Summary
Her, præsenteres en protokol til medium-høj overførselshastighed analyse af protein fosforylering begivenheder på cellulært niveau. Phospho flowcytometri er en kraftfuld tilgang til at karakterisere signaling aberrationer, identificere og validere biomarkører og vurdere farmakodynamik.
Abstract
Afvigende celle signalering spiller en central rolle i udviklingen af kræft og progression. Mest roman målrettede behandlinger er faktisk rettet mod proteiner og protein funktioner, og celle signalering afvigelser kan derfor tjene som biomarkører at angive personlige behandlingsmuligheder. I modsætning til DNA og RNA analyser, kan ændringer i protein aktivitet mere effektivt evaluere de underliggende drug følsomhed og modstand mekanismer. Phospho flowcytometri er en kraftfuld teknik, der måler protein fosforylering begivenheder på cellulært niveau, et vigtigt element, der adskiller denne metode fra andre antistof-baserede tilgange. Metoden giver mulighed for simultan analyse af flere signaling proteiner. I kombination med fluorescerende celle stregkodesystem, kan større medium til høj overførselshastighed datasæt erhverves af standard forskellige hardware i kort tid. Phospho flowcytometri har applikationer såvel i undersøgelser af grundlæggende biologi i klinisk forskning, herunder signalering analyse, biomarkør opdagelse og vurdering af farmakodynamik. Her er en udførlig forsøgsplan fastsatte phospho flow analyse af renset perifert blod mononukleære celler, med kronisk lymfatisk leukæmiceller som eksempel.
Introduction
Phospho flowcytometri bruges til at analysere protein fosforylering niveauer på én celle opløsning. Det overordnede mål med metoden er at kortlægge cellulær signalering mønstre under specificerede betingelser. Ved at udnytte flowcytometri multiparameter kapacitet, kan flere signaling veje analyseres samtidig i forskellige delgrupper af en heterogene celle population som perifert blod. Disse træk tilbyde fordele i forhold til andre antistof-baserede teknologier såsom immunhistokemi, enzymmaerket assay (ELISA), protein array og omvendt fase protein array (RPPA)1. Phospho flowcytometri kan kombineres med fluorescerende celle stregkodesystem (FCB), hvilket betyder, at enkelte celle prøver er mærket med unik signaturer af fluorescerende farvestoffer, således at de kan være blandet sammen, farves og analyseret som en enkelt prøve2. Dette reducerer antistof forbruget, øger data robusthed gennem kombinationen af kontrol og behandlede prøver og øger hastigheden af erhvervelse. Den kombinerede FCB befolkning kan derefter opdelt i mindre prøver og farves med op til 35 forskellige phospho-specifikke antistoffer, afhængigt af mængden af start materiale. Store profilering eksperimenter kan derved køres med standard forskellige hardware. Phospho flowcytometri er blevet anvendt på profil signalerer veje i patient prøver fra flere hematological kræftformer, herunder kronisk lymfatisk leukæmi (CLL)3,4,5, akut myeloid leukæmi (AML) 6 og ikke-Hodgkin lymfomer7. Phospho flowcytometri er således en kraftfuld tilgang til at karakterisere signaling aberrationer, identificere og validere biomarkører og vurdere farmakodynamik.
Her tilbydes den optimerede protokol analyse af CLL patienten prøverne ved phospho flowcytometri (figur 1A). Eksempler på basal signaling karakterisering, anti-IgM/B-celle receptoren stimulation og narkotika undertrykkelse af netbårne er vist. En detaljeret beskrivelse af en FCB matrix er fastsat. Protokollen kan let tilpasses til andre suspension celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Blodprøver blev modtaget efter skriftlig informeret samtykke fra alle donorer. Undersøgelsen blev godkendt af det regionale udvalg for medicinske og sundhed Research etik af syd-øst Norge og forskning på menneskelige blod blev udført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen8.
Bemærk: Trin 1-3 skal udføres under sterile forhold i vævskultur hætte.
1. isolering af perifert blod mononukleære celler (PBMC) fra CLL patienten blodprøver
Forsigtig: Menneskeblod behandles efter regler for Biosikkerhed niveau 2.
- Fortynde blodet 1:1 med fosfatbufferet saltopløsning (PBS: 136.9 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10,1 mM Na2HPO4 x 2 H2O, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4) og overførsel til 50 mL rør (30 mL/tube).
- Omhyggeligt lag 10 mL af en tæthed gradient medium (f.eks.Lymphoprep) til bunden af røret ved hjælp af 10 mL pipette.
- Der centrifugeres ved 800 x g i 20 min. ved 4 ° C. PBMC er nu synligt på toppen af tæthed gradient medium lag.
- Bruge en Pasteur pipette til at overføre cellerne i to nye 50 mL rør. Vaskes to gange med PBS (fyld op rør).
- Der centrifugeres ved 350 x g i 15 min. Fjern supernatanten og resuspend i 3 mL PBS.
- Tælle celler ved hjælp af en foretrukne metode.
- Der centrifugeres celler på 350 x g i 5 min. Fjern supernatanten. Bemærk: Trin 1,8 til 3.2 er valgfri. Det er muligt at gå direkte til trin 3.3.
- Resuspend celler i føtal bovint serum (FBS) suppleret med 10% dimethylsulfoxid (DMSO) og fryse ned i passende alikvoter ved hjælp af cryo rør.
Bemærk: DMSO er giftigt for celler. Arbejde hurtigt når cellerne er blandet med FBS/DMSO. Celler kan være gemt lang sigt i flydende kvælstof.
2. optøning af celler
- Hurtigt optø cellerne i et 37 ° C vandbad.
Bemærk: DMSO er giftigt for celler. Arbejde hurtigt for at begrænse eksponeringen for DMSO. - Vaske cellerne en gang med 10 mL af kolde Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI 1640 med supplerende GlutaMAX, se Tabel af materialer).
- Der centrifugeres ved 300 x g i 5 min. supernatanten.
- Resuspend celler i RPMI 1640 medium suppleret med natrium pyruvat, MEM ikke-essentielle aminosyrer og penicillin/streptomycin (tilføjet på 1 x fortynding ifølge instruktioner) og 10% FBS. Overføre cellerne til en lille celle kultur kolbe og efterlade i en inkubator i 5% CO2, 37 ° C i 1 time at tillade cellerne til at kalibrere.
3. forberedelse af celler
- Tælle de levedygtige celler ved hjælp af en foretrukne metode.
- Overføre cellerne til en 50 mL tube og centrifugeres ved 300 x g i 5 min. supernatanten.
- Resuspend celler i RPMI 1640 medium (trin 2.2) suppleret med 1% FBS til ikke mere end 50 x 106 celler/mL.
- Overfør den nødvendige mængde af cellesuspension til brønde i en 96 godt V-bundplade.
Bemærk: Antallet af brønde svarer til antallet af betingelser for at blive testet. Udtages til en stimulation tidsforløb fra en enkelt brønd. Beregne 50 µL prøve pr. tidspunkt + 50 µL af dødvolumen. Gemme prøver for kompensation kontrolelementer (én unstained prøve + ét proeveeksemplar pr. stregkodesystem farvestof). - Overførsel 96 godt pladen til en forvarmet 37 ° C vandbad. Hvile celler i 10 min.
4. stimulering og fiksering af celler
Bemærk: Udfør trin 4-8 på lab bænken (dvs. ikke sterile).
Forsigtig: Den vigtigste ingrediens i lave Buffer jeg er PARAFORMALDEHYD, som er giftigt (indånding og hud kontakt). Håndterer med omhu.
- Forberede en 96 godt V-bund plade med 60 µL af lave Buffer jeg pr. brønd pr. prøve. Forlade i 37 ° C vandbad.
Bemærk: Celler: Fix buffer bør være 1:1. For at give mulighed for fordampning ved 37 ° C, er bufferen, Fix i første omgang i overflod. - Valgfrit, behandling af celler med narkotika før stimulation.
- Overføre en stikprøve, der er 50 µL til at lave pladen. Mix af pipettering op og ned.
- Eventuelt starte stimulation tidsforløb ved at føje 10 µg/mL anti-IgM til cellerne. Mix af pipettering op og ned.
- Overføre en 50 µL prøve at lave pladen på hvert tidspunkt. Mix af pipettering op og ned.
Bemærk: Anti-IgM induceret signalering startes som regel tidligt (minutter). - Forlade fix plade ved 37 ° C i 10 min, efter den sidste prøve er blevet tilføjet.
5. fluorescerende celle stregkodesystem (FCB)
Bemærk: Se tabel 1 for en liste over stregkodesystem reagenser.
- Vaske de faste celler 3 x med PBS (fyld op brøndene).
- Der centrifugeres 500 g ved x i 5 min. supernatanten.
- Forberede en 96 godt V-bund plade med stregkodesystem reagenser. Med pipette overfoeres 5 µL af hver stregkodesystem reagens pr. brønd i antallet af kombinationer for at plette alle prøver efter farvning matrix, fx i figur 1B. Hver prøve, vil have en unik kombination af forskellige stregkodesystem koncentrationer.
- Resuspend celler i 190 µL af PBS og overførsel til stregkodesystem plade. Blandes grundigt.
Bemærk: Pletten én erstatning prøve med den højeste endelige koncentration anvendt til hver stregkodesystem reagens og gemme én unstained prøve. - Forlade cellerne i 20 min. ved stuetemperatur i mørke.
- Vaske de farvede celler 2 x med flow vask (PBS, 1% FBS, 0,09% natriumazid) (fylde brøndene).
- Der centrifugeres 500 g ved x i 5 min. supernatanten.
- Tilføje 190 µL af flow vask til cellerne og kombinere barcoded prøver i en 15 mL tube. Overføre hver kompensation kontrol til en separat 1,7 mL tube.
- Der centrifugeres 500 g ved x i 5 min. supernatanten.
6. celle Permeabilization for intracellulære Antigen farvning
Forsigtig: Den vigtigste ingrediens i Perm Buffer III er methanol, der er giftige (indånding og hud kontakt) og brandfarlige. Håndterer med omhu.
- 2 mL af Perm Buffer III overføres til en 15 mL tube. Forlade ved-20 ° C, så det er iskold efter brug.
Bemærk: Perm Buffer kan stå ved-20 ° C fra starten af forsøget. - Tilføje 1,5 mL iskold Perm Buffer til befolkningens barcoded celle (i en 15 mL tube) og 100 µL til hver kompensation kontrol (i 1,7 mL rør) Dråbevist mens vortexing til at undgå, at cellerne klumper sig sammen.
- Overføre cellerne direkte til-80 ° C. Henstår i mindst 30 min.
Bemærk: Det er naturligt at afbryde forsøget på dette punkt. Celler i Perm Buffer kan være gemt langt sigt ved-80 ° C.
7. antistoffarvning
Bemærk: Se Tabel af materialer for en liste over rapporterede phospho-specifikke antistoffer.
- Overføre cellerne fra-80 ° C til en kasse med is.
- Vask 3 x med flow vask.
Bemærk: Det er vigtigt at tilføje flow vask i overskud til at se den celle pellet, fx, tilsættes 3 mL flow vask barcoded celle befolkning og 1 mL til hver kompensation kontrol. - Der centrifugeres 500 g ved x i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
- Resuspend barcoded cellen befolkningen i et volumen på flow vask, der giver 25 µL af cellesuspension pr. phospho-antistof pletten. Resuspend kompensation kontrolelementer i 200 µL af flow vask.
- Forberede antistoffer farvning i et 96 godt V-bundplade. Den endelige mængden vil være 50 µL/brønd. Pr. brønd, tilføje phospho-specifikke antistof fortyndet i flow vask til en endelige mængden af 10 µL, overflade markør fortyndet i flow vask til en endelige mængden af 15 µL og 25 µL af cellesuspension.
Bemærk: Antistof fortyndinger bør titreres før eksperimentet. Omfatte isotype kontrol. - Forlade cellerne i 30 min. ved stuetemperatur i mørke.
- Vaske de farvede celler 2 x med flow vask (fyld op brøndene).
- Der centrifugeres 500 g ved x i 5 min. supernatanten.
- Resuspend celler i 150 µL af flow vask.
8. forberedelse af kompensation kontrol
- Forberede de antistof konjugeret fluorokromer parallelt med den antistoffarvning kompensation kontrol. Bruge kompensation perler efter leverandørens anvisninger.
9. flow flowcytometri analyse
Bemærk: Eksperimentet kan køres på en flow Flowcytometret med en høj overførselshastighed Sampler (HTS).
- Optimere photomultiplier tube (PMT) spænding med den unstained kontrol.
- Køre kompensation objekter og beregne kompensationsmatrix.
- Køre prøver. Arrangementet bør i henhold til instrument-specifikationerne.
10. gating strategi og analyse af Data
- Importere FCS-filer fra eksperimentet til en strøm flowcytometri analyse software som FlowJo eller Cytobank (https://cellmass.cytobank.org).
- Gating strategi
- Vælg lymfocytter af plotte SSC-A versus FSC-A i en tæthed dot plot.
- Vise lymfocytter og vælg slåbrokker af plotte SSC-A versus FSC -W.
- Få vist enkelt celler og gate cellen type af plotte SSC-A versus den overflade markør.
- Vise celle type befolkning i en Pacific Blue versus SSC-A tæthed plot og vælge de forskellige FCB befolkning baseret på deres Pacific Blue farvning intensitet (Se figur 1A).
- Plot phospho antistof kanalen mod FCB kanal, eller som et heatmap (Se figur 1A) til at få vist hændelserne fosforylering.
- Beregne phospho-signaler ved hjælp af den inverse hyperbolske sinus (arcsinh) af MFI (median fluorescerende intensitet) phospho-signal versus isotype kontrol (basal fosforylering niveauer, se figur 1 d), eller af stimuleret versus unstimulated cellepopulationer (Se figur 1E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De vigtigste trin i phospho flow flowcytometri protokol er illustreret i figur 1A. I eksemplet præsenteres var CLL celler farvet med stregkodesystem reagens Pacific Blue på fire fortyndinger. Tre-dimensionelle stregkodesystem kan udføres ved at kombinere tre stregkodesystem farvestoffer, som illustreret i figur 1B. De individuelle prøver er derefter deconvoluted af efterfølgende gating på hver stregkodesystem reagens versus SSC-A (figur 1 c). Detaljerede oplysninger om stregkodesystem reagenser er angivet i tabel 1.
Efter proceduren beskrevet her, phospho-protein niveauer blev karakteriseret i B-celler fra CLL patienter og normal kontrol under forskellige betingelser3. Både basal og stimulation-induceret fosforylering niveauer af 20 signalering molekyler nedstrøms af B-celle receptoren (BCR) blev analyseret (Se Tabel af materialer til en liste over rapporterede phospho-specifikke antistoffer). Basal phospho-protein niveauer blev kortlagt i 22 CLL patienten prøver af gennemsnittet af normal kontrol. Denne analyse viste at STAT3 (pY705) er betydeligt upregulated i CLL celler (fig. 1 d). Konstituerende aktivering af STAT3 er blevet rapporteret i andre hematological maligniteter og er knyttet til modstand mod apoptose9.
For at identificere signaling aberrationer induceret gennem BCR vej, blev celler stimuleret med anti-IgM i op til 30 min. Det har vist sig at CLL celler fra patienter med IgVH unmutated status (UM-CLL) vise øget følsomhed over for anti-IgM stimulation10. Dette var faktisk observeret for fleste af de analyserede proteiner, men effekten var statistisk signifikant kun for AKT (pS473) (figur 1E, UM-CLL versus M-CLL og Normal). For at teste, hvis den afvigende AKT (pS473) signal kunne vendes blev CLL celler udsat for PI3Kδ hæmmer idelalisib, som bruges i klinikken til at behandle CLL patienter11. Som vist i figur 1F, blev AKT (pS473) niveauer væsentligt reduceret ved idelalisib behandling i en koncentration-afhængige måde, viser, at kinase hæmmere kan anvendes til at normalisere afvigende signalering i CLL celler.
Disse resultater viser, at phospho flowcytometri i kombination med FCB er en kraftfuld tilgang til at udføre signaling analyse undersøgelser, identificere potentielle biomarkører og vurdere farmakodynamik.
Figur 1. Arbejdsfordeling og eksempler på anvendte phospho flow flowcytometri analyse.
(A) vigtigste trin i proceduren phospho flow er illustreret. Celler er først stimuleres, så fast og udsat for FCB, før de kan kombineres i ét rør til permeabilization og efterfølgende antistoffarvning. Cellerne er kørt på en flow forskellige og cellepopulationer er deconvoluted af gating under dataanalyse. Resultaterne kan visualiseres som histogrammer eller heatmaps, som vist. (B) eksempel på en tre-dimensionel FCB farvning matrix ved hjælp af Alexa Fluor 488 (tre fortyndinger), Pacific Blue (fire fortyndinger) og Pacific Orange (tre fortyndinger). Denne matrix vil tillade kombinationen af op til 36 prøver. (C) cellen FCB befolkning kan være deconvoluted af gating på hver FCB kanal versus SSC-A. Kombination af gates i den analyse software genererer de korrekte befolkninger til analyse. (D) Unstimulated B celler fra raske donorer (n = 25) og CLL patienter (n = 22) blev udsat for analyse af phospho flow følge fremgangsmåden under (A). Basal fluorescens intensitet signaler blev beregnet i forhold til IgGκ isotype kontrol som arcsinh forhold. Signaler i CLL B-celler blev derefter normaliseret til signaler i B-celler fra normal kontrol. p < 0,01, beregnet ved en uparret stikprøve t-test. UM-CLL: IgVH unmutated CLL, M-CLL: IgVH muteret CLL. Symboler af samme farve repræsenterer patientprøver, som grupperet i en hierarkisk agglomerative klynge baseret på niveauer 20 phospho-proteiner3. (E) B celler fra normal kontrol (n = 10, betyder + SEM) eller CLL patienter (n = 11 [M-CLL] og n = 8 [UM-CLL], betyder + SEM) blev stimuleret med anti-IgM for den angivne tidsforløb og underkastes phospho flow analyse. Fluorescens intensitet signaler blev målt i forhold til unstimulated prøver og vist som arcsinh forhold. p < 0,01 (Normal vs UM-CLL) og ***p < 0,001 (M-CLL vs UM-CLL), beregnes af flere sammenligning test med Holm-Sidak korrektion. UM-CLL: IgVH unmutated CLL, M-CLL: IgVH muteret CLL. (F) CLL celler blev inkuberet med DMSO eller idelalisib som angivet i 20 min. før anti-IgM stimulation i 3 min. Cellerne blev derefter behandlet efter phospho flow protokol. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,0001, beregnet ved flere sammenligning test med Holm-Sidak korrektion. UM-CLL: IgVH unmutated CLL, M-CLL: IgVH muteret CLL. Se (D) for forklaring af symbol farve. (D-F) er ændret fra3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Seriel fortyndet som følger (begyndende med stamopløsningen) | ||||||
| Stregkodesystem reagens | Stock koncentration | #1 | #2 | #3 | #4 | unstained |
| Alexa Fluor 488 | 10 mg/mL | 1: 500 | 1:5 | x | ||
| Pacific Blue | 10 mg/mL | 1: 2500 | 1:4 | 1:4 | 1:10 | |
| Pacific Orange | 2 mg/mL | 1:50 | 1:12 | 1:24 | ||
Bord 1. Stregkodesystem reagenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Phospho flowcytometri er en kraftfuld teknik til at måle fosforylering Proteinniveau i enkelte celler. Da metoden bygger på farvning med antistoffer, er phospho flowcytometri begrænset af antistof tilgængelighed. Desuden, for at opnå pålidelige resultater, alle antistoffer bør titreres og kontrollerede før brug. En detaljeret protokol til titrering af phospho-specifikke antistoffer har været beskrevet andetsteds12. Under panel design er overvejelse af signal-støj-forholdet kritisk. I eksemplet præsenteres var alle phospho-antistoffer konjugeret med Alexa Fluor 647. Denne fluorophore giver ofte optimal forskellen mellem prøver med lav versus høje niveauer af phospho-protein. Desuden ved hjælp af kun én farve til phospho-proteiner vil de andre kanaler være frit for FCB og overflade markør farvning. Dette panel design reducerer spillover til phospho-kanal. Ved at have alle phospho-antistoffer konjugeret med den samme fluorophore, forenkles dataanalyse også.
I præsenteret protokollen, blev alle antistof stainings udført efter fiksering og permeabilization af celler. Det er dog vigtigt at huske at overflade markør farvning kan blive negativt påvirket af fiksering og permeabilization skridt på grund af denaturering af overflade antigen eller øget uspecifik farvning13. Brugeren bør derfor teste reaktiviteten af antistoffer på et sag til sag. Ressourcer på kompatible kloner kan også være nyttigt, såsom oversigt over forskellige fiksering/permeabilization procedurer og deres kompatibilitet med forskellige antistoffer på https://www.cytobank.org/facselect/.
Protein fosforylering eller nedtrapning fosforylering er en forbigående ændring, der opstår i svar på både ydre og indre signaler. Når man sammenligner fosforylering mønstre, er det derfor afgørende, at forsøgene udføres på lignende betingelser. Hvornår studerer signalering i primærelementer fra blod, faktorer, der kunne påvirke resultatet omfatter tid gået efter tegning af blod, betingelser for opbevaring og hvor længe de isolerede celler er udhvilet før indledningen af eksperimentet. Når man sammenligner signaling mønstre i cryo bevaret celler og frisk isolerede celler fra blod, kunne kun meget mindre betydelige forskelle observeret (Skånland, upubliceret). Dog er det stadig tilrådeligt at bruge cryo bevaret normale celler som et kontrolelement, når man studerer biobanked patientprøver, for eksempel. De optimale betingelser for at udføre phospho flow flowcytometri eksperimenter og virkningen af eksterne faktorer bør prøves af den enkelte bruger.
Her præsenteres en protokol for phospho flow analyse af suspension celler. Protokollen kan tilpasses til andre celletyper, men det er en forudsætning, at cellerne er i suspension som enkelt celler analyseres ved flowcytometri. Proceduren for at opnå dette skal være vanskelige at bevare, og ikke påvirke fosforylering mønstre. Eksempler findes hvor vedhængende celler er løsrevet fra de dyrkningsbaserede parabol af kolde trypsination12,14, eller er snarere vokset på mikrokugler15. Når det kommer til phospho flowcytometri på solid væv, findes en rapport på lunge tumorer hvor enkelt celler blev opnået ved at overføre celler gennem et rør med en celle si16. For nylig, phospho flowcytometri blev kombineret med en ny tilgang betegnes opdeling til intracellulær signalering i enkelt epitelceller fra væv (DISSEKERE) for at studere phospho-proteiner i epitelvæv17 og kolorektal cancer 18.
FCB er et afgørende skridt i protokollen, da deconvolution prøver i slutningen af forsøget bygger på forskellige FCB populationer. For at opnå dette, skal cellerne administrationsprocedurerne farves. Det er derfor vigtigt at forberede et stregkodesystem plade, som cellerne kan tilføjes. Tilføje reagenser til cellerne vil resultere i ujævn farvning og blandede befolkninger, der ikke kan være deconvoluted af gating. Det anbefales at køre en test af stregkodesystem fortyndinger, før eksperimentet udføres som farvning intensiteten er celletype afhængige.
Ekstra antistof-baserede teknikker såsom protein array og omvendt fase protein array (RPPA) kan anvendes til kvantificering af phospho-protein niveauer i et medium til høj overførselshastighed måde. Dog skelne nogle kvaliteter af phospho flowcytometri denne metode fra de andre. En vigtig fordel af phospho flowcytometri er, at det giver mulighed for enkelt celle profilering. Ved at inkludere overflade markører for forskellige cellulære delgrupper, kan mellem cellulære heterogenitet påvises. Kombination med FCB giver desuden mulighed for analyse af flere betingelser i samme eksperimentelle køre. Disse funktioner gør phospho flowcytometri en attraktiv metode for fremtidige ansøgninger i biomarkør opdagelse og præcision medicin19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har intet at videregive.
Acknowledgments
Dette arbejde blev udført i laboratoriet af Professor Kjetil Taskén, og blev støttet af den norske Cancer Society og Stiftelsen Kristian Gerhard Jebsen. Johannes Landskron og Marianne Enger er anerkendt for kritisk læsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10270169 | Additive to cell culture medium |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | Additive to cell culture medium |
| MEM non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | Additive to cell culture medium |
| Lymphoprep | Alere Technologies AS | 1114547 | Density gradient medium |
| Anti-IgM | Southern Biotech | 2022-01 | For stimulation of the B cell receptor |
| BD Phosflow Fix Buffer I | BD | 557870 | Fixation buffer |
| BD Phosflow Perm Buffer III | BD | 558050 | Permeabilization buffer |
| Alexa Fluor 488 5-TFP | ThermoFisher Scientific | A30005 | Barcoding reagent |
| Pacific Blue Succinimidyl Ester | ThermoFisher Scientific | P10163 | Barcoding reagent |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | ThermoFisher Scientific | P30253 | Barcoding reagent |
| Compensation beads | Defined by user | Correct species reactivity | |
| Falcon tubes | Defined by user | ||
| Eppendorf tubes | Defined by user | ||
| 96 well V-bottom plates | Defined by user | Compatible with the flow cytometer | |
| Centrifuges | Defined by user | For Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates | |
| Water bath | Defined by user | Temperature regulated | |
| Flow cytometer | Defined by user | With High Throughput Sampler (HTS) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen | |||
| AKT (pS473) | Cell Signaling Technologies | 4075 | Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| ATF-2 (pT71) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8398 | Clone: F-1 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| BLNK (pY84) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558443 | Clone: J117-1278 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY223)/Itk (pY180) | Beckton Dickinson Pharmingen | 564846 | Clone: N35-86 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY551) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558129 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| Btk (pY551)/Itk (pY511) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558134 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| CD3ζ (pY142) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558489 | Clone: K25-407.69 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Histone H3 (pS10) | Cell Signaling Technologies | 9716 | Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| IκBα | Cell Signaling Technologies | 5743 | Clone: L35A5 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| LAT (pY171) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558518 | Clone: I58-1169 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Lck (pY505) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558577 | Clone: 4/LCK-Y505 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| MEK1 (pS298) | Beckton Dickinson Pharmingen | 560043 | Clone: J114-64 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| NF-κB p65 (pS529) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558422 | Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| NF-κB p65 (pS536) | Cell Signaling Technologies | 4887 | Clone: 93H1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| p38 MAPK (pT180/Y182) | Cell Signaling Technologies | 4552 | Clone: 28B10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p44/42 MAPK (pT202/Y204) | Cell Signaling Technologies | 4375 | Clone: E10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p53 (pS15) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: 16G8 Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS20) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS37) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS46) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS392) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| PLCγ2 (pY759) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558498 | Clone: K86-689.37 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Rb (pS807/pS811) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558590 | Clone: J112-906 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| S6-Ribos. Prot. (pS235/236) | Cell Signaling Technologies | 4851 | Clone: D57.2.2E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SAPK/JNK (pT183/Y185) | Cell Signaling Technologies | 9257 | Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| SLP76 (pY128) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558438 | Clone: J141-668.36.58 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| STAT1 (pY701) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612597 | Clone: 4a Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT3 (pY705) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557815 | Clone: 4/P-STAT3 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| STAT4 (pY693) | Zymed/ThermoFisher Scientific | 71-7900 | Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry, Clin Immunol, 100(3): 270-6 |
| STAT5 (pY694) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612599 | Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT6 (pY641) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612601 | Clone: 18/P-Stat6 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SYK (pY525/Y526) | Cell Signaling Technologies | 12081 | Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| ZAP70/SYK (pY319/Y352) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557817 | Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
References
- Lu, Y., et al. Using reverse-phase protein arrays as pharmacodynamic assays for functional proteomics, biomarker discovery, and drug development in cancer. Seminars in Oncology. 43 (4), 476-483 (2016).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
- Myhrvold, I. K., et al. Single cell profiling of phospho-protein levels in chronic lymphocytic leukemia. Oncotarget. 9 (10), 9273-9284 (2018).
- Parente-Ribes, A., et al. Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce CD40L-induced proliferation of chronic lymphocytic leukemia cells but not normal B cells. Haematologica. 101 (2), e59-e62 (2016).
- Blix, E. S., et al. Phospho-specific flow cytometry identifies aberrant signaling in indolent B-cell lymphoma. BMC Cancer. 12, 478 (2012).
- Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
- Myklebust, J. H., et al. Distinct patterns of B-cell receptor signaling in non-Hodgkin lymphomas identified by single-cell profiling. Blood. 129 (6), 759-770 (2017).
- World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION. 310 (20), 2191-2194 (2013).
- Siveen, K. S., et al. Targeting the STAT3 signaling pathway in cancer: role of synthetic and natural inhibitors. Biochimica et Biophysica Acta. 1845 (2), 136-154 (2014).
- Fabbri, G., Dalla-Favera, R. The molecular pathogenesis of chronic lymphocytic leukaemia. Nature Reviews Cancer. 16 (3), 145-162 (2016).
- Arnason, J. E., Brown, J. R. Targeting B Cell Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia. Current Oncology Reports. 19 (9), 61 (2017).
- Landskron, J., Tasken, K. Phosphoprotein Detection by High-Throughput Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1355, 275-290 (2016).
- Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. Journal of Immunology. 175 (4), 2357-2365 (2005).
- Pollheimer, J., et al. Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial activation that selectively targets nonquiescent cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), e47-e55 (2013).
- Ertsås, H. C., Nolan, G. P., LaBarge, M. A., Lorens, J. B. Microsphere cytometry to interrogate microenvironment-dependent cell signaling. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 9 (2), 123-134 (2017).
- Lin, C. C., et al. Single cell phospho-specific flow cytometry can detect dynamic changes of phospho-Stat1 level in lung cancer cells. Cytometry A. 77 (11), 1008-1019 (2010).
- Simmons, A. J., et al. Cytometry-based single-cell analysis of intact epithelial signaling reveals MAPK activation divergent from TNF-alpha-induced apoptosis in vivo. Molecular Systems Biology. 11 (10), 835 (2015).
- Simmons, A. J., et al. Impaired coordination between signaling pathways is revealed in human colorectal cancer using single-cell mass cytometry of archival tissue blocks. Science Signaling. 9 (449), rs11 (2016).
- Friedman, A. A., Letai, A., Fisher, D. E., Flaherty, K. T. Precision medicine for cancer with next-generation functional diagnostics. Nature Reviews Cancer. 15 (12), 747-756 (2015).
