Summary
여기, 세포 수준에서 단백질 인 산화 이벤트의 중간-높은 처리량 분석을 위한 프로토콜 제공 됩니다. 인 cytometry 신호 차 특성, 식별 바이오 마커, 유효성을 검사 하 고 pharmacodynamics를 평가 하는 강력한 접근 이다.
Abstract
벗어난 셀 신호 암 개발 및 진행에 중심 역할을 하고있다. 가장 새로운 표적으로 한 치료는 실제로 단백질 및 단백질 기능에서 감독과 셀 신호 착오 따라서 맞춤된 치료 옵션을 나타내는 생체 역할 수 있습니다. DNA와 RNA 분석, 반대로 변화 단백질 활동에 보다 효율적으로 기본 약물 감도 및 저항 메커니즘을 평가할 수 있다. 인 cytometry 단백질 인 산화 이벤트는 세포 수준에서 다른 항 체 기반 접근에서이 메서드를 구별 하는 중요 한 기능을 측정 하는 강력한 기술입니다. 메서드는 여러 신호 전달 단백질의 동시 분석에 대 한 수 있습니다. 형광 세포 바코드와 함께, 짧은 시간에 표준 cytometer 하드웨어에 의해 더 큰 매체-높은 처리량 데이터 집합을 취득 수 있습니다. 인 cytometry 응용 프로그램 기본 생물학의 연구와 임상 연구에서, 신호 분석, 바이오 마커 발견과 pharmacodynamics의 평가 포함 하 여 있다. 여기, 자세한 실험 프로토콜의 예를 들어 만성 림프모구 백혈병 세포를 사용 하 여 순화 된 말 초 혈액 단 세포 인 흐름 분석을 위해 제공 됩니다.
Introduction
인 cytometry는 단일 셀 해상도 단백질 인 산화 수준을 분석 하는 데 사용 됩니다. 방법의 전반적인 목표는 지정 된 조건에서 세포 신호 패턴을 지도. Cytometry multiparameter 용량을 이용 하 여 여러 신호 전달 경로 말 초 혈액 등 다른 유형의 세포 인구의 다른 하위 집합에 동시에 분석할 수 있습니다. 이러한 특성에는 다른 항 체 기반 기술 immunohistochemistry, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA), 단백질 배열 등 역 위상 단백질 배열 (RPPA)1에 비해 이점을 제공합니다. 인 cytometry 형광 세포 바코드 (FCB)를 함께 혼합, 스테인드 하 수 단일 샘플2분석 개별 셀 샘플 형광 염료의 독특한 서명으로 표시 됩니다 즉 결합 될 수 있다. 이 항 체 소비 감소, 제어 및 치료 샘플의 조합을 통해 데이터 안정성을 증가 하 고 수집의 속도 향상 시킵니다. 결합 된 FCB 인구 다음 작은 샘플을 나누어 하 고 최대 35 가지 인 특정 항 체, 시작 물자의 양에 따라 물 들일 수 있습니다. 대형 프로 파일링 실험, 표준 cytometer 하드웨어로 실행할 수 있습니다. 인 cytometry 만성 림프모구 백혈병 (CLL)3,,45, 급성 골수성 백혈병 (AML)을 포함 한 여러 혈액 암에서 환자 샘플에서 통로 신호 하는 프로 파일에 적용 된 6 과 비 Hodgkin 림프 종7. 인 cytometry 따라서 신호 차 특성, 식별 및 바이오 마커, 유효성 평가 하 pharmacodynamics 강력한 접근 이다.
여기, 인 cytometry에 의해 CLL 환자 샘플의 분석을 위해 최적화 된 프로토콜 (그림 1A) 제공 됩니다. 기저 신호 특성화, 안티-IgM/B 세포 수용 체 자극 및 약 섭 동 예 표시 됩니다. FCB 매트릭스에 대 한 자세한 설명이 제공 됩니다. 프로토콜은 쉽게 다른 현 탁 액 셀 형식에 적용할 수 있습니다.
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Protocol
혈액 샘플은 모든 기증자 로부터 서 면된 동의 따라 접수 됐다. 연구는 의료 및 건강 연구 윤리의 남쪽-동쪽 노르웨이 지역 위원회에 의해 승인 되었다 하 고 인간의 피에 대 한 연구8헬싱키 선언 따라 실시 됐다.
참고: 1-3 단계 조직 문화 후드에서 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다.
1. 절연 CLL 환자 혈액 샘플에서 주변 혈액 단 셀 (PBMCs)
주의: 인간의 피는 Biosafety 수준 2에 대 한 규정에 따라 처리 되어야 합니다.
- 혈액 인산 염 버퍼 식 염 수와 1:1 희석 (PBS: 136.9 m NaCl, 2.7 m m KCl, 10.1 m m 나2HPO4 x 2 H2O, 1.8 m m KH2포4, pH 7.4 m) 및 50 mL 튜브 (30 mL/튜브)에 전송.
- 신중 하 게 10 mL 피 펫을 사용 하 여 튜브의 하단에 10 mL 밀도 그라데이션 매체 (예, Lymphoprep)의 레이어.
- 4 ° c.에 20 분 동안 800 x g에서 원심 분리기 PBMCs는 지금 밀도 그라데이션 중간 계층의 위에 볼 수 있습니다.
- 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 두 개의 새로운 50 mL 튜브에 세포를 전송. PBS (튜브를 채우기) 두 번 씻어.
- 350 x g 15 분 삭제는 상쾌한에 centrifuge 고 3 ml PBS의 resuspend.
- 선호 하는 방법을 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
- 350 x g 5 분 삭제에 대 한에 셀은 상쾌한 원심. 참고: 1.8 3.2 단계는 선택적입니다. 3.3 단계에 직접 진행이 가능 하다.
- Resuspend 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 보충에 있는 세포 및 곳을 알아내는 튜브를 사용 하 여 적합 한 aliquots에 아래로 동결.
참고: DMSO는 세포에 독성이 있다. 셀 FBS/DMSO와 혼합 되어 한번에 빨리 작동. 셀 액체 질소에 긴 기간 저장된 될 수 있습니다.
2. 셀의 해빙
- 신속 하 게 녹여 37 ° C 물 욕조에 셀.
참고: DMSO는 세포에 독성이 있다. 빨리 DMSO에 노출을 제한 하는 작업. - 셀 (RPMI 1640 추가 GlutaMAX 참조 테이블의 자료) 차가운 로스웰 파크 기념 연구소 매체의 10 mL을 한번 씻어.
- 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다.
- Resuspend 나트륨 pyruvate, MEM 비필수 아미노산 및 페니실린/스 (지시에 따라 1 x 희석에 추가)와 10% 보충 RPMI 1640 매체에 셀 FBS. 작은 세포 배양 플라스 크에 세포를 전송 하 고 5% CO2, 보정 셀 수 있도록 1 시간 동안 37 ° C 배양 기에서 두고.
3입니다. 셀의 준비
- 선호 하는 방법을 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다.
- 50 mL 튜브에 세포를 전송 및 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기는 상쾌한 삭제.
- 1% 보충 RPMI 1640 매체 (단계 2.2)에 셀 resuspend 더 이상 50 x 106 셀/ml FBS.
- 96 잘 V 하단 플레이트에 웰 스에 세포 현 탁 액의 필요한 금액을 전송 합니다.
참고: 우물의 수 테스트 조건의 수에 해당 합니다. 자극 시간 코스에 대 한 샘플에서 단일 잘 그려집니다. 시간-포인트 + 죽은 볼륨의 50 µ L 당 50 µ L 샘플을 계산 합니다. (한 흠 없는 샘플 + 바코드 염료 당 하나의 샘플) 보상 컨트롤에 대 한 샘플을 저장 합니다. - 37 ° C를 미리가 열된 물 욕조에 96 잘 접시를 전송. 10 분에 대 한 셀을 휴식.
4. 자극과 셀의 고정
참고: (즉, 하지 무 균) 실험실 벤치에 4-8 단계를 수행 합니다.
주의: 수정 버퍼의 주요 성분입니다 독성 paraformaldehyde (흡입 및 피부 접촉). 관심을가지고 처리 합니다.
- 고정 버퍼의 60 µ L 96 잘 V 하단 플레이트를 준비 나 잘 샘플 당 당. 37 ° C 물 목욕에 남겨 주세요.
참고: 셀: 수정 버퍼 1:1 이어야 한다. 37 ° C에 증발을 허용 하기 위하여 수정 버퍼는 처음에 풍부 하 게. - 필요에 따라 셀 자극 하기 전에 마약을 취급 합니다.
- 50 µ L 컨트롤 샘플 수정 접시에 전송 합니다. 아래로 pipetting으로 혼합.
- 필요에 따라 셀에 10 µ g/mL 안티-IgM를 추가 하 여 자극 시간 과정을 시작 합니다. 아래로 pipetting으로 혼합.
- 각 시간 점에서 50 µ L 샘플 수정 접시에 전송. 아래로 pipetting으로 혼합.
참고: 안티-IgM 유도 일반적으로 일찍 시작 신호 (분). - 마지막 샘플 추가 된 후 10 분 동안 37 ° C에서 수정 접시를 남겨 주세요.
5. 형광 셀 바코드 (FCB)
참고: 바코드 시 약의 목록은 표 1 을 참조 하십시오.
- 고정된 셀 3 워시 x PBS (우물을 채우기).
- 5 분에 대 한 500 x g에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다.
- 시 약 바코드와 96 잘 V-아래 접시를 준비 합니다. 피펫으로 5 µ L 조합 얼룩 얼룩 매트릭스, 예를 들어, 그림 1B에서 다음 모든 샘플 하는 데 필요한 수에 잘 당 각 바코드 시 약의. 각 샘플은 다른 바코드 농도의 독특한 조합이 있을 것 이다.
- PBS 및 바코드 접시에 전송의 190 µ L 셀 resuspend 철저 하 게 혼합.
참고: 각 바코드 시 약 사용 높은 최종 농도와 하나의 보상 샘플을 얼룩 그리고 한 흠 없는 샘플 저장. - 어둠 속에서 실 온에서 20 분에 대 한 셀을 둡니다.
- 씻으십시오 스테인드 셀 2 흐름 세척 (PBS, 1 %FBS, 0.09% 나트륨 아 지 드)와 x (우물 채워).
- 5 분에 대 한 500 x g에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다.
- 셀에 흐름 세척의 190 µ L을 추가 하 고 결합 한 15 mL 튜브에 바코드 샘플. 별도 1.7 mL 튜브 각 보상 제어 전송.
- 5 분에 대 한 500 x g에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다.
6. 세포내 항 원 얼룩에 대 한 Permeabilization 셀
주의: 페름 버퍼 III의 주요 성분이 이다 메탄올 독성 (흡입 및 피부 접촉)과 연. 관심을가지고 처리 합니다.
- 15 mL 튜브에 파 마 버퍼 III의 2 개 mL를 전송. 그래서 사용 시 얼음은-20 ° C에 둡니다.
참고: 페름 버퍼 실험의 시작에서-20 ° C에서 남아 있을 수 있습니다. - 바코드 셀 인구 (15 mL 튜브)에 얼음 처럼 차가운 페름 버퍼의 1.5 mL 및 100 µ L를 추가할 각 보상 컨트롤 (1.7 mL 튜브) drop-wise 세포 덩어리 같이 피하려고 vortexing 동안.
- 셀-80 ° c.에 직접 전송 최소 30 분 동안 둡니다.
참고: 그것은 시점에서 실험을 일시 중지 하는 자연입니다. 셀 파 마 버퍼에 저장 된 장기-80 ° c.에 수 있습니다.
7. 항 체 얼룩이 지기
참고: 보고 인 특정 항 체의 목록 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
- -80 ° C에서 얼음의 상자 셀을 전송.
- 씻어 3 배 흐름 세척.
참고: 참조 셀 펠 릿을 초과에서 흐름 세척을 추가 하는 것이 중요 하다, 예를 들어, 각 보상 제어 흐름 세척 바코드 세포 인구를 1 mL의 3 개 mL를 추가. - 4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.
- 인 항 체 얼룩 당 세포 현 탁 액의 25 µ L를 수 있는 흐름 세척의 볼륨에 바코드 셀 인구 resuspend. 보상 제어 흐름 세척의 200 µ L에서 resuspend.
- 96 잘 V 하단 플레이트에 얼룩에 대 한 항 체를 준비 합니다. 마지막 볼륨 50 µ L/잘 될 것입니다. 잘, 당 10 µ L, 표면 표식 15 µ L, 그리고 세포 현 탁 액의 25 µ L의 최종 볼륨을 흐름을 세척에 희석의 최종 볼륨을 흐름을 세척에 희석 인 특정 항 체를 추가 합니다.
참고: 항 체 희석 실험 전에 적정 한다. Isotype 컨트롤을 포함 합니다. - 어둠 속에서 실 온에서 30 분에 대 한 셀을 둡니다.
- 씻으십시오 스테인드 셀 2 x 흐름 세척 (우물을 채우기).
- 5 분에 대 한 500 x g에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다.
- 셀의 흐름 워시 150 µ L에 resuspend
8입니다. 보상 컨트롤의 준비
- 항 체 활용 된 형광 항 체 염색 법 병행에서에 대 한 보상 컨트롤을 준비 합니다. 공급 업체의 지침에 따라 보상 구슬을 사용 합니다.
9. 교류 Cytometry 분석
참고: 실험은 교류 cytometer는 높은 처리량 샘플러 (HTS)와 함께 실행할 수 있습니다.
- 광 전 증폭 관 관 (PMT) 전압 흠 없는 컨트롤을 최적화 합니다.
- 보상 제어를 실행 하 고 보상 매트릭스를 계산 합니다.
- 샘플을 실행 합니다. 이벤트 비율이 악기 사양에 따라 해야 합니다.
10. 게이팅 전략 및 데이터 분석
- FlowJo 또는 Cytobank (https://cellmass.cytobank.org) 같은 흐름 cytometry 분석 소프트웨어에 실험에서 FCS 파일을 가져옵니다.
- 제어 전략
- SSC-A 대 그려서 림프 톨을 선택 밀도 점 플롯에 FSC-A.
- 세포를 표시 하 고 SSC-A 대 FSC-W. 그려서는 singlets를 선택
- 단일 셀과 게이트 SSC-A 대 표면 마커 그려서 입력 하는 셀을 표시 합니다.
- SSC A 밀도 음모 대 태평양 블루 셀 유형 인구를 표시 하 고 그들의 태평양 파랑 얼룩 강도에 따라 다른 FCB 인구 선택 ( 그림 1A참조).
- 인 항 체 채널 또는 있는 heatmap FCB 채널에 대 한 플롯 ( 그림 1A)를 참조 인 산화 이벤트 표시.
- 인-신호 인 신호 대 isotype 컨트롤의 MFI (중간 형광 강도)의 역 하이퍼볼릭 사인 (arcsinh)를 사용 하 여 계산 (기저 인 산화 수준 그림 1D참조), 또는 자극 대 의 unstimulated 세포 인구 ( 그림 1E참조).
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Representative Results
인 흐름 cytometry 프로토콜의 주요 단계는 그림 1A에 설명 됩니다. 제시 예에서 CLL 세포 4 희석에 바코드 시 약 태평양 블루와 스테인드 했다. 3 차원 바코드 그림 1B에서 볼 수 있듯이 3 barcoding 염료를 결합 하 여 수행할 수 있습니다. 개별 샘플은 다음 후속 게이팅 각 바코드 시 약 대 SSC-A (그림 1C)에 의해 deconvoluted. 바코드 시 약에 대 한 자세한 정보는 표 1에 나열 됩니다.
여기에 설명 된 절차에 따라 인 단백질 레벨 B 세포 CLL 환자와 다양 한 조건3일반 컨트롤에서 특징 했다. B 세포 수용 체 (BCR)의 하류 분자 분석 되었다 신호 20의 두 기저와 자극 유발 인 산화 수준 (보고 인 특정 항 체의 목록에 대 한 재료의 표 참조). 기저 인 단백질 레벨은 일반 컨트롤의 평균을 기준으로 22 CLL 환자 샘플이 매핑됩니다. 이 분석은 보여주었다는 STAT3 (pY705)은 크게 upregulated CLL 세포 (그림 1D). 구성 적인 STAT3 활성화 다른 혈액 악성 종양에서 알려졌다 고 apoptosis9저항 연결.
BCR 통로 통해 유도 하는 신호 차를 식별, 셀 안티-IgM 최대 30 분으로 자극 했다. 그것은 CLL 세포 환자에서 IgVH unmutated 상태 (UM-CLL) 디스플레이 증가 감도 안티 IgM 자극10으로 표시 되었습니다. 이 실제로 분석된 단백질의 대부분을 위해 관찰 되었다 하지만 효과 AKT (pS473)에 대 한 통계적 (그림 1E, UM CLL 대 M CLL와 정상). 탈 선 AKT (pS473) 신호를 반전할 수 있는지 테스트 하려면 CLL 세포 CLL 환자11을 치료 하는 병원에서 사용 되는 PI3Kδ 억제제 idelalisib에 노출 되었다. 그림 1 층에서처럼 AKT (pS473) 수준 kinase 억제제 정상화 CLL 세포에 탈 선 신호에 적용할 수 있는 시연 농도 의존 방식에서에 idelalisib 치료에도 감소 크게 되었다.
이러한 결과 인 cytometry FCB와 함께에서 신호 분석 연구를 수행 하 고, 잠재적인 생체 식별 하 고 pharmacodynamics를 평가 하는 강력한 접근 이다.
그림 1입니다. 작업 흐름 및 적용된 인 흐름 cytometry 분석의 예.
(A) 메인 인 흐름 절차의 단계는 설명. 세포는 처음 자극, 다음 고정 복종 고 FCB를 전에 permeabilization 및 후속 항 체 얼룩이 지기에 대 한 1 개의 관에 결합 될 수 있다. 셀 흐름 cytometer에서 실행 되 고 세포 인구는 데이터 분석 중 게이팅 하 여 deconvoluted. 결과 같이 히스토그램 또는 heatmaps, 구상 될 수 있다. 알 렉 사 Fluor 488 (3 희석), 퍼시픽 블루 (4 희석) 및 태평양 오렌지 (3 희석)를 사용 하 여 매트릭스를 얼룩이 지는 3 차원 FCB의 (B) 예. 이 매트릭스 최대 36 샘플의 조합을 수 있습니다. (C) FCB 셀 인구 게이팅 각 FCB 채널 대 에 의해 deconvoluted 수 있다 SSC. 분석 소프트웨어에 게이츠의 조합 분석에 대 한 정확한 인구를 생성합니다. (D) Unstimulated B 건강 한 기증자 로부터 세포 (n = 25)와 CLL 환자 (n = 22) 절차 (A)에 따라 인 흐름에 의해 분석 대상이 됐다. 기저 형광 강도 신호는 arcsinh 비율으로 IgGκ isotype 컨트롤을 기준으로 계산 했다. CLL B 세포에서 신호 했다 다음 일반 컨트롤에서 B 세포에서 신호에 정규화 됩니다. p < 0.01, 계산 홀된 2 샘플 t-테스트. UM-CLL: IgVH unmutated CLL, M-CLL: IgVH CLL 돌연변이. 같은 색상의 기호 환자 샘플을 20 인 단백질3의 수준에 따라 계층적 agglomerative 클러스터에 그룹화를 나타냅니다. 일반 컨트롤에서 (E) B 세포 (n = 10, 평균 + SEM) 또는 CLL 환자 (n = 11 [M-CLL] 및 n = 8 [UM-CLL], 평균 + SEM) 표시 시간 코스에 대 한 안티-IgM와 자극 되었고 인 흐름 분석을 복종. 형광 강도 신호 unstimulated 샘플 관련 측정 하 고 arcsinh 비율으로 표시 했다. p < 0.01 (정상 vs UM CLL)와 * * *p < 0.001 (M CLL vs UM CLL), Holm Sidak 보정 테스트 하는 여러 비교 하 여 계산. UM-CLL: IgVH unmutated CLL, M-CLL: IgVH CLL 돌연변이. (F) CLL 세포는 DMSO와 idelalisib 3 분에 대 한 안티-IgM 자극 하기 전에 20 분 동안 표시 된 대로 incubated 했다. 셀 인 흐름 프로토콜에 따라 처리 했다. p < 0.05 * *p < 0.01, * * *p < 0.0001, Holm Sidak 보정 테스트 하는 여러 비교 하 여 계산. UM-CLL: IgVH unmutated CLL, M-CLL: IgVH CLL 돌연변이. 기호 색의 설명 (D)를 참조 하십시오. (D-F)3에서 수정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 직렬 (재고 솔루션으로 시작 하는) 다음과 같이 희석 | ||||||
| 바코드 시 약 | 사진 농도 | # 1 | # 2 | # 3 | # 4 | 흠 없는 |
| 알 렉 사 Fluor 488 | 10 mg/mL | 1: 500 | 1:5 | x | ||
| 태평양 파랑 | 10 mg/mL | 1: 2500 | 1:4 | 1:4 | 1:10 | |
| 태평양 오렌지 | 2 mg/mL | 1:50 | 1:12 | 1:24 | ||
표 1. 시 약 바코드입니다.
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Discussion
인 cytometry 단 세포에 있는 단백질 인 산화 수준을 측정 하는 강력한 기술입니다. 때문에 항 체와 얼룩에 의존 하는 방법, 인 cytometry 항 체 여부에 의해 제한 됩니다. 또한, 신뢰할 수 있는 결과 얻으려면, 모든 항 체 적정와 있어야 사용 하기 전에 확인 합니다. 인 특정 항 체의 적정에 대 한 자세한 프로토콜 되었습니다12설명 되어. 패널 디자인, 신호 대 잡음 비율의 배려가 중요 합니다. 제시 등 모든 인 항 체 알 렉 사 Fluor 647을 활용 했다. 이 fluorophore 종종 낮은 대 와 사이 최적의 미분 인 단백질의 높은 수준을 제공합니다. 또한, 인 단백질에 대 한 단 하나의 색상을 사용 하 여 다른 채널 것입니다 남아 있을 무료 FCB 및 표면 마커 얼룩. 이 패널 디자인 인 채널에 다른 일을 줄일 수 있습니다. 모든 인-항 체 같은 fluorophore를 활용 함으로써 데이터 분석 간소화 됩니다.
제시 프로토콜에서 모든 항 stainings 고정 및 세포의 permeabilization 후 수행 했다. 그러나, 그것은 그 표면 마커 얼룩 수 있습니다 부정적인 영향을 수 표면 항 원 또는 얼룩13증가 특이 현상의 변성으로 인해 고정 및 permeabilization 단계에서 염두에 두어야 하는 것이 중요. 사용자 따라서 케이스별으로 사건에 항 체의 반응성을 테스트 해야 합니다. 리소스 호환 클론에 또한 다른 고정/permeabilization 절차의 개요 및 https://www.cytobank.org/facselect/에서 다양 한 항 체와의 호환성 등 도움이 될 수 있습니다.
단백질 인 산화 또는 탈 인 산화는 외부와 본질적인 신호 응답 발생 과도 수정. 인 산화 패턴을 비교할 때 중요 한 실험은 유사한 조건 하에서 실시는 그러므로 이다.입니다. 때 그림 혈액, 저장 조건 후 그리고 얼마나 오랫동안 고립 된 세포 실험의 개시 전에 휴식은 경과 시간을 포함 하는 결과 영향을 미칠 수 있는 요인 혈액에서 1 차 셀에 신호를 공부. 보존 하는 cryo 세포와 혈액에서 갓 고립 된 세포에 신호 패턴을 비교할 때만 매우 중요 한 차이점이 (Skånland, 미 출판)을 관찰 될 수 있었다. 그러나, 그것은 여전히 예를 들어 biobanked 환자 샘플, 공부를 할 때 제어로 정상 세포를 보존 하는 cryo 사용 하도록 권장입니다. 고 인을 수행 하기 위한 최적의 조건을 flow cytometry 실험 하 고 개별 사용자에 의해 외부 요인의 영향을 테스트 해야 합니다.
여기, 프로토콜 인 현 탁 액 셀의 흐름 분석을 위해 제공 됩니다. 프로토콜은 다른 세포 유형에 적응 시킬 수 있다 하지만 cytometry에 의해 분석에 대 한 단일 셀에 셀이 필수. 이 절차는 보존에 영향을 주지, 인 산화 패턴을 섬세 한 해야 합니다. 예 어디 부착 세포 분리 자란 접시에서 찬 trypsination12,14또는 오히려 성장 스피어15에 존재 한다. 그것에 올 때 인 cytometry 단단한 조직에, 한 보고서는 단일 셀 셀 스 트레이너16튜브를 통해 세포에 전달 하 여 얻은 했다 폐 종양에 존재 합니다. 최근, 인 cytometry 단일 상피 세포 조직 (DISSECT)에서 세포내 신호에 대 한 피의 상피 조직17 및 대 장 암 인 단백질을 공부 하기 위하여 불리는 새로운 접근 방식을 함께 했다 18.
이후 뚜렷한 FCB 인구에 의존 하는 실험의 끝에 샘플의 deconvolution는 FCB 프로토콜에 중요 한 단계 이다. 이것을 얻기 위해 셀 균질 스테인드 될 필요가 있다. 그것은 따라서 셀에 추가 될 수 있는 바코드 접시를 준비 하는 것이 중요입니다. 셀에는 시 약을 추가 고르지 얼룩이 지 고 혼합된 인구 게이팅에 의해 deconvoluted 수 없습니다 발생 합니다. 착 강도 셀 유형으로 실험을 수행 하기 전에 바코드 희석의 테스트를 실행 하려면이 좋습니다 의존.
높은 처리량 방법에 매체에서 인 단백질 레벨의 정량화에 대 한 추가 항 체 기반 기술이 단백질 배열 역 위상 단백질 배열 (RPPA)를 적용할 수 있습니다. 그러나, 몇 가지 자질 인 cytometry의 다른 사람에서이 메서드를 구별합니다. 인 cytometry의 중요 한 이점은 단일 셀 프로 파일링을 허용 한다 이다. 포함 하 여 다른 세포 하위 집합에 대 한 표면 마커, 간 세포이 감지할 수 있습니다. 당사와 함께 실행 하는 동일한 실험에서 여러 조건의 분석 또한 수 있습니다. 이러한 기능 바이오 마커 발견 및 정밀 의학19인 cytometry 미래의 응용 프로그램에 대 한 매력적인 방법 확인.
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Disclosures
저자는 공개 상관이 있다.
Acknowledgments
이 작품은 교수 Kjetil Taskén의 실험실에서 실시 하 고 노르웨이 암 협회와 Stiftelsen 크리스티 앙 게르하르트 Jebsen에 의해 지원 되었다. 랜드 스크 론 요하네스와 마리 Enger 원고의 중요 한 독서에 대 한 인정 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10270169 | Additive to cell culture medium |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | Additive to cell culture medium |
| MEM non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | Additive to cell culture medium |
| Lymphoprep | Alere Technologies AS | 1114547 | Density gradient medium |
| Anti-IgM | Southern Biotech | 2022-01 | For stimulation of the B cell receptor |
| BD Phosflow Fix Buffer I | BD | 557870 | Fixation buffer |
| BD Phosflow Perm Buffer III | BD | 558050 | Permeabilization buffer |
| Alexa Fluor 488 5-TFP | ThermoFisher Scientific | A30005 | Barcoding reagent |
| Pacific Blue Succinimidyl Ester | ThermoFisher Scientific | P10163 | Barcoding reagent |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | ThermoFisher Scientific | P30253 | Barcoding reagent |
| Compensation beads | Defined by user | Correct species reactivity | |
| Falcon tubes | Defined by user | ||
| Eppendorf tubes | Defined by user | ||
| 96 well V-bottom plates | Defined by user | Compatible with the flow cytometer | |
| Centrifuges | Defined by user | For Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates | |
| Water bath | Defined by user | Temperature regulated | |
| Flow cytometer | Defined by user | With High Throughput Sampler (HTS) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen | |||
| AKT (pS473) | Cell Signaling Technologies | 4075 | Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| ATF-2 (pT71) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8398 | Clone: F-1 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| BLNK (pY84) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558443 | Clone: J117-1278 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY223)/Itk (pY180) | Beckton Dickinson Pharmingen | 564846 | Clone: N35-86 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY551) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558129 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| Btk (pY551)/Itk (pY511) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558134 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| CD3ζ (pY142) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558489 | Clone: K25-407.69 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Histone H3 (pS10) | Cell Signaling Technologies | 9716 | Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| IκBα | Cell Signaling Technologies | 5743 | Clone: L35A5 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| LAT (pY171) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558518 | Clone: I58-1169 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Lck (pY505) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558577 | Clone: 4/LCK-Y505 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| MEK1 (pS298) | Beckton Dickinson Pharmingen | 560043 | Clone: J114-64 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| NF-κB p65 (pS529) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558422 | Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| NF-κB p65 (pS536) | Cell Signaling Technologies | 4887 | Clone: 93H1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| p38 MAPK (pT180/Y182) | Cell Signaling Technologies | 4552 | Clone: 28B10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p44/42 MAPK (pT202/Y204) | Cell Signaling Technologies | 4375 | Clone: E10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p53 (pS15) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: 16G8 Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS20) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS37) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS46) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS392) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| PLCγ2 (pY759) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558498 | Clone: K86-689.37 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Rb (pS807/pS811) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558590 | Clone: J112-906 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| S6-Ribos. Prot. (pS235/236) | Cell Signaling Technologies | 4851 | Clone: D57.2.2E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SAPK/JNK (pT183/Y185) | Cell Signaling Technologies | 9257 | Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| SLP76 (pY128) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558438 | Clone: J141-668.36.58 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| STAT1 (pY701) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612597 | Clone: 4a Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT3 (pY705) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557815 | Clone: 4/P-STAT3 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| STAT4 (pY693) | Zymed/ThermoFisher Scientific | 71-7900 | Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry, Clin Immunol, 100(3): 270-6 |
| STAT5 (pY694) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612599 | Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT6 (pY641) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612601 | Clone: 18/P-Stat6 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SYK (pY525/Y526) | Cell Signaling Technologies | 12081 | Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| ZAP70/SYK (pY319/Y352) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557817 | Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
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