Summary
Здесь представлен протокол для анализа средне высокой производительностью событий фосфорилирование белков на клеточном уровне. Фосфоресцентный проточной цитометрии является мощный подход к характеризуют сигнализации аберраций, выявления и проверки биомаркеров и оценить фармакодинамика.
Abstract
Сигнализации аберрантных клеток играет центральную роль в развитии рака и прогрессии. Наиболее Роман целевой терапии действительно направлены на белки и функций белков, и клетки сигнализации аберраций поэтому может служить в качестве биомаркеров для обозначения персонализированные лечения. В отличие от анализа ДНК и РНК изменения в активности белка может более эффективно оценить механизмы лекарственной чувствительности и сопротивления. Фосфоресцентный проточной цитометрии является мощным средством, что меры события фосфорилирование белков на клеточном уровне, важной особенностью, которая отличает этот метод от других подходов, основанных на антитела. Этот метод позволяет одновременный анализ нескольких сигнальных белков. В сочетании с люминесцентные клеток штриховое кодирование большие наборы данных средне высокой производительностью могут быть приобретены по стандартным цитометр оборудования в короткие сроки. Фосфоресцентный проточной цитометрии имеет приложений как в исследованиях по вопросам базовой биологии, так и в клинических исследованиях, в том числе сигнального анализа, обнаружения биомаркеров и оценки фармакодинамика. Здесь для анализа потока фосфористой очищенный периферической крови мононуклеаров, с использованием клеток хронического лимфолейкоза в качестве примера приводится подробный экспериментальный протокол.
Introduction
Фосфоресцентный проточной цитометрии используется для анализа уровня фосфорилирование белка одноклеточных разрешением. Общая цель метода является сопоставление клеточных сигналов шаблоны при определенных условиях. Эксплуатируя многопараметрических потенциала проточной цитометрии, несколько сигнальных путей может быть одновременно исследовано в разных подмножеств населения гетерогенных клеток периферической крови. Эти черты предлагают преимущества перед другими технологиями на основе антител, иммуногистохимия, энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA), блок протеина и обратной фазы белка массив (RPPA)1. Фосфоресцентный проточной цитометрии может сочетаться с люминесцентные клеток штриховое кодирование (FCB), что означает, что образцы отдельные клетки помечены с уникальными подписями флуоресцентных красителей, так что они могут быть смешаны вместе, витражи и проанализированы как единого образца2. Это уменьшает потребление антител, повышает надежность данных через сочетание управления и обработанные образцы и повышает скорость приобретения. Численностью населения FCB затем можно разделить на меньшие образцов и окрашивали до 35 различных фосфо специфические антитела, в зависимости от количества исходного материала. Таким образом, большие профилирования эксперименты выполняется с стандартным цитометр оборудования. Фосфоресцентный проточной цитометрии был применен к профилю, сигнальные пути в пациентов образцов из нескольких гематологических рака, включая хронического лимфолейкоза (ХЛЛ)3,4,5, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) 6 и неходжкинских лимфом7. Таким образом, фосфористой проточной цитометрии является мощный подход к характеризуют сигнализации аберраций, выявления и проверки биомаркеров и оценить фармакодинамика.
Здесь оптимизированный протокол для анализа ХЛЛ пациентов образцов подачей cytometry фосфористой предоставляется (рис. 1A). Приведены примеры базальной сигнализации характеристика, стимуляции рецепторов клеток anti-IgM/B и наркотиков возмущений. Приводится подробное описание FCB матрицы. Протокол может быть легко адаптирована для других типов клеток подвеска.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Образцы крови были получены после письменного информированного согласия от всех доноров. Исследования была утверждена региональным комитетом для медицинских и здравоохранения исследовательской этики Юго-Восточной Норвегии и исследования крови человека была проведена в соответствии с Хельсинкской декларации8.
Примечание: Шаги 1-3 должны выполняться в стерильных условиях в культуре ткани капюшоном.
1. изоляция мононуклеаров периферической крови (получения) из образцов крови пациента ХЛЛ
Предупреждение: Кровь человека должны обрабатываться согласно правилам для 2-го уровня биобезопасности.
- Разбавления крови 1:1 с фосфат амортизированное saline (PBS: 136.9 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 10.1 мм Na2HPO4 x 2 H2O, 1.8 мм х2PO4, рН 7,4) и передачи в 50 мл трубки (30 мл).
- Тщательно слой 10 мл градиента плотности среды (например, Lymphoprep) в нижней части трубки с помощью пипетки 10 мл.
- Центрифуга на 800 x g 20 мин при 4 ° C. Получения теперь видны на вершине плотность градиента среднего слоя.
- Использование пипетки Пастера перевести клетки на две новые трубы 50 мл. Мыть дважды с PBS (заполнить трубы).
- Центрифуга на 350 g x 15 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте в 3 мл ФСБ.
- Подсчет количества ячеек с использованием предпочтительного метода.
- Центрифуга клетки на 350 x g для 5 минут удалить супернатант. Примечание: 1.8 в 3.2 шаги являются необязательными. Это позволяет перейти непосредственно к шагу 3.3.
- Ресуспензируйте клетки плода бычьим сывороточным (ФБС) с 10% диметилсульфоксида (ДМСО) и заморозить вниз в подходящих аликвоты, используя крио трубы.
Примечание: ДМСО токсичны для клеток. Работе быстро, когда клетки смешивают с FBS/ДМСО. Клетки могут быть хранимой долгосрочной перспективе в жидком азоте.
2. отогрева клетки
- Быстро разморозить клетки в ванну воды 37 ° C.
Примечание: ДМСО токсичны для клеток. Работе быстро, чтобы ограничить воздействие ДМСО. - Вымойте клетки один раз с 10 мл холодной среды Розуэлл парк Мемориальный институт (RPMI 1640 с дополнительной GlutaMAX, смотрите Таблицу материалы).
- Центрифуга на 300 x g 5 мин отбросить супернатант.
- Ресуспензируйте клеток в среде RPMI 1640, дополненная пируват натрия, MEM несущественные аминокислот и пенициллин/стрептомицина (Добавлено при разбавлении 1 x согласно инструкции) и 10% FBS. Клетки перехода к колбе культуры мелкоклеточный и оставить в инкубаторе в 5% CO2, 37 ° C в течение 1 часа, чтобы позволить клетки для калибровки.
3. Подготовка клеток
- Количество жизнеспособных клеток с использованием предпочтительного метода.
- Клетки перехода к 50 мл трубки и центрифуги на 300 x g для 5 минут удалить супернатант.
- Ресуспензируйте клеток в среде RPMI 1640 (шаг 2.2) дополнен с 1% FBS не более чем 50 x 106 клеток/мл.
- Передать необходимое количество суспензию клеток скважин в 96 хорошо V-днище.
Примечание: Количество скважин соответствует количество условий для проверки. Образцы для стимуляции-курс взяты из одной скважины. Вычислите 50 мкл пример в момент времени + 50 мкл мертвого объема. Сохранение образцов для компенсации элементов управления (один безупречный образец + один образец за штриховое кодирование краситель). - Передача пластину 96 хорошо разогретую 37 ° C водяной бане. Остальные клетки за 10 мин.
4. стимулирование и фиксации клеток
Примечание: Выполните шаги 4-8 на стенде лаборатории (т.е., не стерильный).
Предупреждение: Основной ингредиент исправить буфера я это параформальдегида, который является токсичным (вдыхании и контакте с кожей). Обращаться с осторожностью.
- Подготовить 96 хорошо V-днище с 60 мкл буфера исправить я за хорошо на сэмпл. Оставьте в водяной бане 37 ° C.
Примечание: Ячейки: Исправление буфера должно быть 1:1. Чтобы на испарение при 37 ° C, исправить буфер — первоначально в изобилии. - При необходимости лечения клетки с наркотиками до стимуляции.
- Передача 50 мкл пример управления к пластине исправить. Смешайте закупорить вверх и вниз.
- При необходимости Начните стимуляции время курс, добавив 10 мкг/мл anti-IgM к клеткам. Смешайте закупорить вверх и вниз.
- Передача 50 мкл пример пластины исправить в каждый момент времени. Смешайте закупорить вверх и вниз.
Примечание: Anti-IgM индуцированной сигнализации обычно начинается рано (в минутах). - Оставьте пластины исправить при 37 ° C в течение 10 минут после того, как последний пример был добавлен.
5. люминесцентные клеток штриховое кодирование (FCB)
Примечание: Приведена Таблица 1 список штриховое кодирование реагентов.
- Мыть фиксированные клетки 3 x с PBS (заполнение скважины).
- Центрифуга на 500 x g 5 мин отбросить супернатант.
- Подготовьте 96 хорошо V-днище с реагентами штриховое кодирование. Накапайте 5 мкл Реагента каждого штриховое кодирование на скважину в количество комбинаций, необходимых для пятно все образцы после окрашивания матрицы, например, на рисунке 1B. Каждый образец будет иметь уникальную комбинацию концентраций различных штриховое кодирование.
- Ресуспензируйте клетки в 190 мкл PBS и передачи пластину штриховое кодирование. Тщательно перемешать.
Примечание: Пятно один образец компенсации с самой высокой концентрацией окончательный, используемые для каждого реагента штриховое кодирование и сохранить один безупречный пример. - Оставьте клетки для 20 мин при комнатной температуре, в темноте.
- Мыть окрашенные клетки 2 x с потоком мыть (PBS, 1% FBS, азид натрия 0,09%) (заполнить скважин).
- Центрифуга на 500 x g 5 мин отбросить супернатант.
- 190 мкл потока мыть в клетки и объединить перепутываются образцов в одной тубе 15 мл. Передача управления каждого компенсации в отдельном 1,7 мл трубку.
- Центрифуга на 500 x g 5 мин отбросить супернатант.
6. клетки Permeabilization для окрашивания внутриклеточных антигена
Предупреждение: Основной ингредиент Пермь буфера III является метанола, который горючих и токсичных (вдыхании и контакте с кожей). Обращаться с осторожностью.
- Передать 15 мл 2 мл Пермь буфера III. Оставьте при-20 ° C, так что это ледяной после использования.
Примечание: В Перми буфер можно оставить в-20 ° C с самого начала эксперимента. - Добавьте 1,5 мл ледяной Пермь буфера перепутываются клеток населению (15 мл) и 100 мкл каждого компенсации элемента управления (в 1,7 мл трубки) каплям при vortexing, чтобы избежать, что клетки слипаются.
- Напрямую передавать клетки-80 ° C. Оставьте как минимум 30 мин.
Примечание: Это естественно для приостановки эксперимент на данный момент. Клетки в Перми буфера может быть хранимой в долгосрочной перспективе при температуре-80 ° C.
7. антитело пятная
Примечание: Приведена Таблица материалов список зарегистрированных фосфо специфических антител.
- Передача клетки от-80 ° C к коробке льда.
- Вымойте 3 x с потоком мыть.
Примечание: Важно добавить поток мыть в избыток, чтобы увидеть ячейки Пелле, например, добавить 3 мл потока мыть популяции клеток перепутываются и 1 мл на каждый элемент управления компенсации. - Центрифуга на 500 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
- Ресуспензируйте перепутываются популяции клеток в объеме потока мыть, что позволяет 25 мкл суспензии клеток на пятно фосфо антитела. Ресуспензируйте компенсации управления в 200 мкл потока мыть.
- Подготовка антител для пятнать в 96 хорошо V-днище. Окончательный объем будет 50 мкл/хорошо. На хорошо добавьте фосфо специфические антитела, разбавленных в поток мыть в окончательный объем 10 мкл, поверхности маркер, разбавленных в поток мыть в окончательный объем 15 мкл и 25 мкл суспензии клеток.
Примечание: Разбавления антитела должны быть титруют до эксперимента. Включите изотипа управления. - Оставьте клетки для 30 мин при комнатной температуре, в темноте.
- Мыть окрашенные клетки 2 x с потоком мыть (заполнение скважины).
- Центрифуга на 500 x g 5 мин отбросить супернатант.
- Ресуспензируйте клетки в 150 мкл потока мыть.
8. Подготовка компенсации элементов управления
- Подготовьте элементы компенсации конъюгированных антител флуорохромов параллельно с Пятнать антитела. Используйте шарики компенсации согласно инструкциям производителя.
9. поток Cytometry анализ
Примечание: Эксперимент может быть выполнен на проточный цитометр с высокой пропускной способностью сборники (HTS).
- Оптимизируйте фотоэлектронный умножитель напряжения трубки (ПЛТ) с неокрашенных управления.
- Запуск управления компенсации и рассчитать компенсацию матрицы.
- Запуск образцов. Частота событий должно соответствовать спецификации инструмента.
10. стробирования стратегии и анализа данных
- Импорт файлов FCS из эксперимента для потока cytometry анализ программного обеспечения как FlowJo или Cytobank (https://cellmass.cytobank.org).
- Шлюзовые стратегия
- Выберите лимфоцитов путем построения SSC-A по сравнению с FSC-A в участке плотность точка.
- Лимфоциты и выберите фуфайки путем построения SSC-A по сравнению с FSC -W.
- Отображение единичных клеток и ворота ячейки типа путем построения SSC-A по сравнению с поверхности маркер.
- Отображение типа популяции клеток в Pacific Blue сюжет по сравнению SSC-A плотность и выберите различные популяции FCB, основанный на их Pacific Blue пятнать интенсивности (см. рис. 1A).
- Участок канала фосфористой антитела против FCB канала, или как heatmap (см. рис. 1A) для отображения событий фосфорилирования.
- Рассчитать фосфо сигналы, используя обратный гиперболический синус (arcsinh) МФО (средней интенсивности флуоресценции) фосфо сигнал против изотипа управления (уровень базальной фосфорилирование, см. Рисунок 1 d), или стимулировали против кератоз клеточных популяций (см. Рисунок 1E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Основные этапы протоколом cytometry потока фосфористой приведены на рисунке 1A. В примере представлены клетки CLL окрашивали с реактивом штриховое кодирование, Pacific Blue на четыре разведениях. Трехмерные штриховое кодирование может выполняться путем объединения трех штриховое кодирование красители, как показано на рисунке 1B. Отдельные образцы затем deconvoluted на последующие стробирования на каждой штриховое кодирование реагента по сравнению SSC-A (рис. 1 c). Подробная информация о штриховое кодирование реагентов, перечислены в таблице 1.
После процедуры, описанные здесь были охарактеризованы уровни фосфо белка в B клетки CLL пациентов и обычных элементов управления при различных условиях3. Оба уровня базальной и стимуляции индуцированного фосфорилирование 20 сигнальные молекулы по течению B клеточного рецептора (BCR) были проанализированы (см. Таблицу материалы список зарегистрированных фосфо специфических антител). Уровни базального фосфо белка были сопоставлены в 22 ХЛЛ пациентов образцов по отношению к виду обычных элементов управления. Этот анализ показал, что STAT3 (pY705), значительно upregulated в клетки CLL (рис. 1 d). Учредительный активация STAT3 уже сообщалось в других гемобластозами и связана с устойчивостью к апоптозу9.
С целью выявления сигнализации аберраций, индуцированной через пути BCR, клетки были стимулируется с anti-IgM до 30 мин. Было показано, что ХЛЛ клетки от пациентов с IgVH unmutated статус (UM-ХЛЛ) дисплей увеличена чувствительность к anti-IgM стимуляции10. Это действительно было отмечено в большинстве анализируемых белков, но эффект был статистически значимым только для AKT (pS473) (Рисунок 1E, UM-CLL по сравнению с М-ХЛЛ и нормальный). Чтобы проверить, если аберрантных AKT (pS473) сигнал может быть обращена вспять клетки CLL были подвержены PI3Kδ ингибитором idelalisib, которая используется в клинике для лечения больных ХЛЛ11. Как показано на рисунке 1F, AKT (pS473) уровни были значительно снижены после idelalisib лечения в зависимости от концентрации, демонстрируя, что ингибиторы киназ может применяться для нормализации аберрантных сигнализации в клетки CLL.
Эти результаты показывают, что фосфористой проточной цитометрии в сочетании с FCB является мощный подход для выполнения сигнальный анализ исследований, выявления потенциальных биомаркеров и оценить фармакодинамика.
Рисунок 1. Рабочий поток и примеры прикладных фосфористой потока cytometry анализ.
(A) основные этапы процедуры потока фосфористой проиллюстрированы. Клетки сначала стимулировали, а затем фиксированной и подвергается FCB, прежде чем они могут быть объединены в одной из труб для permeabilization и последующие антитело пятная. Клетки запускаются на проточный цитометр и клеточных популяций deconvoluted, стробирование в ходе анализа данных. Результаты могут быть визуализированы как гистограммы или диаграммы, как показано. (B) Пример трехмерной FCB, окрашивание матрицы с помощью Alexa Fluor 488 (трех разведений), Pacific Blue (четыре разведений) на всей территории отеля и в тихоокеанских оранжевый (три разведения). Эта матрица позволит комбинации до 36 образцов. (C) FCB клеток населения можно deconvoluted по стробирования на каждом FCB канала против SSC-A. Комбинация ворот в программное обеспечение для анализа генерирует правильные населения для анализа. (D) кератоз B клеток от здоровых доноров (n = 25) и ХЛЛ пациентов (n = 22) были подвергнуты анализу, фосфористой потока после процедуры в (A). Базальные флуоресценции интенсивности сигналов были рассчитаны по отношению к IgGκ изотипа управления как arcsinh соотношение. Сигналы в клетки CLL B затем были нормализованы на сигналы в клетки от обычных элементов управления. p < 0.01, вычисляемая непарных Двухвыборочный t-тест. UM-CLL: IgVH unmutated ХЛЛ, M-CLL: IgVH мутировал ХЛЛ. Символы одного цвета представляют пациентов образцов, которые сгруппированы вместе в кластере иерархической агломерационное, исходя из 20 Фосфоропротеиды3уровней. (E) B клетки от обычных элементов управления (n = 10, значит + SEM) или ХЛЛ пациентов (n = 11 [M-CLL] и n = 8 [UM-CLL], означает + SEM) были стимулируется с anti-IgM для указанного времени курса и подвергнуты фосфористой анализа потока. Сигналы интенсивности флуоресценции были измеряется относительно кератоз образцов и показано как отношение arcsinh. p < 0.01 (нормальный против UM-CLL) и ***p < 0,001 (M-CLL против UM-CLL), вычисляемая множественные сравнения тестирование с Holm-Sidak коррекции. UM-CLL: IgVH unmutated ХЛЛ, M-CLL: IgVH мутировал ХЛЛ. (F) ХЛЛ клетки инкубировали с ДМСО или idelalisib как указано за 20 мин до стимуляции anti-IgM на 3 мин. Клетки были затем обрабатываются после фосфористой протокол потока. p < 0,05, **p < 0.01, ***p < 0,0001, вычисляемая множественные сравнения тестирование с Holm-Sidak коррекции. UM-CLL: IgVH unmutated ХЛЛ, M-CLL: IgVH мутировал ХЛЛ. Для объяснения цвет символа см (D). (D-F) изменяются от3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Серийный разбавляют следующим образом (начиная с Стоковый раствор) | ||||||
| Штриховое кодирование реагент | Складе концентрация | #1 | #2 | #3 | #4 | Безупречная |
| Alexa Fluor 488 | 10 мг/мл | 1: 500 | 1:5 | x | ||
| Тихоокеанский синий | 10 мг/мл | 1:2500 | 1:4 | 1:4 | 1:10 | |
| Тихого океана оранжевый | 2 мг/мл | 1:50 | 1:12 | 1:24 | ||
Таблица 1. Штриховое кодирование реагентов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Фосфоресцентный проточной цитометрии – это мощный метод для измерения уровней фосфорилирование белков в одиночных клетках. Поскольку этот метод опирается на окрашивание с антителами, фосфористой проточной цитометрии ограничено наличием антител. Кроме того для того чтобы получить надежные результаты, все антитела должны титруют и проверены перед использованием. Подробный протокол для титрования фосфо специфических антител был описано в других разделах12. Во время дизайн панели рассмотрение соотношения сигнал шум имеет решающее значение. В примере представлены все фосфо антитела были конъюгированных с Alexa Fluor 647. Этот Флюорофор часто обеспечивает оптимальный разницы между образцы с низкой по сравнению с высокий уровень фосфо белка. Кроме того с помощью только одного цвета для фосфоропротеидов другие каналы останется бесплатным FCB и пятнать поверхности маркер. Этот дизайн Группа уменьшает побочные в фосфористой канал. Имея все фосфо антитела, конъюгированных с же Флюорофор, будет также упростить анализ данных.
В протоколе представлены все антитела stainings были выполнены после фиксации и permeabilization клеток. Однако важно иметь в виду, что окрашивание поверхности маркер может пострадать от фиксации и permeabilization шаги благодаря денатурации поверхности антиген или повышение неспецифической пятнать13. Пользователь должен поэтому проверить реактивности антител на основе каждого конкретного случая. Ресурсы на совместимых клонов также может быть полезным, например обзор различных фиксации/permeabilization процедур и их совместимости с различными антителами в https://www.cytobank.org/facselect/.
Фосфорилирование белков или де фосфорилирование — временные изменения, возникающее в ответ на внутренние и внешние сигналы. При сравнении фосфорилирование моделей, поэтому важно что эксперименты проводятся в аналогичных условиях. При изучении сигнализации в первичной клетки из крови, факторы, которые могут повлиять на результат включают время прошло после нанесения крови, условий хранения и для сколько времени отдыхали изолированных клеток до начала эксперимента. При сравнении сигнализации модели в крио сохранились клетки и свежевыделенных клеток из крови, лишь весьма незначительные различия можно наблюдать (Сконланн, неопубликованные). Однако по-прежнему целесообразно использовать крио, сохранить нормальные клетки как элемент управления при изучении biobanked пациента образцы, например. Оптимальные условия для выполнения фосфористой потока цитометрии эксперименты и воздействие внешних факторов должны испытываться на индивидуального пользователя.
Здесь протокол представляется для анализа потока фосфористой подвеска клеток. Протокол могут быть адаптированы для других типов клеток, но это является условием, что клетки в подвеска как отдельные ячейки для анализа проточной цитометрии. Процедура для достижения этой цели должна быть деликатной сохранить, и не влияет на, фосфорилирование шаблонов. Имеются примеры где адэрентных клеток отсоединенной от культивирования блюдо холодных trypsination12,14, или скорее выросли на микросферы15. Когда дело доходит до фосфористой проточной цитометрии на твердых тканей, один доклад существует на опухоли легких, где отдельные клетки были получены путем передачи клетки через трубку с ячейки сетчатый фильтр16. Недавно фосфористой проточной цитометрии была объединена с новаторский подход называется дезагрегирования для внутриклеточная сигнализация в эпителиальных клетках одного из ткани (НАКТОУЗАХ) с целью изучения Фосфоропротеиды в эпителиальных тканей17 и колоректального рака 18.
FCB является важнейшим шагом в протоколе, поскольку деконволюция образцов в конце эксперимента опирается на собственный FCB населения. Чтобы получить это, клетки должны быть однородно окрашенные. Поэтому важно подготовить штриховое кодирование пластины, что клетки могут быть добавлены к. Добавление реагентов к клеткам приведет к неравномерным окрашивание и смешанного населения, которые не могут быть deconvoluted на память. Настоятельно рекомендуется выполнить тест разведений штриховое кодирование, прежде чем эксперимент выполняется как интенсивность окрашивания клеток тип зависимого.
Дополнительные методы, основанные на антитела, такие как белок массива и обратной фазы белка (RPPA) может применяться для количественной оценки уровня фосфо белка в среде высок объём манере. Однако некоторые качества фосфористой проточной цитометрии отличать этот метод от других. Важным преимуществом фосфористой проточной цитометрии является, что она позволяет для профилирования отдельной ячейки. В том числе поверхностных маркеров для различных клеточных подмножеств, между сотовой неоднородность могут быть обнаружены. Комбинация с FCB Кроме того позволяет для анализа нескольких условий в том же экспериментальный запуск. Эти особенности делают фосфористой проточной цитометрии привлекательный метод для будущих приложений в биомаркер обнаружения и точность медицины19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор не имеет ничего, чтобы раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа проводилась в лаборатории профессора Kjetil Taskén и была поддержана норвежского общества рака и Стифтельсен Кристиан Gerhard Jebsen. Йоханнес Ландскрон и Марианна Enger признал критических чтении рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10270169 | Additive to cell culture medium |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | Additive to cell culture medium |
| MEM non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | Additive to cell culture medium |
| Lymphoprep | Alere Technologies AS | 1114547 | Density gradient medium |
| Anti-IgM | Southern Biotech | 2022-01 | For stimulation of the B cell receptor |
| BD Phosflow Fix Buffer I | BD | 557870 | Fixation buffer |
| BD Phosflow Perm Buffer III | BD | 558050 | Permeabilization buffer |
| Alexa Fluor 488 5-TFP | ThermoFisher Scientific | A30005 | Barcoding reagent |
| Pacific Blue Succinimidyl Ester | ThermoFisher Scientific | P10163 | Barcoding reagent |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | ThermoFisher Scientific | P30253 | Barcoding reagent |
| Compensation beads | Defined by user | Correct species reactivity | |
| Falcon tubes | Defined by user | ||
| Eppendorf tubes | Defined by user | ||
| 96 well V-bottom plates | Defined by user | Compatible with the flow cytometer | |
| Centrifuges | Defined by user | For Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates | |
| Water bath | Defined by user | Temperature regulated | |
| Flow cytometer | Defined by user | With High Throughput Sampler (HTS) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen | |||
| AKT (pS473) | Cell Signaling Technologies | 4075 | Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| ATF-2 (pT71) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8398 | Clone: F-1 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| BLNK (pY84) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558443 | Clone: J117-1278 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY223)/Itk (pY180) | Beckton Dickinson Pharmingen | 564846 | Clone: N35-86 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY551) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558129 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| Btk (pY551)/Itk (pY511) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558134 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| CD3ζ (pY142) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558489 | Clone: K25-407.69 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Histone H3 (pS10) | Cell Signaling Technologies | 9716 | Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| IκBα | Cell Signaling Technologies | 5743 | Clone: L35A5 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| LAT (pY171) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558518 | Clone: I58-1169 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Lck (pY505) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558577 | Clone: 4/LCK-Y505 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| MEK1 (pS298) | Beckton Dickinson Pharmingen | 560043 | Clone: J114-64 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| NF-κB p65 (pS529) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558422 | Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| NF-κB p65 (pS536) | Cell Signaling Technologies | 4887 | Clone: 93H1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| p38 MAPK (pT180/Y182) | Cell Signaling Technologies | 4552 | Clone: 28B10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p44/42 MAPK (pT202/Y204) | Cell Signaling Technologies | 4375 | Clone: E10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p53 (pS15) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: 16G8 Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS20) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS37) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS46) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS392) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| PLCγ2 (pY759) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558498 | Clone: K86-689.37 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Rb (pS807/pS811) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558590 | Clone: J112-906 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| S6-Ribos. Prot. (pS235/236) | Cell Signaling Technologies | 4851 | Clone: D57.2.2E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SAPK/JNK (pT183/Y185) | Cell Signaling Technologies | 9257 | Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| SLP76 (pY128) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558438 | Clone: J141-668.36.58 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| STAT1 (pY701) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612597 | Clone: 4a Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT3 (pY705) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557815 | Clone: 4/P-STAT3 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| STAT4 (pY693) | Zymed/ThermoFisher Scientific | 71-7900 | Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry, Clin Immunol, 100(3): 270-6 |
| STAT5 (pY694) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612599 | Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT6 (pY641) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612601 | Clone: 18/P-Stat6 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SYK (pY525/Y526) | Cell Signaling Technologies | 12081 | Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| ZAP70/SYK (pY319/Y352) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557817 | Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
References
- Lu, Y., et al. Using reverse-phase protein arrays as pharmacodynamic assays for functional proteomics, biomarker discovery, and drug development in cancer. Seminars in Oncology. 43 (4), 476-483 (2016).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
- Myhrvold, I. K., et al. Single cell profiling of phospho-protein levels in chronic lymphocytic leukemia. Oncotarget. 9 (10), 9273-9284 (2018).
- Parente-Ribes, A., et al. Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce CD40L-induced proliferation of chronic lymphocytic leukemia cells but not normal B cells. Haematologica. 101 (2), e59-e62 (2016).
- Blix, E. S., et al. Phospho-specific flow cytometry identifies aberrant signaling in indolent B-cell lymphoma. BMC Cancer. 12, 478 (2012).
- Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
- Myklebust, J. H., et al. Distinct patterns of B-cell receptor signaling in non-Hodgkin lymphomas identified by single-cell profiling. Blood. 129 (6), 759-770 (2017).
- World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION. 310 (20), 2191-2194 (2013).
- Siveen, K. S., et al. Targeting the STAT3 signaling pathway in cancer: role of synthetic and natural inhibitors. Biochimica et Biophysica Acta. 1845 (2), 136-154 (2014).
- Fabbri, G., Dalla-Favera, R. The molecular pathogenesis of chronic lymphocytic leukaemia. Nature Reviews Cancer. 16 (3), 145-162 (2016).
- Arnason, J. E., Brown, J. R. Targeting B Cell Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia. Current Oncology Reports. 19 (9), 61 (2017).
- Landskron, J., Tasken, K. Phosphoprotein Detection by High-Throughput Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1355, 275-290 (2016).
- Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. Journal of Immunology. 175 (4), 2357-2365 (2005).
- Pollheimer, J., et al. Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial activation that selectively targets nonquiescent cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), e47-e55 (2013).
- Ertsås, H. C., Nolan, G. P., LaBarge, M. A., Lorens, J. B. Microsphere cytometry to interrogate microenvironment-dependent cell signaling. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 9 (2), 123-134 (2017).
- Lin, C. C., et al. Single cell phospho-specific flow cytometry can detect dynamic changes of phospho-Stat1 level in lung cancer cells. Cytometry A. 77 (11), 1008-1019 (2010).
- Simmons, A. J., et al. Cytometry-based single-cell analysis of intact epithelial signaling reveals MAPK activation divergent from TNF-alpha-induced apoptosis in vivo. Molecular Systems Biology. 11 (10), 835 (2015).
- Simmons, A. J., et al. Impaired coordination between signaling pathways is revealed in human colorectal cancer using single-cell mass cytometry of archival tissue blocks. Science Signaling. 9 (449), rs11 (2016).
- Friedman, A. A., Letai, A., Fisher, D. E., Flaherty, K. T. Precision medicine for cancer with next-generation functional diagnostics. Nature Reviews Cancer. 15 (12), 747-756 (2015).
