Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

홀스타인 젖소에서 미토 콘 드리 아 호흡 추정 간 미토 콘 드리 아 산소 소비와 양성자 누출 속도 론 측정

doi: 10.3791/58387 Published: November 30, 2018

Summary

여기, 우리는 미토 콘 드리 아 산소 소비, 영양에 너 지론, 및 양성자 누출, 미토 콘 드리 아에서 ATP 비능률적의 주요 원인의 정의 개념을 측정 하기 위한 방법 공유. 이러한 결과 미토 콘 드리 아 기능을 평가할 수 있도록 영양소 사용률에 에너지의 30%에 대 한 계정 수 있습니다.

Abstract

산소 소비, 양성자 동기 힘 (PMF) 그리고 양성자 누출 측정의 미토 콘 드리 아 호흡, 또는 얼마나 잘 미토 콘 드리 아 ATP로 NADH와 FADH 변환할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아도 산소 사용 및 이산화탄소와 물에 영양분 산화에 대 한 기본 사이트 이기 때문에, 그들이 얼마나 효율적으로 산소를 사용 하 고 직접 ATP를 생산 영양소 대사의 효율성에 관한 동물의 영양소 요구 사항 및 동물의 건강입니다. 이 방법의 목적은 다른 약물, 다이어트와 미토 콘 드리 아 대사에 환경에 미치는 영향의 효과 검사 하는 데 사용할 수 있습니다 미토 콘 드리 아 호흡을 살펴보는 것입니다. 결과 산소 소비를 양성자 종속 호흡 (주 3) 및 양성자 누출 종속 호흡 (주 4)으로 측정 포함 됩니다. 주 3 / 주 4 호흡의 비율 호흡 제어 비율 (RCR)로 정의 되 고 미토 콘 드리 아 에너지 효율을 나타낼 수 있습니다. 미토 콘 드 리아 양성자 누출에서 ADP ATP 합성의 효율을 감소 연결을 푸는 산화 인 산화에 의해 미토 콘 드리 아 막 잠재적인 (MMP)의 소비를 허용 하는 프로세스입니다. 미토 콘 드리 아 기질 및 전자 수송 체인 억제제 산소와 TRMP + 민감한 전극 상태 3 주 4 호흡, 미토 콘 드 리아 멤브레인 PMF (또는 ATP 생산 잠재력)를 측정 하는 데 사용는 양성자 누출. 이 방법에 한계는 간 조직을 최대한 신선한 해야 모든 생 검 및 분석 실험 10 h이 하에서 수행 되어야 합니다. 이 샘플을 수집 하 고 약 5 하루에 한 사람에 의해 처리 수의 수를 제한 합니다. 그러나, 간 조직 1 g만 필요, 그래서 젖소와 같은 큰 동물에 필요한 샘플의 금액은 간 크기에 상대적으로 작은 작은 복구 시간이 필요 합니다.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

미토 콘 드리 아 스트레스에 매우 민감합니다 그리고 그들의 세포질 환경 다양 한 대사 질환에 기여할 수 있다. 산소 소비와 양성자 누출 미토 콘 드리 아에는 미토 콘 드리 아 건강의 지표입니다. 산소 소비와 양성자 누출 없이 RCR을 사용 하 여이 종이 견적 미토 콘 드 리아 에너지 효율에 설명 된 방법을 기반으로 합니다. 이러한 결과 영양소 사용률1에서 손실 에너지의 30%에 대 한 계정 수 있습니다. 산소 소비와 양성자 누출에 변화는 신진 대사 질환에 기여 하 고 감소 에너지 효율에서 결과 미토 콘 드 리아 기능 장애를 식별할 수 있습니다. 이러한 방법 또한 미토 콘 드리 아 호흡에 다른 처리의 효과 검사를 사용할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아 산소 소비와 양성자 누출 속도 측정의 전반적인 목표는 미토 콘 드리 아 기능 및 에너지 효율 평가입니다.

간 미토 콘 드 리아 기능 장애 젖소에 여러 가지 질병으로 연결 되었습니다. 수 유 초기에 에너지 적자를 직면 하는 때 지질과 탄수화물 연료 전환 세포질 물질 대사 수 숫자 셀2에 미토 콘 드리 아의 기능에 의해 좌우 된다. 에너지와 증가 β-산화에 대 한 증가 수요에 적응 하는 미토 콘 드리 아의 능력에 결함이 인슐린 저항와 관련 된 세포내 지질의 축적으로 이어질 수 있습니다 그리고 젖소 초 유에에서 지방 간의 형성으로 이어질 수 있습니다. 미토 콘 드리 아, 케 톤 체 생산 및 사용의 사이트로 젖소3ketosis에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아 또는 미토 콘 드 리아 기능 장애의 부족 주변에 연료 가용성에 영향을 미칠 것이 고 산소 소비 또는 RCR 변화에 반영.

염증 반응의 미토 콘 드리 아 산소 소비 변화입니다. 7-하루-오래 된 브로 일러에 감염 된 Eimeria 맥시 마 와 제어 그룹4그룹에 무작위로 지정 되었다. Coccidiosis 도전 받아야 하지 않았다 broilers 양성자 누출 및 높은 RCR 간 미토 콘 드리 아 증가 양성자 누출에 의해 면역도 전에 대응을 나타내는 낮은 산소 소비를 했다. 양성자 누출 동안 및 반응성 산소 종 생산 미토 콘 드 리아 멤브레인 부전의 상징으로 간주 한 번 했다 고 에너지 효율, 해로운 지금 알려져 있다 미토 콘 드리 아5 으로 단백질과 칼슘의 가져오기에 대 한 중요 하다는 것 열1의 세대에 대 한.

호흡기 체인에서 전자 누출에 게 미토 콘 드리 아 반응 산소 종 생산 및 산화 손상에 취약 미토 콘 드 리아 멤브레인 단백질, 지질 및 미토 콘 드리 아 DNA. 미토 콘 드리 아 나이, 손상 더 미토 콘 드리 아 대사6 에 더 큰 민감성 질병에 암소의 부전을 일으키는 mtDNA를 특히 누적 될 수 있습니다. 실제로, 많은 가축 동물 보충 항 산화 기능을 강화 하는 Cu, Zn와 Mn 등의 상부를 먹인 다. 그러나, 높은 수준의 Cu, Zn와 Mn 우유 생산 감소 유와 양성자 누출 (상태 4 호흡)7인 산소 소비를 증가.

미토 콘 드 리아 기능 가축에 에너지 효율에서의 역할에 대 한 이전 연구는 미토 콘 드리 아 산소 소비와 양성자 누출에 변화에 집중 했다. 젖소에 거의 연구 출판 되었습니다 및 대부분 논문 쇠고기 가축에 미토 콘 드리 아 기능에 잔여 먹이 섭취 (RFI)의 형태로 생산 효율을 비교 합니다. 미토 콘 드리 아 호흡 속도 양모 홀스타인 암소를 젖을 쇠고기 간에서 주 3, 주 4 및 RCR을 측정 하 여 시험 되었다 다양성 소 (앵거스, Brangus와 헤 리)8. 연구원은 성장 또는 쇠고기 가축에 대 한 특성을 짤 미토 콘 드리 아 호흡에 어떤 상관 관계를 찾지 못했습니다 하지만 미토 콘 드리 아 호흡 및 우유 홀스타인 열에 대 한 특성 간의 상관 관계를 보고 했다. 두 연구, RFI 근육 mitochondria9,10에 미토 콘 드리 아 호흡 요금 (3, 4 주와 RCR 상태) 쇠고기 가축에 비교 되었다. 미토 콘 드리 아 호흡 속도 DMI에 대 한 응답에서 변경 하 고 낮은 속도 덜 효율적인 쇠고기 steers와 관련 되었다. 또 다른 연구에서는, 높은 또는 낮은 RFI 불스에서 steers의 RFI 미토 콘 드리 아 호흡 속도 양성자 누출 속도 론 자손11의 두 그룹 사이 비교 되었다. 차이 때문에 이득 얻을 결론 쇠고기 가축에서 미토 콘 드리 아 호흡을 영향 하지 않습니다 확인 했다.

이 논문에서는, 실험 3 항 산화 미네랄 양모 젖소를 먹이에 대 한 응답 RCR에서는 측정 하는 방법 사용 하는 간 검사 중 산소 소비 4 고 3 호흡 및 PMF 상태.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

모든 메서드, 프로토콜 및 여기서 설명 하는 연구 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 캘리포니아 대학, 데이비스 승인 되었다.

1. 홀스타인 낙농 암소에서 간 생 검을 얻기

참고: 간 생 검은 허용한 수 의사에 의해 수행 되어야 한다. 간 생 검 젖소는 유제품 사이트에 수행할 수 있습니다. 일반적으로 젖을 계속 젖이 젖소 그리고 우유 식량 공급 절차 전후에서 철회 될 필요가 없습니다. 적어도 4 명 낙농 소에 간 생 검을 수행 해야 하는 것이 좋습니다: 생 검, 생 검 위치 및 수 의사, 세가에 펜의 외부에 실험실 기술자를 보호 하기 위해 암소의 엉덩이에 서는 동물 처리기를 수행 하는 수 의사 어 도구, 재료와 생 수 의사에서 샘플 고 뒤쪽에 차량 (그림 1), 그리고 간 샘플을 검색 하 여 미토 콘 드리 아 격리 시작 기술 자가 될 수 있는 깨끗 한 영역을 유지.

  1. 1 개월 간 생 검 전에 주고 소 clostridia 예방 접종. 압력가 마로 소독 외과 수건, 생 검 계기, 메스 홀더 및 수술 장비 수술 팩을 만듭니다.
  2. 간 생 검 전에 1 일 Ceftiofur 염 0.044 mL/kg bodyweight 목에 피하와 암소를 주사. 암소 온도, 입구 및 정상적인 기능에 대 한 기준으로 사용 하 여 배설물로 점수를 모니터링 합니다.
  3. 4 ° c.에 미토 콘 드리 아 격리 미디어 (MIM) containining 220 m m 마 니 톨, 70mm 자당, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA, 및 0.1% (w/v) 지방산 무료 BSA, pH 7.4 만들기 샘플 당 약 30 mL이 필요 합니다.
  4. 제 지 소 필요에 따라 물리적으로 고삐를 놓지를 활용 하 여 (그림 2). 고삐를 사용 하 여 그녀의 머리는 기둥의 왼쪽에 넥타이. 필요한 경우, 화학 구속 (Xylazine 0.010 0.015에서 염 산 100 mg/mL 4 mg/kg 체중) 사용할 수 있습니다.
  5. 생 검의 영역 오른쪽 10-11 늑 공간 (그림 3)에서 발견 된다. 오른쪽 어깨의 지점에 오른쪽 결 절 coxae에서 직선을 그립니다. 생 검 사이트가이 라인 10-11 늑 공간와 교차 하는 곳입니다. 10 cm의 사각형 영역 (그림 4)를 면도 하 여 biopsied 되도록 암소의 영역을 소독. 10 %providone 스크럽 (그림 5) 원형 모션을 사용 하 여 영역을 씻어. 스프레이 영역 70% 에탄올 용액 (그림 6). 반복 providone 및 에탄올 세척입니다.
    참고: 간 쇠고기 가축에 비해 홀스타인 젖소에서 약간 다른 위치에 있다.
  6. 피부와 내부 근육과 결합 조직 (그림 7)의 마 취를 제공 하기 위해 지역에 2% lidocaine HCl (10-15 mL)를 로컬로 주사. Providone 및 70% 에탄올 세척을 반복 합니다.
    참고: 피부에 신경 엔딩은 고 하지 내부 장기, anesthestic만 로컬 하지만 근육이 필요 하다. 대부분, 암소만 느껴야 어떤 압력과 고통 생 검 절차 중.
  7. 1-2 cm 자상-절 개를 통해 10-11 늑 공간 (그림 8)의 피부를 확인 합니다. 피부를 통해 Schackelford-코 티 소 간 생 검 계기를 통과 하 고 통해 횡 경 막과 간 (그림 9, 그림 10)에 계속 하는 동안 약간의 두개골 방향에 생 악기를 직접. 간 1 g 샘플을 악기 (그림 11)를 제거 합니다. 피부 봉합 배치 (그림 12)를 닫습니다.
  8. 즉각적인 미토 콘 드리 아 격리에 대 한 얼음에 샘플을 충당 하기 위해 충분 한 MIM 원뿔 튜브에 장소 간 샘플
  9. 어떤 빨갛게, 붓기에 대 한 검사 절 개 열, 또는 생 검의 24 시간 이내에 통증 및 주입 암소 목에 피하 Ceftiofur 염 0.044 mL/kg bodyweight (그림 13) 다음 3 일 동안 하루에 한 번. 간 생 검 후 1 주 동안 암소의 온도, 섭취 및 배설물 점수 매일 모니터링 합니다. 발열을 개발 하 고, 수 의사의 판단에 따라 항생제를 계속 합니다.
    참고: 지금까지 소 간 생 검 후 1 시간 이내 터치 통증, 절 개 사이트, recumbancy, 빨갛게, 열, 또는 반응에서 내보내는 등의 흔적을 전시는 경우에 1 mg/kg bodyweight IV 주입 flunixin meglumine의 통증과 염증을 완화 시키기 위해 사용할 수 있습니다. 필요한 경우 두 번째 주사를 관리할 수 있습니다.
  10. 생 후 7 일 봉합을 제거 합니다.

2. 미토 콘 드리 아에서 낙농 소 간 격리

  1. 간 샘플 암소에서 제거 후에 가능한 한 빨리 붉은 혈액 세포를 제거 하 고 잘게가 위로 샘플을 말하다 (1.3 단계) MIM에 간 샘플을 씻어. 간 촉촉한 조직 유지에 충분 한 절연 미디어를 포함 하는 냉된 비 커에 다진 합니다.
  2. 0.16 m m 허가 얼음에서 incubated와 MIM (1:4 w/v)를 포함 하는 테 플 론 유 봉 다진된 간 30 mL 유리 유리병에 넣습니다.
  3. 4 선/min 분 500 rpm에 테 플 론 유 봉 간 샘플 균질
    참고: 간 homogenate 전체 과정에서, MIM에 얼음 포장 비 커에 보관 됩니다 및 모든 다음 원심 분리 단계 4 ° C에서 완료
  4. 10 분 동안 500 x g에서 homogenate 원심, 펠 릿을 버리고, 냉장된 원심 분리기 튜브에 상쾌한을 전송 및 다음 결과 상쾌한 미토 콘 드리 아 펠 렛을 얻기 위해 10 분 동안 10000 x g에서 원심.
  5. Resuspend 및 지방산 무료 BSA와 MIM의 10 mL에 펠 릿을 세척 하 고 10 분 삭제 상쾌한 8100 x g에서 원심.
  6. Resuspend와 MIM 지방산 무료 BSA 없이 10 mL에 펠 릿을 세척 하 고 10 분 삭제 상쾌한 8100 x g에서 원심.
  7. 격리 미디어의 200 µ L에 펠 릿을 일시 중단 하 고 산소 소비와 양성자 누출 운동 분석 실험을 위해 사용 될 때까지 얼음에 놓습니다.
  8. 표준으로 BSA와 제조 업체의 프로토콜 당 Bicinchoninic 산 (BCA) 키트를 사용 하 여 펠 렛 서 스 펜 션 (1/100 희석)의 단백질 농도 결정 합니다. 모든 단백질은 미토 콘 드리 아 단백질 간주.

3. 미토 콘 드리 아 산소 소비 (주 3 주 4) 측정

  1. 5 mM Hepes와 1mm EGTA, pH 7.4 0.3 %30 ° C에서 defatted BSA, 120 m m KCl, 5mm KH24, 5 mM MgCl2에서 산소 소비 미디어 (OCM)를 만듭니다. 샘플 당 약 3 mL이 필요 합니다. 또한 8 μ g/mL oligomycin 에탄올에서의 솔루션을 준비 합니다.
  2. 30 ° c.에 OCM을 품 어 호흡 약 실, 펌프 및 산소 전극 제조 지시 (oxygraph 시스템)를 설정 합니다. Oxygraph 소프트웨어는 이미 컴퓨터에 설치 되어야 한다.
  3. 호흡 챔버로 OCM의 1 mL를 배치 하 고 적극적으로 저 어. 이 솔루션 공기 포화 된다 확실히 도움이 됩니다.
  4. 호흡 약 실에 미토 콘 드리 아 단백질의 0.35 mg 단백질을 추가 하 고 30 ° c.에 온도 유지
  5. 약 5 분 동안 산소 소비를 기록 합니다. Oxygraph 시스템 레코드 산소 농도 그래서 호흡 증가, 산소 농도 감소합니다. 산소 소비 되 면 상수 (감소 직선), 기록 산소 소비 (선의 기울기 농도 산소/시간 =). 이것은 초기 산소 소비입니다.
  6. 1.25 µ L 복잡 하 4 m m로 테 논 솔루션의 추가 나 5mm 호박의 호흡기 실에서 최종 농도 도달 1 M 합성 솔루션의 5 µ L 추가. 이것은 상태 4 호흡 이다.
  7. 100 μ M의 호흡 실에서 최종 농도 도달 100 m m ADP 솔루션의 1 µ L를 추가 합니다. 산소 농도 (증가 한 호흡) 줄어 다음 직선 약 5 분 후. 산소 소비를 기록 (선의 기울기 농도 산소/시간 =). 이것은 상태 3 호흡 이다.
  8. 선택 사항: 실행의 끝에, 최대한 호흡을 유도 하기 위해 FCCP (0.2 μ M 총 볼륨) 추가 합니다. (약) 약 5 분 동안 호흡을 기록 합니다. 때 산소 소비 일정, 기록 산소 소비 된다. 이것은 극대 산소 소비입니다.
  9. 호흡 제어 비율 (RCR) 방정식 상태 3 산소 소비를 사용 하 여 계산/4 산소 소비 상태.
  10. 호흡 약 실에서 솔루션의 모든 발음. 더블 이온된 물으로 여러 번 챔버 린스.

4. 미토 콘 드리 아 막 잠재력 (MMP) 및 양성자 동기 힘 (PMF) 측정

  1. 에탄올에 80 ng/mL nigericin의 솔루션을 준비 합니다.
    참고: 이러한 화학 물질은 에탄올, 해산 하 고 모든 노력 에탄올 전자 교통 시스템 연결을 푸십시오 하 고 mitchondrial 장애를 일으킬 수 있기 때문에 1 μ, 추가 되는 에탄올의 양을 제한 하 여야 한다.
  2. 철저 하 게 rinsing 후 이중 이온된 수와 챔버, 1 mL는 OCM의 호흡 챔버에 놓고 저으 적극적으로 자기 저 어 바. 이 솔루션 공기 포화 된다 확실히 도움이 됩니다. 메 틸-triphenyl-phosphonium (TPMP +) 민감한 전극 설치 챔버를 추가 합니다. TPMP + 전극 pH 미터에 연결 되어야 하 고 값 pH 미터에서 읽혀집니다.
  3. 호흡 약 실에 미토 콘 드리 아 단백질의 0.35 밀리 그램을 추가 합니다.
  4. (약) 2-5 분에 대 한 복잡 한 I. 기록 호흡을 억제 하기 위해 4 m m로 테 논 솔루션의 1.25 µ L를 추가 합니다. 때 산소 소비 일정, 기록 산소 소비 된다.
  5. 2.8 µ g oligomycin ADP 사용률을 억제 하기 위해 미토 콘 드리 아 단백질의 /0.35 mg의 최종 농도 대 한 8 μ g/mL oligomycin 솔루션의 0.56 μ를 추가 합니다. (약) 2-5 분 동안 호흡을 기록 합니다. 때 산소 소비 일정, 기록 산소 소비 된다.
  6. 미토 콘 드리 아 내 막에 걸쳐 pH 기온 변화도 폐지 하 고 0.112 μ 80 ng/mL nigericin 솔루션을 추가 합니다. (약) 2-5 분 동안 호흡을 기록 합니다. 때 산소 소비 일정, 기록 산소 소비 된다.
    참고:로 테 논과 oligomycin 전자 수송을 차단 하는 데 사용 됩니다 체인 복잡 한에 어 ATP synthase, 각각. Nigericin 전극으로 측정 될 수 있다 K + 그라데이션 막 횡단 H + 그라데이션 변환에 추가 됩니다.
  7. 미토 콘 드리 아 외피를 10 m m TPMP + 솔루션의 5 µ L을 추가 하 여 TPMP +에 대 한 표준 곡선을 준비 합니다. TPMP + 2.5 μ M의 총 농도 추가 될 때까지이 단계 4 번 더 반복 합니다.
  8. 실로 1m 호박의 5 μ를 추가 하 여 호흡을 시작 합니다.
  9. 안정 된 추적을 달성 때까지 호흡을 기록 하 고 malonate를 추가 하 여 시스템을 적정 하십시오. Malonate의 추가 0.5 µ L, 1 µ L, 1.5 µ L, 3.0 µ L, 6.0 µ L, 9.0 µ L, 0.1 m m의 0.1, 0.2, 0.3, 0.6, 1.2, 1.8, 보육 실에서 malonate 농도의 연속 추가 달성 하기 위해 Malonate 솔루션 및 2.5 m m의 다음 12.5 µ L 이어야 한다.
  10. 두 개의 전극 (산소와 TPMP+)에서 데이터를 수집 합니다. 미토 콘 드 리아 산소 소비와 미토 콘 드리 아 막 잠재력의 동시 측정을 수집 하 여 실시간으로 산소 소비에 변화 관찰 oxygraph 시스템에서 데이터 수집 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 그림 14 oxygraph 시스템 실험 진행으로 산소 소비를 기록 하는 방법을 보여 줍니다.
  11. Nernst 방정식에 따라 mV에 MMP를 계산:
    MMP 61.5 로그 = ([TPMP +] 추가-외부 [TPMP +]) x TPMP+ 바인딩 수정 / (단백질/ml 0.001 x mg x [TPMP +])
    미토 콘 드리 아 단백질-1 의 0.4 µ L/mg의 TPMP + 바인딩 수정 사용 됩니다.
    예제 계산 프로토콜에 농도에 따라:
    MMP = 0.4 x 61.5 x 로그 (5 µ M-2 µ M) / (0.001 x 0.35 mg 미토 콘 드리 아 단백질/mL x 2 µ M)
    MMP 198.9 = mV
  12. 견적 PMF MMP 산소 소비 (그림 15)의 그래프를 그려서. PMF 165의 막 잠재력에 산소 소비량으로 보고 mV.
    참고: Titrating malonate (0.1 ~ 2.5 m m)와 전자 전송 체인 MMP를 양성자 누출의 운동 응답을 보여 줍니다. 다음, 산소 소비에 대 한 MMP를 플로팅 양성자 누출 속도를 결정 합니다. PMF 일반적인 막 잠재력에 산소 소비를 계산 하 여 결정 (165 mV).
  13. 샘플의 마지막 실행의 끝에, 최대한 호흡을 유도 및 릴리스 TPMP + 기준 정정 FCCP (0.2 μ M 총 볼륨)을 추가 합니다.
  14. 호흡 약 실에서 솔루션의 모든 발음. 더블 이온된 물으로 여러 번 챔버 린스. 하루의 끝에, 챔버 한다 또한 수 씻어 서 몇 번 에탄올과.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

RCR와 양성자 누출 속도 보여주는 긍정적인 결과 각각 표 1그림 15에 표시 됩니다. 이 연구7, RCR 및 단백질 누출에서 속도 론 측정 되었다 홀스타인 젖소에서 우유에 70 일 후 소는 28 일에 대 한 Cu, Zn와 Mn의 5 가지 레벨의 1을 공급 했다. 주 4, 최대 양성자 누출 종속 호흡, Cu, Mn, Zn (p < 0.1)의 미네랄 섭취에 의해 영향을 받을 하는 경향이 있었다. 주 3 호흡 (최대 ATP 자극 호흡) 및 RCR = 상태 3 / 상태 4 (호흡 제어 비율)은 미네랄 섭취에 의해 영향을 받지 않습니다. 4 호흡 했다 LowMn에서 최고 및 최저 컨트롤, 미네소타 최소화 양성자 누출 종속 호흡에 중요 한 역할을 합니다 나타내는 상태. 망간 Mn Superoxide Dismutase 효소를 통해 양성자 누출12시키고 미토 콘 드리 아 매트릭스에서 반응성 산소 종의 감소 시키기 위하여 알려져 있다. 높은 상태 4 호흡 낮은 우유와 우유 단백질 수율와 연관 되었다. 양성자 누출 에너지 효율성의 중요 한 요소 이기 때문에, 미네소타 보완 통해 상태 4 호흡을 줄이고 효율성을 높일 수 있습니다.

치료1
높은 클럽 메 드 낮은 LowMn 제어 SEM의
우유, kg 47.4ab 50.9 46.0ab 43.6b 49.7 2.9
우유 단백질, kg 1.38ab 1.44 1.40ab 1.23b 1.43 0.09
주 3 75.8 64.4 78.2 73 64.1 13
상태 4 26.2ab 22.6ab 25.9ab 27.1 22.0b 3
RCR 2.89 2.76 2.98 2.65 2.83 0.27
a b 같은 위 첨자 문자 따르지 행 수단은 크게 다른 (P < 0.1).
1 높은 처리 요구 사항13위의 모두 잘 Cu, Zn와 Mn의 높은 수준을 포함, 메 드 치료 포함 요구 사항 위의 Cu, Zn와 Mn의 중간 수준, 낮은 치료 포함 Cu, Zn와 Mn의 낮지만 여전히 낮은 수준 요구 사항, 낮은 미네소타 치료 포함 미네소타 (및 Cu와 Zn의 낮은 레벨)의 저급 하지만 요구 사항 및 컨트롤 위에 여전히 치료 포함 Cu와 Zn, 요구 사항에 가까운 낮은 수준.

표 1: 간 미토 콘 드리 아 산소 소비 및 우유 생산에 젖소에서 우유에 70 일에서 효과의 Cu, Mn, Zn 보충. 이 테이블은 Acetoze 외. 20177에서 적응 되었습니다.

미토 콘 드 리아 양성자 누출 ATP14의 생산 없이 미토 콘 드리 아 내 막에 걸쳐 양성자의 움직임을 통해 MMP를 소비 하는 프로세스입니다. 165의 일반적인 막 잠재력에 산소 소비 속도 계산 하 여 양성자 누출 속도 론 평가 mV. 낮은 막 잠재적인는 양성자는 '새' 낮은 ATP 합성 (그림 15)에서 미토 콘 드리 아 막에 걸쳐 의미 합니다. 홀스타인 암소 연구에서 간 양성자 누출 종속 호흡 되었고 LowMn에서 가장 큰 컨트롤 상태 4 호흡 했다 LowMn에서 가장 큰 및 컨트롤에 가장 낮은 결과 표 1에 동의에서 최저.

Figure 15
그림 15. 홀스타인 암소에서 양성자 누출 속도 론 Cu, Mn, Zn의 다른 양의 먹이. 이 그래프는 Acetoze 외. 20177에서 데이터를 기반으로 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

부정적인 결과 표 2그림 16에 나와 있습니다. 사료 효율 (RFI) 높은 앵거스 steers 높은 RFI 황소 보다 낮은 RFI 불스에서 태어난 하지만이 미토 콘 드 리아 RCR (표 2) 또는 양성자 누출 속도 (그림 16)에 반영 되지 않습니다 되었다. Steers 그룹 간의 미토 콘 드리 아 호흡 및 양성자 누출 속도에 차이가 있었지만 RFI에 차이. 차이가 있었다 (p = 0.88) 간 미토 콘 드 리아 양성자에 누출에 높고 낮은 RFI steers (그림 16). 큰 표준 오류가 관련 된 미토 콘 드리 아 호흡 측정, 그리고 양성자 누출 운동 곡선 평평 했다. 이 연구에서 간 샘플 steers 학살 했다 후 가져온 간 샘플 수집 및 처리 시간을 지연 하는 프로세스. 미토 콘 드리 아 호흡 측정에서 조직의 죽음 때문에 미토 콘 드리 아 호흡 저하를 반영 수 있습니다. 산소 소비 측정 고원 장비 오작동으로 인해 이미 도달 했다 때 8 분까지 시작 하지 않았다 때문에 양성자 누출 운동 라인 플랫 했다.

낮은 RFI 높은 RFI SEM의 P
(n = 7) (n = 8)
RFI -0.58 -0.01 0.1 0.05
주 3 31.3 30.8 9.42 0.9
상태 4 9.76 10.4 3.23 0.8
RCR 3.05 3.03 0.24 0.93

표 2: 성능 및 높은 및 낮은 잔여 먹이 섭취 (RFI) 앵거스의 미토 콘 드리 아 호흡 불 자손. 이 테이블은 Acetoze 외. 201511에서 적응 되었습니다.

Figure 16
그림 16. 높고 낮은 RFI 앵거스 황소의 자손에 대 한 양성자 누출 속도 론. 이 그래프는 Acetoze 외. 201511에서 적응 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 1
그림 1:에 대 한 영역을 청소 수술 및 생 검 재료 암소 펜 외부 차량 뒤쪽에 위치한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 억제 고삐를 사용 하 여 암소의 머리 자물쇠의 교차 기둥에 묶여. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 생 검 및 생 검 오른쪽 어깨의 지점에 오른쪽 결 절 coxae에서 직선을 그려서 발견 오른쪽 10-11 있는 공간에서의 위치에 대 한 청소 암소의 지역. 생 검 사이트가이 라인 10-11 늑 공간와 교차 하는 곳입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 면도 생 검에 대 한 소독을 준비 암소의 10 cm 지역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 원형 모션을 사용 하 여 10 %providone 스크럽으로 암소의 생 검 지역을 씻어. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6. 70% 에탄올 용액으로 생 검 위치를 스프레이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: 피부 마 취를 제공 하기 위해 지역에 2% lidocaine HCl (10-15 mL)을 로컬로 삽입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8: 1-2 cm 자상-절 개를 생 도구를 삽입 하는 10-11 늑 공간의 피부를 통해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 9
그림 9: 피부를 통해 소 간 생 검 계기의 삽입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 10
그림 10: 생 악기 통해 횡 경 막과 간으로 계속 하는 동안 약간의 두개골 방향으로 감독 해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 11
그림 11: 매 사냥꾼 튜브로 미토 콘 드리 아 격리 역 전송에 대 한 생 검 계기에서 이동 되 고 간 1 g 샘플. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 12
그림 12: 절 개 생 검을 피부 봉합. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 13
그림 13: Ceftiofur 염 0.044 mL/kg bodyweight 피하는 목에서에서와 암소의 주입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 14
그림 14: Oxygraph 소프트웨어 결과 보여주는 산소 미토 콘 드 리아 멤브레인 잠재적인 (MMP) 및 양성자 동기 측정 각 물질의 추가 소비 응답 힘 (PMF). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

프로토콜에서 가장 중요 한 포인트는 대표 간 조직 샘플을 얻기 이며 생 후 즉시 미토 콘 드리 아의 격리를 시작. 호흡 측정에 변이 실험실으로 암소에서 짧은 전송 시간으로 인해 낮은 (표 1). 전송 시간을 줄이기 위해, 작은 실험실 세워졌다는 유제품의 사무실에서 그리고 각 미토 콘 드리 아 생의 10 분 안에 고립 됐다 있도록 수집으로 간 샘플 사무실 실험실에 기반 했다. 설치 및 사용 기록 차이 양성자 기온 변화도에 하루 전에 수집 하 고 처리 하는 샘플 양성자 누출에서 초기 측정 누락 등 오작동을 방지할 수 있습니다 pH 미터 호흡 챔버 및 전극 (산소, TPMP +)의 테스트 속도 론 (그림 16)입니다.

신선한 간 샘플 및 미토 콘 드리 아의 신속한 격리에 대 한 필요 때문에 수집 되 고 하루에 처리 될 수 있는 샘플의 수는 제한 됩니다. 각 샘플 완료; 약 5-6 시간 걸립니다. 따라서, 하루 약 5 샘플 수집 하 고 호흡 챔버 별로 분석 될 수 있습니다. 이것은 높은 처리량 방법.입니다. 치료에 대 한 샘플 크기 제한 되며 작은 오류 변화 결과 의미를 감지 하는 능력을 높일 수 있습니다.

절연 기술 일부 셀 구성 요소와 연결 하 고 펠 릿에 포함 된 남아 일부 미토 콘 드리 아를 제외 시킬 수 있습니다 또는 작은 미토 콘 드리 아 펠 릿 세척에 원심 분리 단계 동안 손실 될 수 있습니다. 이 미토 콘 드리 아의 전체 인구를 반영 하지 않는 결과가 발생할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아 수 크기와 기아 등 생리 상태에 따라 밀도 변화와 운동 (훈련)15. 효소 활동 결과 확증을 구 연산 염 synthase16 또는 호박 효소17 을 사용 하 여 견적 하는 미토 콘 드리 아 수 필요할 수 있습니다.

수정 없이 원래 기법 대 한 미토 콘 드리 아 격리18, 호흡19 설치류에 설립 되었다 그리고 양성자 누출 속도 론20. 이 기술에 대 한 수정 조직 미토 콘 드리 아와 실험적 치료의 원본에 따라 만들 수 있습니다. BSA (defatted)는 조직에서 무료 지방산을 바인딩하는 데 사용 됩니다. 조직에 많은 경우 지방산의 (10% 이상) 관련 된, 더 defatted BSA 추가할 수 있습니다 때문에 무료 지방산이 미토 콘 드리 아 측정에 방해가 됩니다.

미토 콘 드리 아 산소 소비와이 기술을 사용 하 여 양성자 누출 속도 측정 하는 것은 표준 절차입니다. 주로 하기 때문에 미토 콘 드리 아의 많은 있다, 그들은 비교적 쉽게 추출, 간은 영양 처리의 주 사이트 간 선택의 조직 되었습니다. 이 기술의 수정과 유 방 근육 등 다른 조직에서 산소 소비량을 측정 하기 위해 사용 되었습니다. 그러나, 미토 콘 드 리아 절연 기술 조직에 맞게 수정 해야 합니다. 예를 들어, 근육, 미토 콘 드리 아 근육 섬유에 포함 된 고 미토 콘 드리 아 기능을 방해 하지는 보장 하기 위해 단백질 소화와 소화를 제어 해야 합니다 그래서 격리 절차를 포함 해야 합니다.

특별히 호흡을 측정 하는 분석기를 필요로 하는 미토 콘 드리 아 호흡을 측정 하기 위한 다른 방법이 있다. 세포 조직에서 수확 하 고 외피 격판덮개를 고정 해야 합니다. 분석기 측정 전체 셀 산소 소비 속도 (OCR, 기저), ATP (미토 콘 드리 아와 관련 된) OCR, nonmitochondrial OCR, 그리고 최대한 OCR 연결. 그러나, 때문에 미토 콘 드리 아 중 일부는 외피의 억제는, 고립 된 미토 콘 드리 아 측정 가능 하지 않습니다. 이 방법은 인간의 질병 및 약물 개입21 OCR 변경 검사 사용 되었습니다.

현재와 미래의 응용 프로그램

동물의 에너지 요구 사항에 양성자 누출의 기여는 큰 성장, 수 유 및 질병 등 동물의 생리 적 상태를 나타내는 수 있습니다. 과거에는,이 기술은 주로 미토 콘 드리 아 산소 소비의 협회와 피드 양성자 누출 또는 에너지 효율성의 기여 검토 하 사용 되었습니다. 그러나, 대사에 미토 콘 드리 아의 역할에 대 한 우리의 이해를 확장 하면서,이 기술의 중요성 또한 증가 함께 전자 전송 체인 효소 활동, 칼슘 등 다른 미토 콘 드리 아 측정에 특히 TCA 사이클의 apoptosis와 효소 활동에 역학.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 연구 센터를 통해 Alltech 및 USDA 해치 자금 음식 동물 건강에 UC 데이비스 수의 학부의 지원 한다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Liver Biopsy
Equipment
Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument Sontec Instruments Englewood CO 1103-904
Suture Fisher Scientific 19-037-516
Suture needles NA NA Included with Suture
Scalpels Sigma - Aldrich S2896 / S2646 # for handle and blades
Surgery towels Fisher Scientific 50-129-6667
Falcon tubes 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Tweezers Sigma - Aldrich Z168750
50 mL syringes Fisher Scientific 22-314387
Injection needles (22, 2 1/2) VWR MJ8881-200342
Cow halter Tractor Supply Co. 101966599
Cotton swabbing Fisher Scientific 14-959-102
cotton gauze squares (4x4) Fisher Scientific 22-246069
Medical scissors Sigma - Aldrich Z265969
Chemicals
Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow Provided by Veterinarian
Clostridia Vaccine Provided by Veterinarian
Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days Provided by Veterinarian
Providone Scrub Aspen Veteterinary Resources 21260221
Ethanol 70% Sigma - Aldrich 793213
Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight Provided by Veterinarian
2% lidocaine HCl (10-15 mL) Provided by Veterinarian
1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine Provided by Veterinarian
Isolation of Mitochondria (liver)
Equipment
Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance Fisher Scientific 02-911-527
Homogenizer Motor Cole Parmer EW-04369-10
Homogenizer Probe Cole Parmer EW-04468-22
Auto Pipette (10 mL) Cole Parmer SK-21600-74
Beaker (500 mL) with ice Fisher Scientific FB100600
Refrigerated microfuge Fisher Scientific 75-002-441EW3
Microfuge tubes (1.5 mL) Fisher Scientific AM12400
Chemicals
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) abcam ab102536
Sucrose Sigma - Aldrich S7903-1KG
Tris-HCl Sigma - Aldrich T1503-1KG
EDTA Sigma - Aldrich EDS-1KG
BSA (fatty acid free) Sigma - Aldrich A7030-50G
Mannitol Sigma - Aldrich M4125-1KG
Deionized water Sigma - Aldrich 38796
Hepes Sigma - Aldrich H3375-500G
Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,  pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator
Mitochondrial Oxygen Comsuption
Equipment
Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode Hansatech (PP Systems) OXY1
Thermoregulated Water Pump ADInstruments MLE2001
Clark type Oxygen electrode NA NA
Autopipette (1 mL) Cole Parmer SK-21600-70 Included with Oxy1
Small magnetic stir bar Fisher Scientific 14-513-95
Micropipette (10 μL) Cole Parmer SK-21600-60
pH meter VWR
Chemicals
KCl Sigma - Aldrich P9333-1KG
Hepes Sigma - Aldrich H3375-500G
KH2PO4 Sigma - Aldrich P5655-1KG
MgCl2 Sigma - Aldrich M1028-100ML
EGTA Sigma - Aldrich E3889-100G
Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA
Rotenone (4 mM solution) Sigma - Aldrich R8875-5G
Succinate (1 M solution) Sigma - Aldrich S3674-250G
ADP (100 mM solution) Sigma - Aldrich A5285-1G
Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) Sigma - Aldrich 75351
FCCP Sigma - Aldrich C2920
Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force
Equipment
TPMP electrode World Precision Instruments. DRIREF-2
Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs
Malonate (0.1 mM solution) Sigma - Aldrich M1296
Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer Sigma - Aldrich 75351
Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer Sigma - Aldrich N7143
FCCP Sigma - Aldrich C3920
TPMP Sigma - Aldrich T200
TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
  2. Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).
  3. Bartlett, K., Eaton, S. Mitochondrial B oxidation. European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).
  4. Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).
  5. Wallace, D. C., Fan, W. Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics. Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).
  6. Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging. Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).
  7. Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc. Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).
  8. Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle. Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).
  9. Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers. Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).
  10. Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle. Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).
  11. Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls. ISRN Vet Sci. 2015, (194014), (2015).
  12. Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. Free Radicals in Biology and Medicine. Oxford University Press. Oxford. 186-187 (1989).
  13. National Research Council. Nutrient Requirements of Dairy Cattle. 7th revised edition, National Academy Press. Washington, DC. (2001).
  14. Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging. Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).
  15. Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity: beyond ATP. Nature. 17, 608-620 (2017).
  16. Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. Biochemical assays of respiratory chain complex activity. Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).
  17. Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression. Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).
  18. Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats. British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).
  19. Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice. PloS One. 3, (3), e1759 (2008).
  20. Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction. Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).
  21. Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research. Clinical Science. 127, 367-373 (2014).
홀스타인 젖소에서 미토 콘 드리 아 호흡 추정 간 미토 콘 드리 아 산소 소비와 양성자 누출 속도 론 측정
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rossow, H. A., Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J. Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle. J. Vis. Exp. (141), e58387, doi:10.3791/58387 (2018).More

Rossow, H. A., Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J. Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle. J. Vis. Exp. (141), e58387, doi:10.3791/58387 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter