Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Genetiska införlivandet av biosyntetiseras L-dihydroxifenylalanin (DOPA) och dess tillämpning på Protein konjugation

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58383
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, Sogang University

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för genetiska införlivandet av L-dihydroxifenylalanin biosyntetiseras från enkla utgångsmaterial och dess tillämpning på protein konjugation.

Abstract

L-dihydroxifenylalanin (L-dopa) är en aminosyra som finns i biosyntesen av katekolaminer i djur och växter. På grund av dess särskilda biokemiska egenskaper har aminosyran flera användningsområden i biokemiska tillämpningar. Denna rapport beskriver ett protokoll för genetiska införlivandet av biosyntetiseras DOPA och dess tillämpning på protein konjugation. L-dopa är biosyntetiseras av en tyrosin fenol-lyasen (TPL) från katekol, pyruvat och ammoniak, och aminosyran är direkt införlivad med proteiner av metoden genetiska inkorporering med hjälp av en utvecklad aminoacyl-tRNA och aminoacyl-tRNA Synthetasen par. Detta direkta inkorporering system inlemmar effektivt DOPA med lite införlivandet av andra naturliga aminosyror och med bättre protein avkastning än det tidigare genetiska inkorporering systemet för DOPA. Protein konjugering med DOPA-innehållande proteiner är effektiv och platsspecifika och visar dess användbarhet för olika applikationer. Detta protokoll ger protein forskare med detaljerade förfaranden för effektiv biosyntesen av muterade proteiner som innehåller DOPA på önskad webbplatser och deras konjugation för industriella och farmaceutiska tillämpningar.

Introduction

L-dopa är en aminosyra som är involverad i biosyntesen av katekolaminer i djur och växter. Denna aminosyra är syntetiserade från Tyr av tyrosin hydroxylas och molekylärt syre (O2)1. Eftersom L-dopa är en förelöpare till dopamin och kan genomsyra den blood - brain barriären, har det använts för behandling av Parkinsons sjukdom2. DOPA finns även i mussla vidhäftning proteiner (MAPs), som ansvarar för de vidhäftande egenskaperna av musslor i våta förhållanden3,4,5,6,7. Tyr är ursprungligen kodad på positioner där DOPA finns i kartor och omvandlas sedan till DOPA med tyrosinases8,9. På grund av dess intressanta biokemiska egenskaper, har DOPA använts i en mängd tillämpningar. Gruppen dihydroxyl av DOPA är kemiskt benägna att oxidation och aminosyran omvandlas enkelt till L-dopaquinone, en föregångare av melanins. På grund av dess höga elektrofilicitet, har L-dopaquinone och dess derivat använts för crosslinking och konjugation med tioler och aminer10,11,12,13. 1,2-kinoner kan också fungera som en Dien för cykloadditionen reaktioner och har använts för bioconjugation av stam-främjas för oxidation-kontrollerade cyclooctyne-1,2-quinone (SPOCQ) cykloadditionen14. Dessutom gruppen dihydroxyl kan kelat metalljoner såsom Fe3 + och Cu2 +, och proteiner som innehåller DOPA har utnyttjats för drogen leverans och metall Jon avkänning15,16.

L-dopa har genetiskt införlivas proteiner med hjälp av en ortogonal aminoacyl-tRNA (aa-tRNA) och aminoacyl-tRNA Synthetasen (aaRS) par17 och används för protein konjugering och crosslinking10,det11, 12,13. I denna rapport beskrivs experimentella resultat och protokoll för genetiska införlivandet av DOPA biosyntetiseras från billiga utgångsmaterial och dess tillämpningar till bioconjugation. L-dopa är biosyntetiseras använder en TPL och start från katekol, pyruvat och ammoniak i Escherichia coli. Biosyntetiseras DOPA är direkt införlivat proteiner genom att uttrycka en utvecklad aa-tRNA och aaRS par för DOPA. Dessutom är proteinet biosyntetiseras innehållande DOPA anläggningsvis konjugerat med en fluorescerande sond och tvärbundna att producera protein oligomerer. Detta protokoll kommer att vara användbart för protein forskare, att biosynthesize muterade proteiner som innehåller DOPA och konjugat proteinerna med biokemiska sonder eller läkemedel för industriella och farmaceutiska tillämpningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. plasmid konstruktion

  1. Konstruera ett uttryck plasmid (pBAD-dual-TPL-GFP-WT) som uttrycker genen TPL från Citrobakter freundii under kontroll av en konstitutiva promotorn och grönt fluorescerande protein (GFP) genen med en hans6-tagg under kontroll av den araBAD initiativtagare. För pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG, Ersätt Codonen för webbplatsen (E90) av DOPA med en bärnstensfärgad kodon (TAG), använder en webbplats riktad mutagenes protokoll. Detaljer för byggandet av denna plasmid beskrevs i våra tidigare rapport18.
  2. Konstruera en tRNA/aaRS-uttryckande plasmid (pEVOL-DHPRS2)18,19 för genetiska inkorporeringen av DOPA. pEVOL är en särskild plasmid vektor uttrycka två kopior av aaRS gener med oberoende främjare, och den detaljerade informationen av Plasmiden beskrivs i en tidigare rapport19.
  3. Använda kommersiellt tillgängliga plasmid förberedelse byggsatser för att erhålla hög renhet kontrollplasmid-DNA. Kontrollera renheten av de preppad DNAs genom att använda agaros gel-elektrofores, om det behövs.

2. kultur förberedelse

  1. Elektroporation
    1. Använd den electro-behöriga E. coli DH10β stam för detta experiment. Tillsätt 1 µL av varje plasmid DNA (pEVOL-DHPRS2 och pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG) till 20 µL av behöriga celler. Blanda dem försiktigt för att göra en homogen blandning, med hjälp av en pipett.
    2. Överför blandningen till de elektroporation kyvetter. Placera kyvetten i elektroporation kammaren. Skjut kyvetten i kammaren att göra fast cuvette-kammare kontakta.
    3. Chocka den kyvetten, använder 25 µF och 2,5 kV för 0,1 cm kyvetter.
    4. Tillsätt 1 mL av förvärmd super optimal buljong (SOC), som innehåller 2% (w/v) trypton, 0,5% (w/v) jäst extrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2och 20 mM glukos, till kyvetten, och överföra cellerna till en kultur-röret. Rädda cellerna genom inkubering för 1 h vid 37 ° C under skakning.
    5. Spridning 10-100 µL av de rädda cellerna på en lysogeny buljong (LB) agarplatta som innehåller 35 µg/mL kloramfenikol och 100 µg/mL ampicillin. Inkubera cellerna vid 37 ° C i 16 h.
  2. Förrätt kultur förberedelse
    1. Inokulera en enda transformerad koloni i 5 mL LB medium som innehåller antibiotika. Inkubera kolonin för 12 timmar vid 37 ° C under skakning.

3. uttryck och rening av GFP-E90DOPA av ett biosyntetiska System

  1. Uttryck för GFP-E90DOPA av ett biosyntetiska system
    1. Överföra den förrätt kulturen (2 mL) till 100 mL PA-5052 medium20 (50 mM Na2HPO4, 50 mM KH2PO4, 25 mM [NH4]2så4, 2 mM MgSO4, 0,1% [volymvikt] spåra metaller, 0,5% [volymvikt] glycerol, 0,05% [volymvikt] glukos och aminosyror för 5% [w/v] [pH 7,25]) som innehåller 35 µg/mL kloramfenikol, 100 µg/mL ampicillin, 100 mM pyruvat, 10 mM katekol, 25 mM ammoniak och 300 µM Ditiotreitol (DTT) följt av en inkubation vid 30 ° C under skakning.
    2. Tillsätt 2 mL 0,2% (w/v) L-arabinos när den optiska densiteten (OD) vid 550 nm når 0,8. Inkubera provet för 12 timmar vid 30 ° C under skakning.
    3. Snurra ner cellerna vid 11 000 x g i 5 min, avlägsna supernatanten och frysa cellpelleten vid-80 ° C.
  2. Cellys
    1. Tina cellpelleten på is och resuspendera cellerna i 10 mL lyseringsbuffert innehållande 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), 10 mM Imidazol och 300 mM NaCl.
    2. Sonikera återsuspenderade cellerna på is för 10 min. Använd 80% ultraljudsbehandling amplitud med en puls på 25 s på och 35 s off.
    3. Snurra ner cellen lysate vid 18.000 x g vid 4 ° C i 15 min. överföring supernatanten till en frisk slang för rening och kassera pelleten.
  3. Ni-NTA affinitetskromatografi
    1. Lägga till Ni-NTA (nitrilotriacetic acid) harts (300 µL av harts suspension för en 100-mL kultur) i supernatanten och bind proteinerna till Ni-NTA harts vid 4 ° C genom att försiktigt skaka suspensionen för 1 h.
    2. Överför till en kolumn av polypropylen och tvätta kådan 3 x 5 ml tvättbuffert innehållande 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), 20 mM Imidazol och 300 mM NaCl.
    3. Eluera proteinerna 3 x med 300 µL av eluering buffert innehållande 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), 250 mM Imidazol och 300 mM NaCl.
    4. För att bestämma proteinkoncentration genom att mäta absorbansen vid 280 nm. En extinktionskoefficient (24,630 M-1cm-1) för GFP-E90DOPA vid 280 nm beräknades genom en protein utrotning koefficient Kalkylatorn (t.ex., https://web.expasy.org/protparam/) och självständigt uppmätta utrotning coefficiennt (2630 M-1cm-1) för DOPA. Som en alternativ metod, använda de Bradford protein assay21 för en bestämning av protein koncentrationen.

4. oligomerisering av renad GFP-E90DOPA

  1. Lägg till 1 µL natrium natriumperjodat i H2O (6 mM) (1,0 motsv till GFP-E90DOPA) till en lösning av 20 µL av GFP-E90DOPA (300 µM) i en fosfatbuffert innehållande 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) och 300 mM NaCl.
  2. Tillåta oligomerisering reaktionen att gå vidare vid 25 ° C för 48 h.
  3. Analysera reaktionsblandningen av sodium dodecyl sulfate-polyakrylamid gelelektrofores) (SDS-PAGE) som beskrivs i steg 6.

5. Konjugation av GFP-E90DOPA med en alkynen sond av SPOCQ

  1. Tillsätt 1 µL av Cy5.5-länkade azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO)22 i H2O (4,0 mM) (10 motsv till GFP-E90DOPA) till en lösning av 20 µL av GFP-E90DOPA (20 µM) i en fosfatbuffert innehållande 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) och 300 mM NaCl.
  2. Lägg till 1 µL natrium natriumperjodat i H2O (400 µM) (1,0 motsv till GFP-E90DOPA) till reaktionsblandningen.
  3. Tillåta SPOCQ reaktionen att gå vidare vid 25 ° C i 1 h. Om en ljuskänslig sond används, omfatta reaktionskärlet med aluminiumfolie.

6. rening av de märkta GFP

  1. Späd SPOCQ reaktionsblandningen genom att tillsätta en fosfatbuffert, innehållande 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) och 300 mM NaCl, upp till 500 µL.
  2. Överföra den utspädda lösningen till en centrifugal filter spin kolumn. Centrifugera kolumnen spin vid 14 000 x g vid 4 ° C under 15 minuter och kasta genomflöde. Upprepa detta steg 3 x för att ta bort någon överflödig Cy5.5-ADIBO.
  3. Överföra renat provet från kolumnen spin till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
  4. Alternativt, genomföra en rening av dialys mot samma bufferten.
  5. Lagra den renad GFP vid 4 ° C.

7. SDS-PAGE analys och fluorescens Gel skanning

  1. Förbereda protein prover för SDS-PAGE analys genom att lägga till 5 µL protein prov buffert (se Tabell av material) och 2 µL av DTT (1,00 M) till 13 µL av renat eller rå, märkt GFP (13,6 µM eller 0,38 mg/mL). För en analys av Oligomera GFP, använda en högre koncentration av god Jordbrukarsed (67,8 µM eller 1,9 mg/mL). Denaturera proteiner genom inkubering vid 95 ° C i 10 min.
  2. Placera en 4% - 12% Bis-Tris SDS-PAGE gel kassett (köpta, premade gel kassetter) till cellen elektrofores och tillsätt en rinnande buffert (se Tabell för material). Ladda protein proverna och molekylvikt markör. Köra elektrofores för 35-40 min på 200 V.
    Obs: Undvik all exponering av protein proverna att lysa genom att utföra alla processer i mörkret, att minimera foto-blekning av fluorescerande sonden.
  3. Använda en fluorescens scanner för fluorescens imaging. Vira en protein gel från elektrofores och placera den på en fluorescens-skanner. Skanna gelen med hjälp av en lämplig våglängd inställningen. För Cy5.5, Välj Cy5 i skannerprogramvara.
  4. Fläcken gelen med en kommersiell protein färgning reagens.

8. MALDI-TOF MS analys av Trypsin matsmältning

  1. Inkubera 100 µL av renad GFP-E90DOPA (2,2 mg/mL eller 80 µM) i en buffert som innehåller 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1% (w/v) SDS och 25 mM DTT vid 60 ° C för 1 h.
  2. Tillsätt 1 µL av Iodoacetamide i H2O (IAA, 4.0 M) (500 motsv till GFP-E90DOPA) till renad GFP-E90DOPA lösning (80 µM) i samma bufferten. Inkubera blandningen vid 25 ° C i 30 min med skydd från ljus.
  3. Smälta GFP-E90DOPA provet genom att lägga till trypsin (1: 100 proteas-till-substrat-protein kvoten [w/w]) och inkubera reaktionsblandningen vid 37 ° C i 4 h.
  4. Rena smält peptid provet genom att använda en avsaltning standardmetod med C18 spin kolumner.
  5. Analysera de smälta peptiderna av rapporterade protokollet för matrix-assisted laser desorption/jonisering time-of-flight masspektrometri (MALDI-TOF MS) med alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) som en matris23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Uttryck systemet för direkt inkorporeringen av DOPA biosyntetiseras från en TPL visas i figur 1. Gener för utvecklade aa-tRNA och aaRS paret placeras i en plasmid, och den GFP-genen (GFP-E90TAG) som innehåller en bärnstensfärgad kodon på plats 90 ligger i en annan plasmiden att utvärdera införlivandet av DOPA av GFP fluorescens. TPL genen placeras i samma uttryck plasmiden innehållande GFP-genen och konstitutivt uttryckta för att maximera avkastningen av DOPA biosyntesen. Med detta uttryck system, screenades optimala förhållanden för DOPA biosyntes. Tillväxtmassmedia som används för detta experiment innehöll 25 mM ammoniak och 100 mM pyruvat, med varierande koncentrationer av katekol (0 - 10 mM). Katekol koncentrationen var kritisk för DOPA biosyntesen, medan ammoniak och pyruvat koncentrationer över 25 mM och 100 mM, respektive, inte påverka biosyntes och införlivandet av DOPA. Den optimala koncentrationen av katekol var 10 mM, och en koncentration av mer än 10 mM minskade signifikant bakteriecell tillväxten på grund av dess cytotoxicitet. I detta optimala tillstånd var DOPA biosyntetiseras av TPL från utgångsmaterialen och den biosyntetiseras DOPA införlivades direkt god Jordbrukarsed. Den uttryckta muterat GFP (GFP-E90DOPA) var renat och analyseras av SDS-PAGE (figur 2A). Den fullängds GFP renades och DOPA inkorporeringen bekräftades av MALDI-TOF MS analys (figur 2B). Proteinet har smält med trypsin, peptid fragmentet som innehåller DOPA analyserades och resultatet visade exklusiva införlivandet av DOPA med inga detekterbara Tyr eller andra naturliga aminosyra inkorporering. Inkorporering effektiviteten av DOPA biosyntetiseras av TPL liknade inkorporering effektiviteten med 3 mM DOPA, vilket är den högsta koncentrationen av DOPA på grund av dess cytotoxicitet19. Även om 10 mM katekol visade måttlig toxicitet, var cell densiteten efter 16 h kultur tid tre-till fyrfaldigt högre än i närvaro av 3 mM DOPA. Renat protein avkastningen av biosyntes var trefaldigt högre än från experiment med 3 mM DOPA (figur 3).

Den muterade GFP som innehåller DOPA användes för protein konjugation. L-dopa kan oxideras till L-dopaquinone av mild oxidanter och den elektrofil quinone reagerar med ansträngda alkyner och nukleofil, såsom tioler och aminer, och kan användas för bioconjugation (figur 4). GFP-E90DOPA testades för SPOCQ cykloadditionen genom att reagera med natrium natriumperjodat, följt av en behandling med Cy5.5-ADIBO22. Denna SPOCQ reaktion analyserades av SDS-PAGE och fluorescens imaging (figur 5A). Intensiv fluorescens bandet observerades med en behandling av natrium natriumperjodat och Cy5.5-ADIBO, medan ingen fluorescens bandet visades i kontrollreaktioner med GFP-WT eller utan en natrium natriumperjodat behandling, bekräftar effektiviteten och specificiteten hos de Konjugation reaktion med den genetiskt bolagiserade DOPA. Dessutom användes den DOPA-innehållande GFP för protein oligomerisering. L-dopaquinone reagerar med Lys eller Cys i samma protein, vilket resulterar i Oligomera proteiner. GFP-E90DOPA behandlades med natrium natriumperjodat och oligomerisering genomfördes för 48 h, och reaktionen analyserades av SDS-PAGE i jämförelse med ett kontrollprov utan en natrium natriumperjodat behandling (figur 5B). Analysen visade en tydlig oligomerisering mönster med jämnt fördelade protein band för periodate-behandlade provet, medan stickprovet som visade det intakt proteinet utan några andra band.

Figure 1
Figur 1 : Direkt införlivande av DOPA biosyntetiseras från katekol, pyruvat och ammoniak. L-dopa är biosyntetiseras av heterologously uttryckta TPL från katekol, pyruvat och ammoniak i odlingsmedium. Det utvecklade tRNA/aaRS paret för DOPA är samtidig uttryckt att införliva biosyntetiseras DOPA i målproteinet, GFP. TPL genen placerades under en konstitutiva promotorn för att börja DOPA biosyntesen innan inducerande uttrycket god Jordbrukarsed. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : SDS-PAGE och MALDI-TOF MS analyser av GFP-E90DOPA uttryckt av designade biosyntetiska systemet. (A) GFP-E90DOPA var uttryckt av designade biosyntetiska systemet i närvaro av 10 mM katekol, 100 mM pyruvat och 25 mM ammoniak, och renas av Ni-NTA affinitetskromatografi. GFP-WT analyserades också för jämförelse. Proverna var åtskilda av Bis-Tris 4% - 12% SDS-PAGE och gelen var fläckade Coomassie Brilliant Blue R-250. (B) MALDI-TOF MS analys av peptid fragmentet som innehåller DOPA från tryptic nedbrytning av GFP-E90DOPA. Peptid fragmentet från GFP-WT innehåller rester 86-96 (SAMPEGYVQER). Glu i fragmentet från GFP-WT ersätts med DOPA i peptid fragmentet från GFP-E90DOPA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Jämförelse av ett direkt införlivande av biosyntetiseras DOPA med en allmän genetiska inkorporering av DOPA. Dessa paneler visar GFP-E90DOPA utformade biosyntetiska systemet och genetiska inkorporeringen i närvaro av 3 mM DOPA utan ytterligare pyruvat, ammoniak och katekol uttryckt. (A) proteinet avkastning erhölls från renad GFP-E90DOPA, och (B) cell tätheterna mättes på 16 h efter induktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Reaktionsformel av bioconjugation av GFP-E90DOPA. GFP-E90DOPA oxideras för att omvandla L-dopa till dopaquinone. Reaktionen av dopaquinone-innehållande protein med en ansträngd alkynen uppnår platsspecifika protein märkning. Inkubering av proteinet dopaquinone-innehållande på en hög koncentration under lång tid (48 h) orsakar protein själv konjugation att producera protein oligomerer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Bioconjugation av muterade proteiner som innehåller DOPA. (A), SPOCQ reaktioner av ett DOPA-innehållande protein med en ansträngd alkynen, ADIBO-Cy5.5. GFP-WT och GFP-E90DOPA behandlades med natrium natriumperjodat och reagerade med ADIBO-Cy5.5 för 60 min. Reaktionerna analyserades av SDS-PAGE och Coomassie-färgade (överst) och fluorescens (nederst) bilder visas. (B) oligomerisering av GFP-E90DOPA. Den DOPA-innehållande GFP behandlades med natrium natriumperjodat och inkuberas i 48 h. Reaktionsblandningen var analyseras av SDS-PAGE. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta protokoll beskrivs biosyntes och direkt införlivande av DOPA. Den bakteriella cellen som används i den här metoden kan syntetisera en ytterligare aminosyra och använda den som en onaturlig byggsten för proteinsyntesen. Genetiska införlivandet av onaturliga aminosyror har varit en nyckel-teknologi för utveckling av onaturliga organism med en utökad genetiska kod. Men denna metod har varit tekniskt ofullständig och håller på att ändras för att förbättra införlivandet effektiviteten och minimera störning till endogena översättningssystem. Nyligen har har betydande framsteg i metoden uppnåtts genom återanvisa kodon24,25 för onaturliga aminosyror och engineering ortogonala translationell komponenter26,27,28 ,29. Utöver dessa förbättringar, erbjuder systemet beskrivs här en annan kapacitet till en onaturlig organism med en utökad genetiska koden: biosyntesen av en onaturlig aminosyra. Denna kapacitet ger onaturliga systemet mer självständighet som en organism med en utökad genetiska repertoar. Dessutom visar DOPA måttlig toxicitet på den bakteriestam som används i denna metod, och på 3 mM DOPA, celltillväxt minskas avsevärt, vilket resulterade i låg protein avkastning. Med hjälp av direkta inkorporering systemet, toxicitet minskades och protein avkastningen ökat trefaldigt.

AaRS mutant används för genetiska inkorporeringen av DOPA har måttlig effektivitet och trohet och innehåller Tyr på en låg koncentration av DOPA. 18 därför biosyntesen av DOPA i bakterieceller bör vara tillräckligt effektiv för att förhindra Tyr inkorporering. DOPA biosyntesen av TPL från katekol, ammoniak och pyruvat är en reversibel reaktion, och höga koncentrationer av utgångsmaterial krävs för en effektiv biosyntes. Dock kan inte katekol användas över 10 mM eftersom det är giftigt för den bakteriestam som används i detta protokoll. DTT koncentrationen är också viktigt i detta protokoll. DOPA visar dess toxicitet när det omvandlas till L-dopaquinone, och DTT läggs i odlingsmedium att minska oxidation. Vi observerat en minskning av celltillväxt när DTT koncentrationen var över 300 µM. För en optimal biosyntes och iblandning av DOPA, bör därför komponenterna (särskilt katekol och DTT) för odlingsmedium användas i lämpliga koncentrationer som beskrivs i detta protokoll.

Det här protokollet beskriver också tillämpningar av DOPA-innehållande proteiner för platsspecifika protein konjugation. L-dopaquinone genereras genom oxidation av DOPA effektivt reagerar med en ansträngd alkynen kopplad till en biokemisk sond. Denna cykloadditionen reaktion är vanligtvis snabbare än nukleofil addition reaktioner av aminer eller tioler. Oxidation av DOPA bör dock utföras i närvaro av både ett DOPA-innehållande protein och en ansträngd alkynen, att minimera de nukleofil addition av nukleofiler i proteinet. Ordningen för tillägg av reagenser för denna reaktion är därför kritisk.

Många onaturliga aminosyror finns tillgängliga för protein konjugation, och några av dem uppnå en snabb reaktionshastigheten och utmärkta konjugation effektivitet30,31,32,33. Dessa aminosyror innehåller biorthogonal funktionella grupper såsom azider, alkyner, ansträngda alkener eller alkyner och tetrazines. Även om de är användbara för platsspecifika protein konjugation, är många av dem dyra eller kommersiellt otillgängliga, vilket begränsar deras tillämpningar, särskilt hos dem som kräver storskaliga proteiner. Biosyntesen av DOPA från billiga utgångsmaterial och dess direkta införlivande kommer därför att vara användbar för läkemedels- och industriella applikationer som kräver storskaliga muterade proteiner som innehåller en biokemisk sond eller ett läkemedel (antikropp-läkemedel konjugat, ADC).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av globala Frontier forskningsprogrammet (NRF-2015M3A6A8065833), och grundläggande vetenskap forskningsprogrammet (2018R1A6A1A03024940) genom den nationella Research Foundation i Korea (NRF) finansieras av Korea regeringen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Plasmid Construction
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmid pEvol-DHPRS2 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).
DH10β Invitrogen C6400-03 Expression Host
Plasmid Mini-prep kit Nucleogen 5112 200/pack
Agarose Intron biotechnology 32034 500 g
Ethidium bromide Alfa Aesar L07482 1 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser  BIO-RAD 165-2100
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2089 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium Wako 018-10372 25 g
Chloramphenicol Alfa Aesar B20841 25 g
Agar SAMCHUN 214230 500 g
SOC medium Sigma S1797 100 mL
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
L(+)-Arabinose, 99% Acros 104981000 100 g
Pyrocatechol, 99% SAMCHUN P1387 25 g
Ammonium sulfate, 99% SAMCHUN A0943 500 g
pyruvic acid, 98% Alfa Aesar A13875 100 g
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% SAMCHUN S0891 1 kg
Potassium phophate, monobasic, 99% SAMCHUN P1127 1 kg
Magnesium sulfate, anhydrous, 99% SAMCHUN M0146 1 kg
D(+)-Glucose, anhydrous, 99% SAMCHUN D0092 500 g
Glycerol, 99% SAMCHUN G0269 1 kg
Trace metal mix a5 with co Sigma 92949 25 mL
L-Proline, 99% SAMCHUN P1257 25 g
L-Phenylalanine, 98.5% SAMCHUN P1982 25 g
L-Tryptophane JUNSEI 49550-0310 25 g
L-Arginine, 98% SAMCHUN A1149 25 g
L-Glutamine, 98% JUNSEI 27340-0310 25 g
L-Asparagine monohydrate, 99% SAMCHUN A1198 25 g
L-Methionine JUNSEI 73190-0410 25 g
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% SAMCHUN H0604 25 g
L-Threonine, 99% SAMCHUN T2938 25 g
L-Leucine JUNSEI 87070-0310 25 g
Glycine, 99% SAMCHUN G0286 25 g
L-Glutamic acid, 99% SAMCHUN G0233 25 g
L-Alanine, 99% SAMCHUN A1543 25 g
L-Isoleucine, 99% SAMCHUN I1049 25 g
L-Valine, 99% SAMCHUN V0088 25 g
L-Serine SAMCHUN S2447 25 g
L-Aspartic acid SAMCHUN A1205 25 g
L-Lysine monohydrochloride, 99% SAMCHUN L0592 25 g
3.2 Cell lysis
Imidazole, 99% SAMCHUN I0578 1kg
Sodium phosphate monobasic, 98% SAMCHUN S0919 1 kg
Sodium Chloride, 99% SAMCHUN S2907 1 kg
Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 milliliters SONIC & MATERIALS VCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 25 mL
Polypropylene column QIAGEN 34924 50/pack, 1 mL capacity
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA 
Sodium periodate, 99.8& Acros 419610050 5 g
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) 
Cy5.5-ADIBO  FutureChem FC-6119 1mg
6. Purification of Labeled GFP
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters MILLIPORE UFC500396 96/pack, 500ul capacity
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % Sigma 10708984001 10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X Thermofisher NP0007 10 mL
MES running buffer Thermofisher NP0002 500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels Thermofisher NO0321 12 well
Coomassie Brilliant Blue R-250 Wako 031-17922 25 g
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System Syngene G BOX Chemi XT4
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% SAMCHUN T1351 500 g
Hydrochloric acid, 35~37% SAMCHUN H0256 500 mL
Dodecyl sulfate sodium salt, 85% SAMCHUN D1070 250 g
Iodoacetamide Sigma I6125 5 g
Trypsin Protease, MS Grade Thermofisher 90057 5 x 20 µg/pack
C-18 spin columns Thermofisher 89870 25/pack, 200 µL capacity
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF
Acetonitirile, 99.5% SAMCHUN A0125 500 mL
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma C2020 10 g
Trifluoroacetic acid, 99% SAMCHUN T1666 100 g
MTP 384 target plate ground steel BC targets Bruker 8280784
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer Bruker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagatsu, T., Levitt, M., Udenfriend, S. Tyrosine hydroxylase: The initial step in norepinephrine biosynthesis. Journal of Biological Chemistry. 239, 2910-2917 (1964).
  2. Pinder, R. M. Possible dopamine derivatives capable of crossing the blood-brain barrier in relation to parkinsonism. Nature. 228 (5269), 358 (1970).
  3. Waite, J. H., Tanzer, M. L. Polyphenolic substance of mytilus edulis: novel adhesive containing L-DOPA and hydroxyproline. Science. 212 (4498), 1038-1040 (1981).
  4. Lee, H., Scherer, N. F., Messersmith, P. B. Single-molecule mechanics of mussel adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 12999-13003 (2006).
  5. Papov, V. V., Diamond, T. V., Biemann, K., Waite, J. H. Hydroxyarginine-containing polyphenolic proteins in the adhesive plaques of the marine mussel Mytilus edulis. Journal of Biological Chemistry. 270 (34), 20183-20192 (1995).
  6. Waite, J. H., Qin, X. Polyphosphoprotein from the adhesive pads of Mytilus edulis. Biochemistry. 40 (9), 2887-2893 (2001).
  7. Nicklisch, S. C., Waite, J. H. Mini-review: The role of redox in DOPA-mediated marine adhesion. Biofouling. 28 (8), 865-877 (2012).
  8. Silverman, H. G., Roberto, F. Understanding marine mussel adhesion. Marine Biotechnology. 9 (6), 661-681 (2007).
  9. Lee, B. P., Messersmith, P. B., Israelachvili, J. N., Waite, J. H. Mussel-inspired adhesives and coatings. Annual Review of Materials Research. 41, 99-132 (2011).
  10. Umeda, A., Thibodeux, G. N., Zhu, J., Lee, Y., Zhang, Z. J. Site-specific protein cross-linking with genetically incorporated 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine. ChemBioChem. 10 (8), 1302-1304 (2009).
  11. Umeda, A., Thibodeux, G. N., Moncivais, K., Jiang, F., Zhang, Z. J. A versatile approach to transform low-affinity peptides into protein probes with cotranslationally expressed chemical cross-linker. Analytical Biochemistry. 405 (1), 82-88 (2010).
  12. Xu, J., Tack, D., Hughes, R. A., Ellington, A. D., Gray, J. J. Structure-based non-canonical amino acid design to covalently crosslink an antibody-antigen complex. Journal of Structural Biology. 185 (2), 215-222 (2014).
  13. Burdine, L., Gillette, T. G., Lin, H. J., Kodadek, T. Periodate-triggered cross-linking of DOPA-containing peptide-protein complexes. Journal of the American Chemical Society. 126 (37), 11442-11443 (2004).
  14. Borrmann, E., et al. Strain-promoted oxidation-controlled cyclooctyne-1,2-quinone cycloaddition (SPOCQ) for fast and activatable protein conjugation. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 257-261 (2015).
  15. Ayyadurai, N., et al. Development of a selective, sensitive, and reversible biosensor by the genetic incorporation of a metal-binding site into green fluorescent protein. Angewandte Chemie International Edition. 50 (29), 6534-6537 (2011).
  16. Kim, B. J., Cheong, H., Hwang, B. H., Cha, H. J. Mussel-inspired protein nanoparticles containing iron(III)-DOPA complexes for pH-responsive drug delivery. Angewandte Chemie International Edition. 54 (25), 7318-7322 (2015).
  17. Alfonta, L., Zhang, Z., Uryu, S., Loo, J. A., Schultz, P. G. Site-specific incorporation of a redox-active amino acid into proteins. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14662-14663 (2003).
  18. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chemical Communications. 54 (24), 3002-3005 (2018).
  19. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
  20. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).
  21. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  22. Jang, S., Sachin, K., Lee, H. J., Kim, D. W., Lee, H. S. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2256-2261 (2012).
  23. Gobom, J., et al. Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid affinity sample preparation. A protocol for MALDI-MS peptide analysis in proteomics. Analytical Chemistry. 73 (3), 434-438 (2001).
  24. Mukai, T., et al. Highly reproductive Escherichia coli cells with no specific assignment to the UAG codon. Scientific Reports. 5, 9699 (2015).
  25. Lajoie, M. J., et al. Genomically recoded organisms expand biological functions. Science. 342 (6156), 357-360 (2013).
  26. Bryson, D. I., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases. Nature Chemical Biology. 13 (12), 1253-1260 (2017).
  27. Guo, J., Melancon, C. E., Lee, H. S., Groff, D., Schultz, P. G. Evolution of amber suppressor tRNAs for efficient bacterial production of proteins containing nonnatural amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 48 (48), 9148-9151 (2009).
  28. Lee, S., et al. A facile strategy for selective phosphoserine incorporation in histones. Angewandte Chemie International Edition. 52 (22), 5771-5775 (2013).
  29. Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M., Chin, J. W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature. 464 (7287), 441-444 (2010).
  30. Lang, K., Chin, J. W. Bioorthogonal reactions for labeling proteins. ACS Chemical Biology. 9 (1), 16-20 (2014).
  31. Lang, K., Chin, J. W. Cellular Incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  32. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angewandte Chemie International Edition. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  33. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. Journal of the American Chemical Society. 134 (6), 2898-2901 (2012).

Tags

Biokemi fråga 138 DOPA genetiska införlivande biosyntes tyrosin fenol-lyasen protein konjugation stam-främjade oxidation-kontrollerade cyclooctyne-1,2-quinone (SPOCQ) cykloadditionen
Genetiska införlivandet av biosyntetiseras L-dihydroxifenylalanin (DOPA) och dess tillämpning på Protein konjugation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, S., Lee, H. S. Genetic… More

Kim, S., Lee, H. S. Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation. J. Vis. Exp. (138), e58383, doi:10.3791/58383 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter