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Biochemistry

Messung der Leber mitochondriale Sauerstoffverbrauch und Proton Leck Kinetik zur Abschätzung der mitochondrialen Atmung in Holstein Milchvieh

doi: 10.3791/58387 Published: November 30, 2018

Summary

Hier teilen wir Methoden zur Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch, eine definierende Konzept der ernährungsphysiologischen Energetik und Proton Leck, die primäre Ursache der Ineffizienz im mitochondrialen Erzeugung von ATP. Diese Ergebnisse können entfallen 30 % der Energie verloren Nährstoff Auslastung zu helfen, mitochondriale Funktion ausgewertet werden soll.

Abstract

Sauerstoffverbrauch, Proton Motive force (PMF) und Proton Leck sind Messungen der mitochondrialen Atmung, oder wie gut Mitochondrien ATP NADH und FADH umsetzen können. Da Mitochondrien auch der primäre Standort für Sauerstoff und Nährstoff Oxidation zu Kohlendioxid und Wasser, wie effizient sie Sauerstoff und produzieren ATP direkt bezieht sich auf die Effizienz der Nährstoff Stoffwechsel Nährstoffbedarf des Tieres, und Gesundheit des Tieres. Der Zweck dieser Methode ist es, mitochondriale Atmung zu untersuchen, die verwendet werden, um die Auswirkungen der verschiedenen Medikamente, Ernährung und Umwelteinflüsse auf mitochondrialen Stoffwechsel untersuchen. Die Ergebnisse enthalten Sauerstoffverbrauch gemessen als Proton abhängigen Atmung (Zustand 3) und Proton Leck abhängigen Atmung (Zustand 4). Das Verhältnis von Staat 3 / staatliche 4 Atmung ist definiert als Atmungskontrolle Verhältnis (RCR) und mitochondriale energetischen Effizienz darstellen kann. Mitochondriale Proton Leck ist ein Prozess, der Ableitung der mitochondrialen Membranpotentials (MMP) ermöglicht durch abkoppeln Oxidative Phosphorylierung von ADP verringern die Effizienz der ATP-Synthese. Sauerstoff und TRMP + empfindliche Elektroden mit mitochondrialen Substrate und Elektronentransport-Kette-Inhibitoren sind zur Messung der Status 3 und Staat 4 Atmung, Mitochondrien-Membran PMF (oder das Potenzial um ATP zu produzieren) und Proton Leck. Einschränkungen dieser Methode sind, dass Lebergewebe so frisch wie möglich sein muss und alle Biopsien und Assays in weniger als 10 h durchgeführt werden müssen. Dies schränkt die Anzahl der Samples, die gesammelt und von einer einzigen Person an einem Tag etwa 5 verarbeitet werden kann. Nur 1 g des Lebergewebes ist jedoch erforderlich, damit in große Tiere wie Milchkühe, die Menge der Probe erforderlich klein im Verhältnis Leber ist und es wenig Erholungszeit benötigt gibt.

Introduction

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Mitochondrien sind sehr empfindlich auf stress und ihre zelluläre Umgebung kann dazu beitragen, eine Vielzahl von Stoffwechselerkrankungen. Sauerstoff-Verbrauch und Proton Leck in den Mitochondrien sind Indikatoren für die Gesundheit der Mitochondrien. In diesem Papier Schätzung mitochondriale Energieeffizienz mit RCR beschriebenen Methoden basierend auf Sauerstoffverbrauch mit und ohne Proton Leck. Diese Ergebnisse können entfallen 30 % der Energie in Nährstoff Auslastung1verloren. Änderungen im Sauerstoff-Verbrauch und Proton Leck erkennen mitochondriale Dysfunktion zur Stoffwechselerkrankung und führt zu verminderter Energie-Effizienz. Diese Methoden können auch verwendet werden, die Wirkung der verschiedenen Behandlungen auf die mitochondriale Atmung prüfen. Das übergeordnete Ziel der Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und Proton Leck Kinetik ist Funktion der Mitochondrien und energetische Effizienz zu bewerten.

Hepatischen mitochondrialen Dysfunktion wurde mit mehreren Krankheiten bei Milchkühen. Die Fähigkeit des Zellstoffwechsels, wechseln zwischen Kohlenhydrat- und Lipid Kraftstoffe konfrontiert mit einem Energiedefizit in frühen Laktation ist durch die Anzahl und Funktion von Mitochondrien in der Zelle2beeinflusst. Mängel in der Fähigkeit der Mitochondrien zur Anpassung an eine erhöhte Nachfrage nach Energie und erhöhter β-Oxidation führt zu einer Akkumulation von intrazellulären Lipid mit Insulinresistenz verbunden und führen zur Bildung von Fettleber in frühen Laktation Milchkühe. Mitochondrien, können als Ort der Keton-Körper Produktion und Gebrauch, eine Schlüsselrolle in Ketose Milchkühe3spielen. Ein Mangel an Mitochondrien oder mitochondriale Dysfunktion wirken sich Kraftstoff Verfügbarkeit an die Peripherie und in Änderungen der Sauerstoffverbrauch oder RCR niederschlagen.

Mitochondriale Sauerstoff Verbrauch Veränderungen in Reaktion auf eine Entzündung. Sieben Tage alte Masthähnchen wurden randomisiert in eine Gruppe mit Eimeria Maxima und eine Kontrolle Gruppe4infiziert. Masthähnchen, die nicht Kokzidiose Herausforderung unterziehen hatte geringeren Sauerstoffverbrauch durch Proton Leck und höhere RCR darauf hinweist, dass Leber Mitochondrien durch zunehmende Proton Leck auf eine immun Herausforderung zu reagieren. Während Proton Leck und reaktive Spezies Sauerstoffproduktion galt einst als ein Zeichen der Mitochondrien-Membran Dysfunktion und schädlich für Energieeffizienz, jetzt ist es bekannt, dass es wichtig für den Import von Proteinen und Kalzium in Mitochondrien5 , und für die Erzeugung von Wärme1.

Elektron Leck aus der Atmungskette macht Mitochondrien anfällig reaktiven Sauerstoff-Spezies-Produktion und oxidative Schäden an Mitochondrien-Membranproteine, Lipide und mitochondriale DNA. Zunehmendem Alter der Mitochondrien Schäden vor allem an MtDNA verursacht weitere Dysfunktion in den mitochondrialen Stoffwechsel6 und höhere Krankheitsanfälligkeit der Kuh ansammeln kann. In der Praxis fließen viele Nutztiere hohe Zuschläge wie Cu, Zn und Mn antioxidative Funktion zu steigern. Allerdings Fütterung hohe Cu, Zn und Mn verringerte Milchproduktion und erhöhten Sauerstoffverbrauch durch Proton Leck (Zustand 4 Atmung)7.

Frühere Untersuchungen über die Rolle der mitochondrialen Funktion im Bereich der Energieeffizienz bei Rindern konzentriert sich auf Veränderungen in der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und Proton Leck. Nur wenige Studien bei Milchkühen veröffentlicht wurden und die meisten Zeitungen vergleichen Produktionseffizienz in Form von Rest-Futteraufnahme (RFI), mitochondriale Funktion in Rinder. Variabilität in der mitochondrialen Atmung, die Preise untersucht wurden, durch Messung von Zustand 3, Stand 4 und RCR in Lebern von stillenden Holstein-Kühen und laktierenden Rind Rinder (Brangus, Angus und Hereford)8. Die Forscher fanden keinen Zusammenhang in der mitochondrialen Atmung mit Wachstum oder Melken Merkmale für Rinder aber eine Korrelation zwischen mitochondriale Atmung und Melken Merkmale für Holsteins gemeldet. In zwei Studien wurde RFI in Rinder, mitochondriale Atmung Preise (Zustand 3, Stand 4 und RCR) im Muskel Mitochondrien9,10verglichen. Mitochondriale Atmung Preise geändert in Reaktion auf DMI und niedrige Preise wurden weniger effizient Rindfleisch Ochsen zugeordnet. In einer weiteren Studie wurden RFI Ochsen von hohen oder niedrigen RFI Bulls mit mitochondrialen Atmung und Proton Leck Kinetik zwischen den beiden Gruppen von Nachkommen11verglichen. Unterschiede wurden durch Gewinn bestätigt wird, dass die Schlussfolgerung, die gewinnen nicht Auswirkungen mitochondriale Atmung in Rinder hat.

In diesem Papier ein Experiment untersucht Leber RCR als Reaktion auf die Verfütterung von 3 Antioxidans Mineralien an laktierenden Milchkühen die Verwendung von Methoden zur Messung veranschaulicht Sauerstoffverbrauch während Zustand 4 und 3 Atmung und PMF.

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Protocol

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Alle Methoden, Protokoll und hier beschriebenen Studien stimmten mit den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der University of California, Davis.

(1) erhalten eine Leberbiopsie aus einer Milchkuh Holstein

Hinweis: Eine Leberbiopsie sollte von einem zugelassenen Tierarzt durchgeführt werden. Leberbiopsien können auf der Molkerei Website durchgeführt werden, wo die Kühe befinden. Laktierenden Milchkühe können weiterhin normalerweise gemolken werden und Milch muss nicht aus der Versorgung mit Lebensmitteln vor oder nach dem Eingriff genommen werden. Es wird empfohlen, mindestens 4 Personen erforderlich sind, um die Leberbiopsie auf eine Milchkuh durchführen: ein Tierarzt die Biopsie, ein Tier-Handler an die Kuh Hüfte zum Schutz der Biopsie Bereich und Tierarzt, eine Laborantin an der Außenseite des Stiftes zu Transf stehen durchführen Werkzeuge, Materialien und Biopsie Probe zum und vom Tierarzt und pflegen die sauberen Bereich, die auf der Rückseite eines Fahrzeugs (Abbildung 1), und einen Techniker zum Abrufen der Leber Probe und beginnen mitochondriale isoliert werden können.

  1. Einen Monat vor Leberbiopsien, Kühe geben eine Clostridien-Impfung. Erstellen Sie chirurgische Packs durch Autoklavieren chirurgische Handtücher, Biopsie-Instrument, Skalpell Halter und chirurgische Geräte.
  2. Injizieren Sie einen Tag vor der Leberbiopsie, die Kuh mit Ceftiofur Hydrochlorid 0,044 mL/kg Körpergewicht subkutan in den Hals. Monitor-Kuh-Temperatur, Aufnahme und fäkale Partituren, als Grundlage für die normale Funktion zu verwenden.
  3. Erstellen von Mitochondrien Isolierung Medien (MIM) Containining 220 mM Mannit, 70 mM Saccharose, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA und 0,1 % (w/V) Fettsäure kostenlose BSA, pH 7.4 bei 4 ° C. Etwa 30 mL pro Probe wird benötigt.
  4. Zurückhalten Sie, Kuh physisch mit einem Headlock mit einem Halfter Bedarf (Abbildung 2). Mit dem Halfter, binden Sie den Kopf auf die linke Seite des Standrohres. Falls erforderlich, eine Freiheitsbeschränkung (Xylazin Hydrochlorid 100 mg/mL IV bei 0,010-0,015 mg/kg Körpergewicht) eingesetzt werden.
  5. Das Gebiet der Biopsie befindet sich an der rechten Seite 10 - 11. Intercostalneuralgie Raum (Abbildung 3). Zeichnen Sie eine gerade Linie von der richtigen Tuber Coxae, bis zu dem Punkt der rechten Schulter. Die Biopsie-Website ist, wo diese Linie schneidet mit dem 10.-11. Intercostalneuralgie Raum. Sterilisieren Sie das Gebiet der Kuh biopsiert werden durch das Rasieren einer quadratische Fläche von 10 cm (Abbildung 4). Waschen Sie die Stelle mit 10 % Providone Peeling (Abbildung 5) mit kreisenden Bewegungen. Sprühen Sie Bereich mit 70 % Ethanol-Lösung (Abbildung 6). Wiederholte Providone und Ethanol wäscht.
    Hinweis: Die Leber ist in einer etwas anderen Position in Holstein Milchvieh im Vergleich zu Rindfleisch.
  6. 2 % Lidocain HCl (10-15 mL) lokal auf den Bereich Anästhesie der Haut und darunter liegenden Muskel und Bindegewebe (Abbildung 7) zu injizieren. Wiederholen Sie die Providone und 70 % Ethanol wäscht.
    Hinweis: Sind die Nervenenden in der Haut und Muskel, aber keine inneren Organe, so dass nur eine lokale anesthestic ist erforderlich. Bei den meisten soll die Kuh nur etwas Druck und keine Schmerzen während der Biopsie-Verfahren fühlen.
  7. Machen Sie eine Stichinzision 1-2 cm durch die Haut des 10.-11. Intercostalneuralgie Raumes (Abbildung 8). Übergeben Sie eine Schackelford-Courtney bovine Leberbiopsie Instrument über die Haut und direkt das Biopsie-Instrument in eine leichte kraniale Richtung weiter durch das Diaphragma hindurch und in die Leber (Abbildung 9, Abbildung 10). Eine 1 g Probe der Leber, und entfernen Sie das Instrument (Abbildung 11). Schließen Sie die Haut mit Naht Platzierung (Abbildung 12).
  8. Legen Sie Leber Probe in einem konischen Rohr mit genügend MIM auf Probe, auf Eis für sofortige Mitochondrien Isolierung zu decken
  9. Check-Schnitt für jede Rötung, Schwellung, Wärme, oder Schmerzen innerhalb von 24 Stunden nach der Biopsie und injizieren die Kuh mit Ceftiofur Hydrochlorid 0,044 mL/kg Körpergewicht subkutan in den Hals einmal täglich für die nächsten 3 Tage (Abbildung 13). Überwachen Sie die Kuh Temperatur, Aufnahme und fäkale Partituren täglich für 1 Woche nach Leberbiopsie. Wenn Fieber entwickelt, weiter Antibiotika im Ermessen des Tierarztes.
    Hinweis: Wenn eine Kuh Anzeichen von Schmerzen zeigt, z. B. treten im Schnitt Website, Recumbancy, Rötung, Wärme oder Reaktion innerhalb 1 h nach der Leberbiopsie berühren kann eine 1 mg/kg Körpergewicht IV Injektion von Flunixin Meglumine verwendet werden, um Schmerzen und Entzündungen zu lindern. Eine zweite Injektion kann bei Bedarf verabreicht werden.
  10. 7 Tage nach der Biopsie Fäden zu entfernen.

2. isolierende Mitochondrien aus Milchkuh Leber

  1. So bald wie möglich nach die Leber Probe von der Kuh entfernt wird, waschen Sie die Leber Probe in MIM (Schritt 1.3), rote Blutkörperchen zu entfernen und fein hacken die Probe mit einer Schere. Die Leber sollte in ein gekühltes Becherglas mit genügend Isolierung Medien um das Gewebe feucht zu halten gehackt werden.
  2. Legen Sie die gehackte Leber in eine 30 mL Glasflasche mit einem Teflon-Stößel von 0,16 mm Bodenfreiheit im Eis inkubiert und MIM (1:4 w/V) enthalten.
  3. Leber Probe in Teflon Stößel bei 500 u / min mit 4 Hübe/min zu homogenisieren.
    Hinweis: Die Leber Homogenat wird gehalten in einem Becher Eis verpackt in MIM während des gesamten Prozesses und Abschluss aller folgendermaßen Zentrifugation bei 4 ° C
  4. Homogenat 500 X g für 10 min Zentrifugieren, Pellet zu verwerfen, überstand an einer gekühlten Zentrifugenröhrchen übertragen und anschließend Zentrifugieren des resultierenden Überstands bei 10.000 x g für 10 min die mitochondriale Pellet zu erhalten.
  5. Aufschwemmen und waschen das Pellet in 10 mL von MIM mit Fettsäure-kostenlose BSA und Zentrifugieren bei 8100 X g für 10 min. verwerfen überstand.
  6. Aufschwemmen und waschen das Pellet in 10 mL MIM ohne freie Fettsäure BSA und Zentrifugieren bei 8100 X g für 10 min. verwerfen überstand.
  7. Aussetzen Sie das Pellet in 200 µL der Isolierung Medien und auf Eis bis zum Sauerstoffverbrauch und Proton Leck kinetic Assays.
  8. Proteinkonzentration der Pellet-Suspension (1/100 Verdünnung) mit Bicinchoninic Säure (BCA) Kit pro des Herstellers Protokoll mit BSA als Standard zu bestimmen. Alle Protein gilt als mitochondriale Protein.

3. Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch (Zustand 3 und staatliche 4)

  1. Erstellen von Sauerstoff Verbrauch Medien (OCM) von 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes und 1 mM EGTA, entfettet pH 7.4 bei 30 ° C mit 0,3 % BSA. Ca. 3 mL pro Probe wird benötigt. Bereiten Sie auch eine Lösung von 8 μg/mL Oligomycin in Ethanol.
  2. OCM bei 30 ° c inkubieren Atmung-Kammer, Pumpe und Sauerstoff-Elektrode anordnungsgemäß Hersteller (Oxygraph System) eingerichtet. Die Oxygraph Software sollte bereits auf dem Computer installiert sein.
  3. 1 mL der OCM in die Atmung Kammer legen und kräftig rühren. Dies wird helfen, sicherzustellen, dass die Lösung mit Luft gesättigt wird.
  4. Die Atmung Kammer 0,35 mg Protein des mitochondrialen Proteins hinzu und behalten Sie die Temperatur auf 30 ° C.
  5. Sauerstoff-Verbrauch ca. 5 Minuten aufzeichnen. Die Oxygraph System Datensätze Sauerstoffkonzentration sinkt so wie Atmung erhöht, Sauerstoff-Konzentration. Wenn Sauerstoff-Verbrauch wird konstant (abnehmende Luftlinie), Rekord Sauerstoffverbrauch (Steigung der Linie = Konzentration von Sauerstoff/Zeit). Dies ist Grundlinie Sauerstoffverbrauch.
  6. Hinzufügen von 1,25 µL 4 mM Rotenon Lösung für komplexe hemmen ich und fügen Sie dann 5 µL 1 M Succinat-Lösung, eine Endkonzentration von 5 mM Succinat in die Atemwege Kammer zu erreichen. Dies ist Stand 4 Atmung.
  7. Fügen Sie 1 µL 100 mM ADP-Lösung, eine Endkonzentration von 100 μM in der Atmung-Kammer zu erreichen. Sauerstoff-Konzentration sinkt (verstärkte Atmung) und dann nach ca. 5 min eine gerade Linie wird. Sauerstoff-Verbrauch aufzeichnen (Steigung der Linie = Konzentration von Sauerstoff/Zeit). Dies ist Zustand 3 Atmung.
  8. Optional: Am Ende des Laufs fügen Sie FCCP (Gesamtvolumen 0,2 μM), maximale Atmung zu induzieren hinzu. Atmung für ca. 5 min (ca.) aufnehmen. Wenn Sauerstoff-Verbrauch konstant, Rekord Sauerstoffverbrauch wird. Dies ist die maximale Sauerstoff-Verbrauch.
  9. Respiratory Control Verhältnis (RCR) unter Verwendung der Gleichung State 3 Sauerstoff-Verbrauch berechnen / State 4 Sauerstoffverbrauch.
  10. Aspirieren Sie alle Lösungen aus der Atmung-Kammer. Spülen Sie die Kammer mit doppelten deionisiertes Wasser mehrmals.

4. Messung der Mitochondrien-Membran-Potential (MMP) und Proton Motive Force (PMF)

  1. Lösung von 80 ng/mL Nigericin in Ethanol vorzubereiten.
    Hinweis: Diese Chemikalien sind in Ethanol gelöst und alle Anstrengungen unternommen werden sollten, um die Menge von Ethanol zu begrenzen, die weniger als 1 μL hinzugefügt wird, da Ethanol kann das Elektronentransportsystem zu entkoppeln und Mitchondrial Dysfunktion verursachen.
  2. Nach dem gründlich abspülen der Kammer mit doppelten deionisiertes Wasser 1 mL der OCM in die Atmung Kammer legen und mit einer magnetischen Stir Bar kräftig rühren. Dies wird helfen, sicherzustellen, dass die Lösung mit Luft gesättigt wird. Fügen Sie Methyl-Triphenyl-Phosphonium-(TPMP +) sensible Elektrode zur Kammer-Setup hinzu. TPMP + Elektrode sollte mit dem pH-Meter verbunden sein und Werte sind pH-Meter abgelesen.
  3. Die Atmung Kammer 0,35 mg des mitochondrialen Proteins hinzufügen.
  4. Fügen Sie 1,25 µL 4 mM Rotenon Lösung für komplexe I. Datensatz Atmung für 2-5 min (ca.) hemmen. Wenn Sauerstoff-Verbrauch konstant, Rekord Sauerstoffverbrauch wird.
  5. Fügen Sie 0,56 μL 8 μg/mL Oligomycin Lösung für eine Endkonzentration von 2,8 µg Oligomycin 0,35 mg des mitochondrialen Proteins ADP Auslastung zu hemmen. Atmung für 2-5 min (ca.) aufnehmen. Wenn Sauerstoff-Verbrauch konstant, Rekord Sauerstoffverbrauch wird.
  6. Fügen Sie 0.112 μL 80 ng/mL Nigericin Lösung zur Abschaffung von pH-Gradienten über der inneren mitochondrialen Membran hinzu. Atmung für 2-5 min (ca.) aufnehmen. Wenn Sauerstoff-Verbrauch konstant, Rekord Sauerstoffverbrauch wird.
    Hinweis: Rotenone und Oligomycin dienen der Elektronentransport blockieren Kette am Komplex I und ATP-Synthase, beziehungsweise. Nigericin wird hinzugefügt, um transmembranen H + Farbverlauf in einen K +-Gradienten zu konvertieren, die mit einer Elektrode gemessen werden kann.
  7. Bereiten Sie eine Standardkurve für TPMP + durch Zugabe von 5 µL 10 mM TPMP + Lösung auf die mitochondriale Inkubation. Wiederholen Sie diesen Schritt vier weitere Male, bis eine volle Konzentration von 2,5 μM TPMP + hinzugefügt wurden.
  8. Atmung durch Zugabe von 5 μl 1M Succinat in die Kammer zu initiieren.
  9. Nehmen Sie Atmung auf, bis Sie eine stabile Spur erreicht haben, und dann titrieren Sie das System durch das Hinzufügen von Malonat. Ergänzungen von Malonat sollte 0,5 µL, 1 µL, 1,5 µL, 3,0 µL, 6.0 µL 9.0 µL, dann 12,5 µL von 0,1 mM Malonat Lösung für aufeinander folgende Ergänzungen der Malonat Konzentrationen in der Inkubation Kammer von 0,1, 0,2, 0,3, 0,6, 1,2 1,8 und 2,5 mM.
  10. Sammeln von Daten aus den beiden Elektroden (Sauerstoff und TPMP+). Datenerfassungs-Software aus dem Oxygraph-System lässt sich durch simultane Messungen der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und mitochondriale Membranpotential zu sammeln und Änderungen im Sauerstoff-Verbrauch in Echtzeit beobachten. Abbildung 14 zeigt, wie das Oxygraph-System zeichnet Sauerstoffverbrauch im Laufe des Experiments.
  11. Berechnen Sie MMP in mV anhand der Nernst-Gleichung:
    MMP = 61,5 Log ([TPMP +] hinzugefügt – externe [TPMP +]) X TPMP+ Bindung Korrektur / (0,001 x mg Protein/mL x [TPMP +])
    Eine verbindliche Korrektur TPMP + 0.4 µL/mg des mitochondrialen Protein-1 wird verwendet.
    Beispielrechnung anhand der Konzentrationen im Protokoll:
    MMP = 61,5 X Log (5 µM-2 µM) x 0,4 / (0,001 x 0,35 mg mitochondriale Protein/mL 2 µM)
    MMP = 198,9 mV
  12. PMF Schätzung durch Auftragen einer Grafik von MMP vs. Sauerstoffverbrauch (Abbildung 15). PMF wird berichtet, wie Sauerstoff-Verbrauch auf einem Membran-Potential von 165 mV.
    Hinweis: Titrieren die Elektronentransport-Kette mit Malonat (0,1 bis 2,5 mM) zeigt die kinetische Reaktion des Proton Leck MMP. Plotten von MMP gegen Sauerstoff-Verbrauch bestimmt dann, Proton Leck Kinetik. PMF wird bestimmt durch die Berechnung der Sauerstoffverbrauch bei einem gemeinsamen Membranpotential (165 mV).
  13. Fügen Sie am Ende des letzten Laufs der Probe FCCP (0,2 μM Gesamtvolumen) maximale Atmung zu induzieren und loslassen TPMP + für Basislinienkorrektur.
  14. Aspirieren Sie alle Lösungen aus der Atmung-Kammer. Spülen Sie die Kammer mit doppelten deionisiertes Wasser mehrmals. Am Ende des Tages sollte die Kammer auch ein paar Mal mit Ethanol gespült werden.

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Representative Results

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Positive Ergebnisse zeigen RCR und Proton Leck Kinetik sind in Tabelle 1 und Abbildung 15, bzw. gezeigt. In dieser Studie7, RCR und Protein-Leck Kinetik wurden gemessen in Holstein Kühe mit 70 Tagen in Milch nach Kühe 1 5 unterschiedliche Niveaus der Cu, Zn und Mn für 28 Tage gefüttert worden war. Zustand 4, maximale Proton Leck-abhängige Atmung, hatten eine Tendenz zu Mineralienaufnahme von Cu, Mn und Zn (p < 0,1) betroffen sein. Zustand 3 Atmung (maximale ATP stimuliert Atmung) und RCR = State 3 / Stand 4 (Atmungskontrolle Verhältnis) wurde nicht von Mineralienaufnahme betroffen. Zustand 4 Atmung war in LowMn am höchsten und am niedrigsten in Kontrolle, darauf hinweist, dass Mn eine wichtige Rolle spielt bei der Minimierung von Proton Leck abhängigen Atmung. Mangan, durch das Enzym Superoxid-Dismutase Mn ist reaktive Sauerstoffspezies in der mitochondrialen Matrix verringern und Proton Leck12bekannt. Höhere staatliche 4 Atmung war verbunden mit niedriger Milch und Milch-Protein-Ausbeute. Da Proton Leck ein wichtiger Bestandteil des Energie-Effizienz ist, könnte Verringerung der Staat 4 Atmung durch Mn-Supplementierung Effizienz verbessern.

Behandlungen1
Hoch Med Low LowMn Kontrolle SEM
Milch, kg 47.4ab 50.9ein 46.0ab 43,6b 49.7ein 2.9
Milcheiweiß, kg 1,38ab 1,44ein 1.40ab 1.23b 1,43ein 0,09
Zustand 3 75,8 64,4 78.2 73 64.1 13
Zustand 4 26.2ab 22.6ab 25,9ab 27.1ein 22.0b 3
RCR 2,89 2.76 2,98 2.65 2,83 0,27
a b Innerhalb einer Zeile, die nicht von dem gleichen hochgestellte Buchstaben gefolgt sind signifikant unterschiedlich (P < 0,1).
1 hohe Behandlung enthält ein Höchstmaß an Cu, Zn und Mn alle weit über Anforderungen13, Med Behandlung enthält Zwischenebenen der Cu, Zn und Mn über Anforderungen, geringe Behandlung geringerer Cu, Zn und Mn aber immer noch über Anforderungen, Low Mn Behandlung enthält den niedrigsten Gehalt an Mn (und unteren Ebenen der Cu und Zn) aber immer noch über Anforderungen und Kontrolle Behandlung enthält den niedrigsten Gehalt an Cu und Zn, die in der Nähe von Anforderungen sind.

Tabelle 1: Wirkung von Cu, Mn und Zn-Supplementation auf Leber mitochondriale Sauerstoff Verbrauch und Milch Produktion von Milchkühen mit 70 Tagen in Milch. Diese Tabelle wurde von Acetoze Et Al. 20177angepasst.

Mitochondriale Proton Leck ist ein Prozess, der MMP durch die Bewegung der Protonen in die mitochondriale innere Membran ohne Produktion von ATP14zerstreut. Proton Leck Kinetik werden durch die Berechnung der Preise der Sauerstoffverbrauch auf einem gemeinsamen Membran-Potential von 165 bewertet mV. Ein niedriger Membranpotentials bedeutet, dass Protonen durch die mitochondriale Membran, führt zu niedrigeren ATP-Synthese (Abbildung 15) undicht sind. In der Holstein-Kuh-Studie wurde hepatische Proton Leck abhängigen Atmung in LowMn am größten und am niedrigsten in Kontrolle, die Ergebnisse in Tabelle 1, stimmt zu, dass Zustand 4 Atmung in LowMn am größten und am niedrigsten in Kontrolle war.

Figure 15
Abbildung 15. Proton Leck Kinetik in Holstein Kühe gefüttert unterschiedliche Mengen an Cu, Mn und Zn. Dieses Diagramm basiert auf Daten von Acetoze Et Al. 20177. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Negative Ergebnisse sind in Tabelle 2 und Abbildung 16verdeutlicht. Futterverwertung (RFI) lag in Angus Ochsen aus niedrigen RFI Bullen als hohe RFI Bullen geboren, aber dies spiegelte nicht in Mitochondrien RCR (Tabelle 2) oder Proton Leck Kinetik (Abbildung 16). Gab es keine Unterschiede in der mitochondrialen Atmung und Proton Leck Kinetik von Ochsen aber gab es ein Unterschied in der RFI. Auch gab es keine Unterschiede (p = 0,88) in hepatischen mitochondrialen Proton Leck in hohen und niedrigen RFI Ochsen (Abbildung 16). Gab es große Standard Fehler im Zusammenhang mit Messungen der mitochondrialen Atmung und Proton Leck kinetischen Kurven waren flach. Leber Proben aus dieser Studie stammen nach Ochsen geschlachtet wurden, ein Prozess, der Leber Probengewinnung und Verarbeitung durch eine Stunde verzögert. Variation der mitochondrialen Atmung Maßnahmen spiegeln mitochondriale Atmung Degradation durch Absterben von Gewebe. Proton Leck kinetische Linien waren flach, weil Sauerstoff Messungen nicht bis 8 min begann, wenn bereits aufgrund einer Fehlfunktion Ausrüstung Plateau erreicht hatte.

Niedrige RFI Hohe RFI SEM P -Wert
(n = 7) (n = 8)
RFI -0.58 -0,01 0.1 0.05
Zustand 3 31,3 30,8 9,42 0,9
Zustand 4 9,76 10.4 3.23 0,8
RCR 3.05 3.03 0,24 0.93

Tabelle 2: Leistung und mitochondriale Atmung von hohen und niedrigen Residual Feed Aufnahme (RFI) Angus bull nachkommen. Diese Tabelle wurde von Acetoze Et Al. 201511angepasst.

Figure 16
Abbildung 16. Proton Leck Kinetik für Nachkommen von hohen und niedrigen RFI Angus Bullen. Diese Grafik wurde von Acetoze Et Al. 201511angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 1
Abbildung 1: Reinigen Sie für chirurgische und Biopsie-Material befindet sich auf der Rückseite ein Fahrzeug als auch außerhalb der Kuh Stift. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Zurückhaltung der Kuh mit einem Halfter an ein Kreuz Pfahl der Kopf Sperre gebunden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: das Gebiet der Kuh für die Biopsie und Lage der Biopsie an der rechts 10 und 11. Intercostalneuralgie Raum fanden beim Zeichnen von geraden Linien von der richtigen Tuber Coxae bis zu dem Punkt der rechten Schulter zu reinigen. Die Biopsie-Website ist, wo diese Linie schneidet mit dem 10.-11. Intercostalneuralgie Raum. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Rasieren einen 10 cm Bereich der Kuh zur Vorbereitung für die Biopsie zu sterilisieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Waschen Biopsie Bereich der Kuh mit 10 % Providone Peeling mit kreisenden Bewegungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6. Besprühen Sie Biopsie-Bereich mit 70 % Ethanol Lösung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: 2 % Lidocain HCl (10-15 mL) lokal auf den Bereich Anästhesie der Haut zu injizieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8: eine Stichinzision 1-2 cm durch die Haut des 10.-11. Intercostalneuralgie Raumes Biopsie Tool einfügen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 9
Abbildung 9: einsetzen des bovinen Leberbiopsie Instrument über die Haut. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 10
Abbildung 10: das Biopsie-Instrument richten Sie bitte in eine leichte kraniale Richtung weiter durch das Diaphragma hindurch und in die Leber. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 11
Abbildung 11: ein 1 g Probe der Leber von Biopsie-Instrument Falconer Schlauch für den Transport zur mitochondrialen Isolation Station verschoben wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 12
Abbildung 12: die Haut abschließend Biopsie Schnitt nähen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 13
Abbildung 13: Injektion von der Kuh mit Ceftiofur Hydrochlorid 0,044 mL/kg Körpergewicht subkutan in den Hals. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 14
Abbildung 14: Oxygraph Software Ergebnisse zeigen Sauerstoff Verbrauch Antworten zur Ergänzung jedes Stoffes, mitochondriale Membranpotential (MMP) und Proton Motiv messen zwingen (PMF). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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Die kritischsten Punkt im Protokoll ist eine repräsentative Lebergewebe Probe zu erhalten und beginnt die Isolation der Mitochondrien so bald wie möglich nach der Biopsie. Variation in Atmung Messungen ist niedrig (Tabelle 1) durch eine kurze Transportzeit von Kuh ins Labor. Um Verkehr zu reduzieren, wurde ein kleines Labor eingerichtet im Büro der Molkerei und Leber Proben wurden auf der Büro-Labor getrieben, wie jeder gesammelt wurde, so dass Mitochondrien innerhalb 10 min der Biopsie isoliert wurden. Einrichten und Testen der Atmung Kammer und Elektroden (Sauerstoff, TPMP +) mit dem pH-Meter verwendet, um Rekord Unterschiede in Proton Steigungen am Vortag Erhebung und Verarbeitung von Proben Störungen wie zum Beispiel fehlende frühe Messungen in Proton Leck vermeiden können Kinetik (Abbildung 16).

Wegen der Notwendigkeit der frische Leber Proben und schnelle Isolation von Mitochondrien beschränkt sich die Anzahl der Samples, die gesammelt und an einem Tag verarbeitet werden kann. Jede Probe dauert ca. 5-6 h in Anspruch; Daher können nur 5 Proben pro Tag gesammelt und pro Atmung Kammer analysiert werden. Dies ist keine Hochdurchsatz-Methode; die Stichprobengröße für Behandlungen ist begrenzt und kleine Fehler erhöhen Variabilität verbunden mit Ergebnissen und die Fähigkeit, Bedeutung zu erkennen.

Die Isolation Technik kann einige Mitochondrien, die einige Zellbestandteile zugeordnet sind und bleiben eingebettet in das Pellet ausschließen oder kleinere Mitochondrien können in der Pellet-Waschungen während der Zentrifugation Schritte verloren. Dies kann zu Ergebnissen führen, die nicht die komplette Bevölkerung von Mitochondrien widerspiegeln. Mitochondrien können Veränderung der Größe und Dichte je nach physiologischen Zuständen wie Hunger und Übung (Training)15. Schätzung der mitochondrialen Zahl mit Enzym-Aktivität mit Citrat-Synthase16 oder Succinat Dehydrogenase17 Ergebnisse bestätigen kann erforderlich sein.

Keine Änderungen wurden vorgenommen, um der ursprünglichen Techniken Nagetiere für mitochondriale Isolierung18, Atmung19 gegründet und Proton Leck Kinetik20. Änderungen zu dieser Technik können je nach Gewebe Quelle der Mitochondrien und experimentelle Behandlungen vorgenommen werden. BSA (entfettet) wird verwendet, um freie Fettsäuren im Gewebe zu binden. Wenn das Gewebe eine Menge hat an Fettsäuren (mehr als 10 %) zugeordnet, mehr entfettet BSA kann hinzugefügt werden, da freie Fettsäuren mit der mitochondrialen Messungen stören.

Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und Proton Leck Kinetik mit dieser Technik ist das Standardverfahren. Leber ist das Gewebe der Wahl gewesen, vor allem, weil es eine Menge von Mitochondrien hat, sie ziemlich einfach sind zu extrahieren und die Leber der primäre Standort der Nährstoff Verarbeitung ist. Änderungen dieser Technik wurden zur Sauerstoff-Verbrauch in anderen Geweben wie Muskeln und Mamma zu messen. Mitochondriale Isolierungstechniken müssen das Gewebe passen angepasst werden. Zum Beispiel im Muskel, Mitochondrien in Muskelfasern eingebettet sind und damit die Isolierung Prozedur enthalten muss ein Proteinverdauung und die Verdauung kontrolliert werden müssen um sicherzustellen, dass die Funktion der Mitochondrien nicht gestört wird.

Es gibt andere Methoden zur Messung der mitochondrialen Atmung, einen Analysator speziell entwickelt, um die Atmung zu messen. Zellen müssen geerntet aus Gewebe und Inkubation Platten befestigt. Der Analysator Maßnahmen ganze Zelle Sauerstoff-Verbrauch (OCR; basale), ATP OCR (verbunden mit Mitochondrien), der Nonmitochondrial OCR und der maximalen OCR verbunden. Da Mitochondrien während der Inkubation gehemmt sind, sind isolierte Mitochondrien Messungen nicht möglich. Diese Methode wurde zur OCR ändert sich mit Krankheit und Droge Interventionen21 beim Menschen zu untersuchen.

Aktuelle und zukünftige Anwendungen

Der Beitrag der Proton Leck Energiebedarf des Tieres kann groß und bezeichnend für den physiologischen Zustand des Tieres wie Wachstum, Laktation und Krankheit sein. In der Vergangenheit wurde diese Technik in erster Linie eingesetzt, der Verband der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und Beitrag der Proton Leck zu füttern oder energetischen Wirkungsgrad zu untersuchen. Jedoch unser Verständnis der Rolle der Mitochondrien im Stoffwechsel dehnt sich aus, erhöht wie wichtig es ist, dass diese Technik vor allem in Kombination mit anderen mitochondrialen Maßnahmen wie Elektronentransport-Kette Enzymaktivitäten, Kalzium auch Dynamik in Apoptose und Enzym-Aktivitäten des TCA-Zyklus.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde von Alltech und USDA Luke Mittel durch das Zentrum für Tiergesundheit Essen bei UC Davis School of Veterinary Medicine unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Liver Biopsy
Equipment
Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument Sontec Instruments Englewood CO 1103-904
Suture Fisher Scientific 19-037-516
Suture needles NA NA Included with Suture
Scalpels Sigma - Aldrich S2896 / S2646 # for handle and blades
Surgery towels Fisher Scientific 50-129-6667
Falcon tubes 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Tweezers Sigma - Aldrich Z168750
50 mL syringes Fisher Scientific 22-314387
Injection needles (22, 2 1/2) VWR MJ8881-200342
Cow halter Tractor Supply Co. 101966599
Cotton swabbing Fisher Scientific 14-959-102
cotton gauze squares (4x4) Fisher Scientific 22-246069
Medical scissors Sigma - Aldrich Z265969
Chemicals
Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow Provided by Veterinarian
Clostridia Vaccine Provided by Veterinarian
Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days Provided by Veterinarian
Providone Scrub Aspen Veteterinary Resources 21260221
Ethanol 70% Sigma - Aldrich 793213
Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight Provided by Veterinarian
2% lidocaine HCl (10-15 mL) Provided by Veterinarian
1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine Provided by Veterinarian
Isolation of Mitochondria (liver)
Equipment
Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance Fisher Scientific 02-911-527
Homogenizer Motor Cole Parmer EW-04369-10
Homogenizer Probe Cole Parmer EW-04468-22
Auto Pipette (10 mL) Cole Parmer SK-21600-74
Beaker (500 mL) with ice Fisher Scientific FB100600
Refrigerated microfuge Fisher Scientific 75-002-441EW3
Microfuge tubes (1.5 mL) Fisher Scientific AM12400
Chemicals
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) abcam ab102536
Sucrose Sigma - Aldrich S7903-1KG
Tris-HCl Sigma - Aldrich T1503-1KG
EDTA Sigma - Aldrich EDS-1KG
BSA (fatty acid free) Sigma - Aldrich A7030-50G
Mannitol Sigma - Aldrich M4125-1KG
Deionized water Sigma - Aldrich 38796
Hepes Sigma - Aldrich H3375-500G
Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,  pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator
Mitochondrial Oxygen Comsuption
Equipment
Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode Hansatech (PP Systems) OXY1
Thermoregulated Water Pump ADInstruments MLE2001
Clark type Oxygen electrode NA NA
Autopipette (1 mL) Cole Parmer SK-21600-70 Included with Oxy1
Small magnetic stir bar Fisher Scientific 14-513-95
Micropipette (10 μL) Cole Parmer SK-21600-60
pH meter VWR
Chemicals
KCl Sigma - Aldrich P9333-1KG
Hepes Sigma - Aldrich H3375-500G
KH2PO4 Sigma - Aldrich P5655-1KG
MgCl2 Sigma - Aldrich M1028-100ML
EGTA Sigma - Aldrich E3889-100G
Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA
Rotenone (4 mM solution) Sigma - Aldrich R8875-5G
Succinate (1 M solution) Sigma - Aldrich S3674-250G
ADP (100 mM solution) Sigma - Aldrich A5285-1G
Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) Sigma - Aldrich 75351
FCCP Sigma - Aldrich C2920
Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force
Equipment
TPMP electrode World Precision Instruments. DRIREF-2
Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs
Malonate (0.1 mM solution) Sigma - Aldrich M1296
Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer Sigma - Aldrich 75351
Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer Sigma - Aldrich N7143
FCCP Sigma - Aldrich C3920
TPMP Sigma - Aldrich T200
TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA

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References

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Messung der Leber mitochondriale Sauerstoffverbrauch und Proton Leck Kinetik zur Abschätzung der mitochondrialen Atmung in Holstein Milchvieh
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Rossow, H. A., Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J. Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle. J. Vis. Exp. (141), e58387, doi:10.3791/58387 (2018).More

Rossow, H. A., Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J. Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle. J. Vis. Exp. (141), e58387, doi:10.3791/58387 (2018).

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