Summary
Her vises en protokoll for middels til høy gjennomstrømming analyse av protein fosforylering hendelser på cellenivå. Phospho-flowcytometri er en effektiv tilnærming til å karakterisere signalnettverk avvik, identifisere og validere biomarkers og vurdere pharmacodynamics.
Abstract
Avvikende celle signalisering spiller en sentral rolle i hudkreft og progresjon. Mest romanen målrettet terapi er faktisk rettet mot proteiner og protein funksjoner, og cellen signalnettverk avvik kan fungere som biomarkers å angi personlige behandlingstilbud. I motsetning til DNA og RNA analyser, kan endringer i protein aktivitet mer effektivt vurdere mekanismene bak narkotika følsomhet og motstand. Phospho-flowcytometri er en kraftfull teknikk som måler protein fosforylering hendelser på cellenivå, en viktig funksjon som skiller denne metoden fra andre antistoff tilnærminger. Metoden tillater samtidig analyse av flere signalnettverk proteiner. I kombinasjon med fluorescerende celle barcoding, kan større middels til høy gjennomstrømming datasett erverves av standard cytometer på kort tid. Phospho flowcytometri har programmer både studier av grunnleggende biologi og klinisk forskning, inkludert signalering analyse, biomarkør oppdagelse og vurdering av pharmacodynamics. Her tilbys en detaljert eksperimentelle protokoll for phospho flyt analyse av renset perifert blod mononukleære celler, med kronisk lymfatisk leukemi celler som eksempel.
Introduction
Phospho-flowcytometri brukes til å analysere protein fosforylering nivå encellede oppløsning. Det overordnede målet med metoden er å tilordne mobilnettet signalnettverk mønstre angitte vilkår. Ved å utnytte flowcytometri multiparameter kapasitet, kan flere signalveier analyseres samtidig i forskjellige undergrupper av en heterogen celle befolkningen som perifert blod. Disse trekkene tilbyr fordeler over andre antistoff-baserte teknologier som immunohistochemistry, enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA), protein matrise og omvendt fase protein matrise (RPPA)1. Phospho flowcytometri kan kombineres med fluorescerende celle barcoding (FCB), som betyr at enkeltcelle prøver er merket med unike signaturer av fluorescerende fargestoffer slik at de kan være blandet sammen, beiset og analyseres som en enkelt prøve2. Dette reduserer antistoff forbruket øker data robusthet gjennom kombinasjonen av kontroll og behandlet prøver og forbedrer hastigheten på oppkjøpet. Kombinert FCB befolkningen kan deretter delt inn i mindre prøver og farget med opp til 35 forskjellige phospho-spesifikke antistoffer, avhengig av starter materiale. Store profilering eksperimenter kan dermed kjøres med standard cytometer maskinvare. Phospho-flowcytometri brukes på profil signalnettverk trasé i pasientprøvene fra flere Hematologisk kreft inkludert kronisk lymfatisk leukemi (CLL)3,4,5, akutt myelogen leukemi (AML) 6 og non-Hodgkin lymfomer7. Phospho flowcytometri er dermed en effektiv tilnærming til å karakterisere signalnettverk avvik, identifisere og validere biomarkers og vurdere pharmacodynamics.
Her, tilbys optimalisert protokollen for analyse av CLL pasientprøvene av phospho flowcytometri (figur 1A). Eksempler på basale signalnettverk karakterisering, anti-IgM/B celle reseptor stimulering og narkotika forstyrrelsene vises. En detaljert beskrivelse av en FCB matrise tilbys. Protokollen kan enkelt tilpasses til andre suspensjon celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Blodprøver ble mottatt etter skriftlig samtykke fra alle givere. Studien ble godkjent av Regional komité for medisinske og helse Research etikk av Sørøst-Norge og forskning på menneskelig blod ble utført i samsvar med Helsinkideklarasjonen8.
Merk: Trinn 1-3 bør utføres under sterile forhold i vev kultur hette.
1. isolering av perifert blod mononukleære celler (PBMCs) fra CLL pasienten blodprøver
FORSIKTIG: Menneskelig blod skal håndteres i henhold til forskrifter for grad 2.
- Fortynne blodet 1:1 med fosfat-bufret saltvann (PBS: 136.9 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10.1 mM Na2HPO4 x 2 H2O, 1,8 mM KH2PO4, pH 7.4) og overføring til 50 mL rør (30 mL/rør).
- Nøye laget 10 mL av en tetthet gradert medium (f.eksLymphoprep) til bunnen av røret med en 10 mL pipette.
- Sentrifuge 800 x g for 20 min på 4 ° C. PBMCs vises nå på tetthet gradert middels laget.
- Bruk en Pasteur pipette for å overføre cellene til to nye 50 mL rør. Vask to ganger med PBS (Fyll opp rør).
- Sentrifuge 350 x g i 15 min. Forkast nedbryting og resuspend i 3 mL PBS.
- Telle celler med en foretrukket metode.
- Sentrifuge cellene på 350 x g for 5 min. Forkast nedbryting. Merk: Trinn 1.8 til 3.2 er valgfrie. Det er mulig å gå direkte til trinn 3.3.
- Resuspend cellene i fosterets bovin serum (FBS) med 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) og fryse ned i egnet dele bruker cryo rør.
Merk: DMSO er giftig for cellene. Arbeid raskt når cellene er blandet med FBS/DMSO. Cellene kan ligge lagret langsiktige i flytende nitrogen.
2. tiner celler
- Raskt tine cellene i et 37 ° C vannbad.
Merk: DMSO er giftig for cellene. Arbeide raskt for å begrense eksponeringen til DMSO. - Vask cellene gang med 10 mL kaldt Roswell Park Memorial Institute middels (RPMI 1640 med ekstra GlutaMAX, se Tabellen for materiale).
- Sentrifuge 300 x g for 5 min. forkaste nedbryting.
- Resuspend cellene i RPMI 1640 medium med natrium pyruvate, MEM ikke-essensielle aminosyrer og penicillin/streptomycin (lagt på 1 x fortynning i henhold til instruksjonene) og 10% FBS. Overføre cellene til en liten celle kultur kolbe og la i en inkubator på 5% CO2, 37 ° C i 1 time å at cellene å kalibrere.
3. forberedelse av celler
- Telle levedyktig celler med en foretrukket metode.
- Overføre cellene til en 50 mL tube og sentrifuge 300 x g for 5 min. kast nedbryting.
- Resuspend cellene i RPMI 1640 medium (trinn 2.2) med 1% FBS til mer enn 50 x 106 celler/mL.
- Overføre den nødvendige mengden av cellen suspensjon brønner i en 96 godt V bunn plate.
Merk: Antall brønner tilsvarer antall betingelser skal testes. Prøver for en stimulering tid-kurs er trukket fra en enkelt brønn. Beregne 50 µL vareprøve per tidspunkt + 50 µL av død. Lagre prøver for kompensasjon kontroller (ett unstained kvinne utvalg + ett utvalg per barcoding fargestoff). - Overføre 96 godt platen til en forvarmet 37 ° C vannbad. Hvile celler for 10 min.
4. stimulering og fiksering av celler
Merk: Utføre trinn 4-8 på lab benken (dvs. ikke sterilt).
Advarsel: Den viktigste ingrediensen i fikse Buffer I er paraformaldehyde, som er giftig (innånding og hudkontakt kontakt). Håndteres med forsiktighet.
- Forberede en 96 godt V bunn plate med 60 µL fikse bufferen jeg per brønn per prøve. La i vannbad 37 ° C.
Merk: Celler: Fastsette buffer bør være 1:1. For å tillate fordampning på 37 ° C, er fastsette bufferen først i overflod. - Du kan også behandle celler med narkotika før stimulering.
- Overføre en 50 µL kontroll prøven til fastsette plate. Bland ved pipettering opp og ned.
- Eventuelt start stimulering tid-kurset ved å legge 10 µg/mL anti-IgM til cellene. Bland ved pipettering opp og ned.
- Overføre en 50 µL prøve å fikse platen på hvert tidspunkt. Bland ved pipettering opp og ned.
Merk: Anti-IgM indusert signalering startes vanligvis tidlig (minutter). - La fastsette platen på 37 ° C i 10 min etter siste prøven er lagt.
5. fluorescerende celle Barcoding (FCB)
Merk: Se tabell 1 for en liste over barcoding reagenser.
- Vask fast cellene 3 x med PBS (Fyll opp brønnene).
- Sentrifuge på 500 x g for 5 min. forkaste nedbryting.
- Forberede en 96 godt V bunn plate med barcoding reagenser. Pipetter 5 µL av hver barcoding reagensen per brønn i antall kombinasjoner kreves stain alle prøver etter farging matrise, f.eks i figur 1B. Hvert utvalg vil ha en unik kombinasjon av forskjellige barcoding konsentrasjoner.
- Resuspend cellene i 190 µL av PBS og overføre til barcoding plate. Bland godt.
Merk: Flekk en kompensasjon prøven med den høyeste siste konsentrasjonen brukes for hver barcoding reagens og lagre ett unstained kvinne utvalg. - Lar celler for 20 min i romtemperatur, i mørket.
- Vask farget cellene 2 x med flyt vask (PBS, 1% FBS, 0.09% Natriumazid) (Fyll opp brønnene).
- Sentrifuge på 500 x g for 5 min. forkaste nedbryting.
- Legge til 190 µL flyt vask til cellene og kombinere barcoded prøvene i en 15 mL tube. Overføre kontrollene kompensasjon til en separat 1,7 mL tube.
- Sentrifuge på 500 x g for 5 min. forkaste nedbryting.
6. celle Permeabilization til intracellulær Antigen farging
FORSIKTIG: Den viktigste ingrediensen i Perm Buffer III er metanol giftig (innånding og hudkontakt kontakt) og brannfarlig. Håndteres med forsiktighet.
- Overføre 2 mL Perm Buffer III til en 15 mL tube. La på 20 ° C så det er iskaldt ved bruk.
Merk: Perm bufferen kan stå på 20 ° C fra begynnelsen av eksperimentet. - Legge til 1,5 mL iskald Perm bufferen til barcoded celle befolkningen (i en 15 mL tube) og 100 µL kontrollene kompensasjon (i 1,7 mL rør) drop-wise mens vortexing å unngå at cellene clump sammen.
- Overføre cellene direkte til-80 ° C. La for minst 30 min.
Merk: Det er naturlig å stoppe eksperimentet på dette punktet. Celler i Perm Buffer kan være lagret langsiktige på-80 ° C.
7. antistoff flekker
Merk: Se Tabellen for materiale for en liste over rapporterte phospho-spesifikke antistoffer.
- Overføre cellene fra-80 ° C til en boks av is.
- Vask 3 x med flyt vask.
Merk: Det er viktig å legge flyt vask i overkant å se celle pellet, f.eks legge til 3 mL flyt vask barcoded celle befolkningen og 1 mL i hver erstatning. - Sentrifuger på 500 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
- Resuspend barcoded celle befolkningen i et volum på flyt vask, som gir 25 µL av cellen suspensjon per phospho-antistoff flekken. Resuspend kompensasjon kontrollene i 200 µL flyt vask.
- Forberede antistoffer flekker i en 96 godt V bunn plate. Det siste bindet blir 50 µL/godt. Per brønn, legge phospho-spesifikke antistoffer fortynnet i flyt vask til et endelig antall 10 µL, overflate markør fortynnet i flyt vask til et endelig antall 15 µL og 25 µL av cellen suspensjon.
Merk: Antistoff fortynninger bør være titreres før eksperimentet. Inkluder isotype kontroll. - Lar celler for 30 min ved romtemperatur, i mørket.
- Vask farget cellene 2 x med flyt vask (Fyll opp brønnene).
- Sentrifuge på 500 x g for 5 min. forkaste nedbryting.
- Resuspend cellene i 150 µL flyt vask.
8. forberedelse kompensasjon kontroller
- Forberede kompensasjon kontroller antistoff-konjugerte fluorochromes parallelt med den antistoff flekker. Bruk kompensasjon perler i henhold til leverandørens instruksjoner.
9. flyt cytometri analyse
Merk: Eksperimentet kan kjøres på en flyt cytometer med en høy gjennomstrømming Sampler (HTS).
- Optimalisere photomultiplier tube (avdrag) spenningen med kontrollen unstained kvinne.
- Kjøre kompensasjon kontroller og beregne kompensasjonsplanen.
- Kjøre prøver. Arrangementet frekvens bør være i henhold til instrumentet spesifikasjonene.
10. gating strategi og dataanalyse
- FCS importfiler fra eksperimentet til en strøm cytometri analyseprogramvare som FlowJo eller Cytobank (https://cellmass.cytobank.org).
- Gating strategi
- Velg lymfocytter ved å plotte SSC-A versus FSC-en i en tetthet dot plot.
- Vise lymfocytter og velg singleter ved å plotte SSC-A versus FSC -W.
- Vis enkeltceller og gate cellen skriver ved å plotte SSC-A versus overflaten markøren.
- Vise celle type befolkningen i et Pacific Blue versus SSC-en tetthet plott og merke de forskjellige FCB populasjonene basert på deres Pacific Blue flekker intensitet (se figur 1A).
- Plot phospho antistoff kanalen mot FCB kanalen, eller som en heatmap (se figur 1A) vise fosforylering hendelsene.
- Beregne phospho-signaler ved hjelp av den inverse hyperbolske sinusen (arcsinh) av MFI (median fluorescerende intensitet) phospho-signalet versus isotype kontroll (basale fosforylering nivåer, se figur 1 d), eller av stimulert versus unstimulated celle populasjoner (se figur 1E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De viktigste trinnene av phospho flyt cytometri protokollen er illustrert i figur 1A. I eksemplet presentert var CLL celler farget med barcoding reagensen Pacific Blue på fire fortynninger. Tredimensjonale barcoding kan utføres ved å kombinere tre barcoding fargestoffer, som vist i figur 1B. Individuelle prøvene er så deconvoluted av påfølgende gating på hver barcoding reagens versus SSC-en (figur 1 c). Detaljert informasjon om barcoding reagenser er oppført i tabell 1.
Etter fremgangsmåten som er beskrevet her, phospho-protein nivå ble preget i B-celler fra CLL pasienter og normal kontrollene under ulike forhold3. Både basal og stimulering-indusert fosforylering nivåer 20 signalnettverk molekyler nedstrøms av B-celle reseptor (BCR) ble analysert (se Tabell for materiale for en liste over rapporterte phospho-spesifikke antistoffer). Basal phospho-protein nivå ble kartlagt i 22 CLL pasientprøvene i forhold til gjennomsnittet av vanlige kontroller. Denne analysen viste at STAT3 (pY705) er upregulated i CLL celler (figur 1 d). Konstituerende aktivering av STAT3 har blitt rapportert i andre Hematologisk malignitet, og er forbundet med motstand mot apoptose9.
For å identifisere signalnettverk avvik indusert gjennom BCR sti, ble celler stimulert med anti-IgM i opptil 30 min. Det har vist at CLL celler fra pasienter med IgVH unmutated status (UM-CLL) Vis økt følsomhet overfor anti-IgM stimulering10. Dette var faktisk observert for fleste analysert proteiner, men effekten var statistisk signifikant bare for AKT (pS473) (figur 1E, UM-CLL versus M-CLL og Normal). For å teste om avvikende AKT (pS473) signalet kunne reverseres ble CLL celler utsatt for PI3Kδ hemmer idelalisib, som brukes til å behandle CLL pasienter11i klinikken. Som vist i figur 1F, ble AKT (pS473) nivåer betydelig redusert på idelalisib behandling i en konsentrasjon-avhengige måte, viser at kinase hemmere kan brukes for å normalisere avvikende signalering i CLL celler.
Disse resultatene viser at phospho flowcytometri i kombinasjon med FCB er en kraftig tilnærming til utføre signalnettverk analyse studier, identifisere potensielle biomarkers og vurdere pharmacodynamics.
Figur 1. Arbeidsflyt og eksempler på brukte phospho flyt cytometri analyse.
(A) viktigste trinnene av phospho flyt fremgangsmåten er illustrert. Celler først stimulert, så fast og utsatt for FCB før de kan kombineres i én rør for permeabilization og påfølgende antistoff flekker. Cellene kjøres på en flyt cytometer og celle populasjoner er deconvoluted av gating under dataanalyse. Resultatene kan visualiseres histogrammer eller heatmaps, som vist. (B) eksempel på en tredimensjonal FCB flekker matrise med Alexa Fluor 488 (tre fortynninger), Pacific Blue (fire fortynninger) og Pacific oransje (tre fortynninger). Denne matrisen vil tillate kombinasjon av opptil 36 prøver. (C) FCB cellen befolkningen kan være deconvoluted av gating på hver FCB kanal kontra SSC-A. Kombinasjonen av portene i analyseprogramvare genererer riktig befolkningen for analyse. (D) Unstimulated B celler fra friske blodgivere (n = 25) og CLL pasienter (n = 22) ble utsatt for analyse av phospho flyt fremgangsmåten i (A). Basale fluorescens intensitet signalene ble beregnet i forhold til IgGκ isotype kontroll som arcsinh forhold. Signalene i CLL B-cellene var deretter normalisert til signaler i B celler fra vanlige kontroller. p < 0,01, beregnet av en kort to utvalg t-test. UM-CLL: IgVH unmutated CLL, M-CLL: IgVH muterte CLL. Symboler av samme farge representerer pasientprøvene som gruppert sammen i en hierarkisk agglomerative klynge basert på 20 phospho-proteiner3. (E) B celler fra vanlige kontroller (n = 10, betyr + SEM) eller CLL pasienter (n = 11 [M-CLL] og n = 8 [UM-CLL], betyr + SEM) ble stimulert med anti-IgM for det angitte tid-kurset og utsatt for phospho flyt analyse. Fluorescens intensitet signalene ble målt i forhold til unstimulated prøver og vist som arcsinh forhold. p < 0,01 (Normal vs UM-CLL) og ***p < 0,001 (M-CLL vs UM-CLL), beregnet ved flere sammenligning tester med Holm-Sidaks korreksjon. UM-CLL: IgVH unmutated CLL, M-CLL: IgVH muterte CLL. (F) CLL celler ble inkubert med DMSO eller idelalisib som angitt for 20 min før anti-IgM stimulering for 3 min. Cellene ble deretter behandlet følger phospho flyt protokollen. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,0001, beregnet ved flere sammenligning tester med Holm-Sidaks korreksjon. UM-CLL: IgVH unmutated CLL, M-CLL: IgVH muterte CLL. Du kan se (D) for forklaring av symbolet farge. (D-F) endres fra3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Føljetong fortynne slik (starter med lager løsning) | ||||||
| Barcoding reagens | Lager konsentrasjon | #1 | #2 | #3 | #4 | unstained kvinne |
| Alexa Fluor 488 | 10 mg/mL | 1:500 | 1:5 | x | ||
| Pacific Blue | 10 mg/mL | 1:2500 | 1:4 | 1:4 | 1:10 | |
| Pacific oransje | 2 mg/mL | 1:50 | 1:12 | 1:24 | ||
Tabell 1. Barcoding reagenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Phospho-flowcytometri er en kraftfull teknikk å måle protein fosforylering nivå i enkeltceller. Siden metoden er avhengig av farging med antistoffer, begrenses phospho flowcytometri antistoff-tilgjengelighet. Videre for å få pålitelige resultater, bør alle antistoffer titreres og kontrollert før bruk. En detaljert protokoll for titrering av phospho-spesifikke antistoffer er beskrevet andre steder12. Under panelet design er vurdering av signal-til-støy forholdet avgjørende. I eksemplet presentert var alle phospho-antistoffer konjugert til Alexa Fluor 647. Denne fluorophore gir ofte optimal differensial mellom prøvene med lav versus høye nivåer av phospho-protein. Videre ved å bruke bare én farge for phospho-proteiner vil andre kanaler stå ledig for FCB og overflate markør flekker. Dette panelet design reduserer ringvirkninger i phospho kanalen. Ved å ha alle phospho-antistoffer konjugert til den samme fluorophore, vil det også være forenklet dataanalyse.
I presentert protokollen, ble alle antistoff stainings utført etter fiksering og permeabilization i cellene. Det er imidlertid viktig å huske at overflaten markør flekker kan bli negativt påvirket av punktene fiksering og permeabilization på grunn av denaturering av overflate antigen eller økt uspesifikke flekker13. Brukeren bør derfor teste reaktivitet av antistoffer fra sak til sak. Ressurser på kompatible kloner kan også være nyttig, for eksempel en oversikt over ulike fiksering/permeabilization prosedyrer og deres kompatibilitet med ulike antistoffer i https://www.cytobank.org/facselect/.
Protein fosforylering eller de fosforylering er en forbigående endring som oppstår som svar på både ytre og indre signaler. Når du sammenligner fosforylering mønstre, er det derfor avgjørende at eksperimenter utføres under like forhold. Når studere signalering i primære celler fra blod, faktorer som kan påvirke resultatet er tid forløpt etter blodet, lagringsforhold og for hvor lenge isolert cellene er uthvilt før start av eksperimentet. Når du sammenligner signalnettverk mønstre i cryo bevart cellene og ferske isolert fra blod, kan bare svært små betydelige forskjeller være observert (Skånland, upublisert). Det er imidlertid fortsatt tilrådelig å bruke cryo bevart normale celler som en kontroll når studere biobanked pasientprøvene, for eksempel. Optimale forhold for å utføre phospho flyt cytometri eksperimenter og virkningen av ytre faktorer bør bli testet av den enkelte brukeren.
Her vises en protokoll for phospho flyt analyse av suspensjon celler. Protokollen kan tilpasses andre celletyper, men det er en forutsetning at cellene er i suspensjon som enkeltceller for analyse av flowcytometri. Prosedyren for å oppnå dette må delikat å bevare, og ikke påvirke, fosforylering mønstre. Det finnes eksempler der tilhenger celler er løsrevet fra culturing parabolen av kalde trypsination12,14, eller snarere er dyrket på mikrosfærer15. Når det gjelder phospho flowcytometri på solid vev, finnes en rapport på lunge svulst der enkeltceller ble oppnådd ved å sende cellene til en rør med en celle sil16. Nylig ble phospho flowcytometri kombinert med en ny tilnærming kalt Disaggregation for intracellulær signalering i enkelt epitelceller fra vev (analysere) for å studere phospho-proteiner i epithelial vev17 og tykktarmskreft 18.
At FCB er et viktig skritt i protokollen siden deconvolution prøvene på slutten av eksperimentet er avhengig av forskjellige FCB populasjoner. For å oppnå dette, må cellene være homogent farget. Det er derfor viktig å forberede en barcoding plate som cellene kan legges til. Legge reagenser til cellene vil resultere i ujevn flekker og blandet populasjoner som ikke kan være deconvoluted av gating. Det anbefales å kjøre en test av barcoding fortynninger før eksperimentet utføres som flekker intensiteten celle-type avhengig.
Ekstra antistoff-baserte teknikker som protein matrise og omvendt fase protein matrise (RPPA) kan brukes for kvantifisering av phospho-protein i en middels til høy gjennomstrømming måte. Men skille noen kvaliteter phospho flowcytometri denne metoden fra de andre. En viktig fordel med phospho flowcytometri er at det tillater enkeltcelle profilering. Ved overflate markører for ulike mobilnettet delsett, kan Inter mobilnettet heterogenitet oppdages. Kombinasjon med FCB gir videre analyse av flere betingelser i samme eksperimentelle kjøre. Disse funksjonene gjør phospho flowcytometri en attraktiv metode for framtidige applikasjoner i biomarkør oppdagelsen og presisjon medisin19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble utført i laboratoriet av Professor Kjetil Taskén, og ble støttet av den norske Kreftforening og Stiftelsen Kristian Gerhard Jebsen. Johannes Landskron og Marianne Enger er anerkjent for kritisk lesing av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10270169 | Additive to cell culture medium |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | Additive to cell culture medium |
| MEM non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | Additive to cell culture medium |
| Lymphoprep | Alere Technologies AS | 1114547 | Density gradient medium |
| Anti-IgM | Southern Biotech | 2022-01 | For stimulation of the B cell receptor |
| BD Phosflow Fix Buffer I | BD | 557870 | Fixation buffer |
| BD Phosflow Perm Buffer III | BD | 558050 | Permeabilization buffer |
| Alexa Fluor 488 5-TFP | ThermoFisher Scientific | A30005 | Barcoding reagent |
| Pacific Blue Succinimidyl Ester | ThermoFisher Scientific | P10163 | Barcoding reagent |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | ThermoFisher Scientific | P30253 | Barcoding reagent |
| Compensation beads | Defined by user | Correct species reactivity | |
| Falcon tubes | Defined by user | ||
| Eppendorf tubes | Defined by user | ||
| 96 well V-bottom plates | Defined by user | Compatible with the flow cytometer | |
| Centrifuges | Defined by user | For Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates | |
| Water bath | Defined by user | Temperature regulated | |
| Flow cytometer | Defined by user | With High Throughput Sampler (HTS) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen | |||
| AKT (pS473) | Cell Signaling Technologies | 4075 | Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| ATF-2 (pT71) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8398 | Clone: F-1 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| BLNK (pY84) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558443 | Clone: J117-1278 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY223)/Itk (pY180) | Beckton Dickinson Pharmingen | 564846 | Clone: N35-86 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY551) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558129 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| Btk (pY551)/Itk (pY511) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558134 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| CD3ζ (pY142) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558489 | Clone: K25-407.69 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Histone H3 (pS10) | Cell Signaling Technologies | 9716 | Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| IκBα | Cell Signaling Technologies | 5743 | Clone: L35A5 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| LAT (pY171) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558518 | Clone: I58-1169 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Lck (pY505) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558577 | Clone: 4/LCK-Y505 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| MEK1 (pS298) | Beckton Dickinson Pharmingen | 560043 | Clone: J114-64 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| NF-κB p65 (pS529) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558422 | Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| NF-κB p65 (pS536) | Cell Signaling Technologies | 4887 | Clone: 93H1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| p38 MAPK (pT180/Y182) | Cell Signaling Technologies | 4552 | Clone: 28B10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p44/42 MAPK (pT202/Y204) | Cell Signaling Technologies | 4375 | Clone: E10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p53 (pS15) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: 16G8 Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS20) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS37) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS46) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS392) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| PLCγ2 (pY759) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558498 | Clone: K86-689.37 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Rb (pS807/pS811) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558590 | Clone: J112-906 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| S6-Ribos. Prot. (pS235/236) | Cell Signaling Technologies | 4851 | Clone: D57.2.2E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SAPK/JNK (pT183/Y185) | Cell Signaling Technologies | 9257 | Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| SLP76 (pY128) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558438 | Clone: J141-668.36.58 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| STAT1 (pY701) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612597 | Clone: 4a Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT3 (pY705) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557815 | Clone: 4/P-STAT3 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| STAT4 (pY693) | Zymed/ThermoFisher Scientific | 71-7900 | Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry, Clin Immunol, 100(3): 270-6 |
| STAT5 (pY694) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612599 | Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT6 (pY641) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612601 | Clone: 18/P-Stat6 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SYK (pY525/Y526) | Cell Signaling Technologies | 12081 | Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| ZAP70/SYK (pY319/Y352) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557817 | Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
References
- Lu, Y., et al. Using reverse-phase protein arrays as pharmacodynamic assays for functional proteomics, biomarker discovery, and drug development in cancer. Seminars in Oncology. 43 (4), 476-483 (2016).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
- Myhrvold, I. K., et al. Single cell profiling of phospho-protein levels in chronic lymphocytic leukemia. Oncotarget. 9 (10), 9273-9284 (2018).
- Parente-Ribes, A., et al. Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce CD40L-induced proliferation of chronic lymphocytic leukemia cells but not normal B cells. Haematologica. 101 (2), e59-e62 (2016).
- Blix, E. S., et al. Phospho-specific flow cytometry identifies aberrant signaling in indolent B-cell lymphoma. BMC Cancer. 12, 478 (2012).
- Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
- Myklebust, J. H., et al. Distinct patterns of B-cell receptor signaling in non-Hodgkin lymphomas identified by single-cell profiling. Blood. 129 (6), 759-770 (2017).
- World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION. 310 (20), 2191-2194 (2013).
- Siveen, K. S., et al. Targeting the STAT3 signaling pathway in cancer: role of synthetic and natural inhibitors. Biochimica et Biophysica Acta. 1845 (2), 136-154 (2014).
- Fabbri, G., Dalla-Favera, R. The molecular pathogenesis of chronic lymphocytic leukaemia. Nature Reviews Cancer. 16 (3), 145-162 (2016).
- Arnason, J. E., Brown, J. R. Targeting B Cell Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia. Current Oncology Reports. 19 (9), 61 (2017).
- Landskron, J., Tasken, K. Phosphoprotein Detection by High-Throughput Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1355, 275-290 (2016).
- Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. Journal of Immunology. 175 (4), 2357-2365 (2005).
- Pollheimer, J., et al. Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial activation that selectively targets nonquiescent cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), e47-e55 (2013).
- Ertsås, H. C., Nolan, G. P., LaBarge, M. A., Lorens, J. B. Microsphere cytometry to interrogate microenvironment-dependent cell signaling. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 9 (2), 123-134 (2017).
- Lin, C. C., et al. Single cell phospho-specific flow cytometry can detect dynamic changes of phospho-Stat1 level in lung cancer cells. Cytometry A. 77 (11), 1008-1019 (2010).
- Simmons, A. J., et al. Cytometry-based single-cell analysis of intact epithelial signaling reveals MAPK activation divergent from TNF-alpha-induced apoptosis in vivo. Molecular Systems Biology. 11 (10), 835 (2015).
- Simmons, A. J., et al. Impaired coordination between signaling pathways is revealed in human colorectal cancer using single-cell mass cytometry of archival tissue blocks. Science Signaling. 9 (449), rs11 (2016).
- Friedman, A. A., Letai, A., Fisher, D. E., Flaherty, K. T. Precision medicine for cancer with next-generation functional diagnostics. Nature Reviews Cancer. 15 (12), 747-756 (2015).
