Summary
Aquí, compartimos los métodos para medir el consumo de oxígeno mitocondrial, un concepto definitorio de nutrición energética y escape de protones, la principal causa de ineficiencia en generación mitocondrial de ATP. 30% de la energía perdida en la utilización de nutrientes para ayudar a evaluar la función mitocondrial pueden explicar estos resultados.
Abstract
Consumo de oxígeno, fuerza de motivo del protón (PMF) y fuga de protones son las medidas de la respiración mitocondrial, o bien las mitocondrias son capaces de convertir los NADH y FADH en ATP. Puesto que las mitocondrias son el sitio primario para el uso de oxígeno y nutrientes oxidación a dióxido de carbono y agua, sobre la eficacia que utilizan oxígeno y producen ATP directamente se relaciona con la eficiencia del metabolismo de nutrientes, necesidades de nutrientes del animal, y salud del animal. El propósito de este método es examinar la respiración mitocondrial, que puede utilizarse para examinar los efectos de diferentes fármacos, dietas y efectos ambientales sobre el metabolismo mitocondrial. Los resultados incluyen el consumo de oxígeno medido como respiración dependiente de protones (estado 3) y respiración dependiente de fuga de protones (estado 4). La relación de la respiración del estado 3 / Estado 4 se define como el cociente del control respiratorio (RCR) y puede representar eficiencia energética mitocondrial. Escape de protones mitocondrial es un proceso que permite la disipación del potencial de membrana mitocondrial (MMP) por desacoplar la fosforilación oxidativa de ADP disminuye la eficiencia de síntesis de ATP. Oxígeno y TRMP + electrodos sensibles con sustratos mitocondriales e inhibidores de la cadena de transporte de electrones se utilizan para medir el estado 3 y estado 4 respiración, membrana mitocondrial PMF (o el potencial para producir ATP) y fuga de protones. Limitaciones a este método son que el tejido del hígado debe ser tan fresco como sea posible y todas las biopsias y los análisis deben realizarse en menos de 10 h. Esto limita el número de muestras que pueden ser recogidos y procesados por una sola persona en un día a unos 5. Sin embargo, es necesario sólo 1 g de tejido hepático, por lo que en grandes animales, como vacas lecheras, la cantidad de muestra necesaria es pequeña en relación con el tamaño del hígado y hay poco tiempo de recuperación necesario.
Introduction
Las mitocondrias son muy sensibles al estrés y su entorno celular puede contribuir a una amplia variedad de enfermedades metabólicas. Consumo de oxígeno y escape de protones en la mitocondria son indicadores de la salud de las mitocondrias. Los métodos descritos en este documento estimación mitocondrial eficiencia usando RCR basan en el consumo de oxígeno con y sin fuga de protones. Estos resultados pueden representan 30% de la energía perdida en la utilización de nutrientes1. Cambios en la fuga de oxígeno consumo y protón pueden identificar la disfunción mitocondrial que contribuye a la enfermedad metabólica y resultados en eficiencia energética disminuida. Estos métodos pueden utilizarse también para examinar el efecto de diferentes tratamientos sobre la respiración mitocondrial. El objetivo de medir consumo de oxígeno mitocondrial y la cinética de pérdida de protón es evaluar la función mitocondrial y la eficiencia energética.
Disfunción mitocondrial hepática se ha asociado con varias enfermedades en el ganado lechero. La capacidad de metabolismo celular para cambiar entre los combustibles hidratos de carbono y lípidos frente a un déficit de energía en la lactancia temprana está influenciada por el número y función de mitocondrias en la célula2. Defectos en la capacidad de adaptarse a una mayor demanda de energía y aumento de la β-oxidación de las mitocondrias pueden conducir a la acumulación de lípidos intracelulares asociados con resistencia a la insulina y pueden conducir a la formación de hígado graso en vacas primera lactancia. Las mitocondrias, como el sitio de producción del cuerpo de la cetona y el uso, pueden jugar un papel clave en cetosis en vacas lecheras3. La falta de mitocondrias o disfunción mitocondrial afectará la disponibilidad de combustible a la periferia y se refleja en cambios en el consumo de oxígeno o RCR.
Cambios de consumo de oxígeno mitocondrial en respuesta a la inflamación. Pollos de siete días de edad fueron asignados aleatoriamente a un grupo de infectados con Eimeria maxima y un grupo de control4. Pollos que no se someten a desafío de coccidiosis tenían menor consumo de oxígeno debido a la pérdida de protón y RCR superior indicando que las mitocondrias hepáticas responden a un reto inmunológico por creciente fuga de protones. Escape de protones y reactiva producción de especies de oxígeno una vez era considerado un signo de disfunción de la membrana mitocondrial y perjudicial para la eficiencia energética, ahora se sabe que es importante para la importación de proteínas y calcio en la mitocondria5 y para la generación de calor1.
Escape de electrones de la cadena respiratoria hace mitocondrias susceptibles a la producción de especies reactivas del oxígeno y el daño oxidativo a las proteínas de la membrana mitocondrial, lípidos y ADN mitocondrial. Medida que envejecen las mitocondrias, se puede acumular daño especialmente a mtDNA causando más disfunción en el metabolismo mitocondrial6 y una mayor susceptibilidad de la vaca a la enfermedad. En la práctica, muchos animales de ganado son alimentados con altos niveles de suplementos tales como Cu, Zn y Mn para impulsar la función antioxidante. Sin embargo, alimentando altos niveles de Cu, Zn y Mn disminuyeron la producción de leche y mayor consumo de oxígeno debido a la fuga (estado 4 respiración) de protones7.
Investigación previa sobre el papel de la función mitocondrial en la eficiencia energética en el ganado bovino se ha centrado en cambios en el consumo de oxígeno mitocondrial y la fuga de protones. Muy pocos estudios han sido publicados en ganado lechero y mayoría de los papeles compara la eficacia de la producción en la forma de consumo de alimento residual (RFI) para la función mitocondrial en ganado de carne. Variabilidad en la respiración mitocondrial, las tasas fueron examinadas mediante la medición de estado 3 Estado 4 y RCR en hígados de vacas Holstein y de carne lactantes vacas (Angus, Brangus y Hereford)8. Los investigadores no encontraron ninguna correlación en la respiración mitocondrial con crecimiento o rasgos para ganado de ordeño pero presentaron una correlación entre la respiración mitocondrial y ordeño rasgos para vacas Holstein. En dos estudios, RFI se comparó en bovinos para carne (estado 3 Estado 4 y RCR) de las tasas de respiración mitocondrial en músculo mitocondrias9,10. Cambiaron las tasas de respiración mitocondrial en respuesta a DMI y tarifas fueron asociados con novillos de carne de res menos eficientes. En otro estudio, RFI de novillos de toros altas o bajas RFI se compararon con las tasas de respiración mitocondrial y cinética de pérdida de protones entre los dos grupos de progenie11. Las diferencias fueron por aumento confirmando la conclusión de que ganar hace respiración mitocondrial de no impacto en bovinos para carne.
En este papel, un experimento examinar hígado RCR en respuesta a la alimentación de vacas lecheras lactantes 3 minerales antioxidantes ilustra el uso de métodos para medir el consumo de oxígeno durante 4 y estado 3 la respiración y la fuerza motriz protónica.
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Protocol
Todos los métodos, protocolo y estudios descritos aquí fueron aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de California, Davis.
1. obtención de una biopsia del hígado de una vaca lechera Holstein
Nota: Debe realizarse una biopsia del hígado por un veterinario con licencia. Las biopsias del hígado se pueden realizar en el sitio de lácteo donde se encuentran las vacas. Las vacas lecheras lactantes pueden continuar normalmente ordeñar y leche no necesita ser retirado de la fuente de alimentación antes o después del procedimiento. Se recomienda que al menos 4 personas se necesitan para realizar la biopsia del hígado en una vaca lechera: un veterinario para realizar la biopsia, un controlador de animales en la cadera de la vaca para proteger el área de la biopsia y veterinario, técnico de laboratorio en el exterior de la pluma para transf ER herramientas, materiales de biopsia muestra desde el veterinario y y mantener el área limpia, que puede ser en la parte trasera de un vehículo (figura 1) y un técnico para recuperar la muestra de hígado y comenzar Aislamiento mitocondrial.
- Un mes antes de las biopsias del hígado, dan las vacas una vacunación de clostridia. Crear paquetes quirúrgicos por toallas quirúrgicas de esterilización en autoclave, instrumento de biopsia, titulares de bisturí y material quirúrgico.
- Un día antes de la biopsia del hígado, inyectar a la vaca con clorhidrato de Ceftiofur 0,044 mL/kg peso corporal por vía subcutánea en el cuello. Controle la temperatura de la vaca de admisión y puntajes fecales para usar como base para la función normal.
- Crear las mitocondrias aislamiento media (MIM) containining 220 mM el manitol, sacarosa de 70 mM, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA y 0,1% (p/v) BSA libre de ácidos grasos, pH 7,4 a 4 ° C. Se necesitarán aproximadamente 30 mL por muestra.
- Contener la vaca físicamente utilizando un headlock con un halter según sea necesario (figura 2). Uso del cabestro, lazo la cabeza al lado izquierdo de la barra. Si es necesario, una restricción química (IV de 100 mg/mL de clorhidrato de xilacina en 0.010-0.015 mg/kg de peso) puede ser utilizado.
- El área de la biopsia se encuentra en el espacio intercostal derecho 10 - 11 (figura 3). Trazar una línea recta desde las caderas del tubérculo derecho hasta el punto del hombro derecho. El sitio de la biopsia es donde esta recta corta con el espacio intercostal 10 y 11. Esterilizar el área de la vaca para tomar la biopsia por afeitado un área cuadrada de 10 cm (figura 4). Lave el área con 10% providone matorrales (figura 5) con un movimiento circular. Rocíe el área con solución de etanol 70% (figura 6). Repetir los lavados providone y etanol.
Nota: El hígado está en una posición ligeramente diferente en el ganado de lechero Holstein en comparación con el ganado de carne. - Se inyectan 2% lidocaína HCl (10-15 mL) localmente la zona para proporcionar anestesia de la piel y subyacente tejido muscular y conjuntivo (figura 7). Repita providone y lavados de etanol 70%.
Nota: Las terminaciones nerviosas están en la piel y músculo, pero no vísceras, por lo que sólo un local anesthestic es necesaria. En la mayoría, la vaca debe sólo sentir algo de presión y sin dolor durante el procedimiento de biopsia. - Hacer una incisión de stab 1-2 cm a través de la piel del espacio intercostal 10 y 11 (figura 8). Pasar un instrumento de biopsia del hígado bovino Schackelford Courtney a través de la piel y dirigir el instrumento para biopsia en una dirección craneal leve mientras continúa a través del diafragma y en el hígado (figura 9, figura 10). Obtener una muestra de 1 g del hígado y retire el instrumento (figura 11). Cierre la piel con la colocación de sutura (figura 12).
- Colocar hígado muestra en un tubo cónico con suficiente MIM para cubrir la muestra, en el hielo para el aislamiento de las mitocondrias inmediata
- Incisión de verificación para cualquier enrojecimiento, hinchazón, calor, o dolor dentro de las 24 horas de la biopsia e inyectar a la vaca con clorhidrato de Ceftiofur 0,044 mL/kg peso corporal por vía subcutánea en el cuello una vez al día durante los próximos 3 días (figura 13). Monitorear temperatura de admisión y partituras fecales de la vaca diariamente durante 1 semana después de la biopsia del hígado. Si desarrolla fiebre, continuar antibióticos a criterio del veterinario.
Nota: Si una vaca exhibe signos de dolor, como patadas en el sitio de la incisión, recumbancy, enrojecimiento, calor o reacción al tacto dentro de 1 h después de la biopsia del hígado, una inyección de IV de 1 mg/kg peso corporal de meglumina de Flunixina se puede utilizar para aliviar el dolor y la inflamación. Si es necesario se puede administrar una segunda inyección. - Retire las suturas 7 días después de la biopsia.
2. aislamiento de mitocondrias de hígado de vaca lechera
- Tan pronto como sea posible luego de la muestra de hígado de la vaca, lavar la muestra de hígado en MIM (paso 1.3) para eliminar las células de sangre rojas y picar finamente la muestra con tijeras. El hígado debe ser picado en un vaso frío con suficiente medios de aislamiento para mantener el tejido húmedo.
- Coloque el hígado picado en un frasco de vidrio de 30 mL con un pistilo de teflón de 0,16 mm de espacio se incubó en hielo y que contiene MIM (1:4 p/v).
- Homogeneizar la muestra de hígado en Maja de teflon en 500 rpm por un minuto con 4 golpes/min.
Nota: El hígado homogeneizado se conserva en un vaso lleno de hielo en el MIM durante todo el proceso, y todos los siguientes pasos de centrifugación se completan a 4 ° C - Centrifugar el homogeneizado a 500 x g por 10 min, descartar de la pelotilla, transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga refrigerada y luego centrifugar el sobrenadante resultante a 10.000 x g por 10 min obtener el pellet mitocondrial.
- Suspender y lavar el precipitado en 10 mL de MIM con BSA libre de ácidos grasos y centrifugue a 8100 x g durante 10 min descartar sobrenadante.
- Suspender y lavar el precipitado en 10 mL de MIM sin BSA libre de ácidos grasos y centrifugue a 8100 x g durante 10 min descartar sobrenadante.
- Suspender el pellet en 200 μL de medio de aislamiento y coloque en hielo hasta su uso para el consumo de oxígeno y protones fuga ensayos cinéticos.
- Determinar la concentración de la proteína, de la suspensión de la pelotilla (dilución 1/100), con kit de (BCA) ácido Bicinchoninic según el protocolo del fabricante BSA como estándar. Toda proteína se considera proteína mitocondrial.
3. medir el consumo de oxígeno mitocondrial (estado 3 y estado 4)
- Crear medios de consumo de oxígeno (OCM) de 120 mM KCl, 5 m m KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes y 1 mM EGTA, pH 7.4 a 30 ° C con 0.3% desengrasada BSA. Se necesitarán aproximadamente 3 mL por muestra. También prepare una solución de 8 oligomycin μg/mL en etanol.
- OCM de incubar a 30 ° C. Configurar electrodo cámara, bomba y oxígeno de la respiración según las instrucciones del fabricante (sistema oxygraph). El software oxygraph ya debería estar instalado en el equipo.
- Coloque 1 mL de la OCM en la cámara de respiración y agitar vigorosamente. Esto ayudará a asegurar que la solución se satura con el aire.
- Añadir 0,35 mg de proteína de proteína mitocondrial a la cámara de respiración y mantener la temperatura a 30 ° C.
- Registrar el consumo de oxígeno durante aproximadamente 5 minutos. La concentración de oxígeno de los registros de sistema de oxygraph, así como aumentos de la respiración, la concentración de oxígeno disminuye. Cuando el consumo de oxígeno se vuelve constante (una línea recta decreciente), consumo de oxígeno registro (pendiente de línea = concentración de oxígeno/hora). Se trata de consumo de oxígeno basal.
- Añadir 1.25 μl de solución de rotenona de 4 mM para inhibir el complejo I y luego añadir 5 μl de solución de succinato de 1 M para alcanzar una concentración final en la cámara respiratoria del succinato de 5 mM. Esto es estado 4 respiración.
- Añadir 1 μl de solución de ADP 100 mM para alcanzar una concentración final en la cámara de respiración de 100 μM. Disminuirá la concentración de oxígeno (respiración aumentada) y luego después de unos 5 min se convierte en una línea recta. Registrar el consumo de oxígeno (pendiente de línea = concentración de oxígeno/hora). Esto es la respiración de estado 3.
- Opcional: Al final de la carrera, añadir FCCP (volumen total de 0,2 μM) para inducir la respiración máxima. Registrar la respiración durante unos 5 minutos (aproximadamente). Cuando el consumo de oxígeno se convierte en consumo de oxígeno constantes, de registro. Se trata de consumo de oxígeno máximo.
- Calcular el Ratio de Control respiratorio (RCR) usando la ecuación de consumo de oxígeno del estado 3 / 4 consumo de oxígeno del estado.
- Aspirar todas las soluciones de la cámara de respiración. Enjuague la cámara varias veces con agua desionizada.
4. medición de potencial de membrana mitocondrial (MMP) y la fuerza motriz protónica (FMP)
- Preparar solución de 80 nigericin ng/mL en etanol.
Nota: Estos productos químicos se disuelven en etanol, y debe hacer todo lo posible para limitar la cantidad de etanol que se agrega a menos de 1 μL, ya que el etanol puede desacoplar el sistema de transporte de electrones y causar la disfunción mitchondrial. - Después de enjuagar bien la cámara con agua desionizada, coloque 1 mL de la OCM en la cámara de respiración y agite vigorosamente con una barra de agitación magnética. Esto ayudará a asegurar que la solución se satura con el aire. Añadir el electrodo metil-trifenil fosfonio (TPMP +) sensible para configuración de cámara. TPMP + electrodos deben ser conectados a un medidor de pH y valores se leen desde el medidor de pH.
- Añadir 0,35 mg de proteína mitocondrial a la cámara de respiración.
- Añadir 1.25 μl de solución de rotenona de 4 mM para inhibir la respiración complejo registro de I. 2-5 minutos (aproximadamente). Cuando el consumo de oxígeno se convierte en consumo de oxígeno constantes, de registro.
- Agregar 0.56 μL de solución de oligomycin de 8 μg/mL a una concentración final de 2,8 μg oligomycin 0,35 mg de proteína mitocondrial para inhibir la utilización de ADP. Registrar la respiración 2-5 minutos (aproximadamente). Cuando el consumo de oxígeno se convierte en consumo de oxígeno constantes, de registro.
- Añadir 0.112 μL solución de nigericin de 80 ng/mL para abolir el gradiente de pH a través de la membrana interna mitocondrial. Registrar la respiración 2-5 minutos (aproximadamente). Cuando el consumo de oxígeno se convierte en consumo de oxígeno constantes, de registro.
Nota: Rotenona y oligomycin se utilizan para bloquear el transporte de electrones de la cadena en el complejo I y ATP sintasa, respectivamente. Nigericin se añade para convertir el gradiente de H + transmembrana a un gradiente de K + que puede ser medido con un electrodo. - Preparar una curva estándar para TPMP + añadir 5 μl de solución TPMP + 10 mM para la incubación mitocondrial. Repita este paso cuatro veces más hasta una concentración total de 2,5 μM TPMP + se ha añadido.
- Añadir 5 μL de succinato de 1M a la cámara para iniciar la respiración.
- Registrar la respiración hasta que haya obtenido una traza estable, y luego valorar el sistema mediante la adición de malonato. Adiciones de malonato deben ser 0,5 μl, 1 μl, 1,5 μl, 3.0 μL, μl 6.0, 9.0 μL, luego 12.5 μl de 0,1 mM solución malonato para lograr sucesivas adiciones de malonato de concentraciones en la cámara de incubación de 0.1, 0.2, 0.3, 0.6, 1.2, 1.8 y 2.5 mM.
- Recopilar datos de los dos electrodos (oxígeno y TPMP+). Software de adquisición de datos desde el sistema de oxygraph puede utilizarse para recoger mediciones simultáneas de consumo de oxígeno mitocondrial y potencial de membrana mitocondrial y observar los cambios en el consumo de oxígeno en tiempo real. Figura 14 muestra cómo el sistema de oxygraph registra el consumo de oxígeno medida que avanza el experimento.
- Calcular MMP en mV basado en la ecuación de Nernst:
MMP = 61.5 log ([TPMP +] añadido – externo [TPMP +]) corrección de enlace x TPMP+ / (x 0.001 mg de proteína/mL x [TPMP +])
Se utiliza una corrección TPMP + enlace de 0.4 μl/mg de proteína mitocondrial-1 .
Ejemplo cálculo basado en las concentraciones en el protocolo:
MMP = 61.5 x log (5 μm-μm 2) x 0.4 / (0,001 x 0.35 mg proteína/mL mitocondrial x 2 μm)
MMP = 198,9 mV - PMF de estimación mediante el trazado de un gráfico de MMP vs el consumo de oxígeno (figura 15). PMF se divulga como consumo de oxígeno en un potencial de membrana de 165 mV.
Nota: Valorar la cadena de transporte de electrones con malonato (0.1 a 2.5 mM) muestra la respuesta cinética de pérdida de protón a MMP. Entonces, conspirar MMP contra el consumo de oxígeno determina la cinética de pérdida de protón. PMF se determina calculando el consumo de oxígeno en un potencial de membrana comun (165 mV). - Al final de la última serie de la muestra, añadir FCCP (volumen total de 0,2 μM) para inducir la respiración máxima y liberar TPMP + corrección de línea base.
- Aspirar todas las soluciones de la cámara de respiración. Enjuague la cámara varias veces con agua desionizada. Al final del día, la cámara debería también ser enjuagada varias veces con etanol.
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Representative Results
Resultados positivos que muestran cinética de escape RCR y protón se muestran en la tabla 1 y la figura 15, respectivamente. En este estudio7, RCR y proteína fuga cinética se midieron en vacas lecheras Holstein en 70 días en leche después de que las vacas habían sido alimentadas con 1 de 5 diferentes niveles de Cu, Zn y Mn durante 28 días. Estado 4, respiración dependiente de la fuga de protones máximo, tenía una tendencia a ser afectada por la ingesta de minerales de Cu, Mn y Zn (p < 0.1). Estado 3 respiración (máximo ATP estimula la respiración) y RCR = estado 3 / 4 Estado (relación de control respiratorio) no fue afectada por la ingesta de minerales. Estado 4 la respiración fue más alta en LowMn y más bajos de Control, indicando que Mn juega un papel importante en minimizar la respiración dependiente de la pérdida de protones. Manganeso, a través de la enzima superóxido dismutasa de manganeso se sabe para reducir especies reactivas de oxígeno en la matriz mitocondrial y de la fuga de protones12. Mayor respiración del estado 4 se asoció con menor leche y producción de proteína de leche. Puesto que la pérdida de protón es un componente importante de la eficiencia energética, reducción del estado 4 respiración a través de la suplementación de manganeso podría mejorar la eficiencia.
| Tratamientos1 | ||||||
| Alta | Med | Bajo | LowMn | Control | SEM | |
| Leche, kg | 47,4ab | 50,9un | 46.0ab | 43,6b | 49,7un | 2.9 |
| Proteína de la leche, kg | 1.38ab | 1.44una | 1.40ab | 1.23b | 1.43una | 0.09 |
| Estado 3 | 75,8 | 64.4 | 78.2 | 73 | 64.1 | 13 |
| Estado 4 | 26.2ab | 22,6ab | 25,9ab | 27.1un | 22.0b | 3 |
| RCR | 2.89 | 2.76 | 2.98 | 2.65 | 2.83 | 0.27 |
| a b Medios dentro de una fila no siguió por la misma letra superíndice son significativamente diferentes (P < 0.1). | ||||||
| 1 tratamiento alta contiene niveles más altos de Cu, Zn y Mn todo muy por encima de requisitos13, tratamiento Med contiene niveles intermedios de Cu, Zn y Mn sobre requisitos, bajo tratamiento contiene niveles bajos de Cu, Zn y Mn pero aún por encima requisitos, tratamiento bajo Mn contiene los niveles más bajos de Mn (y niveles bajos de Cu y Zn), pero aún por encima de los requisitos y Control de tratamiento contiene los niveles más bajos de Cu y Zn, que son cerca de los requisitos. | ||||||
Tabla 1: efecto de Cu, Mn y Zn la suplementación de oxígeno mitocondrial hepática consumo y producción de leche de las vacas lecheras a los 70 días en leche. Esta tabla ha sido adaptada de Acetoze et al. 20177.
Escape de protones mitocondrial es un proceso que disipa MMP a través del movimiento de protones a través de la membrana interna mitocondrial sin la producción de ATP14. Cinética de pérdida de protón se evaluó mediante el cálculo de las tasas de consumo de oxígeno en un potencial de membrana comunes de 165 mV. Un potencial de membrana más baja significa que los protones son 'escaparse' a través de la membrana mitocondrial, que se traduce en menor síntesis de ATP (figura 15). En el estudio de vaca Holstein, respiración dependiente de fuga de protones hepática fue mayor en LowMn y más bajos de Control, lo que concuerda con resultados en la tabla 1, que la respiración del estado 4 fue mayor en LowMn y bajo control.
Figura 15. Cinética de pérdida de protón en vacas Holstein alimentadas con diferentes cantidades de Cu, Mn y Zn. Este gráfico se basa en datos de Acetoze et al. 20177. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Resultados negativos se ilustran en la tabla 2 y figura 16. Eficacia de la alimentación (RFI) fue mayor en novillos Angus de toros RFI bajo que alto toros RFI, pero esto no se reflejó en RCR mitocondrial (tabla 2) o cinética de pérdida de protones (figura 16). No hubo diferencias en la respiración mitocondrial y la cinética de pérdida de protón entre grupos de novillos, pero había una diferencia en RFI. También hubo diferencias (p = 0,88) de protones mitocondrial hepática fuga en alta y baja novillos RFI (figura 16). Había grandes errores estándar asociados con las mediciones de la respiración mitocondrial, y las curvas cinéticas de protones fuga planas. Se obtuvieron muestras de hígado de este estudio después de bueyes fueron sacrificados, un proceso que retrasa la recolección de muestras de hígado y procesado en una hora. Variación en las medidas de la respiración mitocondrial puede reflejar la degradación de la respiración mitocondrial debido a la muerte del tejido. Líneas cinéticas de fuga de protones eran planas porque las mediciones de consumo de oxígeno no comenzó hasta 8 minutos cuando ya había llegada a meseta debido a un mal funcionamiento del equipo.
| RFI bajo | Alto RFI | SEM | Valor de P | |
| (n = 7) | (n = 8) | |||
| RFI | -0.58 | -0.01 | 0.1 | 0.05 |
| Estado 3 | 31.3 | 30.8 | 9.42 | 0,9 |
| Estado 4 | 9.76 | 10.4 | 3.23 | 0,8 |
| RCR | 3.05 | 3.03 | 0.24 | 0,93 |
Tabla 2: rendimiento y respiración mitocondrial de alto y bajo consumo de alimento Residual (RFI) Angus Toro progenie. Esta tabla ha sido adaptada de Acetoze et al. 201511.
Figura 16. Cinética de fuga de protones para la progenie de toros Angus de RFI de alta y bajas. Este gráfico ha sido adaptado de Acetoze et al. 201511. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 1: Limpie el área de quirúrgica y biopsia materiales ubicados en la parte trasera de un vehículo y fuera de la pluma de vaca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: restricción de la vaca mediante un cabestro atado a un poste transversal de la cerradura principal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: la zona de la vaca para limpiar por la biopsia y la localización de la biopsia en el espacio intercostal del derecho 10 - 11 encontrado dibujando una línea recta desde las caderas del tubérculo derecho hasta el punto del hombro derecho. El sitio de la biopsia es donde esta recta corta con el espacio intercostal 10 y 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: depilar una zona de 10 cm de la vaca para preparar para esterilizar para la biopsia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: lavar el área de la biopsia de la vaca con 10% providone exfoliante usando un movimiento circular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Rocíe el área de la biopsia con solución de etanol 70%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: inyectar lidocaína al 2% (10-15 mL) de HCl localmente a la zona para proporcionar anestesia de la piel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: una puñalada-incisión de 1-2 cm a través de la piel del espacio intercostal 10-11 insertar herramienta de biopsia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: inserción de instrumento de biopsia del hígado bovino a través de la piel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: el instrumento de biopsia debe ser dirigido en una dirección craneal leve mientras continúa a través del diafragma y en el hígado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11: una muestra de 1 g de hígado ser trasladado desde el instrumento de biopsia al tubo de Falconer para transporte a la estación de aislamiento mitocondrial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 12: sutura de la piel para cerrar la incisión de la biopsia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 13: inyección de la vaca con clorhidrato de Ceftiofur 0,044 mL/kg peso corporal por vía subcutánea en el cuello. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 14: Oxygraph software resultados oxígeno respuestas de consumo a la adición de cada sustancia para medir el potencial de membrana mitocondrial (MMP) y motivo de protones (PMF) de la fuerza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El punto más crítico en el protocolo es obtener una muestra representativa de tejido hepático y empezando el aislamiento de las mitocondrias tan pronto como sea posible después de la biopsia. Variación en las mediciones de la respiración es baja (tabla 1) debido a un tiempo de transporte corto de la vaca a laboratorio. Para reducir el tiempo de transporte, se estableció un pequeño laboratorio en la oficina de la lechería, y las muestras de hígado fueron conducidas al laboratorio de la oficina como cada uno se colectó para que las mitocondrias fueron aisladas dentro de 10 minutos de la biopsia. Configuración y prueba de la cámara de respiración y electrodos (oxígeno, TPMP +) con el medidor de pH utilizado para registramos diferencias de gradientes del protón el día antes de recogida y tratamiento de las muestras pueden evitar disfunciones como la falta medidas tempranas en fuga de protones cinética (figura 16).
Debido a la necesidad de muestras de hígado frescas y rápido aislamiento de las mitocondrias, se limita el número de muestras que pueden ser recogidos y procesados en un día. Cada muestra tiene aproximadamente 5-6 horas para completar; por lo tanto, sólo 5 muestras por día pueden ser recogidas y analizadas por la cámara de respiración. Esto no es un método de alto rendimiento; el tamaño de muestra para los tratamientos es limitado y pequeños errores pueden aumentar la variabilidad asociada a los resultados y la capacidad para detectar la significación.
La técnica de aislamiento puede excluir algunas mitocondrias que están asociados con algunos componentes de la célula y permanecen incrustadas en la pastilla o mitocondrias pequeñas se pueden perder en los lavados de pellets durante los pasos de centrifugación. Esto puede conducir a resultados que no reflejan la población completa de mitocondrias. Mitocondria puede cambiar de tamaño y densidad según Estados fisiológicos como el hambre y ejercicio (entrenamiento)15. Puede ser necesario estimar número mitocondrial con actividad enzimática utilizando citrato sintasa16 o Succinato deshidrogenasa17 para corroborar resultados.
Sin modificaciones a las técnicas originales en roedores para aislamiento mitocondrial18, respiración19 y protón fugas cinética20. Modificaciones a esta técnica se pueden hacer dependiendo de la fuente de tejido de las mitocondrias y los tratamientos experimentales. BSA (desengrasada) se utiliza para enlazar los ácidos grasos libres en el tejido. Si el tejido tiene mucho de ácidos grasos (superior al 10%) asociados con él, más desengrasada BSA se puede Agregar debido a ácidos grasos libres va a interferir con las mediciones mitocondriales.
Medir consumo de oxígeno mitocondrial y la cinética de pérdida de protón usando esta técnica es el procedimiento estándar. Hígado ha sido el tejido de elección principalmente porque tiene una gran cantidad de mitocondrias, son bastante fáciles de extraer y el hígado es el sitio principal de procesamiento de nutrientes. Modificaciones de esta técnica se han utilizado para medir el consumo de oxígeno en otros tejidos como músculo y mamaria. Sin embargo, técnicas de aislamiento mitocondrial deben modificarse para adaptarse a los tejidos. Por ejemplo, en el músculo, las mitocondrias están incrustadas en las fibras musculares y por lo que debe incluir el procedimiento de aislamiento una digestión de proteínas y la digestión deben ser controladas para asegurar que no se altera la función mitocondrial.
Hay otros métodos para la medición de la respiración mitocondrial que requieren un analizador diseñado específicamente para medir la respiración. Las células extraídas de tejido y fija a placas de incubación. La tasa de consumo de oxígeno de analizador medidas células enteras (OCR, basal), ATP ligado OCR (asociado con las mitocondrias) y nonmitochondrial OCR OCR máxima. Sin embargo, puesto que las mitocondrias están inhibidas durante parte de la incubación, las mediciones de las mitocondrias aisladas no son posibles. Este método se ha utilizado para examinar los cambios de OCR con la enfermedad y la droga de intervenciones21 en seres humanos.
Aplicaciones actuales y futuras
La contribución de la pérdida de protón a necesidades energéticas del animal puede ser grande e indican el estado fisiológico del animal, incluyendo el crecimiento, lactancia y enfermedad. En el pasado, esta técnica se ha utilizado principalmente para examinar la Asociación de consumo de oxígeno mitocondrial y la contribución de la fuga de protones para alimentar o eficiencia energética. Sin embargo, conforme se expande nuestro entendimiento del papel de la mitocondria en el metabolismo, la importancia de esta técnica también aumentará sobre todo en combinación con otras medidas mitocondriales como las actividades enzimáticas de la cadena de transporte de electrones, calcio dinámica en la apoptosis y las actividades enzimáticas del ciclo del TCA.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por Alltech y la USDA Portilla fondos a través del centro para alimento Animal Health en UC Davis escuela de medicina veterinaria.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liver Biopsy | |||
| Equipment | |||
| Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Suture | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Suture needles | NA | NA | Included with Suture |
| Scalpels | Sigma - Aldrich | S2896 / S2646 | # for handle and blades |
| Surgery towels | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Falcon tubes 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Tweezers | Sigma - Aldrich | Z168750 | |
| 50 mL syringes | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Injection needles (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Cow halter | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
| Cotton swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| cotton gauze squares (4x4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Medical scissors | Sigma - Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Provided by Veterinarian | ||
| Clostridia Vaccine | Provided by Veterinarian | ||
| Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days | Provided by Veterinarian | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Ethanol 70% | Sigma - Aldrich | 793213 | |
| Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight | Provided by Veterinarian | ||
| 2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Provided by Veterinarian | ||
| 1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine | Provided by Veterinarian | ||
| Isolation of Mitochondria (liver) | |||
| Equipment | |||
| Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Homogenizer Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Homogenizer Probe | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Auto Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Beaker (500 mL) with ice | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Refrigerated microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Microfuge tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma - Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma - Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma - Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (fatty acid free) | Sigma - Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma - Aldrich | M4125-1KG | |
| Deionized water | Sigma - Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA, pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator | |||
| Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
| Equipment | |||
| Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| Thermoregulated Water Pump | ADInstruments | MLE2001 | |
| Clark type Oxygen electrode | NA | NA | |
| Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Included with Oxy1 |
| Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Micropipette (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH meter | VWR | ||
| Chemicals | |||
| KCl | Sigma - Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma - Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma - Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma - Aldrich | E3889-100G | |
| Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
| Rotenone (4 mM solution) | Sigma - Aldrich | R8875-5G | |
| Succinate (1 M solution) | Sigma - Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 mM solution) | Sigma - Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
| Equipment | |||
| TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs | |||
| Malonate (0.1 mM solution) | Sigma - Aldrich | M1296 | |
| Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma - Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma - Aldrich | T200 | |
| TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA |
References
- Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
- Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).
- Bartlett, K., Eaton, S. Mitochondrial B oxidation. European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).
- Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).
- Wallace, D. C., Fan, W. Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics. Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).
- Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging. Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).
- Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc. Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).
- Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle. Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).
- Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers. Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).
- Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle. Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).
- Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls. ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).
- Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. Free Radicals in Biology and Medicine. , Oxford University Press. Oxford. 186-187 (1989).
- National Research Council. Nutrient Requirements of Dairy Cattle. , 7th revised edition, National Academy Press. Washington, DC. (2001).
- Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging. Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).
- Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity: beyond ATP. Nature. 17, 608-620 (2017).
- Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. Biochemical assays of respiratory chain complex activity. Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).
- Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression. Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).
- Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats. British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).
- Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice. PloS One. 3 (3), e1759 (2008).
- Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction. Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).
- Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research. Clinical Science. 127, 367-373 (2014).
