Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

ホルスタイン種乳牛におけるミトコンドリア呼吸を推定する肝ミトコンドリアの酸素消費量とプロトン リーク動態測定

doi: 10.3791/58387 Published: November 30, 2018

Summary

ここで、ミトコンドリアの酸素消費量、栄養エネルギー論とプロトンのリーク、ミトコンドリア ATP 生成の非効率性の主な原因の定義する概念を測定するための方法を共有します。これらの結果は、ミトコンドリアの機能を評価するのに役立つ栄養の使用率で失われるエネルギーの 30% は考慮できます。

Abstract

酸素消費量、プロトン動機力 (PMF)、プロトン リークはミトコンドリア呼吸やミトコンドリアが NADH や FADH を ATP に変換することができるどれだけの測定です。どのように効率的に彼らは酸素を使用し、直接 ATP を生成を栄養代謝の効率に関連しているミトコンドリアは酸素使用と二酸化炭素と水に栄養素の酸化のためのプライマリ サイトではまたので、動物の栄養要求と動物の健康。このメソッドの目的は、さまざまな薬物、食事や環境に及ぼすミトコンドリア代謝の効果を検討するためミトコンドリアの呼吸を調べることです。結果には、プロトン依存呼吸 (状態 3) とプロトン リーク依存呼吸 (状態 4) 測定酸素消費が含まれます。状態 3/状態 4 呼吸の比率は呼吸調節比 (RCR) として定義され、ミトコンドリアのエネルギー効率を表すことができます。ミトコンドリアのプロトン リークは、ADP を ATP 合成の効率が下がりますから酸化リン酸化の脱共役のミトコンドリア膜電位 (MMP) の損失をできるようにするプロセスです。状態 3 状態 4 呼吸、ミトコンドリア膜 PMF や ATP を作り出す潜在性) を測定する使用されるミトコンドリアの基板と電子輸送鎖阻害剤酸素と TRMP + 敏感電極とプロトンのリーク。このメソッドの制限、肝組織は可能な限り新鮮なする必要があります、すべての生検とアッセイは、10 h 未満で行う必要があります。これは、サンプルを収集し、約 5 日で一人で処理できる数を制限します。ただし、乳用牛などの大型動物に必要なサンプル量は肝臓の大きさに比べて小さい、少しの回復時間が必要なので、肝組織の 1 g だけが必要です。

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ミトコンドリアはストレスに非常に敏感、彼らの携帯電話の環境は様々 な代謝疾患に貢献できます。酸素消費量とミトコンドリアのプロトン リークがミトコンドリア健康の指標です。RCR を使用してこの用紙見積もりのミトコンドリアのエネルギー効率で説明する方法は、酸素消費量とプロトン リークせずに基づいています。これらの結果は、栄養使用率1で失われたエネルギーの 30% は考慮できます。酸素消費量とプロトン リークの変化はミトコンドリア代謝性疾患に貢献し、減らされたエネルギー効率の結果を識別できます。これらのメソッドは、ミトコンドリア呼吸にさまざまな治療法の効果を検討するも使用できます。ミトコンドリアの酸素消費量とプロトン リーク カイネティクス測定の全体的な目標は、ミトコンドリアの機能とエネルギー効率を評価するためには。

肝ミトコンドリア機能不全は、乳牛のいくつかの疾患に関連付けられています。泌乳初期にエネルギー収支の赤字に直面して炭水化物や脂質の燃料を切り替えるに細胞の代謝能力は、数と2細胞内のミトコンドリアの機能によって影響されます。ミトコンドリアのエネルギーと増加する β-酸化の需要の増加に適応能力の欠陥はインスリン抵抗性に関連する細胞内の脂質の蓄積につながることができ、泌乳牛の泌乳初期の脂肪肝の形成につながる可能性があります。ミトコンドリア、ケトン体の生産と利用、サイトとして、乳牛3でケトーシスで重要な役割を再生できます。ミトコンドリアやミトコンドリア機能障害の欠如は周囲に燃料の可用性に影響を与えるし、酸素消費量または RCR の変更に反映されます。

炎症応答のミトコンドリアの酸素消費変化。7 日齢のブロイラーは、アイメリア ・ マキシマとコントロール グループ4感染グループにランダムに割り当てられました。コクシジウム症の挑戦を受けていないブロイラーは、プロトン リークと肝ミトコンドリアが増加陽子リークによって免疫チャレンジに応答を示す高い RCR のため低酸素消費を持っていた。プロトン リークしながら反応酸素種の生産は一度ミトコンドリア膜機能不全の兆候とエネルギー効率に支障をきたす、今知られているミトコンドリア5にタンパク質とカルシウムのインポートすることが重要です。、および熱1の生成のため。

呼吸鎖の電子漏れはミトコンドリアの膜蛋白質、脂質およびミトコンドリア DNA ミトコンドリアが活性酸素種の生産と酸化的損傷を受けやすいになります。ミトコンドリアの年齢としてダメージが蓄積されミトコンドリア ミトコンドリア代謝6や牛の病気への感受性を増加でさらに機能不全を引き起こしている、特に。実際には、多くの家畜動物は、高レベルの抗酸化機能を高めるため Cu, Zn, Mn などのサプリメントを供給されています。ただし、Cu の高レベルを供給、Zn, Mn 牛乳生産の減少、プロトン リーク (状態 4 呼吸)7のための酸素消費量を増加します。

牛のエネルギー効率におけるミトコンドリア機能の役割に関する先行研究は、ミトコンドリアの酸素消費量とプロトン リークの変化を重視しています。非常にいくつかの研究は、乳牛で公開されているし、ほとんどの論文は肉用牛におけるミトコンドリア機能に残留飼料摂取量 (RFI) の形で生産効率を比較します。ホルスタイン雌牛から授乳中の牛の肝臓状態 3、4 および RCR を測定することによって料金を調べたミトコンドリア呼吸の変動は牛 (アンガス、ヘレフォード Brangus)8.研究者は、ミトコンドリア呼吸成長や搾乳のための肉用牛の特徴の相関関係を見つけなかったが、ミトコンドリア呼吸と搾乳ホルスタインの特徴間の相関関係を報告でした。2 つの研究の RFI がミトコンドリア呼吸速度 (3、4 の状態と RCR の状態) に肉用牛筋ミトコンドリア9,10で比較されました。ミトコンドリア呼吸速度変更 dmi 対応と低料金が少ない効率的な肥育に関連付けられていた。別の研究で高または低の RFI ブルズから去勢牛の RFI はミトコンドリア呼吸速度とプロトン リーク カイネティクス子孫11の 2 つのグループ間で比較しました。違いは、利得を得る結論は肉用牛では、ミトコンドリア呼吸を影響を確認するためだった。

本稿で RCR 泌乳牛に 3 の抗酸化ミネラルを餌に応答を測定する方法の使用に示します肝臓を調べる実験中に酸素消費量 4 の状態し、3 の呼吸と PMF の状態します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

すべてのメソッド、プロトコルおよびここで説明した研究がデイビス機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) カリフォルニア大学によって承認されました。

1. ホルスタイン種の乳牛から肝生検を取得

注: 肝生検は、認可された獣医によって実行する必要があります。肝生検は、牛がある乳製品のサイトで実行できます。泌乳牛は通常搾乳を続けることができ、ミルクがプロシージャの前後に食糧供給から撤退する必要はありません。少なくとも 4 人が乳牛の肝臓の生検を実施する必要がお勧めします: 生検生検エリア、獣医、移動反応するペンの外側にラボ技術者を保護するために牛の股関節に立つ動物ハンドラーを実行する獣医師小胞体ツール、材料および生検サンプルと獣医師から、車両 (図 1) の奥に技術者が肝のサンプルを取得し、ミトコンドリアの分離を開始することができます清潔を維持します。

  1. 肝生検の前に 1 ヶ月与える牛クロストリジウム属の予防接種です。オートクレーブ滅菌手術用タオル、生検機器、メス ホルダー、手術用機器、手術用のパックを作成します。
  2. 1 日肝生検の前に、首の皮下セフチオフル塩酸 0.044 mL/kg 体重で牛を挿入します。牛温度, 摂取量と正常な機能のベースラインとして使用する糞便のスコアを監視します。
  3. 4 ° C でミトコンドリアの分離メディア (MIM) 含 220 mM マンニトール、70 mM ショ糖、20 mM HEPES、1 mM EDTA および 0.1% (w/v) 脂肪酸無料 BSA、pH 7.4 を作成します。サンプルあたり約 30 mL 必要になります。
  4. 必要に応じて物理的にホールターをヘッドロックを利用した牛 (図 2) を抑制します。支柱の左側に頭を結ぶホールターを使用します。必要に応じて、化学的拘束 (キシラジン塩酸塩 100 mg/mL IV で 0.010 0.015 mg/kg 体重) 使用することができます。
  5. 生検の所が右 10-11 肋 (図 3) であります。右塊茎腸骨から右肩の点に直線を描画します。生検は、この行が 10-11 肋と交差する場所です。10 cm の正方形領域 (図 4) を剃ることによって生検する牛の領域を滅菌します。円運動を使用して 10 %providone スクラブ (図 5) で領域を洗ってください。70% エタノール溶液 (図 6) と領域をスプレーします。Providone とエタノールの洗浄の繰り返し。
    注: 肝臓は肉用牛と比較してホルスタイン種乳牛のわずかに異なる位置にです。
  6. 皮膚と基になる筋肉と結合組織 (図 7) の麻酔を提供する区域にローカルで 2% リドカイン塩酸 (10-15 mL) を挿入します。Providone と 70% エタノール洗浄を繰り返します。
    注意: 神経終末が皮膚、筋肉がない内臓、anesthestic ローカルのみが必要です。せいぜい、牛では生検の手順の中にいくつかの圧力と痛みを感じる必要がありますのみ。
  7. 10-11 肋間スペース (図 8) の皮膚を 1-2 cm の鍔を作る。皮膚を通して Schackelford コートニー ウシ肝生検装置を渡すし、横隔膜と肝臓 (図 9図 10) を継続しながらわずかな頭蓋方向に生検機器を直接します。肝臓 1 g サンプルを入手し、計測器 (図 11) を削除します。縫合の配置 (図 12) と皮膚を閉じます。
  8. サンプルでは、即時のミトコンドリアの分離のための氷の上をカバーする十分な MIM と円錐管の場所肝臓サンプル
  9. チェック切開、赤み、腫れ、熱、または生検の 24 時間以内に痛みなどの注入牛首の皮下セフチオフル塩酸 0.044 mL/kg 体重 (図 13) 次の 3 日の日に 1 回。肝生検後 1 週間毎日牛の温度、摂取量と糞便のスコアを監視します。熱を開発し、獣医師の判断で抗生物質を続けます。
    注: 牛の肝生検後 1 時間以内に触れる痛み、切開部位、recumbancy、赤み、熱、または反応で蹴るなどの兆候が現れてフルニキシンの 1 mg/kg 体重の点滴が痛みや炎症を軽減するために使用できます。第 2 の注射は、必要に応じて管理できます。
  10. 生検後 7 日間縫合糸を削除します。

2。 乳牛の肝臓のミトコンドリアを絶縁する

  1. 牛から肝のサンプルを削除すると後に、できるだけ早く赤血液細胞を除去し、サンプルをはさみで細かくミンチに MIM (手順 1.3) で肝臓サンプルを洗浄します。肝臓は、組織の潤いを保つに十分な分離メディアを含む冷蔵ビーカーでみじん切りする必要があります。
  2. 30 mL のバイアルに 0.16 mm クリアランス氷孵化し、MIM (1:4 w/v) を含むテフロン乳棒とみじん切り肝臓を配置します。
  3. 4 ストローク/分と分のため 500 rpm でテフロン乳棒で肝臓サンプルをホモジナイズしてください。
    注: 全体のプロセス中に MIM で氷満載のビーカーにその肝臓ホモジネートの保管され、4 ° C ですべての遠心分離手順の完了
  4. 10 分間 500 x g でホモジネートを遠心分離機、ペレットを破棄、冷蔵遠心チューブに上清を転送およびミトコンドリアのペレットを取得する 10 分間 10,000 x g で結果上澄みを遠心分離します。
  5. 再懸濁します脂肪酸無料 BSA を用いた MIM の 10 mL にペレットを洗いし、10 分破棄上清の 8100 × g で遠心分離機します。
  6. 再懸濁します脂肪酸無料 BSA なし MIM の 10 mL にペレットを洗いし、10 分破棄上清の 8100 × g で遠心分離機します。
  7. 分離媒体の 200 μ L でペレットを中断し、氷の酸素消費量とプロトン リーク カイネティックアッセイに使用されるまでの場所します。
  8. 標準として BSA と製造元のプロトコルごとビシンコニン酸 (BCA) キットを使用してペレット懸濁液 (1/100 倍希釈液) のタンパク質濃度を決定します。すべてのタンパク質は、ミトコンドリアのタンパク質と見なされます。

3. ミトコンドリアの酸素消費量 (3 および州の 4 州) の測定

  1. 5 mM Hepes と 1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、pH 7.4 0.3% と 30 ° C で脱脂 BSA、120 mM KCl、5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2から酸素消費メディア (OCM) を作成します。サンプルあたり約 3 mL 必要になります。またエタノール 8 μ g/mL オリゴマイシンのソリューションを準備します。
  2. OCM を 30 ° c. で孵化させなさい(Oxygraph システム) の製造元の指示に従って呼吸室、ポンプと酸素電極を設定します。Oxygraph ソフトウェアは、コンピューターに既にインストールされている必要があります。
  3. OCM の 1 mL を呼吸室に置き、積極的にかき混ぜます。ソリューションが空気と飽和することを保証するために役立ちます。
  4. 呼吸室にミトコンドリア蛋白質の 0.35 mg タンパク質を加えるし、30 ° C に温度を維持
  5. 約 5 分間の酸素消費量を記録します。Oxygraph システム レコード酸素濃度は酸素呼吸につれて、減少します。酸素消費に変わったら定数 (減少ストレート ライン) レコードの酸素消費量 (直線の傾き/時刻の酸素の濃度を =)。これがベースライン酸素消費量です。
  6. 複合体を阻害する 4 mM ロテノン ソリューションの 1.25 の μ L を追加私、5 mM コハク酸呼吸部屋の最終濃度に到達する 1 M コハク酸溶液 5 μ L を追加。これは、呼吸です。
  7. 100 μ M の呼吸室に最終濃度に到達する 100 mM ADP ソリューションの 1 μ L を追加します。酸素濃度が (高められた呼吸) が減少し、直線となる約 5 分後。酸素消費量を記録 (直線の傾き/時刻の酸素の濃度を =)。これは、状態 3 呼吸です。
  8. オプション: 実行の最後に、最大の呼吸を誘発する FCCP (0.2 μ M 総巻) を追加します。(約) 約 5 分間呼吸を記録します。時の酸素消費量一定、レコードの酸素消費量になります。これは、最大酸素摂取量です。
  9. 呼吸制御比率 (RCR) 状態 3 酸素消費量の方程式を使って計算/4 酸素消費量の状態します。
  10. すべての呼吸室からソリューションを吸い出しなさい。ダブルの脱イオン水で数回チャンバーをすすいでください。

4. ミトコンドリア膜電位 (MMP) とプロトン動機力 (PMF) の測定

  1. エタノール 80 ng/mL nigericin のソリューションを準備します。
    注: これらの化学物質は、エタノールに溶解し、エタノールできます電子輸送システムを切り離すし、ミトコンドリアの機能不全を引き起こすので、未満 1 μ L に追加されるエタノールの量を制限するためにあらゆる努力をすべきであります。
  2. チャンバー内に二重の脱イオン水を徹底的に洗浄後呼吸室に、OCM の 1 mL を置き、電磁攪拌棒で積極的にかき混ぜます。ソリューションが空気と飽和することを保証するために役立ちます。セットアップを商工会議所にメチル トリフェニル ホスホニウム (TPMP +) 敏感な電極を追加します。TPMP + 電極を pH メーターに接続する必要があります、値が pH メーターから読み取られます。
  3. 呼吸室にミトコンドリア蛋白質の 0.35 mg を追加します。
  4. 1.25 μ L (約) 2-5 分のための複雑な I. レコード呼吸を阻害する 4 mM ロテノン ソリューションを追加します。時の酸素消費量一定、レコードの酸素消費量になります。
  5. 8 μ g/mL のオリゴマイシン向け 2.8 μ g オリゴマイシン ADP 使用率を抑制するミトコンドリア蛋白質の 0.35 mg の最終的な集中の 0.56 μ L を追加します。(約) 2-5 分の呼吸を記録します。時の酸素消費量一定、レコードの酸素消費量になります。
  6. ミトコンドリア内膜の間で pH 勾配を廃止する 0.112 μ L 80 ng/mL nigericin ソリューションを追加します。(約) 2-5 分の呼吸を記録します。時の酸素消費量一定、レコードの酸素消費量になります。
    注: ロテノンとオリゴマイシンを使用してブロックする電子輸送鎖複合体私は、ATP 合成酵素、それぞれ。Nigericin は、電極で測定することができます K + グラデーションに貫通型 H + 勾配を変換するのに追加されます。
  7. TPMP + 標準曲線を準備するには、ミトコンドリアのインキュベーションに 10 mM TPMP + ソリューションの 5 μ L を追加します。2.5 μ M TPMP + の合計濃度が追加されるまでに、このステップ 4 回を繰り返します。
  8. 商工会議所に 1 M コハク酸の 5 μ L を追加することによって呼吸を開始します。
  9. 安定したトレースを達成するまで呼吸を記録し、その後、マロン酸を追加することによってシステムを滴定しなさい。マロン酸の追加は、0.5 μ、1 μ L、1.5 μ L、3.0 μ L、6.0 μ L、9.0 μ L、0.1 mM 0.1、0.2、0.3、0.6、1.2、1.8、培養室でマロン酸濃度の連続する追加を実現するマロン酸のソリューションの 2.5 mM、12.5 μ L にする必要があります。
  10. 2 つの電極 (酸素と TPMP+) からデータを収集します。ミトコンドリアの酸素消費量とミトコンドリア膜電位の同時測定を収集し、リアルタイムでの酸素消費量の変化を観察する oxygraph システムからのデータ集録ソフトウェアを使用できます。図 14は、oxygraph システムが実験が進むにつれて酸素消費量を記録する方法を示しています。
  11. ネルンストの同等化に基づく mV で MMP を計算します。
    MMP = 61.5 ログ ([TPMP +] 追加-外部 [TPMP +]) x TPMP+ 結合補正/(x 0.001 mg タンパク質/mL の x [TPMP +])
    ミトコンドリアのタンパク質-1の 0.4 μ L/mg の TPMP + バインド補正が使用されます。
    プロトコルの濃度に基づく計算の例:
    MMP = 0.4 x 61.5 x ログ (5 μ M-2 μ M)/(0.001 × 0.35 mg ミトコンドリア蛋白質/mL x 2 μ M)
    MMP = 198.9 mV
  12. 見積もり PMF MMP酸素消費量 (図 15) のグラフをプロットすることによってです。PMF が 165 の膜電位における酸素消費量として報告された mV。
    注: マロン酸 (0.1 から 2.5 mM) と電子輸送鎖を滴定 MMP にプロトン リークの動力学的挙動を示しています。その後、酸素消費量に対して MMP をプロット陽子リーク速度を決定します。PMF は一般的な膜電位における酸素消費量を計算することによって決定されます (165 mV)。
  13. サンプルの最後の実行の最後に、最大の呼吸を誘発し、基線補正用 TPMP + リリース FCCP (0.2 μ M 総巻) を追加します。
  14. すべての呼吸室からソリューションを吸い出しなさい。ダブルの脱イオン水で数回チャンバーをすすいでください。一日の終わりには、商工会議所も洗い流してください数回エタノール。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

RCR とプロトンのリーク動態を示す肯定的な結果が表 1図 15にそれぞれ表示されます。この研究7、RCR および蛋白質のリークで動態ミルクに 70 日間でホルスタイン種乳牛で測定した後、Cu, Zn, Mn の 5 つの異なるレベルの 1 で 28 日間飼育した牛.状態 4、最大陽子リーク依存型呼吸、Cu, Mn, Zn (p < 0.1) のミネラル摂取量によって影響を受ける傾向があった。状態 3 呼吸 (最大 ATP は、呼吸を刺激される)、RCR = 状態 3/4 状態 (呼吸調節比) はミネラルの摂取量の影響を受けません。4 呼吸が LowMn で最高, Mn プロトン リーク依存呼吸を最小限に抑える重要な役割を果たしていることを示す、コントロールの最低の状態します。マンガン Mn スーパーオキシド ・ ジスムターゼ酵素によって、ミトコンドリアにおける活性酸素種とプロトン リーク12を削減する知られています。高い状態 4 呼吸下乳と乳蛋白質率と関連していた。プロトン リークは、エネルギー効率の重要なコンポーネントは、状態 4 Mn 補充を介して呼吸を減らすと効率が向上します。

治療1
Med LowMn コントロール SEM
ミルク、kg 47.4ab 50.9 46.0ab 43.6b 49.7 2.9
乳タンパク質、kg 1.38ab 1.44 1.40ab 1.23b 1.43 0.09
状態 3 75.8 64.4 78.2 73 64.1 13
状態 4 26.2ab 22.6ab 25.9ab 27.1 22.0b 3
RCR 2.89 2.76 2.98 2.65 2.83 0.27
b同じ上付き文字が続かない行内手段が大幅に異なる (P < 0.1)。
1 には高い治療にはもすべて、上記の要件13Cu, Zn, Mn の最高レベルが含まれています、医学治療を含む要件上の Cu, Zn, Mn 中間レベル、低治療に含まれる低レベルの Cu, Zn, Mn がまだ上要件、低 Mn 治療に含まれる Mn (, 銅および亜鉛の低レベル) の最低レベルですが要件およびコントロールの上にまだ治療は Cu と Zn、要件に近いの最低のレベルを含んでいます。

表 1: 牛乳に 70 日間での乳牛から肝ミトコンドリアの酸素消費量および乳生産に効果の Cu, Mn, Zn の補充。この表は、Acetoze et al. 20177から適応されています。

ミトコンドリアのプロトンのリークは、ATP14の生産なしミトコンドリア内膜のプロトンの動きを通じて MMP を消費するプロセスです。165 の一般的な膜電位における酸素消費量の率を計算することによってプロトン リーク動態を評価 mV。低い膜電位陽子低 ATP 合成 (図 15) の結果、ミトコンドリアの膜を渡って '漏れ' でことを意味します。ホルスタイン牛研究で肝陽子リーク依存呼吸だった LowMn で最大と最低状態 4 呼吸が LowMn で最大とコントロールで最も低いテーブル 1の結果と一致する、コントロールの。

Figure 15
図 15。ホルスタイン牛におけるプロトン リーク動態は、Cu, Mn, Zn の量が異なるを供給しました。このグラフは、Acetoze et al. 20177からのデータに基づいています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

否定的な結果は表 2 図 16に示します。高 RFI 牛よりも低 RFI 牛から生まれたアンガス牛の飼料効率 (RFI) が高かったが、これはミトコンドリア RCR (表 2) やプロトン リーク動態 (図 16) に反映されません。ミトコンドリア呼吸とプロトン リーク カイネティクスの去勢牛の群間に差はなかったが、RFI の違いがあった。差は認められなかった (p = 0.88) 肝ミトコンドリアのプロトンのリークで高低 RFI 去勢牛 (図 16)。ミトコンドリアの呼吸測定に関連付けられている標準誤差が大きいとプロトン リーク運動曲線は横ばいだった。肝この研究から採取した去勢牛が殺された後肝臓サンプル コレクションおよび処理時間が遅延するプロセス。ミトコンドリア呼吸対策の変化組織の死によるミトコンドリア呼吸低下反映するかもしれません。設備故障により既に高原に達したとき、酸素消費量の測定は 8 分まで開始されませんでしたので、プロトン リーク運動線が横ばいだった。

低 RFI 高 RFI SEM P
(n = 7) (n = 8)
RFI -0.58 -0.01 0.1 0.05
状態 3 31.3 30.8 9.42 0.9
状態 4 9.76 10.4 3.23 0.8
RCR 3.05 3.03 0.24 0.93

表 2: パフォーマンスとハイとローの残留飼料摂取量 (RFI) アンガスのミトコンドリア呼吸の雄牛の子孫。この表は、Acetoze201511から適応されています。

Figure 16
図 16。プロトン漏れ反応高と低の RFI アンガス牛の子孫を。このグラフは、Acetoze201511から適応されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 1
図 1: の部分をきれいに手術や生検材料牛ペン外車両の後ろに位置します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: ヘッド ロックのクロス ポールにホールターを使用して牛の拘束拘束します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 生検および塊茎右腸骨から右肩の点に直線を描画することによって発見した右 10-11 肋間スペースで生検の場所をきれいにする牛の領域。生検は、この行が 10-11 肋と交差する場所です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 10 cm 部生検の滅菌を準備する牛をシェービングします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: 円運動を使用して 10 %providone スクラブで生検部牛を洗います。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6。70% エタノール溶液による生検エリアをスプレーします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 7
図 7: 皮膚の麻酔を提供する区域にローカルで 2% リドカイン塩酸 (10-15 mL) を注入します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 8
図 8: 生検ツールを挿入する 10-11 肋間スペースの皮膚を 1-2 cm の鍔。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 9
図 9: 皮膚を介してウシ肝生検装置の挿入。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 10
図 10: 生検機器は横隔膜と肝臓を続けながらわずかな頭蓋方向に監督する必要があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 11
図 11: 肝臓ミトコンドリア分離駅への輸送のファルコナー管生検機器から感動の 1 g サンプル。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 12
図 12: 生検切開を閉じるに皮膚を縫合します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 13
図 13: 首の皮下セフチオフル塩酸 0.044 mL/kg 体重と牛の注入。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 14
図 14: 酸素消費レスポンス ミトコンドリア膜電位 (MMP) とプロトン動機を測定する各物質の添加を示す Oxygraph ソフトウェアの結果を強制的に (PMF)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

プロトコルの最も重要な点は代表的な肝組織サンプルを取得し、生検後できるだけ早くミトコンドリアの分離を開始します。呼吸測定の変化は低所に牛から短い輸送時間のため (表 1)。輸送時間を減らすためには、小さな実験室を設置、酪農場の事務所で、ミトコンドリアが生検の 10 分内に分離されるので、各収集された、肝臓サンプルが事務所に追い込まれました。セットアップと呼吸室と電極 (酸素、TPMP +) プロトンの勾配の記録の違いに前日の収集と処理のサンプルはプロトン リークの初期測定値の欠落などの不具合を避けることができます使用される pH メーターとテストキネティクス (図 16)。

新鮮な肝のサンプルとミトコンドリアの急速な隔離の必要性のためのサンプルを収集し、一日に処理できる数は制限されます。各サンプルの完了に約 5-6 時間したがって、一日あたりのみ約 5 つのサンプルの収集し、呼吸室あたり解析することができます。高スループット方法; ではありません。トリートメントのサンプル ・ サイズが限られ、小さなエラーが結果と意義を検出する能力と関連付けられる可変性を増やすことができます。

分離技術は、いくつかの細胞の部品に関連付けられている、ペレットに埋め込まれたままいくつかのミトコンドリアを除外することがまたは小さいミトコンドリアは、遠心分離の手順中にペレット洗浄で失われる可能性があります。これはミトコンドリアの完全な人口を反映しない結果につながる可能性があります。ミトコンドリアは、大きさや飢餓などの生理学的状態に応じて密度に変更し、運動 (トレーニング)15できます。調査結果を確証するクエン酸合成酵素16またはコハク酸脱水素酵素17を使用して酵素活性を持つミトコンドリア数の推定は必要かもしれない。

ミトコンドリアの分離は18、呼吸19齧歯動物に設立された独自の技術に変更がなされ、プロトン リーク動態20。ミトコンドリアとの実験的治療のティッシュ ソースによってこの手法への変更が可能です。BSA (脱脂) を使用して、組織に遊離脂肪酸をバインドします。組織が多くの脂肪酸 (10% 以上) それに関連付けられている、脱脂より BSA 追加できる遊離脂肪酸がミトコンドリアの測定を妨害するため。

ミトコンドリアの酸素消費量とこの技術を用いたプロトン リーク カイネティクスの測定は、標準的な手順です。肝臓は、ミトコンドリアが多い、彼らは簡単に抽出、および肝臓は栄養処理のプライマリ サイトから主に選択の組織をされています。この手法の変更は、乳腺や筋肉など他の組織の酸素消費を測定するために使用されています。ただし、ミトコンドリアの分離技術は、組織に合わせて変更する必要があります。例えば、筋、ミトコンドリアは筋肉繊維に埋め込まれた、タンパク質の消化と消化がミトコンドリアの機能が中断されないように制御する必要がある分離手順を含める必要がありますので。

呼吸を測定する専用アナライザーを必要とするミトコンドリア呼吸を測定するための他の方法があります。細胞を組織から採取し、培養プレートに固定する必要があります。アナライザー測定セル全体の酸素消費量 (OCR; 基底)、ATP リンク最大 OCR、nonmitochondrial OCR OCR (ミトコンドリアに関連付けられて)。しかし、ミトコンドリアは、インキュベーションのいくつかの間に抑制される、ミトコンドリアの分離測定が可能ないです。このメソッドは、人間の病気と薬物介入21 OCR 変更を検討する使用されています。

現在と将来のアプリケーション

動物のエネルギー要件にプロトン リークの貢献が大成長、母乳や病など動物の生理学的状態を示すことができます。過去には、この手法は、主にミトコンドリアの酸素消費量の協会とフィードにプロトン リークまたはエネルギー効率の貢献を検討する使用されています。しかし、ミトコンドリア代謝の役割の私達の理解を拡大に伴い、この技術の重要性も増加する他ミトコンドリア電子伝達系酵素、カルシウム等との組み合わせで特にTCA サイクルのアポトーシスおよび酵素活性の動態。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この研究は、食品動物健康 UC デービス校獣医学校の中心を通ってアルテックと米国農務省のハッチの資金によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Liver Biopsy
Equipment
Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument Sontec Instruments Englewood CO 1103-904
Suture Fisher Scientific 19-037-516
Suture needles NA NA Included with Suture
Scalpels Sigma - Aldrich S2896 / S2646 # for handle and blades
Surgery towels Fisher Scientific 50-129-6667
Falcon tubes 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Tweezers Sigma - Aldrich Z168750
50 mL syringes Fisher Scientific 22-314387
Injection needles (22, 2 1/2) VWR MJ8881-200342
Cow halter Tractor Supply Co. 101966599
Cotton swabbing Fisher Scientific 14-959-102
cotton gauze squares (4x4) Fisher Scientific 22-246069
Medical scissors Sigma - Aldrich Z265969
Chemicals
Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow Provided by Veterinarian
Clostridia Vaccine Provided by Veterinarian
Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days Provided by Veterinarian
Providone Scrub Aspen Veteterinary Resources 21260221
Ethanol 70% Sigma - Aldrich 793213
Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight Provided by Veterinarian
2% lidocaine HCl (10-15 mL) Provided by Veterinarian
1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine Provided by Veterinarian
Isolation of Mitochondria (liver)
Equipment
Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance Fisher Scientific 02-911-527
Homogenizer Motor Cole Parmer EW-04369-10
Homogenizer Probe Cole Parmer EW-04468-22
Auto Pipette (10 mL) Cole Parmer SK-21600-74
Beaker (500 mL) with ice Fisher Scientific FB100600
Refrigerated microfuge Fisher Scientific 75-002-441EW3
Microfuge tubes (1.5 mL) Fisher Scientific AM12400
Chemicals
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) abcam ab102536
Sucrose Sigma - Aldrich S7903-1KG
Tris-HCl Sigma - Aldrich T1503-1KG
EDTA Sigma - Aldrich EDS-1KG
BSA (fatty acid free) Sigma - Aldrich A7030-50G
Mannitol Sigma - Aldrich M4125-1KG
Deionized water Sigma - Aldrich 38796
Hepes Sigma - Aldrich H3375-500G
Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,  pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator
Mitochondrial Oxygen Comsuption
Equipment
Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode Hansatech (PP Systems) OXY1
Thermoregulated Water Pump ADInstruments MLE2001
Clark type Oxygen electrode NA NA
Autopipette (1 mL) Cole Parmer SK-21600-70 Included with Oxy1
Small magnetic stir bar Fisher Scientific 14-513-95
Micropipette (10 μL) Cole Parmer SK-21600-60
pH meter VWR
Chemicals
KCl Sigma - Aldrich P9333-1KG
Hepes Sigma - Aldrich H3375-500G
KH2PO4 Sigma - Aldrich P5655-1KG
MgCl2 Sigma - Aldrich M1028-100ML
EGTA Sigma - Aldrich E3889-100G
Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA
Rotenone (4 mM solution) Sigma - Aldrich R8875-5G
Succinate (1 M solution) Sigma - Aldrich S3674-250G
ADP (100 mM solution) Sigma - Aldrich A5285-1G
Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) Sigma - Aldrich 75351
FCCP Sigma - Aldrich C2920
Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force
Equipment
TPMP electrode World Precision Instruments. DRIREF-2
Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs
Malonate (0.1 mM solution) Sigma - Aldrich M1296
Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer Sigma - Aldrich 75351
Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer Sigma - Aldrich N7143
FCCP Sigma - Aldrich C3920
TPMP Sigma - Aldrich T200
TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
  2. Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).
  3. Bartlett, K., Eaton, S. Mitochondrial B oxidation. European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).
  4. Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).
  5. Wallace, D. C., Fan, W. Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics. Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).
  6. Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging. Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).
  7. Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc. Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).
  8. Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle. Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).
  9. Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers. Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).
  10. Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle. Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).
  11. Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls. ISRN Vet Sci. 2015, (194014), (2015).
  12. Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. Free Radicals in Biology and Medicine. Oxford University Press. Oxford. 186-187 (1989).
  13. National Research Council. Nutrient Requirements of Dairy Cattle. 7th revised edition, National Academy Press. Washington, DC. (2001).
  14. Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging. Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).
  15. Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity: beyond ATP. Nature. 17, 608-620 (2017).
  16. Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. Biochemical assays of respiratory chain complex activity. Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).
  17. Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression. Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).
  18. Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats. British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).
  19. Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice. PloS One. 3, (3), e1759 (2008).
  20. Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction. Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).
  21. Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research. Clinical Science. 127, 367-373 (2014).
ホルスタイン種乳牛におけるミトコンドリア呼吸を推定する肝ミトコンドリアの酸素消費量とプロトン リーク動態測定
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rossow, H. A., Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J. Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle. J. Vis. Exp. (141), e58387, doi:10.3791/58387 (2018).More

Rossow, H. A., Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J. Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle. J. Vis. Exp. (141), e58387, doi:10.3791/58387 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter