedono grandi proteine mutanti contenenti una sonda biochimica o un farmaco (anticorpo-farmaco coniugato, ADC).

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca di frontiera internazionale (NRF-2015M3A6A8065833), e programma di ricerca scienza base (2018R1A6A1A03024940) attraverso National Research Foundation di Corea (NRF) finanziato dal governo della Corea.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Plasmid Construction
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmid pEvol-DHPRS2 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).
DH10β Invitrogen C6400-03 Expression Host
Plasmid Mini-prep kit Nucleogen 5112 200/pack
Agarose Intron biotechnology 32034 500 g
Ethidium bromide Alfa Aesar L07482 1 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser  BIO-RAD 165-2100
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2089 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium Wako 018-10372 25 g
Chloramphenicol Alfa Aesar B20841 25 g
Agar SAMCHUN 214230 500 g
SOC medium Sigma S1797 100 mL
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
L(+)-Arabinose, 99% Acros 104981000 100 g
Pyrocatechol, 99% SAMCHUN P1387 25 g
Ammonium sulfate, 99% SAMCHUN A0943 500 g
pyruvic acid, 98% Alfa Aesar A13875 100 g
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% SAMCHUN S0891 1 kg
Potassium phophate, monobasic, 99% SAMCHUN P1127 1 kg
Magnesium sulfate, anhydrous, 99% SAMCHUN M0146 1 kg
D(+)-Glucose, anhydrous, 99% SAMCHUN D0092 500 g
Glycerol, 99% SAMCHUN G0269 1 kg
Trace metal mix a5 with co Sigma 92949 25 mL
L-Proline, 99% SAMCHUN P1257 25 g
L-Phenylalanine, 98.5% SAMCHUN P1982 25 g
L-Tryptophane JUNSEI 49550-0310 25 g
L-Arginine, 98% SAMCHUN A1149 25 g
L-Glutamine, 98% JUNSEI 27340-0310 25 g
L-Asparagine monohydrate, 99% SAMCHUN A1198 25 g
L-Methionine JUNSEI 73190-0410 25 g
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% SAMCHUN H0604 25 g
L-Threonine, 99% SAMCHUN T2938 25 g
L-Leucine JUNSEI 87070-0310 25 g
Glycine, 99% SAMCHUN G0286 25 g
L-Glutamic acid, 99% SAMCHUN G0233 25 g
L-Alanine, 99% SAMCHUN A1543 25 g
L-Isoleucine, 99% SAMCHUN I1049 25 g
L-Valine, 99% SAMCHUN V0088 25 g
L-Serine SAMCHUN S2447 25 g
L-Aspartic acid SAMCHUN A1205 25 g
L-Lysine monohydrochloride, 99% SAMCHUN L0592 25 g
3.2 Cell lysis
Imidazole, 99% SAMCHUN I0578 1kg
Sodium phosphate monobasic, 98% SAMCHUN S0919 1 kg
Sodium Chloride, 99% SAMCHUN S2907 1 kg
Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 milliliters SONIC & MATERIALS VCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 25 mL
Polypropylene column QIAGEN 34924 50/pack, 1 mL capacity
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA 
Sodium periodate, 99.8& Acros 419610050 5 g
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) 
Cy5.5-ADIBO  FutureChem FC-6119 1mg
6. Purification of Labeled GFP
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters MILLIPORE UFC500396 96/pack, 500ul capacity
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % Sigma 10708984001 10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X Thermofisher NP0007 10 mL
MES running buffer Thermofisher NP0002 500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels Thermofisher NO0321 12 well
Coomassie Brilliant Blue R-250 Wako 031-17922 25 g
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System Syngene G BOX Chemi XT4
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% SAMCHUN T1351 500 g
Hydrochloric acid, 35~37% SAMCHUN H0256 500 mL
Dodecyl sulfate sodium salt, 85% SAMCHUN D1070 250 g
Iodoacetamide Sigma I6125 5 g
Trypsin Protease, MS Grade Thermofisher 90057 5 x 20 µg/pack
C-18 spin columns Thermofisher 89870 25/pack, 200 µL capacity
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF
Acetonitirile, 99.5% SAMCHUN A0125 500 mL
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma C2020 10 g
Trifluoroacetic acid, 99% SAMCHUN T1666 100 g
MTP 384 target plate ground steel BC targets Bruker 8280784
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer Bruker

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References

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Biochimica problema 138 DOPA costituzione genetica biosintesi tirosina fenolo-liasi coniugazione di proteina cicloaddizione ceppo-promosso ossidazione controllata cyclooctyne-1,2-chinone (SPOCQ)
Genetiche incorporazione di Biosynthesized L-diidrossifenilalanina (DOPA) e la sua applicazione alla proteina coniugazione
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Kim, S., Lee, H. S. Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation. J. Vis. Exp. (138), e58383, doi:10.3791/58383 (2018).

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