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Biochemistry

मापने जिगर Mitochondrial ऑक्सीजन की खपत और प्रोटॉन रिसाव कैनेटीक्स Holstein डेयरी मवेशियों में Mitochondrial श्वसन अनुमान करने के लिए

doi: 10.3791/58387 Published: November 30, 2018

Summary

यहां, हम mitochondrial ऑक्सीजन की खपत, पोषण ऊर्जावान की एक परिभाषित अवधारणा को मापने के लिए तरीकों का हिस्सा है, और प्रोटॉन रिसाव, एटीपी के mitochondrial पीढ़ी में अक्षमता का प्राथमिक कारण । इन परिणामों के लिए पोषक तत्व उपयोग में खो ऊर्जा के 30% के लिए खाते में मदद mitochondrial समारोह का मूल्यांकन कर सकते हैं ।

Abstract

ऑक्सीजन की खपत, प्रोटॉन मकसद बल (PMF) और प्रोटॉन रिसाव mitochondrial श्वसन की माप कर रहे हैं, या कितनी अच्छी तरह mitochondria नध में और फॊध को एटीपी में परिवर्तित करने में सक्षम हैं. चूंकि mitochondria भी ऑक्सीजन का उपयोग करें और कार्बन डाइऑक्साइड और पानी के लिए पोषक तत्व ऑक्सीकरण के लिए प्राथमिक साइट हैं, कैसे कुशलतापूर्वक वे ऑक्सीजन का उपयोग करें और एटीपी का उत्पादन सीधे पोषक तत्व चयापचय, पशु के पोषक तत्वों की आवश्यकताओं की दक्षता से संबंधित है, और पशु का स्वास्थ्य । इस विधि के प्रयोजन के लिए mitochondrial श्वसन, जो विभिंन दवाओं, आहार और mitochondrial चयापचय पर पर्यावरणीय प्रभाव के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की जांच है । परिणाम में शामिल है ऑक्सीजन की खपत के रूप में मापा प्रोटॉन निर्भर श्वसन (राज्य 3) और प्रोटॉन रिसाव निर्भर श्वसन (राज्य 4). राज्य 3/राज्य के अनुपात में 4 श्वसन श्वसन नियंत्रण अनुपात (RCR) के रूप में परिभाषित किया गया है और mitochondrial ऊर्जावान दक्षता का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । Mitochondrial प्रोटॉन रिसाव एक प्रक्रिया है कि Mitochondrial झिल्ली क्षमता के अपव्यय की अनुमति देता है (एमएमपी) द्वारा uncouplन ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण से ADP एटीपी संश्लेषण की दक्षता कम. mitochondrial सब्सट्रेट और इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला अवरोधकों के साथ ऑक्सीजन और TRMP + संवेदनशील इलेक्ट्रोड राज्य 3 और राज्य 4 श्वसन, mitochondrial झिल्ली PMF (या एटीपी का उत्पादन करने की क्षमता) और प्रोटॉन रिसाव को मापने के लिए उपयोग किया जाता है । इस विधि के लिए सीमाएं है कि जिगर ऊतक के रूप में संभव के रूप में ताजा होना चाहिए और सभी बायोप्सी और परख से कम 10 में प्रदर्शन किया जाना चाहिए एच । यह उन नमूनों की संख्या को सीमित करता है जिंहें एक दिन में किसी एकल व्यक्ति द्वारा लगभग 5 तक संग्रहीत और संसाधित किया जा सकता है । हालांकि, जिगर ऊतक के केवल 1 जी की जरूरत है, इसलिए बड़े जानवरों में, ऐसे दुधारू मवेशी के रूप में, आवश्यक नमूना की मात्रा जिगर के आकार के लिए छोटे रिश्तेदार है और वहाँ कम वसूली समय की जरूरत है.

Introduction

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Mitochondria बहुत तनाव के प्रति संवेदनशील होते है और उनके सेलुलर वातावरण चयापचय रोगों की एक विस्तृत विविधता के लिए योगदान कर सकते हैं । ऑक्सीजन की खपत और mitochondria में प्रोटॉन रिसाव mitochondria स्वास्थ्य के संकेतक हैं । इस पेपर में वर्णित विधियों का अनुमान mitochondrial ऊर्जा दक्षता के साथ और प्रोटॉन रिसाव के बिना ऑक्सीजन खपत पर आधारित RCR का उपयोग कर । इन परिणामों के पोषक तत्व उपयोग1में खो ऊर्जा का 30% के लिए खाते में कर सकते हैं । ऑक्सीजन की खपत और प्रोटॉन रिसाव में परिवर्तन mitochondrial रोग है जो चयापचय रोग और कम ऊर्जा दक्षता में परिणाम के लिए योगदान की पहचान कर सकते हैं । इन तरीकों को भी mitochondrial श्वसन पर विभिंन उपचार के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । mitochondrial ऑक्सीजन की खपत और प्रोटॉन रिसाव कैनेटीक्स को मापने के समग्र लक्ष्य के लिए mitochondrial समारोह और ऊर्जावान दक्षता का आकलन है ।

यकृत mitochondrial रोग डेयरी मवेशियों में कई बीमारियों के साथ जुड़ा हुआ है । सेलुलर चयापचय की क्षमता कार्बोहाइड्रेट और लिपिड ईंधन के बीच स्विच करने के लिए जब जल्दी स्तनपान में एक ऊर्जा घाटे के साथ सामना करना पड़ा संख्या और सेल में mitochondria के समारोह से प्रभावित है2। mitochondria की क्षमता में दोष ऊर्जा के लिए एक वृद्धि की मांग के लिए अनुकूल करने के लिए और वृद्धि हुई β-ऑक्सीकरण इंसुलिन प्रतिरोध के साथ जुड़े intracellular लिपिड के संचय के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और जल्दी स्तनपान डेयरी गायों में फैटी लीवर के गठन के लिए ले सकता है । Mitochondria, कीटोंन शरीर के उत्पादन और उपयोग की साइट के रूप में, डेयरी गायों3में ketosis में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं । mitochondria या mitochondrial शिथिलता की कमी की परिधि के लिए ईंधन की उपलब्धता को प्रभावित करेगा और ऑक्सीजन की खपत या RCR में परिवर्तन में परिलक्षित होगा ।

सूजन के जवाब में Mitochondrial ऑक्सीजन की खपत में बदलाव । सात दिन पुराने विवादों बेतरतीब ढंग से एक Eimeria maxima और एक नियंत्रण समूह4से संक्रमित समूह को सौंपा गया । विवाद करने वालों कि coccidiosis चुनौती से गुजरना नहीं था कम ऑक्सीजन की वजह से प्रोटॉन रिसाव और उच्च RCR का संकेत है कि जिगर mitochondria प्रोटॉन रिसाव में वृद्धि से एक प्रतिरक्षा चुनौती का जवाब की खपत थी । जबकि प्रोटॉन रिसाव और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन एक बार mitochondrial झिल्ली शिथिलता और ऊर्जावान दक्षता के लिए हानिकारक का संकेत माना जाता था, अब यह ज्ञात है कि यह mitochondria में प्रोटीन और कैल्शियम के आयात के लिए महत्वपूर्ण है5 , और1गर्मी की पीढ़ी के लिए ।

श्वसन श्रृंखला से इलेक्ट्रॉन रिसाव प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन और mitochondrial झिल्ली प्रोटीन, लिपिड और mitochondrial डीएनए को ऑक्सीडेटिव क्षति के लिए अतिसंवेदनशील mitochondria बनाता है । के रूप में mitochondria उंर, नुकसान विशेष रूप से mitochondrial चयापचय6 में आगे की शिथिलता और रोग के लिए गाय की अधिक संवेदनशीलता पैदा mtDNA के लिए जमा कर सकते हैं । व्यवहार में, कई पशुधन जानवरों की खुराक के उच्च स्तर जैसे घन, Zn और Mn के लिए एंटीऑक्सीडेंट समारोह को बढ़ावा देने के लिए खिलाया जाता है । हालांकि, घन, Zn और Mn के उच्च स्तर खिला दूध उत्पादन में कमी आई और प्रोटॉन रिसाव (राज्य 4 श्वसन) के कारण ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि हुई7

मवेशियों में ऊर्जा क्षमता में mitochondrial समारोह की भूमिका पर पिछले अनुसंधान mitochondrial ऑक्सीजन की खपत और प्रोटॉन रिसाव में परिवर्तन पर ध्यान केंद्रित किया है । बहुत कुछ अध्ययनों से दुधारू मवेशियों में प्रकाशित किया गया है और अधिकांश कागजात अवशिष्ट फ़ीड सेवन (RFI) के रूप में उत्पादन क्षमता की तुलना मांस मवेशियों में mitochondrial समारोह के लिए । mitochondrial श्वसन दरों में परिवर्तनशीलता दोनों स्तनपान कराने वाली Holstein गायों और स्तनपान कराने वाली बीफ़ गायों (एंगस, Brangus और Hereford)8से जिगर में राज्य 3, राज्य 4 और RCR को मापने के द्वारा जांच की गई । शोधकर्ताओं ने mitochondrial श्वसन में कोई संबंध वृद्धि या मांस मवेशियों के लिए दुहना लक्षण के साथ नहीं मिला, लेकिन mitochondrial श्वसन और Holsteins के लिए गुण दुहना के बीच एक संबंध की रिपोर्ट किया था । दो अध्ययनों में, RFI मांस मवेशियों की तुलना में mitochondrial श्वसन दर (राज्य 3, राज्य 4 और RCR) मांसपेशी mitochondria9,10में किया गया था । Mitochondrial श्वसन दर DMI और कम दरों के जवाब में बदल कम कुशल बीफ़ बिजनस के साथ जुड़े थे । एक अन्य अध्ययन में, उच्च या निम्न RFI सांडों से RFI की तुलना mitochondrial श्वसन दरों और संतान के दो समूहों के बीच प्रोटॉन रिसाव कैनेटीक्स से की गई11. मतभेदों को निष्कर्ष है कि लाभ बीफ़ मवेशियों में mitochondrial श्वसन प्रभाव नहीं है पुष्टि लाभ के कारण थे ।

इस पत्र में, एक प्रयोग के जवाब में जिगर RCR की जांच 3 एंटीऑक्सीडेंट खनिजों स्तनपान कराने वाली डेयरी पशु के लिए तरीकों का उपयोग करने के लिए 4 राज्य और राज्य 3 श्वसन और PMF के दौरान ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए दिखाता है ।

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Protocol

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सभी तरीकों, प्रोटोकॉल और अध्ययन यहां वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और विश्वविद्यालय के कैलिफोर्निया, डेविस के उपयोग की समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. एक Holstein डेयरी गाय से एक जिगर बायोप्सी प्राप्त करने

नोट: एक जिगर बायोप्सी एक लाइसेंस पशुचिकित्सा द्वारा किया जाना चाहिए । लिवर बायोप्सी डेयरी साइट पर किया जा सकता है जहां गायों स्थित हैं । स्तनपान कराने वाली दुधारू गायों को सामान्य रूप से दूध पिलाया जाना जारी रखा जा सकता है और दूध को भोजन की आपूर्ति से पहले या बाद में प्रक्रिया से वापस लेने की जरूरत नहीं है । यह अनुशंसा की जाती है कि एक दुधारू गाय पर जिगर बायोप्सी प्रदर्शन करने की जरूरत है कम 4 लोगों: एक पशुचिकित्सा बायोप्सी, एक पशु हेंडलर करने के लिए गाय के कूल्हे पर खड़े करने के लिए बायोप्सी क्षेत्र और पशु चिकित्सक, कलम के बाहर पर एक प्रयोगशाला तकनीशियन की रक्षा करने के लिए transf एर उपकरण, सामग्री और पशु चिकित्सक से और बायोप्सी नमूना और स्वच्छ क्षेत्र है, जो एक वाहन के पीछे (चित्रा 1) में हो सकता है, और एक तकनीशियन जिगर का नमूना प्राप्त करने के लिए और mitochondrial अलगाव शुरू बनाए रखने के लिए ।

  1. एक माह पूर्व लिवर बायोप्सी के लिए गायों को clostridia का टीकाकरण दें । सर्जिकल तौलिए, बायोप्सी इंस्ट्रूमेंट, स्केलपेल धारकों और सर्जिकल उपकरणों को autoclaving करके सर्जिकल पैक बनाएं ।
  2. जिगर की बायोप्सी से पहले एक दिन, Ceftiofur हाइडरोक्लॉराइड ०.०४४ मिलीलीटर/bodyweight के साथ गाय का इंजेक्शन गर्दन में चमड़े के नीचे । मॉनिटर गाय तापमान, सेवन और मल स्कोर सामान्य समारोह के लिए एक आधार रेखा के रूप में उपयोग करने के लिए.
  3. mitochondria आइसोलेशन मीडिया (MIM) containining २२० mm mannitol, ७० mm सुक्रोज, 20 mm HEPES, 1 mm EDTA, और ०.१% (डब्ल्यू/वी) फैटी एसिड फ्री BSA, 4 डिग्री सेल्सियस पर पीएच ७.४ बनाएं । प्रति नमूना लगभग 30 मिलीलीटर की जरूरत होगी ।
  4. गाय की जरूरत के रूप में एक लगाम के साथ शारीरिक रूप से एक headlock का उपयोग नियंत्रित (चित्रा 2) । लगाम का प्रयोग, आधार के बाईं ओर उसके सिर टाई । यदि आवश्यक हो, एक रासायनिक संयम (Xylazine हाइडरोक्लॉराइड १०० मिलीग्राम/एमएल चतुर्थ पर 0.010-0.015 मिलीग्राम/kg bodyweight) किया जा सकता है ।
  5. बायोप्सी के क्षेत्र में सही 10-11 पसलियों के बीच अंतरिक्ष (चित्रा 3) पाया जाता है । सही कंद coxae से सही कंधे के बिंदु पर एक सीधी रेखा ड्रा । बायोप्सी साइट है, जहां इस लाइन 10-11 पसलियों के बीच अंतरिक्ष के साथ संप्रदायों । 10 सेमी स्क्वायर एरिया (चित्रा 4) की biopsied किया शेव करके गाय के क्षेत्र का बंध्याकरण करें । धो क्षेत्र 10% providone सफ़ाई के साथ (चित्रा 5) एक परिपत्र गति का उपयोग कर । ७०% इथेनॉल समाधान (चित्रा 6) के साथ स्प्रे क्षेत्र । दोहराएं providone और इथेनॉल बहाकर ।
    नोट: जिगर बीफ़ मवेशियों की तुलना में Holstein डेयरी मवेशियों में एक थोड़ा अलग स्थिति में है ।
  6. त्वचा और अंतर्निहित मांसपेशी और संयोजी ऊतक (चित्रा 7) के संज्ञाहरण प्रदान करने के लिए क्षेत्र के लिए स्थानीय रूप से 2% lidocaine एचसीएल (10-15 मिलीलीटर) सुई । दोहराएं providone और ७०% इथेनॉल बहाकर ।
    नोट: तंत्रिका अंत त्वचा और मांसपेशियों में हैं, लेकिन आंतरिक अंगों, तो केवल एक स्थानीय anesthestic की जरूरत है । सबसे कम, गाय केवल कुछ दबाव और बायोप्सी प्रक्रिया के दौरान कोई दर्द महसूस करना चाहिए ।
  7. 10-11 पसलियों के बीच अंतरिक्ष (चित्रा 8) की त्वचा के माध्यम से एक 1-2 सेमी छुरा चीरा बनाओ । त्वचा के माध्यम से एक Schackelford-कोर्टनी गोजातीय जिगर बायोप्सी साधन दर्रा और डायाफ्राम के माध्यम से जारी है, जबकि एक मामूली कपाल दिशा में बायोप्सी साधन प्रत्यक्ष और जिगर में (9 चित्रा, चित्रा 10). जिगर का एक 1 जी नमूना प्राप्त करें और साधन (11 अंक) को हटा दें । टांका स्थान (12 अंक) के साथ त्वचा को बंद करें ।
  8. पर्याप्त एमआईएम के साथ एक शंकु ट्यूब में जगह जिगर का नमूना नमूना कवर करने के लिए, तत्काल mitochondria अलगाव के लिए बर्फ पर
  9. किसी भी लालिमा के लिए जांच चीरा, सूजन, गर्मी, या बायोप्सी के 24 घंटे के भीतर दर्द और Ceftiofur हाइडरोक्लॉराइड ०.०४४ मिलीलीटर/किलोग्राम गर्दन में bodyweight के साथ गाय इंजेक्षन अगले 3 दिनों के लिए एक दिन में एक बार (13 चित्रा) । एक सप्ताह के लिए जिगर की बायोप्सी के बाद गाय के तापमान, सेवन और मल स्कोर दैनिक मॉनिटर । यदि एक बुखार विकसित, पशु चिकित्सक के विवेक पर एंटीबायोटिक दवाओं जारी है ।
    नोट: यदि एक गाय दर्द के लक्षण प्रदर्शित है, जैसे चीरा साइट पर लात मार, recumbancy, लाली, गर्मी, या प्रतिक्रिया जिगर बायोप्सी के बाद 1 ज के भीतर स्पर्श करने के लिए, एक 1 मिलीग्राम/flunixin meglumine के bodyweight IV इंजेक्शन दर्द और सूजन को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक दूसरे इंजेक्शन यदि आवश्यक हो तो प्रशासित किया जा सकता है ।
  10. बायोप्सी के बाद 7 दिनों के टांके निकालें ।

2. दुधारू गाय जिगर से अलग Mitochondria

  1. इसके बाद जितनी जल्दी हो सके लिवर का नमूना गाय से हटा दिया जाता है, लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए एमआईएम (स्टेप १.३) में लिवर का नमूना लें और पतले नमूने को कैंची से कीमा करें । जिगर एक ठंडा करने के लिए पर्याप्त अलगाव मीडिया युक्त चोंच में कीमा बनाया जाना चाहिए ऊतक नम रखने के लिए ।
  2. एक 30 मिलीलीटर कांच की शीशी में कीमा बनाया हुआ जिगर ०.१६ mm मंजूरी की एक teflon मूसल बर्फ में और युक्त एमआईएम (1:4 डब्ल्यू/
  3. Homogenize teflon मूसल में जिगर का नमूना 4 स्ट्रोक के साथ एक मिनट के लिए ५०० rpm/
    नोट: जिगर homogenate पूरी प्रक्रिया के दौरान एमआईएम में एक बर्फ पैक चोंच में रखा जाता है, और निंनलिखित केंद्रापसारक कदम के सभी 4 डिग्री सेल्सियस पर पूरा कर रहे है
  4. केंद्रापसारक 10 मिनट के लिए ५०० x जी पर homogenate, गोली, एक ठंडा केंद्रापसारक ट्यूब को supernatant हस्तांतरण और फिर mitochondrial गोली प्राप्त करने के लिए 10 मिनट के लिए १०,००० एक्स जी में जिसके परिणामस्वरूप supernatant केंद्रापसारक छोड़ दें ।
  5. resuspend और फैटी एसिड मुक्त BSA के साथ एमआईएम के 10 मिलीलीटर में गोली धोने और 10 मिनट के लिए ८१०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant त्यागें ।
  6. resuspend और फैटी एसिड मुक्त BSA के बिना एमआईएम के 10 मिलीलीटर में गोली धोने और 10 मिनट के लिए ८१०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant त्यागें ।
  7. अलगाव मीडिया और बर्फ पर जगह के २०० µ एल में गोली निलंबित ऑक्सीजन की खपत और प्रोटॉन रिसाव काइनेटिक परख के लिए इस्तेमाल किया जब तक ।
  8. गोली निलंबन के प्रोटीन एकाग्रता (1/100 कमजोर पड़ने) मानक के रूप में BSA के साथ निर्माता के प्रोटोकॉल प्रति Bicinchoninic एसिड (बीसीए) किट का उपयोग कर निर्धारित करें । सभी प्रोटीन को mitochondrial प्रोटीन माना जाता है ।

3. मापने Mitochondrial ऑक्सीजन की खपत (राज्य 3 और राज्य 4)

  1. १२० मिमी KCl, 5 मिमी KH2पीओ4, 5 मिमी MgCl2, 5 मिमी Hepes और 1 मिमी EGTA, पीएच ७.४ से 30 डिग्री सेल्सियस पर ०.३% defatted BSA के साथ ऑक्सीजन खपत मीडिया (OCM) बनाएं । प्रति नमूना लगभग 3 मिलीलीटर की जरूरत होगी । इसके अलावा एथेनॉल में 8 μg/एमएल oligomycin का सॉल्यूशन तैयार करें ।
  2. 30 डिग्री सेल्सियस पर OCM की मशीन । श्वसन कक्ष, पंप और ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड निर्माता दिशाओं (oxygraph सिस्टम) के अनुसार सेट करें । oxygraph सॉफ़्टवेयर पहले से ही कंप्यूटर पर स्थापित किया जाना चाहिए ।
  3. श्वसन कक्ष में OCM के 1 मिलीलीटर प्लेस और जोरदार हलचल । यह बीमा है कि समाधान हवा के साथ संतृप्त हो जाता है में मदद मिलेगी ।
  4. जोड़ें ०.३५ mitochondrial प्रोटीन के मिलीग्राम प्रोटीन श्वसन कक्ष के लिए और 30 डिग्री सेल्सियस पर तापमान बनाए रखने के ।
  5. रिकॉर्ड ऑक्सीजन की खपत लगभग 5 मिनट के लिए । oxygraph प्रणाली ऑक्सीजन एकाग्रता इतना रिकॉर्ड के रूप में श्वसन वृद्धि, ऑक्सीजन एकाग्रता कम हो जाती है. जब ऑक्सीजन की खपत स्थिर हो जाता है (एक सीधी रेखा को कम), रिकॉर्ड ऑक्सीजन की खपत (ढाल की रेखा = ऑक्सीजन की एकाग्रता/ यह आधारभूत ऑक्सीजन खपत है.
  6. 4 मिमी रोटेनोन समाधान के १.२५ µ एल जोड़ें जटिल मैं को बाधित करने के लिए और फिर 5 मिमी succinate के श्वसन कक्ष में एक अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए 1 मीटर succinate समाधान के 5 µ एल जोड़ें. यह स्थिति 4 संवेदनाएं हैं ।
  7. 1 µ l जोड़ें १०० मिमी ADP समाधान १०० माइक्रोन के श्वसन कक्ष में एक अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए. ऑक्सीजन एकाग्रता (वृद्धि संवेदनाएं) कम हो जाएगा और फिर लगभग 5 मिनट के बाद एक सीधी रेखा बन जाता है । रिकॉर्ड ऑक्सीजन की खपत (ढलान की रेखा = एकाग्रता की ऑक्सीजन/ यह स्थिति 3 श्वसन है ।
  8. वैकल्पिक: चलाने के अंत में, अधिक से अधिक श्वसन प्रेरित करने के लिए FCCP (०.२ माइक्रोन कुल मात्रा) जोड़ें । लगभग 5 मिनट (लगभग) के लिए रिकॉर्ड संवेदनाएं । जब ऑक्सीजन की खपत लगातार हो जाता है, रिकॉर्ड ऑक्सीजन की खपत । यह अधिक से अधिक ऑक्सीजन की खपत है ।
  9. गणना श्वसन नियंत्रण अनुपात (RCR) समीकरण राज्य का उपयोग कर 3 ऑक्सीजन की खपत/
  10. महाप्राण श्वसन कक्ष से बाहर समाधान के सभी । कक्ष को कई बार दोहरा पानी के साथ कुल्ला ।

4. मापने Mitochondrial झिल्ली क्षमता (एमएमपी) और प्रोटॉन मकसद बल (PMF)

  1. इथेनॉल में ८० एनजी/एमएल nigericin के समाधान तैयार करें ।
    नोट: इन रसायनों इथेनॉल में भंग कर रहे हैं, और हर प्रयास इथेनॉल की राशि है कि कम से 1 μL को जोड़ा है सीमा बनाया जाना चाहिए, के बाद से इथेनॉल इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली और mitchondrial शिथिलता के कारण कुछ कर सकते हैं ।
  2. अच्छी तरह से डबल जल के साथ चैंबर धोने के बाद, श्वसन कक्ष में OCM के 1 मिलीलीटर जगह है और एक चुंबकीय हलचल बार के साथ जोरदार हलचल । यह बीमा है कि समाधान हवा के साथ संतृप्त हो जाता है में मदद मिलेगी । चैंबर सेटअप करने के लिए मिथाइल-triphenyl-phosphonium (TPMP +) संवेदनशील इलेक्ट्रोड जोड़ें. TPMP + इलेक्ट्रोड एक पीएच मीटर से जुड़ा होना चाहिए और मूल्यों पीएच मीटर से पढ़ रहे हैं.
  3. जोड़ें ०.३५ mitochondrial प्रोटीन की श्वसन कक्ष में मिलीग्राम ।
  4. जोड़ें १.२५ µ एल के 4 मिमी रोटेनोन समाधान के लिए जटिल मैं रिकॉर्ड श्वसन को बाधित 2-5 मिनट (लगभग). जब ऑक्सीजन की खपत लगातार हो जाता है, रिकॉर्ड ऑक्सीजन की खपत ।
  5. जोड़ें ०.५६ μL के 8 μg/एमएल oligomycin एक अंतिम एकाग्रता के लिए समाधान २.८ µ g oligomycin/०.३५ मिलीग्राम mitochondrial प्रोटीन ADP उपयोग को बाधित करने के लिए । रिकॉर्ड श्वसन 2-5 मिनट (लगभग) के लिए । जब ऑक्सीजन की खपत लगातार हो जाता है, रिकॉर्ड ऑक्सीजन की खपत ।
  6. जोड़ें ०.११२ μL ८० एनजी/एमएल nigericin समाधान mitochondrial भीतरी झिल्ली के पार पीएच ढाल को समाप्त करने के लिए । रिकॉर्ड श्वसन 2-5 मिनट (लगभग) के लिए । जब ऑक्सीजन की खपत लगातार हो जाता है, रिकॉर्ड ऑक्सीजन की खपत ।
    नोट: रोटेनोन और oligomycin क्रमशः जटिल मैं और एटीपी सिंथेस में इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला ब्लॉक करने के लिए उपयोग किया जाता है । Nigericin transmembrane H + ग्रैडिएंट को एक K + ग्रेडिएंट में कनवर्ट करने के लिए जोड़ा गया है जिसे एक इलेक्ट्रोड के साथ मापा जा सकता है.
  7. TPMP के लिए एक मानक वक्र तैयार + 10 मिमी TPMP के 5 µ एल जोड़कर + mitochondrial की मशीन के लिए समाधान । २.५ माइक्रोन TPMP + की कुल एकाग्रता जब तक चार और बार इस कदम को दोहराएं जोड़ा गया है ।
  8. कक्ष में 1m succinate की 5 μL जोड़कर संवेदनाएं आरंभ करें ।
  9. रिकॉर्ड संवेदनाएं जब तक आप एक स्थिर ट्रेस हासिल किया है, और फिर malonate जोड़कर प्रणाली अनुमापन । malonate का जोड़ ०.५ µ l, 1 µ l होना चाहिए, १.५ µ l, ३.० µ l, ६.० µ l, ९.० µ l, फिर १२.५ mm µ के एल malonate सॉल्यूशन की malonate सांद्रता के क्रमिक जोड़ को प्राप्त करने के लिए ०.१, ०.१, ०.२, ०.३, ०.६, १.२, और १.८ मिमी की मशीन चैंबर में ।
  10. दो इलेक्ट्रोड (ऑक्सीजन और TPMP+) से डेटा इकट्ठा. oxygraph प्रणाली से डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर mitochondrial ऑक्सीजन की खपत और mitochondrial झिल्ली की क्षमता के एक साथ माप इकट्ठा और वास्तविक समय में ऑक्सीजन की खपत में परिवर्तन का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । चित्रा 14 से पता चलता है कि कैसे oxygraph प्रणाली रिकॉर्ड ऑक्सीजन की खपत के रूप में प्रयोग की प्रगति ।
  11. ताकि नेर्ंस्ट समीकरण पर आधारित एमवी में एमएमपी की गणना:
    एमएमपी = ६१.५ log ([TPMP +] जोड़ा गया – बाहरी [TPMP +]) x TPMP + बाइंडिंग सुधार/(०.००१ x मिलीग्राम प्रोटीन/एमएल एक्स [TPMP +])
    mitochondrial प्रोटीन-1 के ०.४ µ l/मिलीग्राम का एक TPMP + बाइंडिंग सुधार किया जाता है ।
    प्रोटोकॉल में सांद्रता पर आधारित उदाहरण परिकलन:
    एमएमपी = ६१.५ x लॉग (5 µ एम – 2 µ m) x 0.4/(०.००१ x ०.३५ मिलीग्राम mitochondrial प्रोटीन/एमएल एक्स 2 µ एम)
    एमएमपी = १९८.९ एमवी
  12. एमएमपी बनाम ऑक्सीजन की खपत (चित्रा 15) का ग्राफ प्लॉट करके हमरा PMF । PMF १६५ एमवी की एक झिल्ली क्षमता पर ऑक्सीजन की खपत के रूप में सूचित है ।
    नोट: Titrating malonate के साथ इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (०.१ २.५ mM) प्रोटॉन रिसाव की काइनेटिक प्रतिक्रिया से पता चलता है एमएमपी । फिर, ऑक्सीजन की खपत के खिलाफ साजिश रचने एमएमपी प्रोटॉन रिसाव कैनेटीक्स निर्धारित करता है । PMF एक आम झिल्ली क्षमता (१६५ एमवी) पर ऑक्सीजन की खपत की गणना द्वारा निर्धारित किया जाता है ।
  13. नमूना के अंतिम भाग के अंत में, अधिक से अधिक श्वसन प्रेरित और आधारभूत सुधार के लिए TPMP + रिहाई के लिए FCCP (०.२ माइक्रोन कुल मात्रा) जोड़ें ।
  14. महाप्राण श्वसन कक्ष से बाहर समाधान के सभी । कक्ष को कई बार दोहरा पानी के साथ कुल्ला । दिन के अंत में, चैंबर भी इथेनॉल के साथ कई बार कुल्ला किया जाना चाहिए ।

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Representative Results

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RCR और प्रोटॉन रिसाव कैनेटीक्स दिखा सकारात्मक परिणाम क्रमशः तालिका 1 और चित्रा 15में दिखाए जाते हैं । इस अध्ययन में7, RCR और प्रोटीन रिसाव कैनेटीक्स Holstein डेयरी गायों में ७० दिन में मापा गया दूध में गायों के बाद 1 घन, Zn और Mn के 5 विभिंन स्तरों के 28 दिनों के लिए खिलाया गया था । 4 स्थिति, अधिकतम प्रोटॉन रिसाव-निर्भर श्वसन, घन, Mn और Zn के खनिज सेवन से प्रभावित होने की प्रवृत्ति थी (p < ०.१) । राज्य 3 श्वसन (अधिकतम एटीपी उत्तेजित श्वसन) और RCR = राज्य 3/राज्य 4 (श्वसन नियंत्रण अनुपात) खनिज सेवन से प्रभावित नहीं था । स्थिति 4 श्वसन LowMn में सबसे अधिक और नियंत्रण में सबसे कम था, यह दर्शाता है कि मार्लोन कम प्रोटॉन रिसाव निर्भर श्वसन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । एंजाइम Mn सुपरऑक्साइड Dismutase के माध्यम से मैंगनीज, mitochondrial मैट्रिक्स में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों को कम करने और प्रोटॉन12रिसाव को कम करने के लिए जाना जाता है । उच्च राज्य 4 श्वसन कम दूध और दूध प्रोटीन उपज के साथ जुड़ा हुआ था । चूंकि प्रोटॉन रिसाव ऊर्जा दक्षता का एक महत्वपूर्ण घटक है, Mn पूरकता के माध्यम से राज्य 4 श्वसन को कम करने दक्षता में सुधार कर सकता है ।

उपचार1
उच्च मेड कम LowMn नियंत्रण Sem
दूध, केजी ४७.४एबी ५०.९a ४६.०एबी ४३.६बी ४९.७a २.९
दूध प्रोटीन, केजी १.३८एबी १.४४a १.४०एबी १.२३बी १.४३a ०.०९
स्थिति 3 ७५.८ ६४.४ ७८.२ ७३ ६४.१ 13
स्थिति 4 २६.२एबी २२.६एबी २५.९एबी २७.१a २२.०बी 3
RCR २.८९ २.७६ २.९८ २.६५ २.८३ ०.२७
ए बी एक पंक्ति के भीतर मतलब एक ही सुपरस्क्रिप्ट पत्र के बाद नहीं काफी अलग हैं (P < ०.१).
1 उच्च उपचार घन, Zn और mn के उच्चतम स्तर है सभी अच्छी तरह से ऊपर आवश्यकताओं13, मेड उपचार घन, Zn और ऊपर की आवश्यकताओं mn के मध्यवर्ती स्तर शामिल हैं, कम उपचार घन के निचले स्तर, Zn और mn लेकिन अभी भी ऊपर है आवश्यकताओं, कम mn उपचार mn के निंनतम स्तर (और घन और Zn के निचले स्तर), लेकिन अभी भी ऊपर आवश्यकताओं और नियंत्रण उपचार है घन और Zn, जो आवश्यकताओं के करीब है के निंनतम स्तर शामिल हैं ।

तालिका 1: जिगर mitochondrial ऑक्सीजन की खपत और दूध में ७० दिनों में डेयरी गायों से दुग्ध उत्पादन पर घन, Mn और Zn पूरकता का प्रभाव । इस तालिका Acetoze एट अल. २०१७7से अनुकूलित किया गया है ।

Mitochondrial प्रोटॉन रिसाव एक प्रक्रिया है कि एटीपी14के उत्पादन के बिना Mitochondrial भीतरी झिल्ली के पार प्रोटान के आंदोलन के माध्यम से एमएमपी अपव्यय है । प्रोटॉन रिसाव कैनेटीक्स १६५ एमवी की एक आम झिल्ली की क्षमता पर ऑक्सीजन की खपत की दर की गणना द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं । एक निचली झिल्ली क्षमता का अर्थ है कि प्रोटान mitochondrial झिल्ली में ' लीक ' कर रहे हैं, जो कम एटीपी संश्लेषण (चित्रा 15) में परिणाम है । Holstein गाय अध्ययन में, यकृत प्रोटॉन रिसाव निर्भर श्वसन LowMn में सबसे बड़ा था और नियंत्रण में सबसे कम है, जो 1 तालिकामें परिणाम के साथ सहमत हैं, कि राज्य 4 श्वसन LowMn में सबसे बड़ी और नियंत्रण में सबसे कम था ।

Figure 15
चित्र 15. Holstein गायों में प्रोटॉन रिसाव कैनेटीक्स घन, Mn और Zn के विभिंन मात्रा में खिलाया । यह ग्राफ Acetoze एट अल. २०१७7से डेटा पर आधारित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

नकारात्मक परिणाम तालिका 2 और 16 चित्रामें सचित्र हैं । फ़ीड दक्षता (RFI) एंगस उच्च RFI बैल से कम RFI बैल से पैदा चलाने में उच्च था, लेकिन इस mitochondrial RCR (तालिका 2) या प्रोटॉन रिसाव कैनेटीक्स (चित्रा 16) में प्रतिबिंबित नहीं था । mitochondrial श्वसन और प्रोटॉन के समूहों के बीच कैनेटीक्स रिसाव में कोई अंतर नहीं थे, लेकिन वहां RFI में एक अंतर था । वहां भी थे कोई मतभेद (पी = ०.८८) में यकृत mitochondrial प्रोटॉन रिसाव में उच्च और निंन RFI टी० (आंकड़ा 16) । वहां बड़े मानक mitochondrial श्वसन माप के साथ जुड़े त्रुटियों थे, और प्रोटॉन रिसाव काइनेटिक curves फ्लैट थे । इस अध्ययन से जिगर के नमूनों का वध किया गया, एक प्रक्रिया है कि एक घंटे तक जिगर नमूना संग्रह और प्रसंस्करण में देरी के बाद प्राप्त किए गए थे । mitochondrial श्वसन उपायों में भिन्नता ऊतक मौत के कारण mitochondrial श्वसन क्षरण को प्रतिबिंबित कर सकते हैं. प्रोटॉन रिसाव काइनेटिक लाइनों फ्लैट थे क्योंकि ऑक्सीजन की खपत माप शुरू नहीं किया था जब तक 8 जब पठार पहले से ही एक उपकरण की खराबी के कारण पहुंच गया था मिनट ।

कम RFI उच्च RFI Sem P मान
(n = 7) (n = 8)
Rfi -०.५८ -०.०१ ०.१ ०.०५
स्थिति 3 ३१.३ ३०.८ ९.४२ ०.९
स्थिति 4 ९.७६ १०.४ ३.२३ ०.८
RCR ३.०५ ३.०३ ०.२४ ०.९३

तालिका 2: प्रदर्शन और उच्च और कम अवशिष्ट फ़ीड सेवन (RFI) एंगस बैल संतान के mitochondrial श्वसन । इस तालिका Acetoze एट अल. २०१५11से अनुकूलित किया गया है ।

Figure 16
चित्र 16. उच्च और निंन RFI एंगस बैल की संतति के लिए प्रोटॉन रिसाव कैनेटीक्स । यह ग्राफ Acetoze एट अल. २०१५11से अनुकूलित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 1
चित्रा 1: एक वाहन और गाय कलम के बाहर के पीछे स्थित शल्य चिकित्सा और बायोप्सी सामग्री के लिए स्वच्छ क्षेत्र । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: सिर के ताला के एक क्रॉस पोल से बंधे एक पड़ाव का उपयोग गाय का संयम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: गाय के क्षेत्र की बायोप्सी और सही 10-11 पसलियों के बीच सही कंद coxae से एक सीधी रेखा ड्राइंग द्वारा पाया पर बायोप्सी के स्थान के लिए साफ करने के लिए सही कंधे के बिंदु के लिए । बायोप्सी साइट है, जहां इस लाइन 10-11 पसलियों के बीच अंतरिक्ष के साथ संप्रदायों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: गाय की एक 10 सेमी क्षेत्र शेविंग बायोप्सी के लिए बंध्याकरण करने के लिए तैयार करने के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: 10% providone साफ़ एक परिपत्र गति का उपयोग कर के साथ गाय की बायोप्सी क्षेत्र धोने । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6. ७०% इथेनॉल समाधान के साथ स्प्रे बायोप्सी क्षेत्र क्षेत्र । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: त्वचा के संज्ञाहरण प्रदान करने के लिए क्षेत्र के लिए स्थानीय रूप से 2% lidocaine एचसीएल (10-15 मिलीलीटर) इंजेक्षन. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्रा 8: एक 1-2 सेमी छुरा-10-11 पसलियों के बीच अंतरिक्ष की त्वचा के माध्यम से चीरा बायोप्सी उपकरण डालने के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्रा 9: त्वचा के माध्यम से गोजातीय जिगर बायोप्सी साधन की प्रविष्टि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 10
चित्रा 10: बायोप्सी साधन डायाफ्राम के माध्यम से और जिगर में जारी है, जबकि एक मामूली कपाल दिशा में निर्देशित किया जाना चाहिए. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 11
चित्रा 11: जिगर का एक ग्राम नमूना mitochondrial आइसोलेशन स्टेशन के लिए परिवहन के लिए बायोप्सी साधन से बाज़ल ट्यूब के लिए ले जाया जा रहा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 12
चित्रा 12: Suturing त्वचा बायोप्सी चीरा बंद करने के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 13
चित्र 13: गाय के इंजेक्शन के साथ Ceftiofur हाइडरोक्लॉराइड ०.०४४ मिलीलीटर/bodyweight गर्दन में चमड़े के नीचे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 14
चित्र 14: Oxygraph सॉफ्टवेयर mitochondrial झिल्ली क्षमता (एमएमपी) और प्रोटॉन मकसद बल (PMF) को मापने के लिए प्रत्येक पदार्थ के अलावा ऑक्सीजन की खपत प्रतिक्रियाओं दिखा परिणाम. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण बिंदु एक प्रतिनिधि जिगर ऊतक नमूने प्राप्त करने और बायोप्सी के बाद जितनी जल्दी हो सके mitochondria के अलगाव की शुरुआत है । श्वसन मापन में भिन्नता कम है (तालिका 1) गाय से प्रयोगशाला के लिए एक कम परिवहन समय के कारण. परिवहन समय को कम करने के लिए, एक छोटी सी प्रयोगशाला डेयरी के कार्यालय में स्थापित किया गया था, और जिगर के नमूनों को कार्यालय प्रयोगशाला के लिए प्रेरित किया गया था के रूप में प्रत्येक इतना एकत्र किया गया था कि mitochondria बायोप्सी के 10 मिनट के भीतर अलग थे. सेटअप और श्वसन कक्ष और इलेक्ट्रोड के परीक्षण (ऑक्सीजन, TPMP +) के लिए प्रोटॉन ढाल में मतभेदों को रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया पीएच मीटर के साथ दिन इकट्ठा करने से पहले और प्रसंस्करण नमूनों खराबी से बचने कर सकते हैं जैसे कि प्रोटॉन रिसाव में लापता जल्दी माप कैनेटीक्स (चित्र १६).

ताजा जिगर के नमूनों और mitochondria की तेजी से अलगाव के लिए की जरूरत की वजह से, एकत्र किया जा सकता है और एक दिन में संसाधित कर सकते हैं कि नमूनों की संख्या सीमित है. प्रत्येक नमूने को पूरा करने के लिए लगभग 5-6 ज लेता है; इसलिए, प्रति दिन के बारे में केवल 5 नमूने एकत्र और श्वसन कक्ष प्रति विश्लेषण किया जा सकता है । यह एक उच्च प्रवाह पद्धति नहीं है; उपचार के लिए नमूना आकार सीमित है और छोटे त्रुटियों परिणाम और महत्व का पता लगाने की क्षमता के साथ जुड़े परिवर्तनशीलता को बढ़ा सकते हैं.

अलगाव तकनीक कुछ mitochondria है कि कुछ सेल घटकों के साथ जुड़े रहे है और गोली या छोटे mitochondria में एंबेडेड रहने के लिए कर सकते है बाहर गोली बहाकर कदम के दौरान में खो सकता है । यह परिणाम है कि mitochondria की पूरी आबादी को प्रतिबिंबित नहीं करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । Mitochondria जैसे भुखमरी और व्यायाम (प्रशिक्षण)15के रूप में शारीरिक राज्यों के आधार पर आकार और घनत्व में परिवर्तन कर सकते हैं । एंजाइम सिंथेस16 या succinate डिहाइड्रोजनेज17 से पुष्ट निष्कर्षों का उपयोग गतिविधि के साथ mitochondrial संख्या का अनुमान लगाने की जरूरत हो सकती है ।

mitochondrial अलगाव18, श्वसन19 और प्रोटॉन रिसाव कैनेटीक्स20के लिए कुतर में स्थापित मूल तकनीक में कोई संशोधन नहीं किए गए । इस तकनीक में संशोधन mitochondria और प्रयोगात्मक उपचार के ऊतक स्रोत पर निर्भर करता है बनाया जा सकता है । BSA (defatted) ऊतक में मुक्त फैटी एसिड बांध करने के लिए प्रयोग किया जाता है । यदि ऊतक फैटी एसिड की एक बहुत कुछ है (से अधिक 10%) इसके साथ जुड़े, अधिक defatted BSA जोड़ा जा सकता है क्योंकि मुक्त फैटी एसिड mitochondrial माप के साथ हस्तक्षेप करेगा ।

मापने mitochondrial ऑक्सीजन की खपत और प्रोटॉन रिसाव कैनेटीक्स इस तकनीक का उपयोग कर मानक प्रक्रिया है । जिगर की पसंद के ऊतक किया गया है मुख्य रूप से, क्योंकि यह mitochondria के एक बहुत है, वे काफी निकालने के लिए आसान कर रहे हैं, और जिगर पोषक तत्व प्रसंस्करण के प्राथमिक साइट है । इस तकनीक के संशोधन ऐसे मांसपेशियों और स्तन के रूप में अंय ऊतकों में ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, mitochondrial आइसोलेशन तकनीक ऊतक फिट करने के लिए संशोधित किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, मांसपेशी में, mitochondria मांसपेशी फाइबर में एम्बेडेड हैं और इसलिए अलगाव प्रक्रिया एक प्रोटीन पाचन शामिल होना चाहिए और पाचन mitochondrial समारोह बाधित नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए.

वहां mitochondrial श्वसन कि एक विशेष रूप से श्वसन उपाय करने के लिए डिज़ाइन विश्लेषक की आवश्यकता को मापने के लिए अंय तरीके हैं । कोशिकाओं को ऊतक से काटा और मशीन प्लेट के लिए तय किया जाना चाहिए । विश्लेषक पूरे सेल ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर, बेसल), एटीपी लिंक्ड ओसीआर (mitochondria के साथ जुड़े), nonmitochondrial ओसीआर, और अधिक से अधिक के उपाय ओसीआर । हालांकि, के बाद से mitochondria मशीन के कुछ के दौरान बाधित कर रहे हैं, पृथक mitochondria माप संभव नहीं हैं । इस पद्धति के लिए मानव में रोग और ड्रग हस्तक्षेप21 के साथ ओसीआर परिवर्तन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।

वर्तमान और भविष्य के अनुप्रयोग

इस जानवर की ऊर्जा आवश्यकताओं के लिए प्रोटॉन रिसाव का योगदान बड़े और विकास, स्तनपान और रोग सहित पशु की शारीरिक स्थिति का संकेत हो सकता है । अतीत में, इस तकनीक को मुख्य रूप से mitochondrial ऑक्सीजन की खपत और प्रोटॉन रिसाव के लिए फ़ीड या ऊर्जावान दक्षता के योगदान के संघ की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, चयापचय में mitochondria की भूमिका की हमारी समझ के रूप में फैलता है, इस तकनीक के महत्व को भी विशेष रूप से इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला एंजाइम गतिविधियों, कैल्शियम के रूप में अंय mitochondrial उपायों के साथ संयोजन में वृद्धि होगी टीसीए चक्र की apoptosis और एंजाइम गतिविधियों में गतिशीलता.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध Alltech और USDA हैच धन द्वारा खाद्य पशु स्वास्थ्य के लिए UC डेविस स्कूल में पशु चिकित्सा के केंद्र के माध्यम से समर्थन किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Liver Biopsy
Equipment
Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument Sontec Instruments Englewood CO 1103-904
Suture Fisher Scientific 19-037-516
Suture needles NA NA Included with Suture
Scalpels Sigma - Aldrich S2896 / S2646 # for handle and blades
Surgery towels Fisher Scientific 50-129-6667
Falcon tubes 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Tweezers Sigma - Aldrich Z168750
50 mL syringes Fisher Scientific 22-314387
Injection needles (22, 2 1/2) VWR MJ8881-200342
Cow halter Tractor Supply Co. 101966599
Cotton swabbing Fisher Scientific 14-959-102
cotton gauze squares (4x4) Fisher Scientific 22-246069
Medical scissors Sigma - Aldrich Z265969
Chemicals
Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow Provided by Veterinarian
Clostridia Vaccine Provided by Veterinarian
Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days Provided by Veterinarian
Providone Scrub Aspen Veteterinary Resources 21260221
Ethanol 70% Sigma - Aldrich 793213
Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight Provided by Veterinarian
2% lidocaine HCl (10-15 mL) Provided by Veterinarian
1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine Provided by Veterinarian
Isolation of Mitochondria (liver)
Equipment
Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance Fisher Scientific 02-911-527
Homogenizer Motor Cole Parmer EW-04369-10
Homogenizer Probe Cole Parmer EW-04468-22
Auto Pipette (10 mL) Cole Parmer SK-21600-74
Beaker (500 mL) with ice Fisher Scientific FB100600
Refrigerated microfuge Fisher Scientific 75-002-441EW3
Microfuge tubes (1.5 mL) Fisher Scientific AM12400
Chemicals
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) abcam ab102536
Sucrose Sigma - Aldrich S7903-1KG
Tris-HCl Sigma - Aldrich T1503-1KG
EDTA Sigma - Aldrich EDS-1KG
BSA (fatty acid free) Sigma - Aldrich A7030-50G
Mannitol Sigma - Aldrich M4125-1KG
Deionized water Sigma - Aldrich 38796
Hepes Sigma - Aldrich H3375-500G
Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,  pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator
Mitochondrial Oxygen Comsuption
Equipment
Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode Hansatech (PP Systems) OXY1
Thermoregulated Water Pump ADInstruments MLE2001
Clark type Oxygen electrode NA NA
Autopipette (1 mL) Cole Parmer SK-21600-70 Included with Oxy1
Small magnetic stir bar Fisher Scientific 14-513-95
Micropipette (10 μL) Cole Parmer SK-21600-60
pH meter VWR
Chemicals
KCl Sigma - Aldrich P9333-1KG
Hepes Sigma - Aldrich H3375-500G
KH2PO4 Sigma - Aldrich P5655-1KG
MgCl2 Sigma - Aldrich M1028-100ML
EGTA Sigma - Aldrich E3889-100G
Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA
Rotenone (4 mM solution) Sigma - Aldrich R8875-5G
Succinate (1 M solution) Sigma - Aldrich S3674-250G
ADP (100 mM solution) Sigma - Aldrich A5285-1G
Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) Sigma - Aldrich 75351
FCCP Sigma - Aldrich C2920
Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force
Equipment
TPMP electrode World Precision Instruments. DRIREF-2
Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs
Malonate (0.1 mM solution) Sigma - Aldrich M1296
Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer Sigma - Aldrich 75351
Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer Sigma - Aldrich N7143
FCCP Sigma - Aldrich C3920
TPMP Sigma - Aldrich T200
TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA

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References

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मापने जिगर Mitochondrial ऑक्सीजन की खपत और प्रोटॉन रिसाव कैनेटीक्स Holstein डेयरी मवेशियों में Mitochondrial श्वसन अनुमान करने के लिए
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Rossow, H. A., Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J. Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle. J. Vis. Exp. (141), e58387, doi:10.3791/58387 (2018).More

Rossow, H. A., Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J. Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle. J. Vis. Exp. (141), e58387, doi:10.3791/58387 (2018).

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