Summary
Здесь мы разделяем методы для измерения потребления митохондриальной кислорода, определяющих концепцию питания энергетики и Протон утечки, основной причиной неэффективности в митохондриальной генерации АТФ. Эти результаты можно приходится 30% энергии, потеряли в утилизации питательных веществ, чтобы помочь оценить функции митохондрий.
Abstract
Потребление кислорода, Протон мотив силы (PMF) и Протон утечки являются измерения митохондриальное дыхание, или насколько хорошо митохондрий в состоянии преобразовать NADH и ГВС в СПС. Так как митохондрии также основной сайт для использования кислорода и питательных веществ Окисление диоксида углерода и воды, насколько эффективно они используют кислород и производят АТФ непосредственно относится к эффективности обмена питательных веществ, потребности в питательных веществах животных, и состояние здоровья животного. Этот метод предназначен для изучения митохондриальное дыхание, который может использоваться для изучения воздействия различных препаратов, диеты и воздействия на окружающую среду на митохондриальной метаболизм. Результаты включают потребление кислорода, измеряется как Протон зависит от дыхания (статья 3) и Протон утечки зависит от дыхания (состояние 4). Отношение государства 3 / государственный 4 дыхания определяется как отношение дыхательных путей управления (RCR) и может представлять митохондриальной энергетической эффективности. Митохондриальной Протон утечки является процесс, который позволяет диссипации митохондриальной мембраны потенциальных (СПП) расцеплять окислительного фосфорилирования от ADP, снижается эффективность синтеза АТФ. Кислород и TRMP + чувствительной электроды с митохондриальных субстратов и ингибиторы цепи переноса электронов используются для измерения состояния 3 и 4 государства дыхания, Митохондриальные мембраны PMF (или потенциал для производства АТФ) и Протон утечки. Ограничения этого метода, что ткани печени должны быть как можно более свежей и все биопсии и анализы должны быть выполнены в менее чем 10 h. Это ограничивает количество выборок, которые могут быть собраны и обработаны один человек в день около 5. Однако только в 1 г ткани печени необходима, поэтому в крупных животных, таких как молочного скота, количество образцов необходимо мал по сравнению с печени размер и мало времени восстановления требуется.
Introduction
Митохондрии являются очень чувствительными к стресс и их клеточной среды может способствовать широкий спектр метаболических заболеваний. Протон утечки в митохондриях и потребление кислорода являются показателями здоровья митохондрий. Методы, описанные в этой бумаге смета митохондриальной энергоэффективности с помощью RCR, основанные на потребление кислорода с и без утечки Протон. Эти результаты можно приходится 30% энергии, потеряли в утилизации питательных веществ1. Изменения в утечки Протон и потребления кислорода может идентифицировать митохондриальной дисфункции, которая способствует метаболические болезни и приводит к снижению энергетической эффективности. Эти методы могут также использоваться для изучения влияния различных методов лечения на митохондриальное дыхание. Общая цель измерения потребления митохондриальной кислорода и Протон утечки кинетики — оценить функции митохондрий и энергетической эффективности.
Печеночная митохондриальной дисфункции был связан с несколькими заболеваниями в молочном скотоводстве. Клеточный метаболизм возможность переключения между углеводного и липидного топлива, когда сталкиваются с дефицит энергии в начале кормления зависит от числа и функции митохондрий в ячейки2. Дефекты в митохондриях способность адаптироваться к увеличению спроса на энергию и увеличение β-окисления может привести к накоплению внутриклеточного липидов, связанные с сопротивлением инсулина и может привести к формированию жирной печени в начале кормления дойных коров. Митохондрии, как сайт кетоновые тела производства и использования, могут играть ключевую роль в кетоз в молочных коров3. Отсутствие митохондрий или митохондриальной дисфункции повлияет на доступность топлива к периферии и отражены изменения в потреблении кислорода или RCR.
Изменения потребления в митохондриальной кислорода в ответ на воспаление. 7 день старое бройлеров были случайным образом распределены к группе заражены эймериями Максима и управления группы4. Бройлеров, которые не проходят кокцидиоза вызов имел меньшее потребление кислорода из-за утечки Протон и выше RCR, указывающее, что митохондрий печени реагировать иммунной проблема увеличения Протон утечки. Во время Протон утечки и реактивной видов кислорода считалось признаком митохондриальной мембраны дисфункции и наносит ущерб энергетической эффективности, сейчас известно, что важно для импорта белков и кальция в митохондриях5 и для генерации тепла1.
Электрон утечки из дыхательной цепи делает митохондрий подвержены реактивнооксигенных видов производства и окислительного повреждения митохондриальной мембраны белки, липиды и митохондриальной ДНК. Как возраста митохондрии ущерб может накапливаться, достигая особенно митохондриальной ДНК, вызывая дальнейшее дисфункции в митохондриальной метаболизм6 и большей восприимчивости к болезням коровы. На практике многие скота животных кормят высокого уровня добавки, такие как Cu, Zn и Mn увеличить Антиоксидантная функция. Однако кормления высокий уровень Cu, Zn и Mn сократилось производство молока и увеличение потребления кислорода вследствие Протон утечки (4 состояния дыхания)7.
Предыдущие исследования по вопросу о роли митохондриальной функции в области энергоэффективности в крупного рогатого скота была сосредоточена на изменения в Протон утечки и потребления митохондриальной кислорода. Очень мало исследований были опубликованы в молочном скотоводстве и большинство работ сравнить эффективность производства в виде остаточного потребления корма (RFI) для функции митохондрий в крупного рогатого скота. Изменчивость в митохондриальное дыхание, ставки были рассмотрены путем измерения состояние 3, состояние 4 и RCR в печень из кормящих голштынов и кормящих говядина коровы (Ангус, Брангус и Херефорд)8. Исследователи не нашли каких-либо корреляции в митохондриальное дыхание с роста или доения черты для крупного рогатого скота, но доклад корреляции между митохондриальное дыхание и доения черты для голштины. В двух исследованиях RFI сравнивали в мясном скотоводстве митохондриальное дыхание ставки (состояние 3, состояние 4 и RCR) в мышечных митохондрий9,10. Митохондриальное дыхание ставки изменилась в ответ на DMI и низкие ставки были связаны с менее эффективным говядины Бычков. В другом исследовании RFI Бычков из высоких или низких быков ЗПИ были сопоставлены с митохондриальное дыхание ставки и кинетика утечки протона между двумя группами потомства11. Различия обусловлены получить подтверждающие что делает вывод, что получить не воздействия митохондриальное дыхание в крупного рогатого скота.
В этом документе эксперимент, изучении печени, RCR в ответ на питание 3 антиоксидант минералов для кормящих молочного скота иллюстрирует использование методов измерения потребления кислорода во время 4 и 3 дыхания и PMF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, протокол и исследований, описанных здесь были утверждены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета Калифорнии, Дэвис.
1. получение биопсия печени от Гольштейн молочные коровы
Примечание: Биопсия печени должны выполняться лицензированных ветеринаром. Биопсии печени может выполняться на узле молочные, где расположены коров. Молочных коров может продолжать нормально доят и молоко не нужно быть выведены от продуктов питания до или после процедуры. Рекомендуется, что по крайней мере 4 человек необходимы для выполнения биопсии печени на молочные коровы: ветеринар для выполнения биопсии, дрессировщик стоять на коровье бедра для защиты области биопсии и ветеринар, лаборант на внешней стороне пера для ПРЕОБР ER инструменты, материалы и биопсии образца и от ветеринара и поддерживать чистой зоне, которая может быть задней части транспортного средства (рис. 1) и техник для получения печени образца и начать митохондриальной изоляции.
- За один месяц до биопсии печени, дают коровы клостридий вакцинации. Создание хирургической пакеты автоклавирования хирургические полотенца, инструмент биопсии, Держатели скальпель и хирургическое оборудование.
- Один день до биопсии печени, придать коровы с 0,044 мл/кг веса Цефтиофур гидрохлорида подкожно в области шеи. Контролировать температуру корова, потребление и фекальных оценки для использования в качестве основы для нормальной функции.
- Создайте митохондрий изоляции СМИ (MIM) содержащее 220 мм маннитол, сахароза 70 мм, 20 мм HEPES, 1 мм ЭДТА и 0,1% (w/v) жирных кислот бесплатно BSA, рН 7,4 при 4 ° C. Будет необходимо около 30 мл на сэмпл.
- Останови корова физически используя headlock с halter, при необходимости (рис. 2). С помощью Холтер, галстук голову к левой стороне стойки. При необходимости, химическая сдержанность (Ксилазина гидрохлорид 100 мг/мл IV на 0,010-0,015 мг/кг веса тела) может быть использован.
- Области биопсии находится на право 10 - 11 межреберное пространство (рис. 3). Рисование прямой линии от правой тазобедренному бугру до точки правого плеча. Биопсия сайт находится, где эта линия пересекается с 10-11 межреберное пространство. Стерилизуйте области корову, чтобы быть биопсию после бритья площадь 10 см (рис. 4). Промойте области с 10% providone скраб (рис. 5) с помощью кругового движения. Спрей области с 70% этанола раствор (рис. 6). Повторите смывки providone и этанола.
Примечание: В печени подвергается в несколько иной позиции в Гольштейн молочного скота, по сравнению с крупного рогатого скота. - Внедрить 2% лидокаин HCl (10-15 мл) локально в этот район для обеспечения анестезии кожи и мышц и соединительной ткани (рис. 7). Повторите providone и 70% этанол моет.
Примечание: Нервных окончаний в кожу и мышцы, но не внутренних органов, поэтому только местное anesthestic необходима. В большинстве корова только должны чувствовать некоторое давление и никакой боли во время процедуры биопсии. - Сделайте 1-2 см удар разрез через кожу межреберное пространство 10-11 (рис. 8). Пройти Schackelford-Кортни говядину биопсии печени инструмент через кожу и прямой инструмент биопсии в небольшой черепной направлении, продолжая через диафрагму и в печени (рис. 9, рис. 10). Получение выборки 1 g печени и удалить инструмент (рис. 11). Закройте кожи с размещением швов (Рисунок 12).
- Место печени образца в конической трубки с достаточно MIM для покрытия образца, на льду для немедленного митохондрий изоляции
- Проверка разрез для каких-либо покраснение, опухоль, тепло, или боль в течение 24 часов после биопсии и вводить коровы с 0,044 мл/кг веса Цефтиофур гидрохлорида подкожно в области шеи один раз в день в течение 3 дней (рис. 13). Контролировать температуру, потребление и фекальных баллы коровы ежедневно за 1 неделю после биопсии печени. Если развивается лихорадка, продолжают антибиотиков на усмотрение ветеринара.
Примечание: Если корова проявляет признаки боли, например ногами на разрез сайта, recumbancy, покраснение, тепло или реакции на ощупь в течение 1 ч после биопсии печени, 1 мг/кг веса тела IV инъекции меглумин flunixin может использоваться для облегчения боли и воспаления. Вторая инъекция может управляться при необходимости. - Удаление швов через 7 дней после биопсии.
2. изоляция митохондрий от коровы печени
- Как можно скорее после печени образец удаляется от коровы, мыть печени образца в MIM (шаг 1.3) для удаления красных кровяных клеток и мелко фарш образца с ножницами. Функции печени следует фарша в охлажденный стакан, содержащие достаточно изоляции СМИ держать влажной ткани.
- Положите фарш печени в стеклянный флакон 30 мл с тефлоновым пестиком 0,16 мм зазор инкубировали в лед и содержащие MIM (1:4 w/v).
- Однородный печени образца в тефлоновой пестиком в 500 об/мин мин с 4 тактов/мин.
Примечание: Печени огневки хранится в стакан льда Упакованные в МИМ в течение всего процесса, и выполнены все следующие шаги центрифугированием при температуре 4 ° C - Центрифуга огневки на 500 g x 10 мин, отменить Пелле, передача супернатант в охлажденной центрифуге трубку и затем центрифуга результате супернатант в 10000 x g за 10 мин до получения митохондриальной Пелле.
- Ресуспензируйте и помыть лепешка в 10 мл МИМ с BSA бесплатные жирные кислоты и центрифуги на 8100 x g для 10 минут удалить супернатант.
- Ресуспензируйте и помыть лепешка в 10 мл MIM без бесплатно ЗБТ жирные кислоты и центрифуги на 8100 x g для 10 минут удалить супернатант.
- Приостановить гранулы в 200 мкл изоляции СМИ и место на льду пока не используется для потребления кислорода и Протон утечки кинетическая анализов.
- Определите концентрацию белка гранул суспензии (1/100 разрежения) с помощью Bicinchoninic кислоты (BCA) комплект на производителя протокол с BSA как стандарт. Считается, что все белков митохондриальных белок.
3. измерение потребления митохондриальной кислорода (состояние государственных и 3 4)
- Создание СМИ потребления кислорода (OCM) из 120-мм KCl, 5 мм х2PO4, 5 мм MgCl2, 5 мм Hepes и 1 мм EGTA, рН 7,4 на 30 ° C с 0,3% обезжиренная BSA. Будет необходимо около 3 мл на сэмпл. Также подготовьте раствор 8 мкг/мл oligomycin в этиловом спирте.
- Инкубируйте OCM на 30 ° C. Настройка камеры, насос и кислорода электрода дыхания согласно инструкциям производителя (oxygraph система). Программное обеспечение oxygraph должен быть установлен на компьютере.
- 1 мл раствора OCM в камеру дыхания и размешивать энергично. Это поможет гарантировать, что решение становится насыщенным с воздухом.
- Добавить 0,35 мг белка митохондриальных белок в зале дыхания и поддержания температуры в 30 ° C.
- Запись потребление кислорода для примерно 5 мин. Так как дыхание увеличивает, концентрация кислорода уменьшается концентрация кислорода oxygraph системы записи. Когда потребление кислорода становится константа (снижение прямой), потребление кислорода записи (наклон линии = концентрация кислорода и времени). Это базовый уровень потребления кислорода.
- 1,25 мкл раствора ротенон 4 мм для ингибирования комплекс I и затем добавить 5 мкл раствора сукцината 1 М до конечной концентрации в зале дыхания сукцината 5 мм. Это состояние 4 дыхания.
- 1 мкл раствора ADP 100 мм до конечной концентрации в зале дыхания 100 мкм. Концентрация кислорода будет уменьшаться (увеличение дыхание) и затем после примерно 5 минут становится прямой линии. Записать потребление кислорода (наклон линии = концентрация кислорода и времени). Это состояние 3 дыхания.
- Дополнительно: В конце выполнения, добавьте FCCP (общий объем 0.2 мкм) чтобы побудить максимальной дыхания. Запись дыхания для около 5 минут (примерно). Когда потребление кислорода становится потребление кислорода постоянной, запись. Это потребление кислорода Максимальная.
- Вычислить дыхательных путей управления соотношение (RCR) с помощью уравнения состояния 3 потребление кислорода / государственный 4 потребление кислорода.
- Аспирационная все решения из камеры дыхания. Промойте отсек несколько раз с двойной деионизированной водой.
4. Измерение митохондриальной мембраны потенциал (СПП) и Протон движущей силой (PMF)
- Готовят раствор 80 nigericin нг/мл в этиловом спирте.
Примечание: Эти химические вещества растворяются в спирте, и следует приложить все усилия для ограничения количества этанола, который добавляется к менее чем в 1 мкл, поскольку этанол может расцепить транспортная система электронов и вызывают mitchondrial дисфункции. - После ополаскивания тщательно в камеру с двойной деионизированной воды, место 1 мл OCM в зале дыхания и размешивать энергично с баром магнитные перемешать. Это поможет гарантировать, что решение становится насыщенным с воздухом. Добавление метил илидами фосфониевых (TPMP +) чувствительных электрода для камеры установки. TPMP + Установка электрода должен быть подключен к рН метр, и значения считываются из рН метр.
- Добавьте 0,35 мг митохондриальных белок в зале дыхания.
- 1,25 мкл раствора 4 мм ротенон подавляют дыхание сложных I. запись для 2-5 мин (приблизительно). Когда потребление кислорода становится потребление кислорода постоянной, запись.
- Добавление 0,56 мкл 8 мкг/мл oligomycin раствора для конечной концентрации 2,8 мкг oligomycin /0.35 мг митохондриальных белок, чтобы препятствовать использованию ADP. Запись дыхания для 2-5 мин (приблизительно). Когда потребление кислорода становится потребление кислорода постоянной, запись.
- Добавьте 0,112 мкл 80 нг/мл nigericin решение упразднить градиента рН через внутреннюю мембрану митохондрий. Запись дыхания для 2-5 мин (приблизительно). Когда потребление кислорода становится потребление кислорода постоянной, запись.
Примечание: Ротенон и oligomycin используются для блокировки электрон-транспортной цепи в комплексе I и АТФ-синтаза, соответственно. Nigericin добавляется для преобразования трансмембранного H + градиент градиент K +, которая может быть измерена с электрода. - Подготовьте калибровочной кривой для TPMP +, добавив 5 мкл 10 мм TPMP + решения митохондриальной инкубации. Повторите этот шаг четыре раза, до тех пор, пока общая концентрация 2,5 мкм TPMP + была добавлена.
- Инициировать дыхания, добавив 5 мкл 1M сукцината в палату.
- Запись дыхание, до тех пор, пока вы достигли стабильного трассировки, а затем Титруйте системы путем добавления Дендримерные. Дополнения Дендримерные должна быть 0,5 мкл, 1 мкл, 1.5 мкл, 3.0 мкл, 6.0 мкл, 9.0 мкл, затем 12,5 мкл 0,1 Дендримерные решение для достижения последовательных добавлений Дендримерные концентраций в камере инкубации 0,1, 0,2, 0,3, 0,6, 1.2, 1.8 и 2,5 мм.
- Сбор данных из двух электродов (кислорода и TPMP+). Программное обеспечение для сбора данных от системы oxygraph может использоваться для сбора одновременного измерения потребления митохондриальной кислорода и митохондриальной мембранного потенциала и наблюдать за изменениями в потреблении кислорода в режиме реального времени. На рисунке 14 показано, как oxygraph система записывает потребление кислорода в ходе эксперимента.
- Вычислите ММП в МВ на основе уравнения Нернста:
ММП = 61,5 журнал ([TPMP +] добавлены – внешние [TPMP +]) x TPMP+ привязки коррекция / (0,001 x мг белка/мл x [TPMP +])
Используется привязка коррекция TPMP + 0,4 мг/мкл митохондриальных белок-1 .
Пример вычисления, основанные на концентрации в протоколе:
ММП = 61,5 x журнал (5 мкм-2 мкм) x 0,4 / (0,001 x 0,35 мг митохондриальных белок/мл x 2 µM)
ММП = 198,9 МВ - Оценка PMF путем построения графа ММП против потребления кислорода (рис. 15). PMF сообщается как потребление кислорода в мембранный потенциал 165 МВ.
Примечание: Титрования электрон-транспортной цепи с Дендримерные (0,1 до 2,5 мм) показывает кинетической ответ Протон утечки ММП. Затем заговор против потребления кислорода ММП определяет Протон утечки кинетики. PMF определяется путем расчета потребления кислорода на общих мембранного потенциала (165 МВ). - В конце последнего запуска образца добавьте FCCP (общий объем 0.2 мкм) вызвать максимальное дыхания и освободить TPMP + для коррекции базовой линии.
- Аспирационная все решения из камеры дыхания. Промойте отсек несколько раз с двойной деионизированной водой. В конце дня палата должна также быть промыть несколько раз этанола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Позитивные результаты показаны RCR и Протон утечки кинетики показаны в таблице 1 и на рисунке 15, соответственно. В этом исследовании7, RCR и белка утечки кинетики были измерены в Гольштейн дойных коров на 70 дней в молоке после коров было подано 1 5 различных уровней, Cu, Zn и Mn в течение 28 дней. Состояние 4, максимальная Протон зависящих от утечки дыхания, имели тенденцию быть затронуты минеральных потребление и Cu, Mn, Zn (p < 0.1). Состояние 3 дыхания (максимальная СПС стимулирует дыхание) и RCR = состояние 3 / 4 государства (соотношение дыхательных путей управления) не был затронут минеральных потребление. Состояние 4 дыхания был самым высоким в LowMn и самые низкие в элемент управления, указывающее, что Mn играет важную роль в минимизации Протон утечки зависит от дыхания. Марганец, через фермента супероксиддисмутаза Mn известно сократить реактивнооксигенных видов в матрице митохондриальных и Протон утечки12. Более высокие состояния 4 дыхания был связан с нижней молока и надой молока белок. Так как Протон утечки является важной составляющей энергетической эффективности, сокращение государственного 4 дыхания через Mn добавок может повысить эффективность.
| Лечение1 | ||||||
| Высокая | Мед | Низкая | LowMn | Управления | SEM | |
| Молоко, кг | 47.4АВ | 50.9 | 46.0АВ | 43.6b | 49.7 | 2.9 |
| Молочный белок, кг | 1.38АВ | 1.44 | 1.40АВ | 1.23b | 1.43 | 0,09 |
| Состояние 3 | 75,8 | 64,4 | 78.2 | 73 | 64,1 | 13 |
| Состояние 4 | 26.2АВ | 22.6АВ | 25.9АВ | 27.1 | 22.0b | 3 |
| RCR | 2.89 | 2.76 | 2,98 | 2,65 | 2,83 | 0,27 |
| b Средства в строке не следуют в том же письме надстрочного значительно отличаются (P < 0.1). | ||||||
| 1 высокая лечение содержит наивысшую Cu, Zn и Mn все хорошо выше требования13, Med лечение содержит промежуточные уровни выше требования Cu, Zn и Mn, низкий лечения содержит более низких уровней, Cu, Zn и Mn, но все еще выше требования, низкий Mn лечения содержит низкие уровни Mn (и более низких уровнях Cu и Zn) но по-прежнему выше требования и контроль лечения низкие уровни Cu и Zn, которые близки к требованиям. | ||||||
Таблица 1: влияние Cu, Mn и Zn добавок на печени митохондриальной молока и потребления кислорода из молочных коров на 70 дней в молоке. Эта таблица была адаптирована из Acetoze et al. 20177.
Митохондриальной Протон утечки является процессом, который рассеивает MMP через перемещение протонов через Митохондриальные внутренняя мембрана без производства АТФ14. Протон утечки кинетики оцениваются путем расчета темпов потребления кислорода на общий потенциал мембраны 165 МВ. Нижняя мембранного потенциала означает, что протоны «утечка» через Митохондриальные мембраны, что приводит к нижней синтез АТФ (Рисунок 15). В исследовании корова Гольштейн печеночная Протон утечки зависит от дыхания был наибольшим в LowMn и самые низкие в элемент управления, который соглашается с результатами в таблице 1, что состояние 4 дыхания был наибольшим в LowMn и самые низкие в элементе управления.
Рисунок 15. Протон утечки кинетики в голштынов кормили различных количествах Mn и Cu, Zn. Эта диаграмма основана на данных из Acetoze et al. 20177. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Отрицательные результаты приводятся в таблице 2 и на рисунке 16. Эффективность корма (RFI) была выше в Angus Бычков, родился от низкой быков ЗПИ чем высокой быков ЗПИ, но это не было отражено в митохондриальной RCR (Таблица 2) или Протон утечки кинетика (рис. 16). Существовали никаких различий в митохондриальное дыхание и кинетика утечки протона между группами Бычков, но существует различие в RFI. Не было также никаких различий (p = 0,88) в печени митохондриальной Протон утечки в высоких и низких RFI Бычков (рис. 16). Там были большие стандартные ошибки, связанные с митохондриальное дыхание измерений, и Протон утечки кинетические кривые были плоскими. Печеночных проб из этого исследования были получены после того, как были убиты Бычков, процесс, который задерживается печени выборки и обработки на час. Различия в мерах митохондриальное дыхание может отражать митохондриальное дыхание деградации вследствие смерти ткани. Протон утечки кинетическая линии были плоскими, потому что измерения потребления кислорода не начинается до 8 мин, когда плато уже было достигнуто из-за неисправности оборудования.
| Низкая RFI | Высокая RFI | SEM | Значение P | |
| (n = 7) | (n = 8) | |||
| RFI | -0.58 | -0.01 | 0.1 | 0.05 |
| Состояние 3 | 31,3 | 30,8 | 9.42 | 0.9 |
| Состояние 4 | 9.76 | 10.4 | 3.23 | 0,8 |
| RCR | 3.05 | 3.03 | 0,24 | 0.93 |
Таблица 2: производительность и митохондриальное дыхание Ангус остаточного потребление корма (RFI) высокого и низкого бык потомства. Эта таблица была адаптирована из Acetoze et al. 201511.
На рисунке 16. Протон утечки кинетика для потомства быков ЗПИ Ангус высокого и низкого. Этот график был адаптирован от Acetoze et al. 201511. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 1: очистить область для хирургических и биопсия материалы, расположенные в задней части транспортного средства, так и вне корова перо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: сдержанность коровы с помощью петли привязаны к крест полюс головки замка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: площадь коровы для очистки для биопсии и расположение биопсии на право 10 - 11 межреберные пространстве найден путем рисования прямой линии от правой тазобедренному бугру до точки правого плеча. Биопсия сайт находится, где эта линия пересекается с 10-11 межреберное пространство. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: бритье площадью 10 см корову, чтобы подготовиться к стерилизации для биопсии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: мыть области биопсии коровы с 10% providone скраб с помощью кругового движения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. Spray биопсии районе с 70% этанола раствор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: вводить лидокаин 2% HCl (10-15 мл) локально в этот район для обеспечения анестезии кожи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: 1-2 см удар разрез через кожу 10-11 межреберные пространства для вставки инструмент биопсии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 9: вставки документа говядину биопсии печени через кожу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 10: инструмент биопсии должны быть направлены в небольшой черепной направлении, продолжая через диафрагму и в печени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 11: 1 g образец печени, перемещаются из биопсии инструмент Falconer трубы для транспортировки до станции митохондриальной изоляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 12: Ушивание кожу, чтобы закрыть разрез биопсии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 13: инъекции коровы с 0,044 мл/кг веса Цефтиофур гидрохлорида подкожно в области шеи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 14: Oxygraph программного обеспечения результаты показаны кислорода потребления ответы для добавления каждого вещества для измерения митохондриальной мембраны потенциал (СПП) и Протон мотив силы (PMF). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее критической точки в протокол получения образца представитель ткани печени и начало изоляции митохондрий как можно скорее после биопсии. Вариации в измерениях дыхания является низкой (Таблица 1) из-за короткой транспортной время от коровы в лабораторию. Чтобы сократить время транспортировки, небольшая лаборатория была создана в офисе молочного, и печеночных проб были изгнаны в лаборатории офиса как каждый была собрана так что митохондрии были изолированы в течение 10 мин биопсии. Настройка и тестирование камеры дыхания и электроды (кислород, TPMP +) с pH метр, используется для записи различия в градиенты протона за день до сбора и обработки образцов можно избежать сбоев, таких как утеря ранних измерений в Протон утечки Кинетика (рис. 16).
Из-за необходимости свежие печеночных проб и быстрой изоляции митохондрий ограничено количество выборок, которые могут быть собраны и обработаны в день. Каждый образец занимает приблизительно 5-6 ч до завершения; Таким образом только около 5 образцов в день можно собраны и проанализированы на камеру дыхания. Это не метод, высокая пропускная способность; Размер выборки для лечения ограничены и небольшие ошибки может увеличить изменчивости, связанные с результатами и способность обнаруживать значение.
Метод изоляции может исключить некоторые митохондрий, которые связаны с некоторыми компонентами клеток и остаются встроенных в гранулы или меньше митохондрий могут быть потеряны в Пелле моет во время центрифугирования шаги. Это может привести к результатам, которые не отражают полную совокупность митохондрий. Митохондрии можно изменить в размер и плотность в зависимости от физиологического состояния, например голода и осуществлять (обучение)15. Оценивая митохондриальной номер с ферментативной активности с использованием цитрат синтазы16 или сукцината дегидрогеназа17 подтвердить выводы могут быть необходимы.
Изменения не были внесены оригинальные методики, создана в грызунов для митохондриального изоляции18, дыхание19 и Протон утечки кинетики20. Изменения к этой технике могут быть сделаны в зависимости от источника ткани митохондрий и экспериментальные методы лечения. BSA (обезжиренный) используется для связывания свободных жирных кислот в ткани. Если ткань имеет много жирных кислот (больше чем 10%), связанные с ним, более обезжиренная BSA можно добавить искажать свободных жирных кислот митохондриальное измерения.
Измерение потребления кислорода митохондриальных и Протон кинетики утечки с помощью этой методики является стандартной процедурой. Печень была ткани выбора, главным образом потому, что он имеет много митохондрий, они являются довольно легко извлечь и печень является основной сайт питательных обработки. Модификации этой техники были использованы для измерения потребления кислорода в других тканях, таких как мышцы и молочной. Однако митохондриальных изоляции методов должен быть изменен с учетом ткани. Например в мышцах, митохондрии, внедренные в мышечных волокон и поэтому процедура изоляции должны включать переваривания белка и пищеварение должна контролироваться для обеспечения что митохондриальной функции не нарушается.
Существуют другие методы для измерения митохондриальное дыхание, которые требуют анализатора специально для измерения дыхания. Клетки должны быть собраны из ткани и крепится к инкубации пластины. Расход анализатор кислорода клеточных меры (OCR; базальную), АТФ связаны OCR (связанные с митохондрии), nonmitochondrial OCR и максимальной OCR. Однако поскольку митохондрии тормозится во время некоторых инкубации, изолированных митохондриях измерения не возможны. Этот метод был использован для изучения изменений OCR с болезней и наркотиков вмешательства21 в организме человека.
Текущие и будущие приложения
Вклад Протон утечки энергии требованиям животного может быть большим и показателем физиологического состояния животных, включая рост, лактации и болезни. В прошлом этот метод главным образом используется для изучения ассоциации потребления митохондриальной кислорода и вклад Протон утечки кормить или энергетической эффективности. Однако как расширяет наше понимание роли митохондрий в метаболизме, будет также увеличить значение этой техники особенно в сочетании с другими мерами митохондрий как электрон-транспортной цепи ферментативной активности, кальция динамика в апоптоз и фермента цикла TCA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Оллтек и USDA Люк средства через центр здоровья животных пищевой UC Дэвис школа ветеринарной медицины.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liver Biopsy | |||
| Equipment | |||
| Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Suture | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Suture needles | NA | NA | Included with Suture |
| Scalpels | Sigma - Aldrich | S2896 / S2646 | # for handle and blades |
| Surgery towels | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Falcon tubes 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Tweezers | Sigma - Aldrich | Z168750 | |
| 50 mL syringes | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Injection needles (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Cow halter | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
| Cotton swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| cotton gauze squares (4x4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Medical scissors | Sigma - Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Provided by Veterinarian | ||
| Clostridia Vaccine | Provided by Veterinarian | ||
| Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days | Provided by Veterinarian | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Ethanol 70% | Sigma - Aldrich | 793213 | |
| Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight | Provided by Veterinarian | ||
| 2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Provided by Veterinarian | ||
| 1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine | Provided by Veterinarian | ||
| Isolation of Mitochondria (liver) | |||
| Equipment | |||
| Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Homogenizer Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Homogenizer Probe | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Auto Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Beaker (500 mL) with ice | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Refrigerated microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Microfuge tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma - Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma - Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma - Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (fatty acid free) | Sigma - Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma - Aldrich | M4125-1KG | |
| Deionized water | Sigma - Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA, pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator | |||
| Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
| Equipment | |||
| Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| Thermoregulated Water Pump | ADInstruments | MLE2001 | |
| Clark type Oxygen electrode | NA | NA | |
| Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Included with Oxy1 |
| Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Micropipette (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH meter | VWR | ||
| Chemicals | |||
| KCl | Sigma - Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma - Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma - Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma - Aldrich | E3889-100G | |
| Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
| Rotenone (4 mM solution) | Sigma - Aldrich | R8875-5G | |
| Succinate (1 M solution) | Sigma - Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 mM solution) | Sigma - Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
| Equipment | |||
| TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs | |||
| Malonate (0.1 mM solution) | Sigma - Aldrich | M1296 | |
| Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma - Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma - Aldrich | T200 | |
| TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA |
References
- Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
- Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).
- Bartlett, K., Eaton, S. Mitochondrial B oxidation. European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).
- Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).
- Wallace, D. C., Fan, W. Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics. Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).
- Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging. Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).
- Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc. Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).
- Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle. Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).
- Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers. Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).
- Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle. Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).
- Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls. ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).
- Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. Free Radicals in Biology and Medicine. , Oxford University Press. Oxford. 186-187 (1989).
- National Research Council. Nutrient Requirements of Dairy Cattle. , 7th revised edition, National Academy Press. Washington, DC. (2001).
- Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging. Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).
- Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity: beyond ATP. Nature. 17, 608-620 (2017).
- Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. Biochemical assays of respiratory chain complex activity. Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).
- Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression. Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).
- Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats. British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).
- Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice. PloS One. 3 (3), e1759 (2008).
- Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction. Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).
- Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research. Clinical Science. 127, 367-373 (2014).
