Summary
Aqui, nós compartilhamos métodos de medição do consumo de oxigênio mitocondrial, um definição conceito de nutricional energética e vazamento de prótons, a principal causa de ineficiência na geração mitocondrial de ATP. Estes resultados podem representam 30% da energia perdida na utilização de nutrientes para ajudar a avaliar a função mitocondrial.
Abstract
Consumo de oxigênio, prótons força (PMF) e vazamento de próton são medidas da respiração mitocondrial, ou quão bem as mitocôndrias são capazes de converter o NADH e DANIII em ATP. Desde que as mitocôndrias são também o local principal para o uso de oxigênio e nutriente oxidação de dióxido de carbono e água, quanto à eficácia, eles usam o oxigênio e produzem ATP diretamente se relaciona com a eficiência do metabolismo de nutrientes, as necessidades de nutrientes do animal, e saúde do animal. A finalidade desse método é examinar a respiração mitocondrial, que pode ser usada para examinar os efeitos das diferentes drogas, dietas e os efeitos ambientais sobre o metabolismo mitocondrial. Os resultados incluem o consumo de oxigênio, medido como respiração dependente de próton (estado 3) e respiração dependente do vazamento próton (estado 4). A relação da respiração estado 4 3 / estado é definida como índice de controlo respiratório (ICR) e pode representar a eficiência energética mitocondrial. Vazamento de próton mitocondrial é um processo que permite a dissipação do potencial de membrana mitocondrial (MMP) desacoplamento fosforilação oxidativa do ADP, diminuindo a eficiência da síntese de ATP. Oxigênio e TRMP + eletrodos sensíveis com substratos mitocondriais e inibidores da cadeia de transporte de elétrons são usados para medir o estado 3 e 4 do estado respiração, membrana mitocondrial PMF (ou o potencial para produzir ATP) e vazamento de próton. Limitações para este método são que o tecido do fígado deve ser tão fresco quanto possível e todas as biópsias e ensaios devem ser realizados em menos de 10 h. Isso limita o número de amostras que podem ser recolhidos e tratados por uma única pessoa de um dia para aproximadamente 5. No entanto, é necessário apenas 1 g de tecido hepático, então em grandes animais, como gado leiteiro, a quantidade de amostra necessária é pequena em relação ao tamanho do fígado e há pouco tempo de recuperação necessário.
Introduction
As mitocôndrias são muito sensíveis ao estresse e seu ambiente celular pode contribuir para uma ampla variedade de doenças metabólicas. Consumo de oxigênio e vazamento de prótons na mitocôndria são indicadores de saúde de mitocôndrias. Os métodos descritos neste papel estimativa mitocondrial eficiência de energia usando RCR baseiam no consumo de oxigênio, com e sem vazamento de próton. Estes resultados podem representam 30% da energia perdida na utilização de nutrientes1. Mudanças no consumo e próton vazamento de oxigênio podem identificar a disfunção mitocondrial, o que contribui para doenças metabólicas e resulta em eficiência energética diminuída. Esses métodos também podem ser usados para examinar o efeito de diferentes tratamentos na respiração mitocondrial. O objectivo geral de medição de consumo de oxigênio mitocondrial e cinética de vazamento de próton é para avaliar a função mitocondrial e eficiência energética.
Disfunção mitocondrial hepática tem sido associada com várias doenças no gado leiteiro. A capacidade do metabolismo celular para alternar entre combustíveis carboidrato e lipídios quando confrontados com um déficit de energia no início da lactação é influenciada pelo número e função da mitocôndria na célula2. Defeitos na capacidade das mitocôndrias de adaptar-se a um aumento da demanda de energia e aumento da β-oxidação podem levar ao acúmulo de lipídios intracelulares associados com resistência à insulina e podem levar à formação de esteatose hepática em vacas leiteiras de início da lactação. Mitocôndrias, como local de produção do corpo de cetona e uso, podem desempenhar um papel chave em cetose em vacas leiteiras3. Falta de mitocôndrias ou disfunção mitocondrial afetará a disponibilidade de combustível para a periferia e reflectir-se em mudanças no consumo de oxigênio ou RCR.
Alterações de consumo de oxigênio mitocondrial em resposta à inflamação. Sete dias de idade frangos foram aleatoriamente a um grupo de infectados com maxima de Eimeria e um grupo de controle4. Frangos de corte que não sofreu desafio de coccidiose tinham menor consumo de oxigênio devido ao vazamento de próton e RCR superior indicando que mitocôndrias hepáticas respondem a um desafio imune por crescente fuga de próton. Durante a fuga de próton e reativa produção de espécies de oxigênio foi considerada um sinal de disfunção da membrana mitocondrial e prejudicial para a eficiência energética, agora sabe-se que é importante para a importação de proteínas e cálcio em mitocôndrias5 e para a geração de calor1.
Vazamento de elétrons da cadeia respiratória faz mitocôndrias suscetíveis à produção de espécies reativas de oxigênio e danos oxidativos às proteínas da membrana mitocondrial, lipídios e DNA mitocondrial. Como idade de mitocôndrias, dano pode acumular-se especialmente ao DNA mitocondrial, causando mais de disfunção no metabolismo mitocondrial6 e maior suscetibilidade da vaca a doença. Na prática, muitos animais de pecuária são alimentados com altos níveis de suplementos tais como Cu, Zn e Mn para impulsionar a função antioxidante. No entanto, alimentando a altos níveis de Cu, Zn e Mn diminuição da produção de leite e aumentaram do consumo de oxigênio devido a próton vazamento (respiração estado 4)7.
Pesquisas anteriores sobre o papel da função mitocondrial em eficiência energética em gado centrou-se sobre as mudanças no consumo de oxigênio mitocondrial e vazamento de próton. Poucos estudos foram publicados no gado leiteiro e a maioria dos jornais comparam a eficiência de produção sob a forma de consumo de ração residual (RFI) para a função mitocondrial em bovinos de corte. Variabilidade na respiração mitocondrial taxas foram examinadas através da medição o estado 3, estado 4 e RCR em fígados de carne de vaca em lactação e vacas em lactação de Holstein vacas (Angus, Brangus e Hereford)8. Os pesquisadores não encontrou qualquer correlação na respiração mitocondrial com crescimento ou ordenha traços dos bovinos, mas fizeram relatório uma correlação entre a respiração mitocondrial e traços para Holsteins de ordenha. Em dois estudos, RFI foi comparado em bovinos de corte para taxas de respiração mitocondrial (estado 3, estado 4 e RCR) no músculo mitocôndrias9,10. Taxas de respiração mitocondrial alterada em resposta a DMI e taxas baixas foram associadas com novilhos de carne menos eficientes. Em outro estudo, RFI de novilhos de touros de alta ou baixos RFI foram comparados com as taxas de respiração mitocondrial e cinética de vazamento de protões entre os dois grupos de descendência11. As diferenças foram devido ao ganho confirmando a conclusão de que a ganhar faz não respiração mitocondrial impacto em bovinos de corte.
Neste trabalho, um experimento para examinar o fígado RCR em resposta à alimentação 3 minerais antioxidante para gado de leite em lactação ilustra o uso de métodos para medir consumo de oxigênio durante 4 do estado e estado 3 respiração e PMF.
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Protocol
Todos os métodos, protocolo e estudos aqui descritos foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade da Califórnia, Davis.
1. a obtenção de uma biópsia do fígado de uma vaca leiteira de Holstein
Nota: Uma biópsia do fígado deve ser realizada por um veterinário licenciado. Biópsias do fígado podem ser executadas no site onde se situam as vacas leiteiro. Vacas leiteiras em lactação podem continuar a ser ordenhada normalmente e leite não precisa ser retirada da fonte de alimentos antes ou após o procedimento. É recomendável que pelo menos 4 pessoas são necessários para realizar a biópsia do fígado em uma vaca leiteira: um veterinário para realizar a biópsia, um domador de animais repousar à anca da vaca para proteger a área da biópsia e veterinário, um técnico de laboratório do lado de fora da caneta de arqu er ferramentas, materiais e biópsia da amostra e para o veterinário e mantêm a área limpa, que pode ser na traseira de um veículo (Figura 1) e um técnico para recuperar a amostra de fígado e começar o isolamento mitocondrial.
- Um mês antes de biópsias hepáticas, dar vacas uma vacinação de clostridia. Crie pacotes cirúrgicos por toalhas cirúrgicas de autoclavagem, instrumento de biópsia, titulares de bisturi e equipamento cirúrgico.
- Um dia antes da biópsia do fígado, injete a vaca com cloridrato de Ceftiofur 0,044 mL/kg de peso corporal por via subcutânea no pescoço. Monitorar a temperatura de vaca, a ingestão e fecais Partituras para usar como uma linha de base para a função normal.
- Criar o manitol 220mm mitocôndrias isolamento mídia (MIM) containining, sacarose 70 mM, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA e 0,1% (p/v) ácido graxo livre BSA, pH 7,4 a 4 ° C. Serão necessários aproximadamente 30 mL por amostra.
- Conter a vaca fisicamente utilizando uma chave de braço com um halter conforme necessário (Figura 2). Usando o cabresto, amarre a cabeça para o lado esquerdo do poste. Se necessário, um contenção química (xilazina cloridrato 100mg/mL IV em 0.010-0.015 mg/kg de peso corporal) pode ser usado.
- A área da biópsia é encontrado no espaço de intercostal direito 10 - 11 (Figura 3). Desenhe uma linha reta de coxae o tubérculo certo ao ponto do ombro direito. No local da biópsia é onde esta linha cruza-se com o espaço intercostal 10-11. Esterilize a área da vaca a biopsar cortando uma área quadrada de 10 cm (Figura 4). Lave a área com esfoliante de providone de 10% (Figura 5) usando um movimento circular. Pulverizar a área com solução de etanol 70% (Figura 6). Repetição de lavagens de providone e etanol.
Nota: O fígado está em uma posição ligeiramente diferente em vacas leiteiras Holstein, em comparação com bovinos de corte. - Injete lidocaína a 2% HCl (10-15 mL) localmente à área para fornecer anestesia da pele e músculo subjacente e do tecido conjuntivo (Figura 7). Repeti providone e lavagens de etanol 70%.
Nota: As terminações nervosas estão na pele e músculos, mas os órgãos internos não, tão somente um local anesthestic é necessária. No máximo, a vaca deve apenas sentir alguma pressão e sem dor durante o procedimento de biópsia. - Faça uma facada de 1-2cm-incisão através da pele do espaço intercostal 10-11 (Figura 8). Passar de um instrumento de biópsia do fígado bovino Schackelford-Courtney através da pele e direcionar o instrumento em uma ligeira direção cranial, continuando através do diafragma e o fígado (Figura 9, Figura 10). Obter uma amostra de 1g do fígado e retire o instrumento (Figura 11). Feche a pele com a colocação de sutura (Figura 12).
- Colocar a amostra de fígado em um tubo cônico com suficiente de MIM para cobrir a amostra, no gelo para isolamento de mitocôndrias imediata
- Incisão de seleção para qualquer vermelhidão, inchaço, calor, ou dor dentro de 24 horas da biópsia e injetar a vaca com cloridrato de Ceftiofur 0,044 mL/kg de peso corporal por via subcutânea no pescoço uma vez por dia durante os próximos 3 dias (Figura 13). Monitore temperatura da vaca, a ingestão e escores fecais diariamente por 1 semana após a biópsia do fígado. Se desenvolve uma febre, continue antibióticos a critério do veterinário.
Nota: Se uma vaca está exibindo sinais de dor, tais como chutar para o local da incisão, recumbancy, vermelhidão, calor ou reação ao toque dentro de 1h após a biópsia do fígado, uma injeção de IV 1 mg/kg de peso corporal de flunixin meglumine pode ser usada para aliviar a dor e inflamação. Uma segunda injeção pode ser administrada se necessário. - Remova suturas 7 dias após a biópsia.
2. isolar mitocôndrias de fígado de vaca leiteira
- Logo que possível após a amostra de fígado é retirada da vaca, lave a amostra de fígado em MIM (etapa 1.3) para remover as células vermelhas do sangue e picar finamente a amostra com uma tesoura. O fígado deve ser picado num copo gelado contendo suficientes meios de isolamento para manter o tecido úmido.
- Coloque o fígado picado dentro de um frasco de vidro de 30 mL com um pilão de teflon de afastamento 0,16 mm incubada em gelo e contendo a MIM (1:4 w/v).
- Homogeneizar a amostra de fígado em um pilão de teflon em 500 rpm por um minuto com 4 ciclos/min.
Nota: O fígado homogeneizado é mantido em um copo cheio de gelo em MIM durante todo o processo, e todas as seguintes etapas de centrifugação são concluídas em 4 ° C - Homogeneizado em 500 x g durante 10 minutos de centrifugação, descartar a pelota, transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga refrigerada e centrifugar o sobrenadante resultante a 10.000 x g durante 10 minutos obter a pelota mitocondrial.
- Resuspenda e lave o pellet em 10 mL de MIM com ácido graxo livre BSA e centrifugar a 8100 x g durante 10 min. Discard sobrenadante.
- Resuspenda e lave o pellet em 10 mL de MIM sem ácido graxo livre BSA e centrifugar a 8100 x g durante 10 min. Discard sobrenadante.
- Suspender o sedimento em 200 µ l de mídia de isolamento e Coloque gelo até utilizado para consumo de oxigênio e ensaios cinéticos de vazamento de próton.
- Determine a concentração da proteína, da suspensão da pelota (diluição 1/100), usando o kit de (BCA) ácido Bicinchoninic acordo com o protocolo do fabricante com BSA como padrão. Toda proteína é considerada proteína mitocondrial.
3. medição do consumo de oxigênio mitocondrial (estado 4 3 e estaduais)
- Criar mídia de consumo de oxigênio (OCM) de 120 mM KCl, 5mm KH2PO4, 5mm MgCl2, 5mm Hepes e 1mm EGTA, pH 7,4 a 30 ° C, com 0,3% desengordurada BSA. Serão necessários aproximadamente 3 mL por amostra. Também prepare uma solução de 8 oligomicina μg/mL em etanol.
- Incubar a OCM a 30 ° C. Configure o eletrodo de câmara, bomba e oxigênio de respiração de acordo com as instruções do fabricante (sistema oxygraph). O software de oxygraph já deve estar instalado no computador.
- Coloque 1 mL de OCM na câmara de respiração e agite vigorosamente. Isso ajudará a garantir que a solução se torna saturada com ar.
- Adicionar a proteína de 0,35 mg de proteína mitocondrial para a câmara de respiração e manter a temperatura a 30 ° C.
- Registrar o consumo de oxigênio por aproximadamente 5 min. A concentração de oxigênio de registros de sistema de oxygraph assim como a respiração aumenta, a concentração de oxigênio diminui. Quando o consumo de oxigênio se torna constante (uma linha reta decrescente), consumo de oxigênio de registro (inclinação da linha = concentração de oxigênio/hora). Este é o consumo de oxigênio de linha de base.
- Adicionar 1,25 µ l da solução de rotenona 4mm para inibir o complexo eu e em seguida, adicione 5 µ l de solução 1 M de succinato para atingir uma concentração final de succinato de 5mm na câmara respiratória. Esta é a respiração do estado 4.
- Adicione 1 µ l de solução de ADP 100 mM para atingir uma concentração final de 100 μM na câmara de respiração. Concentração de oxigênio vai diminuir (respiração aumentada) e, em seguida após aproximadamente 5 min torna-se uma linha reta. Registrar o consumo de oxigênio (inclinação da linha = concentração de oxigênio/hora). Esta é a respiração do estado 3.
- Opcional: No final da corrida, adicione FCCP (volume total de 0,2 μM) para induzir a respiração máxima. Grave a respiração por cerca de 5 min (aproximadamente). Quando o consumo de oxigênio torna-se consumo de oxigênio constante e de registro. Este é o consumo máximo de oxigênio.
- Calcular o controle respiratório Ratio (RCR) usando a equação de estado 3 consumo de oxigênio / estado 4 consumo de oxigênio.
- Aspire todas as soluções fora da câmara de respiração. Lave a câmara várias vezes com água desionizada.
4. medir o potencial de membrana mitocondrial (MMP) e força motriz de prótons (PMF)
- Prepare a solução de 80 nigericin ng/mL em etanol.
Nota: Estes produtos químicos são dissolvidos em etanol, e todo esforço deve ser feito para limitar a quantidade de etanol que é adicionada a menos de 1 μL, desde que o etanol pode desacoplar o sistema de transporte de elétrons e causar disfunção mitchondrial. - Após enxaguar cuidadosamente a câmara com água desionizada, coloque 1 mL da OCM na câmara de respiração e agitar vigorosamente com uma barra de agitação magnética. Isso ajudará a garantir que a solução se torna saturada com ar. Adicione o eletrodo metil-trifenil-do phosphonium (TPMP +) sensível para instalação de câmara. TPMP + eletrodo deve ser ligado a um medidor de pH e valores são lidos a partir do medidor de pH.
- Adicione 0,35 mg de proteína mitocondrial para a câmara de respiração.
- Adicione 1,25 µ l da solução de rotenona 4mm para inibir a respiração do complexo I. registro para 2-5 min (aproximadamente). Quando o consumo de oxigênio torna-se consumo de oxigênio constante e de registro.
- Adicione 0,56 μL de solução de oligomicina 8 μg/mL para uma concentração final de 2,8 µ g oligomicina 0,35 mg de proteína mitocondrial para inibir a utilização da ADP. Grave a respiração durante 2-5 min (aproximadamente). Quando o consumo de oxigênio torna-se consumo de oxigênio constante e de registro.
- Adicione solução de nigericin 0.112 μL 80 ng/mL para abolir o gradiente de pH através da membrana mitocondrial interna. Grave a respiração durante 2-5 min (aproximadamente). Quando o consumo de oxigênio torna-se consumo de oxigênio constante e de registro.
Nota: Rotenona e oligomicina são usados para bloquear o transporte de elétrons da cadeia no complexo I e a ATP sintase, respectivamente. Nigericin é adicionado para converter do transmembrane H + gradiente um gradiente K + que pode ser medido com um eletrodo. - Prepare uma curva padrão para TPMP + pela adição de 5 µ l de solução TPMP + 10 mM para a incubação mitocondrial. Repita este passo quatro vezes mais até uma concentração total de 2,5 μM TPMP + foi adicionada.
- Inicie a respiração, adicionando 5 μL de succinato de 1M para a câmara.
- Gravar a respiração até que você tenha conseguido um traço estável e titula-se em seguida o sistema adicionando malonato. Adições de malonato devem ser 0,5 µ l, 1 µ l, 1,5 µ l, µ l 3.0, 6,0 µ l, 9.0 µ l, então 12,5 µ l de 0,1 mM malonato solução para alcançar adições sucessivas de malonato concentrações em câmara úmida de 0.1, 0.2, 0.3, 0.6, 1.2, 1.8 e 2,5 mM.
- Colete dados de dois eletrodos (oxigênio e TPMP+). Software de aquisição de dados do sistema de oxygraph pode ser usado para coletar medições simultâneas de consumo de oxigênio mitocondrial e potencial de membrana mitocondrial e observar alterações no consumo de oxigênio em tempo real. A Figura 14 mostra como o sistema de oxygraph registra o consumo de oxigênio no decorrer do experimento.
- Calcule MMP na mV com base na equação de Nernst:
MMP = 61,5 log ([TPMP +] adicionado – external [TPMP +]) correção de ligação x TPMP+ / (x 0,001 mg de proteína/mL x TPMP [+])
Uma correção de vinculação TPMP + 0,4 µ l/mg de proteína mitocondrial-1 é usada.
Cálculo de exemplo baseado em concentrações no protocolo:
MMP = 61,5 x log (5 µM – 2 µM) x 0,4 / (0.001 x 0,35 mg proteína mitocondrial/mL x 2 µM)
MMP = 198.9 mV - Estimativa do DPP plotando um gráfico de consumo de MMP vs oxigênio (Figura 15). PMF é relatado como o consumo de oxigênio em um potencial de membrana de 165 mV.
Nota: Titulada a cadeia de transporte electrónico com malonato (0,1 a 2,5 mM) mostra a resposta cinética do vazamento de protões para MMP. Em seguida, MMP a conspirar contra o consumo de oxigênio determina a cinética de vazamento do próton. PMF é determinado pelo cálculo do consumo de oxigênio em um potencial de membrana comum (165 mV). - No final da última corrida da amostra, adicione FCCP (volume total de 0,2 μM) para induzir a respiração máxima e liberar TPMP + para correção de linha de base.
- Aspire todas as soluções fora da câmara de respiração. Lave a câmara várias vezes com água desionizada. No final do dia, a câmara deve também ser lavada várias vezes com etanol.
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Representative Results
Resultados positivos, mostrando a cinética de vazamento RCR e prótons são mostrados na tabela 1 e Figura 15, respectivamente. No presente estudo7, RCR e proteína vazamento cinética foram medidos em vacas leiteiras Holstein em 70 dias no leite depois que as vacas tinham sido alimentadas 1 dos 5 níveis diferentes de Cu, Zn e Mn por 28 dias. Estado 4, respiração de vazamento-dependente de próton máximo, tinha uma tendência a ser afectados por ingestão de minerais, de Cu, Mn e Zn (p < 0.1). Estado 3 respiração (máximo ATP estimulada a respiração) e RCR = estado 3 / 4 de estado (índice de controlo respiratório) não foi afetada pela ingestão de minerais. Estado 4 respiração foi maior em LowMn e menor no controle, indicando que o Mn desempenha um papel importante em minimizar a respiração dependente do próton vazamento. Manganês, através da enzima superóxido Dismutase de manganês é conhecido por reduzir espécies reactivas de oxigénio na matriz mitocondrial e reduzir o próton vazamento12. Maior estado 4 respiração foi associada com menor leite e produção de proteína do leite. Desde o vazamento de próton é um componente importante da eficiência energética, reduzir o estado 4 respiração através de suplementação de Mn pode melhorar a eficiência.
| Tratamentos1 | ||||||
| Alta | Med | Baixa | LowMn | Controle | SEM | |
| Leite, kg | 47,4Aguiar | 50.9um | 46.0Aguiar | 43,6b | 49,7um | 2.9 |
| Proteína de leite, kg | 1.38Aguiar | 1,44um | 1,40Aguiar | 1.23b | 1,43um | 0,09 |
| Estado 3 | 75,8 | 64,4 | 78,2 | 73 | 64,1 | 13 |
| Estado 4 | 26.2Aguiar | 22.6Aguiar | 25,9Aguiar | 27.1uma | 22,0b | 3 |
| RCR | 2.89 | 2,76 | 2,98 | 2,65 | 2.83 | 0,27 |
| uma b Significa que dentro de uma linha não seguidas pela mesma letra sobrescrita é significativamente diferentes (P < 0.1). | ||||||
| 1 tratamento alto contém níveis mais altos de Cu, Zn e Mn tudo bem acima de requisitos13, tratamento Med contém níveis intermediários de Cu, Zn e Mn acima requisitos, baixo tratamento contém níveis mais baixos de Cu, Zn e Mn, mas ainda acima requisitos, tratamento de Mn baixo contém os níveis mais baixos de Mn (e menores níveis de Cu e Zn), mas ainda acima de exigências e controle de tratamento contém os níveis mais baixos de Cu e Zn, que são perto de requisitos. | ||||||
Tabela 1: efeito de Cu, Mn e Zn suplementação na produção de leite e consumo de oxigênio mitocondrial hepática de vacas leiteiras em 70 dias no leite. Esta tabela foi adaptada de Acetoze et al . 20177.
Vazamento de próton mitocondrial é um processo que se dissipa MMP através do movimento de prótons através da membrana mitocondrial interna sem produção de ATP14. Cinética de vazamento de próton são avaliadas por meio do cálculo de taxas de consumo de oxigênio em um potencial de membrana comum de 165 mV. Um potencial de membrana inferior significa que os prótons são 'vazando' através da membrana mitocondrial, o que resulta em menor síntese de ATP (Figura 15). O estudo de vaca Holstein, respiração dependente do próton hepática vazamento foi maior em LowMn e mais baixo no controle, que concorda com os resultados na tabela 1, que estado 4 respiração foi maior em LowMn e mais baixa no controle.
Figura 15. Cinética de vazamento próton em vacas Holstein alimentados com diferentes quantidades de Cu, Mn e Zn. Este gráfico é baseado em dados de Acetoze et al . 20177. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Resultados negativos são ilustrados na tabela 2 e Figura 16. Eficiência alimentar (RFI) foi maior nos novilhos Angus nascidos em touros RFI baixos do que alta touros RFI, mas isso não se refletiu em RCR mitocondrial (tabela 2) ou cinética de vazamento de próton (Figura 16). Não houve diferença na respiração mitocondrial e cinética de vazamento de protões entre grupos de bois, mas havia uma diferença de RFI. Também não houve diferença (p = 0,88) em próton mitocondrial hepática vazamento em alta e baixa novilhos RFI (Figura 16). Havia grandes erros-padrão associados com medições de respiração mitocondrial, e curvas cinética do próton vazamento estavam planas. Amostras de fígado deste estudo foram obtidas depois de bois foram abatidos, um processo que atrasou a coleta de amostra de fígado e processamento por uma hora. Variação nas medidas de respiração mitocondrial pode refletir a degradação de respiração mitocondrial devido à morte do tecido. Linhas cinéticas de vazamento de prótons foram planas porque as medições de consumo de oxigênio não começou até 8 min quando planalto já tinha sido alcançado devido a um mau funcionamento do equipamento.
| Baixa RFI | Alta RFI | SEM | Valor de P | |
| (n = 7) | (n = 8) | |||
| RFI | -0.58 | -0.01 | 0.1 | 0.05 |
| Estado 3 | 31. O3 | 30,8 | 9.42 | 0.9 |
| Estado 4 | 9.76 | 10.4 | 3.23 | 0.8 |
| RCR | 3.05 | 3.03 | 0,24 | 0.93 |
Tabela 2: desempenho e respiração mitocondrial de alta e baixa ingestão alimentar Residual (RFI) Angus touro progênie. Esta tabela foi adaptada de Acetoze et al . 201511.
Figura 16. Cinética de vazamento de protões para progênie de touros Angus RFI de alta e baixos. Este gráfico foi adaptado de Acetoze et al . 201511. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 1: limpar a área para cirúrgicos e materiais de biópsia localizados na traseira de um veículo e fora a caneta de vaca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: retenção da vaca usando um cabresto amarrado a um poste transversal da cabeça fechadura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A área da vaca para limpar para a biópsia e o local da biópsia do espaço intercostal de direito 10 - 11 encontrado desenhando uma linha reta de coxae o tubérculo certo ao ponto do ombro direito. No local da biópsia é onde esta linha cruza-se com o espaço intercostal 10-11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: depilar uma área de 10 cm da vaca para preparar para esterilizar para a biópsia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: lavar a área da biópsia da vaca com esfoliante de providone 10% usando um movimento circular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Pulverizar a área de área de biópsia com solução de etanol 70%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: injetar lidocaína a 2% HCl (10-15 mL) localmente à área para fornecer anestesia da pele. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: uma facada de 1-2 cm-incisão através da pele do espaço intercostal 10-11 para inserir a ferramenta de biópsia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: inserção de um instrumento de biópsia do fígado bovino através da pele. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: O instrumento de biópsia deve ser direcionado no sentido cranial ligeiro, continuando através do diafragma e o fígado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: uma amostra de 1g do fígado sendo movido do instrumento de biópsia para tubo Falconer para transporte para a estação de isolamento mitocondrial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 12: suturar a pele para fechar a incisão de biópsia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 13: injeção da vaca com cloridrato de Ceftiofur 0,044 mL/kg de peso corporal por via subcutânea no pescoço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 14: Oxygraph resultados de software mostrando oxigênio respostas de consumo, a adição de cada substância para medir o potencial de membrana mitocondrial (MMP) e motivo de próton forçar (PMF). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O ponto mais crítico no protocolo é obter uma amostra representativa de tecido hepático e começando o isolamento da mitocôndria, logo que possível após a biópsia. Variação nas medições de respiração é baixa (tabela 1) devido a um tempo de transporte curto de vaca para laboratório. Para reduzir o tempo de transporte, foi instituído um pequeno laboratório no escritório da leiteria, e amostras de fígado foram levadas para o laboratório de escritório como cada uma foi coletada para que as mitocôndrias foram isoladas dentro de 10 min de biópsia. Instalação e testes dos eletrodos (oxigênio, TPMP +) e câmara de respiração com o medidor de pH usado para registros diferenças em gradientes de prótons na véspera da coleta e processamento de amostras podem evitar avarias como faltando medições iniciais no vazamento de próton cinética (Figura 16).
Devido à necessidade de amostras de fígado frescas e isolamento rápido de mitocôndrias, o número de amostras que podem ser coletadas e processadas em um dia é limitado. Cada amostra leva aproximadamente 5-6 h para completar; Portanto, apenas cerca de 5 amostras por dia podem ser coletadas e analisadas por câmara de respiração. Este não é um método de alto rendimento; o tamanho da amostra para tratamentos é limitado e pequenos erros podem aumentar a variabilidade associada com os resultados e a capacidade de detectar a significância.
A técnica de isolamento pode excluir algumas mitocôndrias que estão associados a alguns componentes da célula e permanecer incorporado em pelota ou mitocôndrias menores podem ser perdidas em lavagens a pelota durante as etapas de centrifugação. Isso pode levar a resultados que não refletem a população completa de mitocôndrias. Mitocôndria pode mudar de tamanho e densidade dependendo de Estados fisiológicos, como fome e exercício (treinamento)15. Estimar o número mitocondrial com atividade enzimática usando citrato sintase16 ou Succinato desidrogenase17 para corroborar as conclusões pode ser necessários.
Sem modificações foram feitas para as técnicas originais, estabelecidas em roedores para isolamento mitocondrial18, respiração19 e prótons vazam cinética20. Modificações a esta técnica podem ser feitas dependendo da fonte de tecido de mitocôndrias e tratamentos experimentais. BSA (desengordurada) é usado para vincular os ácidos graxos livres no tecido. Se o tecido tem um monte de ácidos graxos (maiores que 10%) associados a ele, mais desengordurada BSA pode ser adicionado porque os ácidos graxos livres irá interferir com as medições mitocondriais.
Medição de consumo de oxigênio mitocondrial e cinética de vazamento de próton usando esta técnica é o procedimento padrão. Fígado tem sido o tecido de escolha, principalmente porque tem um monte de mitocôndrias, eles são bastante fáceis de extrair e o fígado é o principal site de processamento de nutrientes. Modificações desta técnica têm sido utilizadas para medir o consumo de oxigênio em outros tecidos como os músculos e glândulas mamárias. No entanto, técnicas de isolamento mitocondrial devem ser modificadas para caber o tecido. Por exemplo, no músculo, as mitocôndrias são incorporadas nas fibras musculares e portanto, o procedimento de isolamento deve incluir uma digestão de proteínas e a digestão devem ser controladas para garantir que a função mitocondrial não é perturbado.
Existem outros métodos para medir a respiração mitocondrial que exigem um analisador especificamente concebido para medir a respiração. Células devem ser colhidas de tecido e fixo para placas de incubação. A taxa de consumo de oxigênio de toda célula medidas analisador (OCR; basal), ATP ligado OCR (associado com mitocôndrias) e nonmitochondrial OCR OCR máxima. No entanto, desde que as mitocôndrias são inibidas durante alguns da incubação, medições de mitocôndrias isoladas não são possíveis. Esse método tem sido usado para examinar alterações de OCR com doença e drogas intervenções21 em seres humanos.
Aplicações atuais e futuras
A contribuição de vazamento de protões para requisitos de energia do animal pode ser grande e indicativos do estado fisiológico do animal incluindo o crescimento, a lactação e a doença. No passado, esta técnica tem sido usada principalmente para examinar a associação do consumo de oxigênio mitocondrial e contribuição de vazamento de protões para alimentar ou eficiência energética. No entanto, como nosso entendimento do papel das mitocôndrias no metabolismo se expande, a importância desta técnica também aumentará particularmente em combinação com outras medidas mitocondriais como actividades enzimáticas de cadeia de transporte electrónico, cálcio dinâmica nas atividades de apoptose e enzima do ciclo do TCA.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pela Alltech e USDA Hatch fundos através do centro de Sanidade Animal de comida na UC Davis School de medicina veterinária.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liver Biopsy | |||
| Equipment | |||
| Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Suture | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Suture needles | NA | NA | Included with Suture |
| Scalpels | Sigma - Aldrich | S2896 / S2646 | # for handle and blades |
| Surgery towels | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Falcon tubes 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Tweezers | Sigma - Aldrich | Z168750 | |
| 50 mL syringes | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Injection needles (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Cow halter | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
| Cotton swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| cotton gauze squares (4x4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Medical scissors | Sigma - Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Provided by Veterinarian | ||
| Clostridia Vaccine | Provided by Veterinarian | ||
| Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days | Provided by Veterinarian | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Ethanol 70% | Sigma - Aldrich | 793213 | |
| Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight | Provided by Veterinarian | ||
| 2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Provided by Veterinarian | ||
| 1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine | Provided by Veterinarian | ||
| Isolation of Mitochondria (liver) | |||
| Equipment | |||
| Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Homogenizer Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Homogenizer Probe | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Auto Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Beaker (500 mL) with ice | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Refrigerated microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Microfuge tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma - Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma - Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma - Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (fatty acid free) | Sigma - Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma - Aldrich | M4125-1KG | |
| Deionized water | Sigma - Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA, pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator | |||
| Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
| Equipment | |||
| Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| Thermoregulated Water Pump | ADInstruments | MLE2001 | |
| Clark type Oxygen electrode | NA | NA | |
| Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Included with Oxy1 |
| Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Micropipette (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH meter | VWR | ||
| Chemicals | |||
| KCl | Sigma - Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma - Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma - Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma - Aldrich | E3889-100G | |
| Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
| Rotenone (4 mM solution) | Sigma - Aldrich | R8875-5G | |
| Succinate (1 M solution) | Sigma - Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 mM solution) | Sigma - Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
| Equipment | |||
| TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs | |||
| Malonate (0.1 mM solution) | Sigma - Aldrich | M1296 | |
| Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma - Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma - Aldrich | T200 | |
| TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA |
References
- Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
- Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).
- Bartlett, K., Eaton, S. Mitochondrial B oxidation. European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).
- Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).
- Wallace, D. C., Fan, W. Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics. Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).
- Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging. Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).
- Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc. Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).
- Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle. Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).
- Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers. Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).
- Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle. Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).
- Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls. ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).
- Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. Free Radicals in Biology and Medicine. , Oxford University Press. Oxford. 186-187 (1989).
- National Research Council. Nutrient Requirements of Dairy Cattle. , 7th revised edition, National Academy Press. Washington, DC. (2001).
- Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging. Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).
- Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity: beyond ATP. Nature. 17, 608-620 (2017).
- Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. Biochemical assays of respiratory chain complex activity. Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).
- Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression. Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).
- Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats. British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).
- Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice. PloS One. 3 (3), e1759 (2008).
- Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction. Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).
- Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research. Clinical Science. 127, 367-373 (2014).
