Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Genetisk innlemmelse av Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) og sin søknad til Protein Bøyning

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58383
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, Sogang University

Summary

Her presenterer vi en protokoll for genetisk inkorporering av L-dihydroxyphenylalanine biosynthesized fra enkle Start materialer og sin søknad til protein Bøyning.

Abstract

L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) er en aminosyre som finnes i biosyntesen av katekolaminer i dyr og planter. På grunn av bestemt biokjemiske egenskaper har aminosyren flere bruker i biokjemiske programmer. Denne rapporten beskriver en protokoll for genetisk inkorporering av biosynthesized DOPA og sin søknad til protein Bøyning. DOPA er biosynthesized av en tyrosin fenol-lyase (TPL) fra catechol, pyruvate og ammoniakk aminosyren er direkte tatt inn proteiner av genetisk innlemmelse metoden bruker en utviklet aminoacyl-tRNA og aminoacyl-tRNA synthetase par. Direkte tilknyttet systemet inkorporerer effektivt DOPA med lite innlemmelse av andre naturlige aminosyrer og bedre protein avkastning enn forrige genetisk innlemmelse systemet for DOPA. Protein Bøyning med DOPA inneholder proteiner er effektiv og områdespesifikke og viser nytten for ulike applikasjoner. Denne protokollen gir protein forskere med detaljerte prosedyrer for effektiv biosyntesen av mutant proteiner som inneholder DOPA på ønskede områder og deres Bøyning for industri og farmasøytiske.

Introduction

DOPA er en aminosyre som er involvert i biosyntesen av katekolaminer i dyr og planter. Denne aminosyren er syntetisert fra Tyr av tyrosin hydroksylase og molekylære oksygen (O2)1. Fordi DOPA er en forløper til dopamin og kan trenge gjennom blod - hjerne barrieren, har det vært brukt i behandling av Parkinsons sykdom2. DOPA er også funnet i blåskjell vedheft proteiner (kart), som er ansvarlig for egenskapene selvklebende blåskjell i våte forhold,3,,4,,5,,6,,7. Tyr er opprinnelig kodet på plasseringen der DOPA finnes i kart og deretter konverteres til DOPA av tyrosinases8,9. På grunn av dens interessante biokjemiske egenskaper, har DOPA blitt brukt i en rekke applikasjoner. Gruppen dihydroxyl i DOPA er kjemisk utsatt for oksidasjon aminosyren omdannes lett til L-dopaquinone, en forløper til melanins. På grunn av sin høye electrofilia, har L-dopaquinone og dets derivater blitt brukt for crosslinking og Bøyning med thiols og aminer10,11,12,13. 1,2-quinones kan også fungere som en diene for sykloaddisjonsreaksjoner og har vært brukt i bioconjugation av belastning forfremmet oksidasjon-kontrollerte cyclooctyne-1,2-quinone (SPOCQ) cycloaddition14. I tillegg gruppen dihydroxyl kan chelate metall ioner som Fe3 + og Cu2 +og proteiner som inneholder DOPA har vært benyttet for narkotika-leveranser og metall ion sensing15,16.

DOPA har vært genetisk innlemmet i proteiner ved hjelp av en ortogonale aminoacyl-tRNA (aa-tRNA) og aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) par17 og brukt for protein bøyning og crosslinking10,11, 12,13. Eksperimentelle resultater og protokoller for genetisk inkorporering av DOPA biosynthesized fra billige Start materialer og dens søknadene å bioconjugation beskrives i denne rapporten. DOPA er biosynthesized bruker en TPL og starter fra catechol, pyruvate, og ammoniakk i Escherichia coli. Biosynthesized DOPA er direkte tatt inn proteiner ved å uttrykke et utviklet aa-tRNA og aaRS par for DOPA. I tillegg blir biosynthesized protein inneholder DOPA site-specifically bøyd med fluorescerende sonde og krysskoblet å produsere protein oligomers. Denne protokollen er nyttig for protein forskere, biosynthesize mutant proteiner som inneholder DOPA og bøy proteiner med biokjemiske sonder eller medisiner for industri og farmasøytiske.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. plasmider konstruksjon

  1. Konstruere et uttrykk plasmider (pBAD-dobbel-TPL-GFP-WT) som uttrykker TPL genet fra Citrobacter freundii under kontroll av en konstituerende promoter og grønne fluorescerende protein (GFP) genet med en6-koden under kontroll av den araBAD formidler. For pBAD-dobbel-TPL-GFP-E90TAG, erstatte codon for området (E90) av DOPA med et gult codon (TAG), med en område-rettet mutagenese-protokollen. Detaljene for byggingen av denne plasmider ble beskrevet i vår forrige rapport18.
  2. Konstruere en tRNA/aaRS-uttrykke plasmider (pEVOL-DHPRS2)18,19 genetisk inkorporering av DOPA. pEVOL er en spesiell plasmider vektor uttrykke to kopier av aaRS gener med uavhengige arrangører, og detaljert informasjon om plasmider er beskrevet i en tidligere rapport19.
  3. Bruke kommersielt tilgjengelige plasmider forberedelse kits for å få høy renhetsgrad plasmider DNAs. Kontrollere renheten av prepped DNAs ved hjelp agarose gel geleelektroforese, om nødvendig.

2. kultur forberedelse

  1. Electroporation
    1. Bruk electro-kompetent E. coli DH10β belastning for dette eksperimentet. Legge 1 µL av hver plasmider DNA (pEVOL-DHPRS2 og pBAD-dobbel-TPL-GFP-E90TAG) til 20 µL av kompetente celler. Bland dem forsiktig for å få en homogen blanding, bruker en pipette.
    2. Overføre blandingen til electroporation cuvettes. Sted cuvette i electroporation kammeret. Skyv cuvette inn i kammeret til å lage fast cuvette-kammer kontakt.
    3. Sjokk cuvette, bruker 25 µF og 2,5 kV for 0,1-cm cuvettes.
    4. Legg 1 mL av prewarmed super optimal kjøttkraft (SOC), som inneholder 2% (w/v) tryptone, 0,5% (w/v) gjær ekstrakt, 10 mM NaCl, 2,5 KCl, 10 mM MgCl2og 20 mM glukose, til cuvette, og overføre cellene slik kultur. Redde cellene ved rugende dem 1t på 37 ° C med skjelvende.
    5. Spre 10-100 µL reddet cellene i en lysogeny kjøttkraft (LB) agar plate som inneholder 35 µg/mL chloramphenicol og 100 µg/mL ampicillin. Inkuber cellene på 37 ° C 16 h.
  2. Starter kultur forberedelse
    1. Vaksinere en enkelt transformert koloni i 5 mL av LB medium som inneholder antibiotika. Inkuber kolonien 12 h på 37 ° C med skjelvende.

3. uttrykk og rensing av GFP-E90DOPA av biosyntetiske

  1. Uttrykk for GFP-E90DOPA av biosyntetiske
    1. Overføre av startkulturer (2 mL) til 100 mL PA-5052 middels20 (50 mM Na2HPO4, 50 mM KH2PO4, 25 mM [NH4]2så4, 2 mM MgSO4, 0,1% [w/v] spore metaller, 0,5% [w/v] glyserol, 0,05% [w/v] glukose og aminosyrer for 5% [w/v] [pH 7.25]) som inneholder 35 µg/mL chloramphenicol, 100 µg/mL ampicillin, 100 mM pyruvate, 10 mM catechol, 25 mM ammoniakk og 300 µM dithiothreitol (DTT) etterfulgt av en inkubasjon på 30 ° C med skjelvende.
    2. Legge til 2 mL 0,2% (w/v) L-arabinose når optisk densitet (OD) på 550 nm når 0,8. Inkuber utvalget for 12 h 30 ° c med skjelvende.
    3. Nedspinning cellene 11.000 x g i 5 min forkaste nedbryting og fryse celle pellet på-80 ° C.
  2. Cellen lysis
    1. Tine celle pellet på is og resuspend cellene i 10 mL lyseringsbuffer inneholder 50 mM NaH2PO4 (pH 8.0), 10 mM imidazole og 300 mM NaCl.
    2. Sonicate resuspended cellene på is 10 min. Bruk 80% sonication amplitude med en puls på 25 s på og 35 s av.
    3. Nedspinning cellen lysate 18 000 x g ved 4 ° C i 15 min. overføring nedbryting slik frisk for rensing og kast pellet.
  3. Ni-NTA affinitet kromatografi
    1. Legge til Ni-NTA (nitrilotriacetic acid) harpiks (300 µL av harpiks suspensjon for en 100-mL kultur) nedbryting og binde proteiner til Ni-NTA harpiks på 4 ° C ved forsiktig risting suspensjon 1t.
    2. Overføre suspensjon til en polypropylen kolonne og vaske harpiks 3 x med 5 mL av vaskebuffer inneholder 50 mM NaH2PO4 (pH 8.0), 20 mM imidazole og 300 mM NaCl.
    3. Elute proteiner 3 x med 300 µL av elueringsbufferen som inneholder 50 mM NaH2PO4 (pH 8.0), 250 mM imidazole og 300 mM NaCl.
    4. Bestemme protein konsentrasjonen av måler absorbansen på 280 nm. Utryddelse koeffisient (24,630 M-1cm-1) for GFP-E90DOPA på 280 nm ble beregnet av protein utryddelse koeffisienten kalkulator (f.eks, https://web.expasy.org/protparam/) og uavhengig målt utryddelse coefficiennt (2630 M-1cm-1) for DOPA. Som en alternativ, bruke Bradford protein analysen21 for en beslutning av protein konsentrasjonen.

4. oligomerization av renset GFP-E90DOPA

  1. Legge 1 µL av natrium periodate i H2O (6 mM) (1.0 hovedfag GFP-E90DOPA) til en løsning av 20 µL av GFP-E90DOPA (300 µM) i en fosfatbuffer inneholder 50 mM Na2HPO4 (pH 8.0) og 300 mM NaCl.
  2. Tillat oligomerization reaksjonen fortsette ved 25 ° C i 48 timer.
  3. Analysere reaksjonsblandingen av natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel geleelektroforese) (SDS-side) som beskrevet i trinn 6.

5. Bøyning av GFP-E90DOPA med en Alkyne sonden av SPOCQ

  1. Legge 1 µL av de koblede Cy5.5-azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO)22 i H2O (4.0 mM) (10 hovedfag GFP-E90DOPA) til en løsning av 20 µL av GFP-E90DOPA (20 µM) i en fosfatbuffer inneholder 50 mM Na2HPO4 (pH 8.0) og 300 mM NaCl.
  2. Legge 1 µL av natrium periodate i H2O (400 µM) (1.0 hovedfag GFP-E90DOPA) til reaksjonsblandingen.
  3. Tillat SPOCQ reaksjonen fortsette ved 25 ° C i 1 time. Hvis en lys-sensitive probe brukes, dekke reaksjonen fartøyet med aluminiumsfolie.

6. rensing av merket GFP

  1. Fortynne reaksjonsblandingen SPOCQ ved å legge en fosfatbuffer, som inneholder 50 mM Na2HPO4 (pH 8.0) og 300 mM NaCl, opptil 500 µL.
  2. Overføre utvannet løsningen til en sentrifugal filter spinn kolonne. Sentrifuge kolonnen spinn 14.000 x g på 4 ° C i 15 min og kast gjennomflytsenhet. Gjenta dette trinnet 3 x for å fjerne alle overflødig Cy5.5-ADIBO.
  3. Overføre renset prøven spin-kolonnen til en 1.5-mL microcentrifuge tube.
  4. Du kan også utføre en renselse ved dialyse mot samme bufferen.
  5. Lagre den renset GFP på 4 ° C.

7. SDS-side analyse og fluorescens Gel skanning

  1. Forberede protein prøver SDS-side analyse ved å legge til 5 µL av protein eksempel buffer (se Tabell for materiale) og 2 µL av DTT (1,00 M) til 13 µL av renset eller rå, merket GFP (13.6 µM eller 0.38 mg/mL). En analyse av oligomeric GFP, bruke en høyere konsentrasjon av GFP (67.8 µM eller 1.9 mg/mL). Denature proteiner av rugende dem ved 95 ° C i 10 min.
  2. Plasser en 4% - 12% Bis-Tris SDS side gel kassett (kjøpt, forhåndslagde gel kassetter) til geleelektroforese-cellen og legge en løpende buffer (se Tabell for materiale). Last protein prøvene og en molekylvekt. Kjør geleelektroforese i 35-40 min 200 V.
    Merk: Unngå noen eksponering av protein prøvene av utfører alle prosesser i mørket, minimere Foto-bleking av fluorescerende sonden.
  3. Bruke en fluorescens skanner for fluorescens bildebehandling. Pakk en protein gel fra geleelektroforese og plassere den på en fluorescens skanner. Skanne gel ved hjelp av en passende bølgelengde innstillingen. For Cy5.5, Velg Cy5 modus i skannerprogramvaren.
  4. Stain gel med en kommersiell protein flekker reagens.

8. MALDI-TOF MS analyse av Trypsin fordøyelse

  1. Inkuber 100 µL av renset GFP-E90DOPA (2,2 mg/mL eller 80 µM) i en buffer med 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0,1% (w/v) SDS og 25 mM DTT på 60 ° C i 1 time.
  2. Legge 1 µL av Iodoacetamide i H2O (IAA har 4.0 M) (500 hovedfag GFP-E90DOPA) til renset GFP-E90DOPA løsning (80 µM) i samme bufferen. Inkuber blandingen ved 25 ° C i 30 min med beskyttelse mot lyset.
  3. Fordøye GFP-E90DOPA prøven ved å legge til trypsin (1: 100 protease-til-substrat-protein forholdet [w/w]) og ruge reaksjonsblandingen på 37 ° C 4 h.
  4. Rense fordøyd peptid prøven ved hjelp av en standard avsalting metode med C18 spinn kolonner.
  5. Analysere fordøyd peptidene ved rapporterte protokollen for matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering tid-av-flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) med alpha-cyano-4-hydroxycinnamic syre (CHCA) som en matrise23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Uttrykket systemet direkte inkorporering av DOPA biosynthesized fra en TPL er vist i figur 1. Genene for utviklet aa-tRNA og aaRS paret er plassert i en plasmider og GFP genet (GFP-E90TAG) som inneholder et gult codon posisjonen 90 ligger i en annen plasmider evaluere inkorporering av DOPA ved GFP fluorescens. TPL genet er plassert i det samme uttrykket plasmider inneholder GFP genet og constitutively uttrykk for å maksimere avkastningen av DOPA biosyntesen. Bruker denne uttrykket, ble optimale forhold for DOPA biosyntesen vist. Veksten mediene som brukes for dette eksperimentet inneholdt 25 mM ammoniakk og 100 mM pyruvate, med varierende konsentrasjoner av catechol (0 - 10 mM). Catechol konsentrasjonen var avgjørende for DOPA biosyntesen, mens ammoniakk og pyruvate konsentrasjoner over 25 mM og 100 mM, henholdsvis ikke påvirke biosyntesen og innlemmelse av DOPA. Optimal konsentrasjonen av catechol var 10 mM og en konsentrasjon av mer enn 10 mM betydelig redusert bakteriell celle-vekst på grunn av sin cytotoksisitet. I denne optimale tilstand var DOPA biosynthesized av TPL fra sin start materialer, og biosynthesized DOPA ble direkte innlemmet i GFP. Uttrykt mutant GFP (GFP-E90DOPA) ble renset og analyseres av SDS-siden (figur 2A). Den fulle GFP ble renset, og DOPA inkorporering ble bekreftet av MALDI-TOF MS analyse (figur 2B). Protein ble fordøyd med trypsin peptid fragment som inneholder DOPA ble analysert og resultatet viste eksklusive inkorporering av DOPA med ingen synlig Tyr eller andre naturlige aminosyre innlemmelse. Inkorporering effektiviteten av DOPA biosynthesized av TPL var inkorporering effektiviteten med 3 mM DOPA, som er den høyeste konsentrasjonen av DOPA på grunn av sin cytotoksisitet19. Selv om 10 mM catechol viste moderat toksisitet, var celle tetthet etter 16 h kultur tid tre-firedelte høyere enn i nærvær av 3 mM DOPA. Renset protein avkastningen av biosyntesen var tredoblet høyere enn fra eksperimentere med 3 mM DOPA (Figur 3).

Mutant GFP som inneholder DOPA ble brukt for protein Bøyning. DOPA kan oksideres i L-dopaquinone av mild oksidanter, og det Elektrofil quinone reagerer med anstrengt alkynes og nucleophiles, som thiols og aminer, og kan brukes til bioconjugation (Figur 4). GFP-E90DOPA ble testet for SPOCQ cycloaddition reagerer med natrium periodate, etterfulgt av en behandling med Cy5.5-ADIBO22. Denne SPOCQ reaksjonen var analysert av SDS side og fluorescens imaging (figur 5et). Intens fluorescens bandet ble observert med en behandling av natrium periodate og Cy5.5-ADIBO, mens ingen fluorescens band ble vist i kontroll reaksjoner med GFP-WT eller uten en natrium periodate behandling, bekrefter effektivitet og spesifisitet av den Bøyning reaksjon med genetisk innarbeidet DOPA. I tillegg ble til DOPA som inneholder GFP brukt for protein oligomerization. L-dopaquinone reagerer med Lys eller Cys i samme protein, noe som resulterer i oligomeric proteiner. GFP-E90DOPA ble behandlet med natrium periodate oligomerization ble gjennomført på 48 h og reaksjonen var analysert av SDS-side med en kontroll prøven uten en natrium periodate behandling (figur 5B). Analysen viste en klar oligomerization mønster med jevne mellomrom protein band for periodate-behandlet prøven, mens kontroll prøven viste intakt protein uten noen andre band.

Figure 1
Figur 1 : Direkte innlemmelse av DOPA biosynthesized fra catechol, pyruvate og ammoniakk. DOPA er biosynthesized av heterologously uttrykt TPL fra catechol, pyruvate og ammoniakk i vekst medium. Utviklet tRNA/aaRS paret for DOPA er co uttrykte å innlemme biosynthesized DOPA i målet protein, GFP. TPL genet ble satt under en konstituerende pådriver for å starte DOPA biosyntesen før inducing GFP uttrykket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : SDS side og MALDI-TOF MS analyser av GFP-E90DOPA uttrykt av designet biosyntetiske systemet. (A) GFP-E90DOPA ble uttrykt av designet biosyntetiske systemet i nærvær av 10 mM catechol, 100 mM pyruvate og 25 mM ammoniakk, og deretter renset ved Ni-NTA affinitet kromatografi. GFP-WT var også analysert for sammenligning. Prøvene var atskilt med Bis-Tris 4% - 12% SDS-side, og gel var farget med Coomassie briljant blå R-250. (B) MALDI-TOF MS analyse av peptid fragment som inneholder DOPA fra tryptic fordøyelsen av GFP-E90DOPA. Et peptid fragment fra GFP-WT inneholder rester 86-96 (SAMPEGYVQER). Glu i fragment fra GFP-WT er erstattet med DOPA i peptid fragment fra GFP-E90DOPA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Sammenligning av en direkte innlemmelse av biosynthesized DOPA med en generell genetisk innlemmelse av DOPA. Disse skjermbildene viser GFP-E90DOPA uttrykt av designet biosyntetiske systemet og genetisk innlemmelse i nærvær av 3 mM DOPA uten ekstra pyruvate, ammoniakk og catechol. (A) protein gir Hentet fra renset GFP-E90DOPA, og (B) cellen tettheter ble målt på 16 h etter innledningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Reaksjon ordningen med bioconjugation av GFP-E90DOPA. GFP-E90DOPA er oksidert for å konvertere DOPA til dopaquinone. Reaksjonen av dopaquinone inneholder protein med et anstrengt alkyne oppnår områdespesifikke protein merking. Inkubasjonstiden for dopaquinone inneholder proteinet på høy konsentrasjon i lang tid (48 h) forårsaker protein selv Bøyning å produsere protein oligomers. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Bioconjugation mutant proteiner som inneholder DOPA. (A) SPOCQ reaksjoner på et DOPA inneholder protein med et anstrengt alkyne, ADIBO-Cy5.5. GFP-WT og GFP-E90DOPA ble behandlet med natrium periodate og reagerte med ADIBO-Cy5.5 for 60 min. Reaksjonene ble analysert av SDS-siden, og Coomassie-farget (øverst) og fluorescens (nederst) bilder vises. (B) Oligomerization av GFP-E90DOPA. DOPA inneholder GFP ble behandlet med natrium periodate og ruges i 48 timer. Reaksjonsblandingen ble analysert av SDS-side. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokollen, er den biosyntesen og direkte innlemmelse av DOPA beskrevet. Bakteriell cellen som er brukt i denne metoden kan syntetisere en ekstra aminosyre og bruke den som en unaturlig byggeblokk for proteinsyntese. Genetisk inkorporering av unaturlig aminosyrer har vært en viktig teknologi for utvikling av unaturlig organisme med en utvidet genetiske koden. Men denne metoden er teknisk ufullstendig og endres for å forbedre innlemmelse effektiviteten og redusere forstyrrelsene endogene oversettelse systemer. Nylig oppnådd betydelige fremskritt i metoden av blitt kodon24,25 for unaturlig aminosyrer og engineering ortogonale translasjonsforskning komponenter26,27,28 ,29. I tillegg til disse forbedringene, systemet beskrevet her tilbyr en annen evne å en unaturlig organisme med en utvidet genetiske kode: biosyntesen av en unaturlig aminosyre. Denne funksjonen gir unaturlig systemet mer uavhengighet som en organisme med et utvidet genetisk repertoar. DOPA viser videre moderat toksisitet bakterielle belastningen brukes i denne metoden, og 3 mM DOPA, cellevekst betydelig redusert, noe som resulterte i lav protein avkastning. Ved hjelp av direkte innlemmelse system, toksisitet ble redusert og protein avkastning familiebaserte programmer tredoblet.

AaRS mutant brukes for genetisk inkorporering av DOPA har moderat effektivitet og troskap og inkorporerer Tyr på en lav konsentrasjon av DOPA. 18 derfor biosyntesen av DOPA i bakterieceller bør være effektiv nok til å hindre Tyr innlemmelse. DOPA biosyntesen av TPL fra catechol, ammoniakk og pyruvate er en reversibel reaksjon høye konsentrasjoner av Start materialer kreves for en effektiv biosyntesen. Catechol kan imidlertid ikke bruke over 10 mM, fordi det er giftig for bakterielle belastningen i denne protokollen. DTT konsentrasjonen er også viktig i denne protokollen. DOPA viser sine toksisitet når det konverteres til L-dopaquinone, og DTT legges i vekst medium Tilbakebetalingsgraden oksidering. Observerte vi en nedgang i cellevekst når DTT konsentrasjonen var over 300 µM. Derfor for en optimal biosyntesen og innlemmelse av DOPA, bør komponentene (spesielt catechol og DTT) kultur medium brukes i aktuelle konsentrasjoner som beskrevet i denne protokollen.

Denne protokollen beskriver også programmer for DOPA inneholder proteiner for områdespesifikke protein Bøyning. L-dopaquinone generert av oksidasjon av DOPA effektivt reagerer med et anstrengt alkyne knyttet til en biokjemiske sonde. Denne cycloaddition reaksjonen er vanligvis raskere enn nukleofil tillegg reaksjoner av aminer eller thiols. Oksidasjon av DOPA bør imidlertid utføres i nærvær av både en DOPA inneholder protein og et anstrengt alkyne, minimere nukleofil tillegg av nucleophiles i protein. Rekkefølgen på tillegg av reagensene for denne reaksjonen er derfor kritisk.

Mange unaturlig aminosyrer er tilgjengelig for protein Bøyning, og noen av dem nå en rask reaksjon hastighet og utmerket Bøyning effektivitet30,31,32,33. Disse aminosyrer inneholder biorthogonal funksjonelle grupper som azides, alkynes, anstrengt alkener eller alkynes og tetrazines. Selv om de er nyttige for områdespesifikke protein Bøyning, er mange av dem dyre eller kommersielt tilgjengelig, som begrenser deres programmer, særlig i de krever omfattende proteiner. Derfor vil biosyntesen av DOPA fra billige Start materialer og innlemmelse direkte være nyttig for farmasøytisk og industrielle applikasjoner som krever store mutant proteiner som inneholder en biokjemiske sonde eller et medikament (antistoff-stoff konjugert, ADC).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av den globale Frontier Research Program (NRF-2015M3A6A8065833), og den grunnleggende Science Research Program (2018R1A6A1A03024940) gjennom de National Research Foundation av Korea (NRF) finansiert av Korea regjeringen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Plasmid Construction
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmid pEvol-DHPRS2 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).
DH10β Invitrogen C6400-03 Expression Host
Plasmid Mini-prep kit Nucleogen 5112 200/pack
Agarose Intron biotechnology 32034 500 g
Ethidium bromide Alfa Aesar L07482 1 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser  BIO-RAD 165-2100
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2089 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium Wako 018-10372 25 g
Chloramphenicol Alfa Aesar B20841 25 g
Agar SAMCHUN 214230 500 g
SOC medium Sigma S1797 100 mL
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
L(+)-Arabinose, 99% Acros 104981000 100 g
Pyrocatechol, 99% SAMCHUN P1387 25 g
Ammonium sulfate, 99% SAMCHUN A0943 500 g
pyruvic acid, 98% Alfa Aesar A13875 100 g
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% SAMCHUN S0891 1 kg
Potassium phophate, monobasic, 99% SAMCHUN P1127 1 kg
Magnesium sulfate, anhydrous, 99% SAMCHUN M0146 1 kg
D(+)-Glucose, anhydrous, 99% SAMCHUN D0092 500 g
Glycerol, 99% SAMCHUN G0269 1 kg
Trace metal mix a5 with co Sigma 92949 25 mL
L-Proline, 99% SAMCHUN P1257 25 g
L-Phenylalanine, 98.5% SAMCHUN P1982 25 g
L-Tryptophane JUNSEI 49550-0310 25 g
L-Arginine, 98% SAMCHUN A1149 25 g
L-Glutamine, 98% JUNSEI 27340-0310 25 g
L-Asparagine monohydrate, 99% SAMCHUN A1198 25 g
L-Methionine JUNSEI 73190-0410 25 g
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% SAMCHUN H0604 25 g
L-Threonine, 99% SAMCHUN T2938 25 g
L-Leucine JUNSEI 87070-0310 25 g
Glycine, 99% SAMCHUN G0286 25 g
L-Glutamic acid, 99% SAMCHUN G0233 25 g
L-Alanine, 99% SAMCHUN A1543 25 g
L-Isoleucine, 99% SAMCHUN I1049 25 g
L-Valine, 99% SAMCHUN V0088 25 g
L-Serine SAMCHUN S2447 25 g
L-Aspartic acid SAMCHUN A1205 25 g
L-Lysine monohydrochloride, 99% SAMCHUN L0592 25 g
3.2 Cell lysis
Imidazole, 99% SAMCHUN I0578 1kg
Sodium phosphate monobasic, 98% SAMCHUN S0919 1 kg
Sodium Chloride, 99% SAMCHUN S2907 1 kg
Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 milliliters SONIC & MATERIALS VCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 25 mL
Polypropylene column QIAGEN 34924 50/pack, 1 mL capacity
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA 
Sodium periodate, 99.8& Acros 419610050 5 g
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) 
Cy5.5-ADIBO  FutureChem FC-6119 1mg
6. Purification of Labeled GFP
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters MILLIPORE UFC500396 96/pack, 500ul capacity
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % Sigma 10708984001 10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X Thermofisher NP0007 10 mL
MES running buffer Thermofisher NP0002 500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels Thermofisher NO0321 12 well
Coomassie Brilliant Blue R-250 Wako 031-17922 25 g
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System Syngene G BOX Chemi XT4
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% SAMCHUN T1351 500 g
Hydrochloric acid, 35~37% SAMCHUN H0256 500 mL
Dodecyl sulfate sodium salt, 85% SAMCHUN D1070 250 g
Iodoacetamide Sigma I6125 5 g
Trypsin Protease, MS Grade Thermofisher 90057 5 x 20 µg/pack
C-18 spin columns Thermofisher 89870 25/pack, 200 µL capacity
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF
Acetonitirile, 99.5% SAMCHUN A0125 500 mL
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma C2020 10 g
Trifluoroacetic acid, 99% SAMCHUN T1666 100 g
MTP 384 target plate ground steel BC targets Bruker 8280784
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer Bruker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagatsu, T., Levitt, M., Udenfriend, S. Tyrosine hydroxylase: The initial step in norepinephrine biosynthesis. Journal of Biological Chemistry. 239, 2910-2917 (1964).
  2. Pinder, R. M. Possible dopamine derivatives capable of crossing the blood-brain barrier in relation to parkinsonism. Nature. 228 (5269), 358 (1970).
  3. Waite, J. H., Tanzer, M. L. Polyphenolic substance of mytilus edulis: novel adhesive containing L-DOPA and hydroxyproline. Science. 212 (4498), 1038-1040 (1981).
  4. Lee, H., Scherer, N. F., Messersmith, P. B. Single-molecule mechanics of mussel adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 12999-13003 (2006).
  5. Papov, V. V., Diamond, T. V., Biemann, K., Waite, J. H. Hydroxyarginine-containing polyphenolic proteins in the adhesive plaques of the marine mussel Mytilus edulis. Journal of Biological Chemistry. 270 (34), 20183-20192 (1995).
  6. Waite, J. H., Qin, X. Polyphosphoprotein from the adhesive pads of Mytilus edulis. Biochemistry. 40 (9), 2887-2893 (2001).
  7. Nicklisch, S. C., Waite, J. H. Mini-review: The role of redox in DOPA-mediated marine adhesion. Biofouling. 28 (8), 865-877 (2012).
  8. Silverman, H. G., Roberto, F. Understanding marine mussel adhesion. Marine Biotechnology. 9 (6), 661-681 (2007).
  9. Lee, B. P., Messersmith, P. B., Israelachvili, J. N., Waite, J. H. Mussel-inspired adhesives and coatings. Annual Review of Materials Research. 41, 99-132 (2011).
  10. Umeda, A., Thibodeux, G. N., Zhu, J., Lee, Y., Zhang, Z. J. Site-specific protein cross-linking with genetically incorporated 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine. ChemBioChem. 10 (8), 1302-1304 (2009).
  11. Umeda, A., Thibodeux, G. N., Moncivais, K., Jiang, F., Zhang, Z. J. A versatile approach to transform low-affinity peptides into protein probes with cotranslationally expressed chemical cross-linker. Analytical Biochemistry. 405 (1), 82-88 (2010).
  12. Xu, J., Tack, D., Hughes, R. A., Ellington, A. D., Gray, J. J. Structure-based non-canonical amino acid design to covalently crosslink an antibody-antigen complex. Journal of Structural Biology. 185 (2), 215-222 (2014).
  13. Burdine, L., Gillette, T. G., Lin, H. J., Kodadek, T. Periodate-triggered cross-linking of DOPA-containing peptide-protein complexes. Journal of the American Chemical Society. 126 (37), 11442-11443 (2004).
  14. Borrmann, E., et al. Strain-promoted oxidation-controlled cyclooctyne-1,2-quinone cycloaddition (SPOCQ) for fast and activatable protein conjugation. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 257-261 (2015).
  15. Ayyadurai, N., et al. Development of a selective, sensitive, and reversible biosensor by the genetic incorporation of a metal-binding site into green fluorescent protein. Angewandte Chemie International Edition. 50 (29), 6534-6537 (2011).
  16. Kim, B. J., Cheong, H., Hwang, B. H., Cha, H. J. Mussel-inspired protein nanoparticles containing iron(III)-DOPA complexes for pH-responsive drug delivery. Angewandte Chemie International Edition. 54 (25), 7318-7322 (2015).
  17. Alfonta, L., Zhang, Z., Uryu, S., Loo, J. A., Schultz, P. G. Site-specific incorporation of a redox-active amino acid into proteins. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14662-14663 (2003).
  18. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chemical Communications. 54 (24), 3002-3005 (2018).
  19. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
  20. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).
  21. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  22. Jang, S., Sachin, K., Lee, H. J., Kim, D. W., Lee, H. S. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2256-2261 (2012).
  23. Gobom, J., et al. Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid affinity sample preparation. A protocol for MALDI-MS peptide analysis in proteomics. Analytical Chemistry. 73 (3), 434-438 (2001).
  24. Mukai, T., et al. Highly reproductive Escherichia coli cells with no specific assignment to the UAG codon. Scientific Reports. 5, 9699 (2015).
  25. Lajoie, M. J., et al. Genomically recoded organisms expand biological functions. Science. 342 (6156), 357-360 (2013).
  26. Bryson, D. I., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases. Nature Chemical Biology. 13 (12), 1253-1260 (2017).
  27. Guo, J., Melancon, C. E., Lee, H. S., Groff, D., Schultz, P. G. Evolution of amber suppressor tRNAs for efficient bacterial production of proteins containing nonnatural amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 48 (48), 9148-9151 (2009).
  28. Lee, S., et al. A facile strategy for selective phosphoserine incorporation in histones. Angewandte Chemie International Edition. 52 (22), 5771-5775 (2013).
  29. Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M., Chin, J. W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature. 464 (7287), 441-444 (2010).
  30. Lang, K., Chin, J. W. Bioorthogonal reactions for labeling proteins. ACS Chemical Biology. 9 (1), 16-20 (2014).
  31. Lang, K., Chin, J. W. Cellular Incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  32. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angewandte Chemie International Edition. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  33. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. Journal of the American Chemical Society. 134 (6), 2898-2901 (2012).

Tags

Biokjemi problemet 138 DOPA genetisk innlemmelse biosyntesen tyrosin fenol-lyase protein Bøyning belastning forfremmet oksidasjon-kontrollerte cyclooctyne-1,2-quinone (SPOCQ) cycloaddition
Genetisk innlemmelse av Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) og sin søknad til Protein Bøyning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, S., Lee, H. S. Genetic… More

Kim, S., Lee, H. S. Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation. J. Vis. Exp. (138), e58383, doi:10.3791/58383 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter