Summary
여기, 우리는 미토 콘 드리 아 산소 소비, 영양에 너 지론, 및 양성자 누출, 미토 콘 드리 아에서 ATP 비능률적의 주요 원인의 정의 개념을 측정 하기 위한 방법 공유. 이러한 결과 미토 콘 드리 아 기능을 평가할 수 있도록 영양소 사용률에 에너지의 30%에 대 한 계정 수 있습니다.
Abstract
산소 소비, 양성자 동기 힘 (PMF) 그리고 양성자 누출 측정의 미토 콘 드리 아 호흡, 또는 얼마나 잘 미토 콘 드리 아 ATP로 NADH와 FADH 변환할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아도 산소 사용 및 이산화탄소와 물에 영양분 산화에 대 한 기본 사이트 이기 때문에, 그들이 얼마나 효율적으로 산소를 사용 하 고 직접 ATP를 생산 영양소 대사의 효율성에 관한 동물의 영양소 요구 사항 및 동물의 건강입니다. 이 방법의 목적은 다른 약물, 다이어트와 미토 콘 드리 아 대사에 환경에 미치는 영향의 효과 검사 하는 데 사용할 수 있습니다 미토 콘 드리 아 호흡을 살펴보는 것입니다. 결과 산소 소비를 양성자 종속 호흡 (주 3) 및 양성자 누출 종속 호흡 (주 4)으로 측정 포함 됩니다. 주 3 / 주 4 호흡의 비율 호흡 제어 비율 (RCR)로 정의 되 고 미토 콘 드리 아 에너지 효율을 나타낼 수 있습니다. 미토 콘 드 리아 양성자 누출에서 ADP ATP 합성의 효율을 감소 연결을 푸는 산화 인 산화에 의해 미토 콘 드리 아 막 잠재적인 (MMP)의 소비를 허용 하는 프로세스입니다. 미토 콘 드리 아 기질 및 전자 수송 체인 억제제 산소와 TRMP + 민감한 전극 상태 3 주 4 호흡, 미토 콘 드 리아 멤브레인 PMF (또는 ATP 생산 잠재력)를 측정 하는 데 사용는 양성자 누출. 이 방법에 한계는 간 조직을 최대한 신선한 해야 모든 생 검 및 분석 실험 10 h이 하에서 수행 되어야 합니다. 이 샘플을 수집 하 고 약 5 하루에 한 사람에 의해 처리 수의 수를 제한 합니다. 그러나, 간 조직 1 g만 필요, 그래서 젖소와 같은 큰 동물에 필요한 샘플의 금액은 간 크기에 상대적으로 작은 작은 복구 시간이 필요 합니다.
Introduction
미토 콘 드리 아 스트레스에 매우 민감합니다 그리고 그들의 세포질 환경 다양 한 대사 질환에 기여할 수 있다. 산소 소비와 양성자 누출 미토 콘 드리 아에는 미토 콘 드리 아 건강의 지표입니다. 산소 소비와 양성자 누출 없이 RCR을 사용 하 여이 종이 견적 미토 콘 드 리아 에너지 효율에 설명 된 방법을 기반으로 합니다. 이러한 결과 영양소 사용률1에서 손실 에너지의 30%에 대 한 계정 수 있습니다. 산소 소비와 양성자 누출에 변화는 신진 대사 질환에 기여 하 고 감소 에너지 효율에서 결과 미토 콘 드 리아 기능 장애를 식별할 수 있습니다. 이러한 방법 또한 미토 콘 드리 아 호흡에 다른 처리의 효과 검사를 사용할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아 산소 소비와 양성자 누출 속도 측정의 전반적인 목표는 미토 콘 드리 아 기능 및 에너지 효율 평가입니다.
간 미토 콘 드 리아 기능 장애 젖소에 여러 가지 질병으로 연결 되었습니다. 수 유 초기에 에너지 적자를 직면 하는 때 지질과 탄수화물 연료 전환 세포질 물질 대사 수 숫자 셀2에 미토 콘 드리 아의 기능에 의해 좌우 된다. 에너지와 증가 β-산화에 대 한 증가 수요에 적응 하는 미토 콘 드리 아의 능력에 결함이 인슐린 저항와 관련 된 세포내 지질의 축적으로 이어질 수 있습니다 그리고 젖소 초 유에에서 지방 간의 형성으로 이어질 수 있습니다. 미토 콘 드리 아, 케 톤 체 생산 및 사용의 사이트로 젖소3ketosis에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아 또는 미토 콘 드 리아 기능 장애의 부족 주변에 연료 가용성에 영향을 미칠 것이 고 산소 소비 또는 RCR 변화에 반영.
염증 반응의 미토 콘 드리 아 산소 소비 변화입니다. 7-하루-오래 된 브로 일러에 감염 된 Eimeria 맥시 마 와 제어 그룹4그룹에 무작위로 지정 되었다. Coccidiosis 도전 받아야 하지 않았다 broilers 양성자 누출 및 높은 RCR 간 미토 콘 드리 아 증가 양성자 누출에 의해 면역도 전에 대응을 나타내는 낮은 산소 소비를 했다. 양성자 누출 동안 및 반응성 산소 종 생산 미토 콘 드 리아 멤브레인 부전의 상징으로 간주 한 번 했다 고 에너지 효율, 해로운 지금 알려져 있다 미토 콘 드리 아5 으로 단백질과 칼슘의 가져오기에 대 한 중요 하다는 것 열1의 세대에 대 한.
호흡기 체인에서 전자 누출에 게 미토 콘 드리 아 반응 산소 종 생산 및 산화 손상에 취약 미토 콘 드 리아 멤브레인 단백질, 지질 및 미토 콘 드리 아 DNA. 미토 콘 드리 아 나이, 손상 더 미토 콘 드리 아 대사6 에 더 큰 민감성 질병에 암소의 부전을 일으키는 mtDNA를 특히 누적 될 수 있습니다. 실제로, 많은 가축 동물 보충 항 산화 기능을 강화 하는 Cu, Zn와 Mn 등의 상부를 먹인 다. 그러나, 높은 수준의 Cu, Zn와 Mn 우유 생산 감소 유와 양성자 누출 (상태 4 호흡)7인 산소 소비를 증가.
미토 콘 드 리아 기능 가축에 에너지 효율에서의 역할에 대 한 이전 연구는 미토 콘 드리 아 산소 소비와 양성자 누출에 변화에 집중 했다. 젖소에 거의 연구 출판 되었습니다 및 대부분 논문 쇠고기 가축에 미토 콘 드리 아 기능에 잔여 먹이 섭취 (RFI)의 형태로 생산 효율을 비교 합니다. 미토 콘 드리 아 호흡 속도 양모 홀스타인 암소를 젖을 쇠고기 간에서 주 3, 주 4 및 RCR을 측정 하 여 시험 되었다 다양성 소 (앵거스, Brangus와 헤 리)8. 연구원은 성장 또는 쇠고기 가축에 대 한 특성을 짤 미토 콘 드리 아 호흡에 어떤 상관 관계를 찾지 못했습니다 하지만 미토 콘 드리 아 호흡 및 우유 홀스타인 열에 대 한 특성 간의 상관 관계를 보고 했다. 두 연구, RFI 근육 mitochondria9,10에 미토 콘 드리 아 호흡 요금 (3, 4 주와 RCR 상태) 쇠고기 가축에 비교 되었다. 미토 콘 드리 아 호흡 속도 DMI에 대 한 응답에서 변경 하 고 낮은 속도 덜 효율적인 쇠고기 steers와 관련 되었다. 또 다른 연구에서는, 높은 또는 낮은 RFI 불스에서 steers의 RFI 미토 콘 드리 아 호흡 속도 양성자 누출 속도 론 자손11의 두 그룹 사이 비교 되었다. 차이 때문에 이득 얻을 결론 쇠고기 가축에서 미토 콘 드리 아 호흡을 영향 하지 않습니다 확인 했다.
이 논문에서는, 실험 3 항 산화 미네랄 양모 젖소를 먹이에 대 한 응답 RCR에서는 측정 하는 방법 사용 하는 간 검사 중 산소 소비 4 고 3 호흡 및 PMF 상태.
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Protocol
모든 메서드, 프로토콜 및 여기서 설명 하는 연구 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 캘리포니아 대학, 데이비스 승인 되었다.
1. 홀스타인 낙농 암소에서 간 생 검을 얻기
참고: 간 생 검은 허용한 수 의사에 의해 수행 되어야 한다. 간 생 검 젖소는 유제품 사이트에 수행할 수 있습니다. 일반적으로 젖을 계속 젖이 젖소 그리고 우유 식량 공급 절차 전후에서 철회 될 필요가 없습니다. 적어도 4 명 낙농 소에 간 생 검을 수행 해야 하는 것이 좋습니다: 생 검, 생 검 위치 및 수 의사, 세가에 펜의 외부에 실험실 기술자를 보호 하기 위해 암소의 엉덩이에 서는 동물 처리기를 수행 하는 수 의사 어 도구, 재료와 생 수 의사에서 샘플 고 뒤쪽에 차량 (그림 1), 그리고 간 샘플을 검색 하 여 미토 콘 드리 아 격리 시작 기술 자가 될 수 있는 깨끗 한 영역을 유지.
- 1 개월 간 생 검 전에 주고 소 clostridia 예방 접종. 압력가 마로 소독 외과 수건, 생 검 계기, 메스 홀더 및 수술 장비 수술 팩을 만듭니다.
- 간 생 검 전에 1 일 Ceftiofur 염 0.044 mL/kg bodyweight 목에 피하와 암소를 주사. 암소 온도, 입구 및 정상적인 기능에 대 한 기준으로 사용 하 여 배설물로 점수를 모니터링 합니다.
- 4 ° c.에 미토 콘 드리 아 격리 미디어 (MIM) containining 220 m m 마 니 톨, 70mm 자당, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA, 및 0.1% (w/v) 지방산 무료 BSA, pH 7.4 만들기 샘플 당 약 30 mL이 필요 합니다.
- 제 지 소 필요에 따라 물리적으로 고삐를 놓지를 활용 하 여 (그림 2). 고삐를 사용 하 여 그녀의 머리는 기둥의 왼쪽에 넥타이. 필요한 경우, 화학 구속 (Xylazine 0.010 0.015에서 염 산 100 mg/mL 4 mg/kg 체중) 사용할 수 있습니다.
- 생 검의 영역 오른쪽 10-11 늑 공간 (그림 3)에서 발견 된다. 오른쪽 어깨의 지점에 오른쪽 결 절 coxae에서 직선을 그립니다. 생 검 사이트가이 라인 10-11 늑 공간와 교차 하는 곳입니다. 10 cm의 사각형 영역 (그림 4)를 면도 하 여 biopsied 되도록 암소의 영역을 소독. 10 %providone 스크럽 (그림 5) 원형 모션을 사용 하 여 영역을 씻어. 스프레이 영역 70% 에탄올 용액 (그림 6). 반복 providone 및 에탄올 세척입니다.
참고: 간 쇠고기 가축에 비해 홀스타인 젖소에서 약간 다른 위치에 있다. - 피부와 내부 근육과 결합 조직 (그림 7)의 마 취를 제공 하기 위해 지역에 2% lidocaine HCl (10-15 mL)를 로컬로 주사. Providone 및 70% 에탄올 세척을 반복 합니다.
참고: 피부에 신경 엔딩은 고 하지 내부 장기, anesthestic만 로컬 하지만 근육이 필요 하다. 대부분, 암소만 느껴야 어떤 압력과 고통 생 검 절차 중. - 1-2 cm 자상-절 개를 통해 10-11 늑 공간 (그림 8)의 피부를 확인 합니다. 피부를 통해 Schackelford-코 티 소 간 생 검 계기를 통과 하 고 통해 횡 경 막과 간 (그림 9, 그림 10)에 계속 하는 동안 약간의 두개골 방향에 생 악기를 직접. 간 1 g 샘플을 악기 (그림 11)를 제거 합니다. 피부 봉합 배치 (그림 12)를 닫습니다.
- 즉각적인 미토 콘 드리 아 격리에 대 한 얼음에 샘플을 충당 하기 위해 충분 한 MIM 원뿔 튜브에 장소 간 샘플
- 어떤 빨갛게, 붓기에 대 한 검사 절 개 열, 또는 생 검의 24 시간 이내에 통증 및 주입 암소 목에 피하 Ceftiofur 염 0.044 mL/kg bodyweight (그림 13) 다음 3 일 동안 하루에 한 번. 간 생 검 후 1 주 동안 암소의 온도, 섭취 및 배설물 점수 매일 모니터링 합니다. 발열을 개발 하 고, 수 의사의 판단에 따라 항생제를 계속 합니다.
참고: 지금까지 소 간 생 검 후 1 시간 이내 터치 통증, 절 개 사이트, recumbancy, 빨갛게, 열, 또는 반응에서 내보내는 등의 흔적을 전시는 경우에 1 mg/kg bodyweight IV 주입 flunixin meglumine의 통증과 염증을 완화 시키기 위해 사용할 수 있습니다. 필요한 경우 두 번째 주사를 관리할 수 있습니다. - 생 후 7 일 봉합을 제거 합니다.
2. 미토 콘 드리 아에서 낙농 소 간 격리
- 간 샘플 암소에서 제거 후에 가능한 한 빨리 붉은 혈액 세포를 제거 하 고 잘게가 위로 샘플을 말하다 (1.3 단계) MIM에 간 샘플을 씻어. 간 촉촉한 조직 유지에 충분 한 절연 미디어를 포함 하는 냉된 비 커에 다진 합니다.
- 0.16 m m 허가 얼음에서 incubated와 MIM (1:4 w/v)를 포함 하는 테 플 론 유 봉 다진된 간 30 mL 유리 유리병에 넣습니다.
- 4 선/min 분 500 rpm에 테 플 론 유 봉 간 샘플 균질
참고: 간 homogenate 전체 과정에서, MIM에 얼음 포장 비 커에 보관 됩니다 및 모든 다음 원심 분리 단계 4 ° C에서 완료 - 10 분 동안 500 x g에서 homogenate 원심, 펠 릿을 버리고, 냉장된 원심 분리기 튜브에 상쾌한을 전송 및 다음 결과 상쾌한 미토 콘 드리 아 펠 렛을 얻기 위해 10 분 동안 10000 x g에서 원심.
- Resuspend 및 지방산 무료 BSA와 MIM의 10 mL에 펠 릿을 세척 하 고 10 분 삭제 상쾌한 8100 x g에서 원심.
- Resuspend와 MIM 지방산 무료 BSA 없이 10 mL에 펠 릿을 세척 하 고 10 분 삭제 상쾌한 8100 x g에서 원심.
- 격리 미디어의 200 µ L에 펠 릿을 일시 중단 하 고 산소 소비와 양성자 누출 운동 분석 실험을 위해 사용 될 때까지 얼음에 놓습니다.
- 표준으로 BSA와 제조 업체의 프로토콜 당 Bicinchoninic 산 (BCA) 키트를 사용 하 여 펠 렛 서 스 펜 션 (1/100 희석)의 단백질 농도 결정 합니다. 모든 단백질은 미토 콘 드리 아 단백질 간주.
3. 미토 콘 드리 아 산소 소비 (주 3 주 4) 측정
- 5 mM Hepes와 1mm EGTA, pH 7.4 0.3 %30 ° C에서 defatted BSA, 120 m m KCl, 5mm KH2포4, 5 mM MgCl2에서 산소 소비 미디어 (OCM)를 만듭니다. 샘플 당 약 3 mL이 필요 합니다. 또한 8 μ g/mL oligomycin 에탄올에서의 솔루션을 준비 합니다.
- 30 ° c.에 OCM을 품 어 호흡 약 실, 펌프 및 산소 전극 제조 지시 (oxygraph 시스템)를 설정 합니다. Oxygraph 소프트웨어는 이미 컴퓨터에 설치 되어야 한다.
- 호흡 챔버로 OCM의 1 mL를 배치 하 고 적극적으로 저 어. 이 솔루션 공기 포화 된다 확실히 도움이 됩니다.
- 호흡 약 실에 미토 콘 드리 아 단백질의 0.35 mg 단백질을 추가 하 고 30 ° c.에 온도 유지
- 약 5 분 동안 산소 소비를 기록 합니다. Oxygraph 시스템 레코드 산소 농도 그래서 호흡 증가, 산소 농도 감소합니다. 산소 소비 되 면 상수 (감소 직선), 기록 산소 소비 (선의 기울기 농도 산소/시간 =). 이것은 초기 산소 소비입니다.
- 1.25 µ L 복잡 하 4 m m로 테 논 솔루션의 추가 나 5mm 호박의 호흡기 실에서 최종 농도 도달 1 M 합성 솔루션의 5 µ L 추가. 이것은 상태 4 호흡 이다.
- 100 μ M의 호흡 실에서 최종 농도 도달 100 m m ADP 솔루션의 1 µ L를 추가 합니다. 산소 농도 (증가 한 호흡) 줄어 다음 직선 약 5 분 후. 산소 소비를 기록 (선의 기울기 농도 산소/시간 =). 이것은 상태 3 호흡 이다.
- 선택 사항: 실행의 끝에, 최대한 호흡을 유도 하기 위해 FCCP (0.2 μ M 총 볼륨) 추가 합니다. (약) 약 5 분 동안 호흡을 기록 합니다. 때 산소 소비 일정, 기록 산소 소비 된다. 이것은 극대 산소 소비입니다.
- 호흡 제어 비율 (RCR) 방정식 상태 3 산소 소비를 사용 하 여 계산/4 산소 소비 상태.
- 호흡 약 실에서 솔루션의 모든 발음. 더블 이온된 물으로 여러 번 챔버 린스.
4. 미토 콘 드리 아 막 잠재력 (MMP) 및 양성자 동기 힘 (PMF) 측정
- 에탄올에 80 ng/mL nigericin의 솔루션을 준비 합니다.
참고: 이러한 화학 물질은 에탄올, 해산 하 고 모든 노력 에탄올 전자 교통 시스템 연결을 푸십시오 하 고 mitchondrial 장애를 일으킬 수 있기 때문에 1 μ, 추가 되는 에탄올의 양을 제한 하 여야 한다. - 철저 하 게 rinsing 후 이중 이온된 수와 챔버, 1 mL는 OCM의 호흡 챔버에 놓고 저으 적극적으로 자기 저 어 바. 이 솔루션 공기 포화 된다 확실히 도움이 됩니다. 메 틸-triphenyl-phosphonium (TPMP +) 민감한 전극 설치 챔버를 추가 합니다. TPMP + 전극 pH 미터에 연결 되어야 하 고 값 pH 미터에서 읽혀집니다.
- 호흡 약 실에 미토 콘 드리 아 단백질의 0.35 밀리 그램을 추가 합니다.
- (약) 2-5 분에 대 한 복잡 한 I. 기록 호흡을 억제 하기 위해 4 m m로 테 논 솔루션의 1.25 µ L를 추가 합니다. 때 산소 소비 일정, 기록 산소 소비 된다.
- 2.8 µ g oligomycin ADP 사용률을 억제 하기 위해 미토 콘 드리 아 단백질의 /0.35 mg의 최종 농도 대 한 8 μ g/mL oligomycin 솔루션의 0.56 μ를 추가 합니다. (약) 2-5 분 동안 호흡을 기록 합니다. 때 산소 소비 일정, 기록 산소 소비 된다.
- 미토 콘 드리 아 내 막에 걸쳐 pH 기온 변화도 폐지 하 고 0.112 μ 80 ng/mL nigericin 솔루션을 추가 합니다. (약) 2-5 분 동안 호흡을 기록 합니다. 때 산소 소비 일정, 기록 산소 소비 된다.
참고:로 테 논과 oligomycin 전자 수송을 차단 하는 데 사용 됩니다 체인 복잡 한에 어 ATP synthase, 각각. Nigericin 전극으로 측정 될 수 있다 K + 그라데이션 막 횡단 H + 그라데이션 변환에 추가 됩니다. - 미토 콘 드리 아 외피를 10 m m TPMP + 솔루션의 5 µ L을 추가 하 여 TPMP +에 대 한 표준 곡선을 준비 합니다. TPMP + 2.5 μ M의 총 농도 추가 될 때까지이 단계 4 번 더 반복 합니다.
- 실로 1m 호박의 5 μ를 추가 하 여 호흡을 시작 합니다.
- 안정 된 추적을 달성 때까지 호흡을 기록 하 고 malonate를 추가 하 여 시스템을 적정 하십시오. Malonate의 추가 0.5 µ L, 1 µ L, 1.5 µ L, 3.0 µ L, 6.0 µ L, 9.0 µ L, 0.1 m m의 0.1, 0.2, 0.3, 0.6, 1.2, 1.8, 보육 실에서 malonate 농도의 연속 추가 달성 하기 위해 Malonate 솔루션 및 2.5 m m의 다음 12.5 µ L 이어야 한다.
- 두 개의 전극 (산소와 TPMP+)에서 데이터를 수집 합니다. 미토 콘 드 리아 산소 소비와 미토 콘 드리 아 막 잠재력의 동시 측정을 수집 하 여 실시간으로 산소 소비에 변화 관찰 oxygraph 시스템에서 데이터 수집 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 그림 14 oxygraph 시스템 실험 진행으로 산소 소비를 기록 하는 방법을 보여 줍니다.
- Nernst 방정식에 따라 mV에 MMP를 계산:
MMP 61.5 로그 = ([TPMP +] 추가-외부 [TPMP +]) x TPMP+ 바인딩 수정 / (단백질/ml 0.001 x mg x [TPMP +])
미토 콘 드리 아 단백질-1 의 0.4 µ L/mg의 TPMP + 바인딩 수정 사용 됩니다.
예제 계산 프로토콜에 농도에 따라:
MMP = 0.4 x 61.5 x 로그 (5 µ M-2 µ M) / (0.001 x 0.35 mg 미토 콘 드리 아 단백질/mL x 2 µ M)
MMP 198.9 = mV - 견적 PMF MMP 대 산소 소비 (그림 15)의 그래프를 그려서. PMF 165의 막 잠재력에 산소 소비량으로 보고 mV.
참고: Titrating malonate (0.1 ~ 2.5 m m)와 전자 전송 체인 MMP를 양성자 누출의 운동 응답을 보여 줍니다. 다음, 산소 소비에 대 한 MMP를 플로팅 양성자 누출 속도를 결정 합니다. PMF 일반적인 막 잠재력에 산소 소비를 계산 하 여 결정 (165 mV). - 샘플의 마지막 실행의 끝에, 최대한 호흡을 유도 및 릴리스 TPMP + 기준 정정 FCCP (0.2 μ M 총 볼륨)을 추가 합니다.
- 호흡 약 실에서 솔루션의 모든 발음. 더블 이온된 물으로 여러 번 챔버 린스. 하루의 끝에, 챔버 한다 또한 수 씻어 서 몇 번 에탄올과.
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Representative Results
RCR와 양성자 누출 속도 보여주는 긍정적인 결과 각각 표 1 과 그림 15에 표시 됩니다. 이 연구7, RCR 및 단백질 누출에서 속도 론 측정 되었다 홀스타인 젖소에서 우유에 70 일 후 소는 28 일에 대 한 Cu, Zn와 Mn의 5 가지 레벨의 1을 공급 했다. 주 4, 최대 양성자 누출 종속 호흡, Cu, Mn, Zn (p < 0.1)의 미네랄 섭취에 의해 영향을 받을 하는 경향이 있었다. 주 3 호흡 (최대 ATP 자극 호흡) 및 RCR = 상태 3 / 상태 4 (호흡 제어 비율)은 미네랄 섭취에 의해 영향을 받지 않습니다. 4 호흡 했다 LowMn에서 최고 및 최저 컨트롤, 미네소타 최소화 양성자 누출 종속 호흡에 중요 한 역할을 합니다 나타내는 상태. 망간 Mn Superoxide Dismutase 효소를 통해 양성자 누출12시키고 미토 콘 드리 아 매트릭스에서 반응성 산소 종의 감소 시키기 위하여 알려져 있다. 높은 상태 4 호흡 낮은 우유와 우유 단백질 수율와 연관 되었다. 양성자 누출 에너지 효율성의 중요 한 요소 이기 때문에, 미네소타 보완 통해 상태 4 호흡을 줄이고 효율성을 높일 수 있습니다.
| 치료1 | ||||||
| 높은 | 클럽 메 드 | 낮은 | LowMn | 제어 | SEM의 | |
| 우유, kg | 47.4ab | 50.9 | 46.0ab | 43.6b | 49.7 | 2.9 |
| 우유 단백질, kg | 1.38ab | 1.44 | 1.40ab | 1.23b | 1.43 | 0.09 |
| 주 3 | 75.8 | 64.4 | 78.2 | 73 | 64.1 | 13 |
| 상태 4 | 26.2ab | 22.6ab | 25.9ab | 27.1 | 22.0b | 3 |
| RCR | 2.89 | 2.76 | 2.98 | 2.65 | 2.83 | 0.27 |
| a b 같은 위 첨자 문자 따르지 행 수단은 크게 다른 (P < 0.1). | ||||||
| 1 높은 처리 요구 사항13위의 모두 잘 Cu, Zn와 Mn의 높은 수준을 포함, 메 드 치료 포함 요구 사항 위의 Cu, Zn와 Mn의 중간 수준, 낮은 치료 포함 Cu, Zn와 Mn의 낮지만 여전히 낮은 수준 요구 사항, 낮은 미네소타 치료 포함 미네소타 (및 Cu와 Zn의 낮은 레벨)의 저급 하지만 요구 사항 및 컨트롤 위에 여전히 치료 포함 Cu와 Zn, 요구 사항에 가까운 낮은 수준. | ||||||
표 1: 간 미토 콘 드리 아 산소 소비 및 우유 생산에 젖소에서 우유에 70 일에서 효과의 Cu, Mn, Zn 보충. 이 테이블은 Acetoze 외. 20177에서 적응 되었습니다.
미토 콘 드 리아 양성자 누출 ATP14의 생산 없이 미토 콘 드리 아 내 막에 걸쳐 양성자의 움직임을 통해 MMP를 소비 하는 프로세스입니다. 165의 일반적인 막 잠재력에 산소 소비 속도 계산 하 여 양성자 누출 속도 론 평가 mV. 낮은 막 잠재적인는 양성자는 '새' 낮은 ATP 합성 (그림 15)에서 미토 콘 드리 아 막에 걸쳐 의미 합니다. 홀스타인 암소 연구에서 간 양성자 누출 종속 호흡 되었고 LowMn에서 가장 큰 컨트롤 상태 4 호흡 했다 LowMn에서 가장 큰 및 컨트롤에 가장 낮은 결과 표 1에 동의에서 최저.
그림 15. 홀스타인 암소에서 양성자 누출 속도 론 Cu, Mn, Zn의 다른 양의 먹이. 이 그래프는 Acetoze 외. 20177에서 데이터를 기반으로 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
부정적인 결과 표 2 와 그림 16에 나와 있습니다. 사료 효율 (RFI) 높은 앵거스 steers 높은 RFI 황소 보다 낮은 RFI 불스에서 태어난 하지만이 미토 콘 드 리아 RCR (표 2) 또는 양성자 누출 속도 (그림 16)에 반영 되지 않습니다 되었다. Steers 그룹 간의 미토 콘 드리 아 호흡 및 양성자 누출 속도에 차이가 있었지만 RFI에 차이. 차이가 있었다 (p = 0.88) 간 미토 콘 드 리아 양성자에 누출에 높고 낮은 RFI steers (그림 16). 큰 표준 오류가 관련 된 미토 콘 드리 아 호흡 측정, 그리고 양성자 누출 운동 곡선 평평 했다. 이 연구에서 간 샘플 steers 학살 했다 후 가져온 간 샘플 수집 및 처리 시간을 지연 하는 프로세스. 미토 콘 드리 아 호흡 측정에서 조직의 죽음 때문에 미토 콘 드리 아 호흡 저하를 반영 수 있습니다. 산소 소비 측정 고원 장비 오작동으로 인해 이미 도달 했다 때 8 분까지 시작 하지 않았다 때문에 양성자 누출 운동 라인 플랫 했다.
| 낮은 RFI | 높은 RFI | SEM의 | P 값 | |
| (n = 7) | (n = 8) | |||
| RFI | -0.58 | -0.01 | 0.1 | 0.05 |
| 주 3 | 31.3 | 30.8 | 9.42 | 0.9 |
| 상태 4 | 9.76 | 10.4 | 3.23 | 0.8 |
| RCR | 3.05 | 3.03 | 0.24 | 0.93 |
표 2: 성능 및 높은 및 낮은 잔여 먹이 섭취 (RFI) 앵거스의 미토 콘 드리 아 호흡 불 자손. 이 테이블은 Acetoze 외. 201511에서 적응 되었습니다.
그림 16. 높고 낮은 RFI 앵거스 황소의 자손에 대 한 양성자 누출 속도 론. 이 그래프는 Acetoze 외. 201511에서 적응 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 1:에 대 한 영역을 청소 수술 및 생 검 재료 암소 펜 외부 차량 뒤쪽에 위치한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 억제 고삐를 사용 하 여 암소의 머리 자물쇠의 교차 기둥에 묶여. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 생 검 및 생 검 오른쪽 어깨의 지점에 오른쪽 결 절 coxae에서 직선을 그려서 발견 오른쪽 10-11 있는 공간에서의 위치에 대 한 청소 암소의 지역. 생 검 사이트가이 라인 10-11 늑 공간와 교차 하는 곳입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 면도 생 검에 대 한 소독을 준비 암소의 10 cm 지역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 원형 모션을 사용 하 여 10 %providone 스크럽으로 암소의 생 검 지역을 씻어. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6. 70% 에탄올 용액으로 생 검 위치를 스프레이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 피부 마 취를 제공 하기 위해 지역에 2% lidocaine HCl (10-15 mL)을 로컬로 삽입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 1-2 cm 자상-절 개를 생 도구를 삽입 하는 10-11 늑 공간의 피부를 통해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9: 피부를 통해 소 간 생 검 계기의 삽입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 10: 생 악기 통해 횡 경 막과 간으로 계속 하는 동안 약간의 두개골 방향으로 감독 해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 11: 매 사냥꾼 튜브로 미토 콘 드리 아 격리 역 전송에 대 한 생 검 계기에서 이동 되 고 간 1 g 샘플. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 12: 절 개 생 검을 피부 봉합. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 13: Ceftiofur 염 0.044 mL/kg bodyweight 피하는 목에서에서와 암소의 주입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 14: Oxygraph 소프트웨어 결과 보여주는 산소 미토 콘 드 리아 멤브레인 잠재적인 (MMP) 및 양성자 동기 측정 각 물질의 추가 소비 응답 힘 (PMF). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
프로토콜에서 가장 중요 한 포인트는 대표 간 조직 샘플을 얻기 이며 생 후 즉시 미토 콘 드리 아의 격리를 시작. 호흡 측정에 변이 실험실으로 암소에서 짧은 전송 시간으로 인해 낮은 (표 1). 전송 시간을 줄이기 위해, 작은 실험실 세워졌다는 유제품의 사무실에서 그리고 각 미토 콘 드리 아 생의 10 분 안에 고립 됐다 있도록 수집으로 간 샘플 사무실 실험실에 기반 했다. 설치 및 사용 기록 차이 양성자 기온 변화도에 하루 전에 수집 하 고 처리 하는 샘플 양성자 누출에서 초기 측정 누락 등 오작동을 방지할 수 있습니다 pH 미터 호흡 챔버 및 전극 (산소, TPMP +)의 테스트 속도 론 (그림 16)입니다.
신선한 간 샘플 및 미토 콘 드리 아의 신속한 격리에 대 한 필요 때문에 수집 되 고 하루에 처리 될 수 있는 샘플의 수는 제한 됩니다. 각 샘플 완료; 약 5-6 시간 걸립니다. 따라서, 하루 약 5 샘플 수집 하 고 호흡 챔버 별로 분석 될 수 있습니다. 이것은 높은 처리량 방법.입니다. 치료에 대 한 샘플 크기 제한 되며 작은 오류 변화 결과 의미를 감지 하는 능력을 높일 수 있습니다.
절연 기술 일부 셀 구성 요소와 연결 하 고 펠 릿에 포함 된 남아 일부 미토 콘 드리 아를 제외 시킬 수 있습니다 또는 작은 미토 콘 드리 아 펠 릿 세척에 원심 분리 단계 동안 손실 될 수 있습니다. 이 미토 콘 드리 아의 전체 인구를 반영 하지 않는 결과가 발생할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아 수 크기와 기아 등 생리 상태에 따라 밀도 변화와 운동 (훈련)15. 효소 활동 결과 확증을 구 연산 염 synthase16 또는 호박 효소17 을 사용 하 여 견적 하는 미토 콘 드리 아 수 필요할 수 있습니다.
수정 없이 원래 기법 대 한 미토 콘 드리 아 격리18, 호흡19 설치류에 설립 되었다 그리고 양성자 누출 속도 론20. 이 기술에 대 한 수정 조직 미토 콘 드리 아와 실험적 치료의 원본에 따라 만들 수 있습니다. BSA (defatted)는 조직에서 무료 지방산을 바인딩하는 데 사용 됩니다. 조직에 많은 경우 지방산의 (10% 이상) 관련 된, 더 defatted BSA 추가할 수 있습니다 때문에 무료 지방산이 미토 콘 드리 아 측정에 방해가 됩니다.
미토 콘 드리 아 산소 소비와이 기술을 사용 하 여 양성자 누출 속도 측정 하는 것은 표준 절차입니다. 주로 하기 때문에 미토 콘 드리 아의 많은 있다, 그들은 비교적 쉽게 추출, 간은 영양 처리의 주 사이트 간 선택의 조직 되었습니다. 이 기술의 수정과 유 방 근육 등 다른 조직에서 산소 소비량을 측정 하기 위해 사용 되었습니다. 그러나, 미토 콘 드 리아 절연 기술 조직에 맞게 수정 해야 합니다. 예를 들어, 근육, 미토 콘 드리 아 근육 섬유에 포함 된 고 미토 콘 드리 아 기능을 방해 하지는 보장 하기 위해 단백질 소화와 소화를 제어 해야 합니다 그래서 격리 절차를 포함 해야 합니다.
특별히 호흡을 측정 하는 분석기를 필요로 하는 미토 콘 드리 아 호흡을 측정 하기 위한 다른 방법이 있다. 세포 조직에서 수확 하 고 외피 격판덮개를 고정 해야 합니다. 분석기 측정 전체 셀 산소 소비 속도 (OCR, 기저), ATP (미토 콘 드리 아와 관련 된) OCR, nonmitochondrial OCR, 그리고 최대한 OCR 연결. 그러나, 때문에 미토 콘 드리 아 중 일부는 외피의 억제는, 고립 된 미토 콘 드리 아 측정 가능 하지 않습니다. 이 방법은 인간의 질병 및 약물 개입21 OCR 변경 검사 사용 되었습니다.
현재와 미래의 응용 프로그램
동물의 에너지 요구 사항에 양성자 누출의 기여는 큰 성장, 수 유 및 질병 등 동물의 생리 적 상태를 나타내는 수 있습니다. 과거에는,이 기술은 주로 미토 콘 드리 아 산소 소비의 협회와 피드 양성자 누출 또는 에너지 효율성의 기여 검토 하 사용 되었습니다. 그러나, 대사에 미토 콘 드리 아의 역할에 대 한 우리의 이해를 확장 하면서,이 기술의 중요성 또한 증가 함께 전자 전송 체인 효소 활동, 칼슘 등 다른 미토 콘 드리 아 측정에 특히 TCA 사이클의 apoptosis와 효소 활동에 역학.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구 센터를 통해 Alltech 및 USDA 해치 자금 음식 동물 건강에 UC 데이비스 수의 학부의 지원 한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liver Biopsy | |||
| Equipment | |||
| Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Suture | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Suture needles | NA | NA | Included with Suture |
| Scalpels | Sigma - Aldrich | S2896 / S2646 | # for handle and blades |
| Surgery towels | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Falcon tubes 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Tweezers | Sigma - Aldrich | Z168750 | |
| 50 mL syringes | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Injection needles (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Cow halter | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
| Cotton swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| cotton gauze squares (4x4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Medical scissors | Sigma - Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Provided by Veterinarian | ||
| Clostridia Vaccine | Provided by Veterinarian | ||
| Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days | Provided by Veterinarian | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Ethanol 70% | Sigma - Aldrich | 793213 | |
| Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight | Provided by Veterinarian | ||
| 2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Provided by Veterinarian | ||
| 1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine | Provided by Veterinarian | ||
| Isolation of Mitochondria (liver) | |||
| Equipment | |||
| Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Homogenizer Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Homogenizer Probe | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Auto Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Beaker (500 mL) with ice | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Refrigerated microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Microfuge tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma - Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma - Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma - Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (fatty acid free) | Sigma - Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma - Aldrich | M4125-1KG | |
| Deionized water | Sigma - Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA, pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator | |||
| Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
| Equipment | |||
| Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| Thermoregulated Water Pump | ADInstruments | MLE2001 | |
| Clark type Oxygen electrode | NA | NA | |
| Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Included with Oxy1 |
| Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Micropipette (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH meter | VWR | ||
| Chemicals | |||
| KCl | Sigma - Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma - Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma - Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma - Aldrich | E3889-100G | |
| Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
| Rotenone (4 mM solution) | Sigma - Aldrich | R8875-5G | |
| Succinate (1 M solution) | Sigma - Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 mM solution) | Sigma - Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
| Equipment | |||
| TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs | |||
| Malonate (0.1 mM solution) | Sigma - Aldrich | M1296 | |
| Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma - Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma - Aldrich | T200 | |
| TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA |
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