Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Overflade-forstærket resonans Raman spredning Nanoprobe Ratiometry til påvisning af mikroskopiske æggestokkræft via folat Receptor målretning

Published: March 25, 2019 doi: 10.3791/58389
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1,3,4,5,6,7
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Department of Chemistry, The Graduate Center of the City University of New York, 3Molecular Pharmacology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (CMINT), Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 5Gerstner Sloan Kettering Graduate School of Biomedical Sciences, 6Department of Radiology, Weill Cornell Medical College of Cornell University, 7Dana-Farber Cancer Institute and Harvard Medical Center

Summary

Kræft i æggestokkene danner metastaser i hele bughulen. Her præsenterer vi en protokol til at foretage og brug folat-receptor målrettet overflade-forstærket resonans Raman spredning nanoprobes, der afslører disse læsioner med høj specificitet via ratiometric imaging. Nanoprobes er blevet administreret intraperitoneal til levende mus, og de afledte billeder korrelere godt med histologi.

Abstract

Kræft i æggestokkene repræsenterer den dødeligste gynækologisk malignitet. De fleste patienter til stede på et fremskredent stadium (FIGO stadie III eller IV), når lokale metastatisk sprede allerede er indtruffet. Kræft i æggestokkene har imidlertid et entydigt mønster af metastatisk spredning, idet tumor implantater er oprindeligt indeholdt i bughulen. Denne funktion kunne aktivere, i princippet, det komplette resektion af tumor implantater med helbredende hensigt. Mange af disse metastatisk læsioner er mikroskopiske, hvilket gør dem svære at identificere og behandle. Neutralisere sådanne micrometastases menes at være et vigtigt mål mod at fjerne tumor recidiv og opnå langsigtet overlevelse. Raman imaging med overflade forbedret resonans Raman spredning nanoprobes kan bruges til at afgrænse mikroskopiske tumorer med høj følsomhed, på grund af deres lyse og bioorthogonal spektrale signaturer. Her, vi beskrive syntesen af to varianter af sådanne nanoprobes: et antistof-functionalized, der henvender sig til folat receptor — overexpressed i mange ovariecancer — og en ikke-målrettet kontrol nanoprobe, med forskellige spektre. Nanoprobes er co-administreret intraperitoneal til musemodeller af metastatisk menneskelige æggestokkene adenocarcinom. Alle dyreforsøg blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Bughulen i dyr er kirurgisk udsat, vasket og scannet med en Raman microphotospectrometer. Efterfølgende Raman underskrifter fra de to nanoprobes er afkoblet, ved hjælp af en klassisk mindste kvadraters montering algoritme, og deres respektive scores opdelt til at give et ratiometric signal af folat-målrettet over ikke-målrettede sonder. På denne måde, er mikroskopiske metastaser visualiseret med høj specificitet. Den største fordel ved denne tilgang er, at den lokale ansøgning ind i bughulen — som kan gøres praktisk under den kirurgiske procedure – kan mærke tumorer uden at udsætte patienten for systemisk nanopartikel eksponering. Falsk positive signaler, som stammer fra ikke-specifik binding af nanoprobes på visceral overflader kan elimineres ved at følge en ratiometric tilgang, hvor målrettet og ikke-målrettet nanoprobes med særskilte Raman signaturer er anvendt som en blanding. Proceduren, der er i øjeblikket stadig begrænset af manglen på en kommerciel wide-felt Raman imaging kamerasystem, som engang tilgængelige vil give mulighed for anvendelse af denne teknik i teatret drift.

Introduction

Raman imaging med overflade forbedret Raman spredning (SERS) nanopartikler har vist lovende i skildrer læsioner i en række indstillinger og for mange forskellige tumor typer1,2,3,4 . Den største fordel ved SERS nanopartikler er deres fingeraftryk-lignende spektrale signatur, giver dem ubestridelige registrering, der ikke er forvirret af biologiske baggrund signaler5. Derudover intensiteten af det udsendte signal forstærkes yderligere med brug af reporter molekyler (farvestoffer) med absorbans maxima i overensstemmelse med excitation laser, giver anledning til overflade forbedret resonans Raman spredning (SERRS) nanopartikler med endnu større følsomhed6,7,8,9,10,11,12.

En barriere, der skal løses for vedtagelse af SE(R)RS nanopartikler13 og mange andre nanopartikel konstruktioner14,15 til klinisk brug er deres tilstand af administration, som intravenøs injektion forårsager systemisk eksponering af agent, og nødvendiggør omfattende test for at udelukke potentielle skadevirkninger. I denne artikel, vi præsenterer en anden paradigme baseret på anvendelsen af nanopartikler lokalt i vivo, direkte ind i bughulen under operationen, efterfulgt af en vask skridt til at fjerne enhver ubundne nanopartikler1. Denne tilgang er i overensstemmelse med roman terapeutiske tilgange, der er i øjeblikket under efterforskning, der også gør brug af lokale instillation af agenter ind i bughulen, kaldet hyperthermic intraperitoneal kemoterapi (HIPEC). Derfor, selve princippet bør være relativt let at integrere i en klinisk arbejdsproces. Vi har studeret biodistribution af nanopartikler efter intraperitoneal ansøgningen, og har ikke observeret nogen påviselig absorption i systemisk cirkulation1. Derudover omgår lokale ansøgning tilgang binding af nanopartikler af Retikuloendoteliale system, så antallet af nanopartikler kræves reduceres markant. Men, når det påføres topisk, antistof-functionalized nanopartikler tendens til at holde sig på de viscerale overflader selv i mangel af deres mål. For at minimere falske positive signaler på grund af ikke-specifik nanopartikel vedhæftning, forfølger vi en ratiometric tilgang, hvor et molekylært målrettet nanoprobe giver den specifikke signal og en ikke-målrettet kontrol nanoprobe, med forskellige Raman spektrum, regnskaber for ikke-specifikke baggrund16,17. Vi har vist denne metode af topikalt overflade forbedret resonans Raman ratiometric spektroskopi for nylig i en musemodel af diffuse æggestokkræft1.

Det overordnede mål med denne metode er at udvikle to SERRS nanoprobes, en målrettet og en ikke-specifik, skal anvendes lokalt i musemodeller, for at billede prævalens/overekspression af en cancer-relaterede biomarkør ved hjælp af ratiometric påvisning af de to sonder via Raman imaging. I dette arbejde, blev folat receptor (FR) valgt som mål, da dette er en markør upregulated i mange ovariecancer18,19. Raman microimaging med SERS-baserede nanopartikler er også blevet påvist for kræft celle identifikation20. To forskellige "varianter" af Raman nanopartikler er syntetiseret, hver der følger sit fingeraftryk fra en forskellige økologiske farvestof. Nanopartikler består af en stjerne-formet guld kerne omgivet af en silica shell og demonstrere overflade plasmon resonans på ca 710 nm. Raman reporter (økologisk farvestof) deponeres samtidig med dannelsen af silica shell. Endelig til den FR-målrettet nanoprobes (αFR-NPs) er silica shell konjugeret med antistoffer, der henviser til, at de ikke-målrettet nanoprobes (nt-NPs) er passivated med en éncellelag af polyethylenglycol (PEG).

Denne teknik var med held bruges til at knytte mikroskopiske tumorer i mus xenograft model af diffuse metastatisk kræft i æggestokkene (SKOV-3), viser sin anvendelighed til in vivo brug. Det kan også udvides til anvendelse i skåret væv, tumor fænotyper eller margin bestemmelse efter debulking som vist i en beslægtet undersøgelse21.

SERRS nanoprobes skabe en robust platform for oprettelsen af flere målrettede tags for biomarkører, syntetiseret med enkle kemiske reaktioner som skitseret skematisk i figur 1. Vi præsenterer her, protokol for syntesen af de to typer af SERRS nanoprobes (afsnit 1-3), udviklingen af en passende æggestokkræft musemodel (afsnit 4), administration af nanoprobes og billeddannelse (afsnit 5), og endelig dataanalyse og visualisering (afsnit 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Memorial Sloan Kettering Cancer Center (#06-07-011).

1. guld Nanostar kerne syntese

Bemærk: Guld nanostars bruges som kerner til begge varianter af SERRS nanoprobes anvendes i dette eksperiment.

  1. Forberede 800 mL af 60 mM ascorbinsyre (C6H8O6) løsning i ionbyttet (DI) vand og 8 mL af 20 mM tetrachloroauric syre (HAuCl4) løsning i osmosevand. Afkøles til 4 ° C.
  2. Udføre trinnet reaktion ved 4 ° C. Placer en konisk kolbe, som indeholder 800 mL af ascorbinsyre på en magnetisk røre pladen og fremkalde en stabil vortex. Hurtigt tilføje 8 mL af tetrachloroauric syre i vortex. Inden for sekunder, nanostars vil danne og løsningen vil antage en mørk blå farve. I tilfælde af farve til enhver tid bliver pink eller lilla, for dannelsen af nanospheres, suspension skal kasseres og syntesen reattempted.
  3. Hæld nanostar suspension i 50 mL konisk rør, og der centrifugeres i 20 min. (4 ° C, 3,220 x g). Opsug supernatanten forlader omtrentlige 200 µL af opløsningen i hver tube. Betale forsigtighed for ikke at forstyrre pelleten af nanopartikler i bunden af røret.
    Bemærk: Supernatanten bør have en blå farvetone på grund af resterende suspenderet nanostars.
  4. Med en mikropipette, agitere løsningen at suspendere og indsamle nanopartikler fra hver tube. En del af toerstoffet kan komprimeres i bunden af røret og vil ikke resuspend selv med kraftig pipettering-kassér denne del.
  5. Overføre nanopartikel suspension til en dialyse kassette (MWCO 3.5 kDa) og dialyze i mindst tre dage mod 2 L DI vand, skiftende vand hver dag. Store nanostars i dialyse ved 4 ° C i op til en måned med vandskift hver 3-4 dage.
    Bemærk: Nanostars bør holdes i dialyse indtil kræves for silication reaktionen, som beskrevet i afsnit 2.

2. dannelse af Silica Shell

Bemærk: To varianter af Raman nanoprobes er syntetiseret. Syntese proceduren er den samme for begge, med den eneste forskel er Raman reporter molekyle (farvestof) anvendes. I dette eksperiment anvendes IR780 perchlorat og IR140. Reaktionen skal altid udføres i plastbeholdere. Syntesen er meget skalerbar og kan tilpasses til den ønskede mængde af injectate kræves. Her, er en mellemlang batch syntese beskrevet, som kan skaleres lineært til lavere eller højere mængder efter behov med den samme koncentrationer og reaktionstider. Reaktioner for begge SERRS nanoprobe kan udføres parallelt. Være opmærksomme på at undgå krydskontaminering. Sonikering skal udføres for redispersion af nanopartikler pellets efter centrifugering under vask trin, eller efter nanopartikler blev opbevaret i længere tid end en time. Sonikering bør udføres, indtil nanopartikler er klart suspenderet i løsning, typisk for 1 s.

  1. I rør A (en 50 mL konisk slange), Bland 10 mL isopropanol, 500 µL af TEOS, 200 µL med Deioniseret vand, og 60 µL af farvestof (IR780 perchlorat eller IR140, 20 mM i DMF (dimethylformamid)).
  2. I rør B (15 mL konisk tube), mix 3 mL ethanol og 200 µL af ammoniumhydroxid. Der sonikeres nanostars fra trin 1.4 at sprede nogen klynger i løsning og tilsættes 1,2 mL nanostars til røret.
    Bemærk: ammoniumhydroxid løsning er meget flygtige og svære at afpipetteres præcist. Opbevares ved 4 ° C, indtil det skal bruges til at lette pipettering.
  3. Sted rør A på en vortex-mixer og fremkalde en stabil vortex. Hurtigt tilføje indholdet af Tube B til vortex og holde blanding for omkring 5 s. straks overføre til en shaker og lad reagerer for 15 min mens ryste på 300 rpm, ved stuetemperatur.
  4. Efter 15 min inkubation, skal du slukke reaktionen ved at tilføje ethanol til at fylde 50 mL tube. Der centrifugeres i 20 min. ved 3220 x g og 4 ° C.
  5. Opsug supernatanten, forlader omkring 0,5 mL af opløsning, være omhyggelig med ikke at forstyrre pelleten. Der tilsættes 1 mL ethanol og agitere med en pipette til resuspend for nanopartikler. Overførsel til en 1,5 mL centrifugeglas og vaske 4 gange med ethanol ved centrifugering ved 11.000 x g i 4 min, sugning supernatanten og resuspending pellet ved ultralydbehandling for ca 1 s.
    Bemærk: På dette stadium, kan den silicated nanopartikler være functionalized, som beskrevet i punkt 3, eller genopslemmes i Deioniseret vand med en ekstra vask skridt for opbevaring ved 4 ° C i op til en uge.

3. overflade Functionalization

Bemærk: IR780 SERRS nanoprobes vil være konjugeret med folat receptor-targeting antistoffer via en PIND crosslinker til form αFR-NPs; IR140 SERRS kontrol nanoprobes vil være konjugeret med en passiverende PIND éncellelag, for nt-NPs. Begge varianter er dannet via en thiol-maleimide reaktion i separat, men parallel reaktioner.

  1. Vask nanopartikler to gange ved centrifugering ved 11.000 x g i 4 min, sugning supernatanten og resuspending pellet i 1 mL ethanol ved ultralydbehandling. Gentag trinnet vask en gang mere, men redisperse i 1 mL 85% ethanol, 10% 3-MPTMS (3-mercaptopropyltrimethoxysilane) og 5% DI vand. Inkuber ved stuetemperatur i 1-2 timer at indføre dithioler på partikel overflade.
  2. Afvaske den thiol-functionalized nanopartikler ved centrifugering ved 11.000 x g i 4 min. sugning supernatanten og resuspending pellet ved ultralydbehandling, to gange i ethanol, to gange i DI, og endelig i HEPES (4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic syre) buffer (10 mM, pH 7.1), og der er afsat.
    Bemærk: MES (2-(N- morpholino) ethanesulfonic syre) buffer eller HEPES bør anvendes. Buffere med højere saltholdighed, såsom PBS (fosfatbufferet saltopløsning), kan fremkalde nanopartikel sammenlægning.
  3. For antistof functionalized αFR-NPs, reagere 200 µg af antistoffer (anti-folat bindende protein antistof klon [LK26]) med tifold kindtand overskud af PIND crosslinker (poly(ethylene glycol) (N-hydroxysuccinimide 5-pentanoate) ether N′-(3- maleimidopropionyl) aminoethane (CAS: 851040-94-3), i dimethylsulfoxid (DMSO)) i 500 µL af MES buffer (10 mM, pH 7.1) i 30 min.
  4. Fjern overskydende crosslinker og koncentrere antistof ved centrifugering antistof-PIND løsning i en centrifugal filter (MWCO 100 kDa). For centrifugal filtre anvendes i denne undersøgelse, udføre centrifugering i 10 min på 14.000 x g og 23 ° C. Genskab de konjugerede antistoffer i en frisk tube af invertere filteret og centrifugering ved 1.000 x g i 2 min.
  5. Med pipette udtages IR780 nanopartikler fra trin 3.2 ind i røret med antistoffer og agitere med pipette til at blande. Inkuber blanding for mindst 30 min. ved stuetemperatur, eller alternativt ved 4 ° C natten til form αFR-NPs.
  6. At danne nt-NPs, tilføje 1% w/v methoxy-afsluttet (m) PEG5000-maleimide (CAS: 99126-64-4) opløst i DMSO til IR140 SERRS nanopartikler fra trin 3.2 og lad reagerer i 500 µL MES buffer (10 mM, pH 7.1) i mindst 30 min. ved stuetemperatur, eller alternativt ved 4 ° C overnatning.
  7. For administrationen at mus (afsnit 5), spin ned begge nanoprobe varianter på 11.000 x g i 4 min., Aspirér supernatanten for at fjerne løsning med gratis ureageret antistoffer/PIND og redisperse hver smag i MES buffer (10 mM, pH 7.1) på 600 pM koncentration . Når resuspending af nanopartikler, minimere unødvendige eksponering for ultralyd til at forhindre denaturering af antistoffet.

4. mus modeludvikling

  1. Etablere en stabil kultur af human æggestokkene adenocarcinom (SKOV-3) cellelinie. Valgfrit, hvis du vil aktivere overvågning via bioluminescens/fluorescens, bruge transfekteret SKOV-3 Luc+/GFP+ celler. Kultur celler i RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium med 10% føtalt kalveserum og passage to gange om ugen. Inkuber celler med 0,25% trypsin/0.05% EDTA i 3 min. til at frigøre, og efterfølgende vask og resuspend i PBS på 2 x 106 celler/100 µL til injektion.
  2. For at etablere æggestokkene micrometastasis model, tilføre 200 µL af suspenderede SKOV-3 celler intraperitoneal athymiske hunmus (FOXn1nu/FOXn1nu mus, 6-8 uger gamle). Formidlet peritoneal spredning vil forekomme i ca. 4 uger. Hvis du bruger SKOV-3 Luc+ celler, kan tumorvækst overvåges med bioluminescens af administration af 2 mg af bille luciferin i 50 µL PBS via retroorbital injektion.

5. Nanoprobe injektion og billedbehandling

  1. Forberede nanoprobes (αFR-NPs og nt-NPs) som beskrevet i afsnit 1-3 og blandes i forholdet 1:1 for en endelig koncentration på 300 pM af hver type i MES buffer (10 mM, pH 7.1). Eventuelt forberede referenceopløsninger af 30 pM af hver af nanoprobe smag i lille (100 µL) koniske rør.
  2. Injicere intraperitoneal 1 mL af nanopartikel suspension i hvert mus og forsigtigt massere maven for at distribuere nanopartikler i bughulen. Returnere musen til sin bolig. Efter 25 eller flere minutter, aflive mus via CO2 kvælning.
  3. Fastgør musen på en kirurgisk platform, i den liggende stilling (for hele underlivet imaging, platform skal være monteres på opretstående mikroskop scenen).
    1. Brug savtakket pincet og dissektion saks, fjerne hud for at afsløre bughinden og udføre en stor sagittal indsnit (mellem 2 og 3 cm i længden) for at udsætte hele underlivet. Vedhæfte de peritoneale klap på platformen. Vask inde i bughulen med mindst 60 mL PBS ved hjælp af en plastik sprøjte flaske.
      Bemærk: For at aktivere uhindret billeddannelse af hele maven, skal tarmene være mobiliserede eller skåret ud. For excision, resect med en ligatur af den mesenteriallymfeknuderne skibe for at mindske blødning i bughulen.
    2. Alternativt billede specifikke organer, punktafgifter dem efter PBS vask og placere dem på et objektglas.
  4. Overføre platform eller dias til en Raman microspectrophotometer med oprejst optiske konfiguration og en motoriseret scenen for billeddannelse; Brug en kommerciel system med en 300 mW 785 nm diodelaser, med en rist af 1.200 fordybninger pr. mm, centreret på 1.115 cm-1.
    1. Fokus på området af interesse ved hjælp af hvide lys optik, parfokale med Raman laser. Vælg område til afbildning og den ønskede opløsning; i denne betænkning en højhastigheds erhvervelse mode blev brugt (spectra erhvervet under kontinuerlig laser belysning med mikroskop scenen konstant bevægelse, med effektiv rumlige opløsning 14.2 µm af 200 µm; på 5 x forstørrelse, 100 mW strøm på mål, og < 100 ms eksponering pr. punkt).
      Bemærk: Rør med reference nanoprobes fra trin 5.1 kan placeres inden for området afbildet, hvis det ønskes, at give intern referencestandarder for den efterfølgende analyse. Kontroller, at ingen uvedkommende lys kilder end laser nå målet.
  5. Eventuelt forberede prøven for histologiske behandling og validering af fiksering i 4% PARAFORMALDEHYD i PBS natten over ved 4 ° C. Skyl med PBS ved 4 ° C i 15 min. mindst to gange. Hold prøven i 70% ethanol i vand indtil standard histologiske forarbejdning og paraffin indlejring. For histologiske validering af tumorer, kan sektioner (5 µm tykt) fra forskellige dybder af paraffin blok farves med hæmatoxylin og eosin (H & E).

6. databehandling og visualisering

Bemærk: Alle databehandling blev udført med en anskuelighed brugergrænseflade udviklet in-house, ved hjælp af kommerciel software. Alle funktioner bruges har generisk tilsvarende fås i andre computermiljøer.

  1. Få reference spektra for de to varianter af spørgekriterierne ren suspensioner af hver. Reference spektre kan være afledt fra punkt scanninger af nanoprobes, imaging af nanoprobes i well-plader, eller ved at inddrage interne referencer i de eksperimentelle scanninger i reference rør (Se trin 5.1).
  2. Forbehandle reference spektre, ved hjælp af baseline subtraktion (Whittaker filter, λ = 200), normalisering af arealet under kurven og Savitzky-Golay afledte filter (andengrads polynomium passer, første-ordens afledte, bredde = 15 trin). Disse forhåndsbehandlede spectra vil tjene som referencer for klassisk mindste kvadraters (CLS) model.
  3. Forbehandle eksempeldataene fra billedet på samme måde som reference spektre. Få CLS scores for hver prøve ved hjælp af en tilgængelig CLS algoritme. De direkte CLS (Dataforbindelser) scorer er simpelthen koordinater fremspringets størrelse for en stikprøve spektrum til den lineære område defineres af den generaliserede inverse matrix (Moore-Penrose inverse) reference Spectra. Andre montering algoritmer kan være brugt (ikke-negative mindste kvadraters, delvis mindste kvadraters eller andre).
    Bemærk: Nogle montering algoritmer kan give anledning til negative vurdering, som i denne sammenhæng ikke er fysisk. Hvis dette er tilfældet, en tærskel kunne indstilles til at udelukke negative noder eller en begrænset ikke-negative mindste kvadraters algoritmen være ansat i stedet.
  4. Beregn pointwise forholdet mellem noder på referencen for den målrettede nanopartikler (scorerαFR) over scorer på referencen for den ikke-øremærket nanopartikler (Scoresnt). Hvis scorer er ikke-negative, kan forholdet udtrykkes i en logaritmisk mode:
    R = log10(noderαFR/ Scoresnt).
    Forholdet R vises bedst i en divergerende farveskala centreret på nul, for at udtrykke den relative forekomst af sonder i størrelsesordener. Den resulterende billede kan overlejres på hvide lys billedet af prøven, til at afsløre områder af folat receptor overekspression.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For kvalitetskontrollen, kan at nanopartikler karakteriseres ved hjælp af en række metoder under syntese processen, herunder TEM, DLS, nanopartikel tracking analyse og UV/Vis absorbans spektroskopi, som vist i figur 2.

På denne måde, størrelsen af guld nanostar core (beskrevet i afsnit 1), dannelsen af silica shell (afsnit 2) og efterfølgende overflade functionalization (afsnit 3) kan være kontrolleret (figur 2). Typisk, guld nanostar core størrelse (hydrodynamiske diameter) forventes at være omkring 80 nm og silica shell er omkring 20 nm tykke, hvilket gør den samlede silicated nanopartikel størrelse omkring 120 nm og omkring 140 nm efter konjugering med αFR-antistof. UV/Vis absorbans kan også bruges til at kontrollere morfologi af nanopartikler. Nanostar kerner i vand har typisk en absorbans maksimum på 670 nm, mens efter silication maksimalt skifter til omkring 710 nm. Absorbansen maksima på lavere bølgelængder er et tegn på enten kugleformet morfologi eller sammenlægning. Typiske reaktion udbytter og koncentrationer er vist i tabel 1 og afhængige stærkt pipettering teknik under vask trin.

Hvert punkt fremstillet af Raman scanning indeholder et spektrum for en afhørt placering. Disse spectra er en lineær superposition af nanoprobes' SERRS signal og enhver baggrund fluorescens. Spektre kan behandles for at fjerne fluorescens og normaliseret til arealenhed at kompensere for signalstyrke, før den CLS model (beskrevet i afsnit 6), som vist i figur 3. Repræsentative billeder til score på hvert af nanoprobe reference spektra og deres pointwise forholdet er vist i figur 4. Selv om hver score individuelt ikke giver specifikke lokalisering af tumorer, afslører forholdet tilstedeværelsen af dissemineret mikroskopiske spredning.

Trin Oprindelige volumen Begyndelseskoncentration Endelige volumen Endelig koncentration
1. Nanostar kerne 8 mL HAuCl4 20 mM HAuCl4 5 mL 1.3 nM
2. Silication 1,2 mL 1.3 nM 1,2 mL 0,5 nM
3.1. Thiolation 1 mL 0,5 nM 1 mL 0,43 nM
3.5. konjugation 1 mL 0,43 nM 1 mL 0,39 nM

Tabel 1: nanopartikel udbytte efter hver reaktion trin. Koncentrationerne er omtrentlige. Udbyttet blev fastsat ved nanopartikel tracking analyse, med to uafhængige synteser og 5 uafhængige målinger fra hver.

Figure 1
Figur 1 : Skematisk syntese og anvendelse af ratiometric SERRS nanoprobe imaging. (1) guld nanostars er syntetiseret som beskrevet i afsnit 1. (2) en silica shell er dannet omkring guld nanostar kerner og Raman reporter molekyler (infrarød farvestoffer IR-780 perchlorat og IR-140) bruges til at oprette to særskilte nanopartikel varianter, som beskrevet i afsnit 2. (3) på overfladen af nanopartikler er belagt med dithioler, som beskrevet i afsnit 3.1, at give yderligere overflade functionalization. IR-780 smag nanopartikler er konjugeret med et anti-folat Receptor antistof, mens IR-140 dem er passivated med et lag af PEG - 5 k som beskrevet i afsnit 3.3 til 3.6. (4) en musemodel af diffuse intraperitoneal æggestokkene metastatisk spredning er udviklet som beskrevet i afsnit 4, og når du er klar, SERRS nanoprobes administreres intraperitoneal. (5) mus er aflivet, og maven kirurgisk udsat for at aktivere Raman imaging som beskrevet i afsnit 5. (6) Raman spectra analyseres pointwise for at bestemme den relative forekomst af de to sonder og generere en ratiometric kort af folat receptor overekspression som beskrevet i afsnit 6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Fysiske karakterisering af SERRS nanoprobes. Nanopartikler kan underkastes kvalitetskontrol efter hver del af syntesen. Transmissions elektronmikroskopi (TEM) afslører form af guld kernen og vellykket dannelsen af silica shell uden nanopartikler sammenlægning; Skalalinjen = 100 nm. Dynamisk lysspredning (DLS) kan måle størrelsen og ζ-potentiale af nanopartikler til at kontrollere succes silication og functionalization. UV/Vis absorbans kan bruges til at bekræfte tilstedeværelsen af en plasmonic peak omkring 670 nm for nanostars, Vindretning 710 nm efter silication. Raman målinger afsløre tilstedeværelsen af de unikke spektre af hver smag i hele syntesen. Intensiteten af nanostar spektrum, med ingen karakteristiske toppe, blev forstærket af 100 x for vægt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Forarbejdning af Raman spektre. Rå spectra består af nanoprobes' SERRS signatur, overlejret på toppen af en bred fluorescens band. Med baseline subtraktion fluorescens band er fjernet, og Raman toppe bliver fremtrædende. For at afsløre den spektrale underskrift af nanopartikler uanset intensitet, er hvert spektrum (referencer og prøver både) normaliseret til arealenhed. Endelig anvendes en gulvafslibning-afledte filteret for at øge Raman toppe, samtidig reducere støj. De forarbejdede reference spektre er brugt til at udvikle en CLS model, for at klassificere de forarbejdede prøve spektre baseret på forholdet R. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Ratiometric billeddannelse af kræft i æggestokkene micrometastases i maven. Raman imaging af udsatte maven af en mus, featuring omfattende æggestokkene metastaser, som afsløres af bioluminescens billeddannelse. Hvert punkt af scanningen har et spektrum, der er forarbejdet (afsnit 6, figur 3) og scorede baseret på en CLS model at opnå scores på de to referencer: αFR-NP vist i rød og nt-NP i blå. Score er derefter opdelt pointwise, for at afsløre den relative forekomst af de to sonder som en ratio. Eventuelt af tærskel forholdet, de "positive" områder kan være overlejret på et optisk billede af maven, tillade resektion eller anden fokuseret behandlinger. Figur 4 er en tilpasset version af reference1, med tilladelse fra kladden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet her giver instruktion for syntesen af to "varianter" af SERRS nanoprobes, og deres beskæftigelse i mus for Raman imaging af æggestokkene tumor overekspression folat Receptor, bruger en ratiometric algoritme. Den største fordel af Raman imaging over andre optiske billeddannelse teknikker (såsom fluorescens) er det nanoprobe signal, som ikke kan blive forvirret med alle signaler af biologisk oprindelse høj specificitet. I dette legemliggørelse af Raman imaging, er nanopartikler ikke administreres intravenøst, men lokalt, via en intraperitoneal injektion, efterfulgt af en enkelt vask trin. Denne metode, når oversat til den kliniske arena, ville repræsentere en elegant løsning til aktiverer kirurger til at visualisere og derfor resect alle kræft i æggestokkene implantater, selv dem der er for lille til at registrere med det blotte øje, og som ikke kan rettes med en systemisk injiceres imaging agent på grund af deres manglende fodring fartøjer forbundet med systemisk cirkulation. På samme tid, som vores SERRS nanopartikler ikke huller i systemisk cirkulation, er potentielle bekymringer for bivirkninger minimeret. Vores undersøgelse er ét eksempel på den voksende beviser for, at omhyggeligt designet nanoconstructs kan levere enestående fordele i forhold til konventionelle imaging og terapi teknologier22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35,36,37,38.

SERRS nanoprobes beskrevet her er biologisk inaktivt og har været ansat i tumor afgrænsning i musemodeller af flere kræft typer. Reaktionen for dannelse af silica shell (samtidige med reporter farvestof indkapsling) er en forbedret version af vores tidligere rapporteret syntese1,7,8, som er mindre tilbøjelige til at nanopartikel sammenlægning og dannelsen af "gratis silica" nanopartikler (uden guld kerne). Reaktionen kan bruges med en bred vifte af kommercielt tilgængelige infrarød organiske farvestoffer, ud over dem, der præsenteres her, for at give en stor samling af Raman varianter. Den resulterende signal intensitet, men afhænger af dye's affinitet til guld og andre faktorer. Derudover bør farvestof føjes til reaktionen fastsættes på grundlag af per farvestof, som visse molekyler og deres counterions forårsage sammenlægning af den guld nanostars mere end andre. I tilfælde af alvorlige nanopartikel opgørelse, bør mængden af farvestoffet anvendes være nedsat. Sammenlægning af guld-kerner er uønsket, da det kan forårsage alvorlige variabilitet i Raman signal intensitet og komplicere de indsamlede data. Dannelsen af frie silica er for det meste uskadelige, da det giver ingen Raman signal. Dog under functionalization vil antistoffer overholde silica nanopartikler, faldende samlede målretning effektiviteten af metoden. Tykkelsen af silica shell afhænger reaktionstid, temperatur og mængden vand tilsat (trin 2.1). Hvis den resulterende silica shell anses for tynd (figur 1, øverst til højre), kan en eller flere af disse parametre forøges passende.

Med hensyn til dataopsamling afhænger dens kvalitet stærkt lysstyrken af nanoprobes. Dette bliver særligt tydelig, når du udfører hurtig Raman erhvervelse, som beskrevet i afsnit 5. For at sikre, at dataene er tilstrækkeligt synlig fra støjen, der skal inspiceres spektre, og tilstedeværelsen af repræsentative Raman toppene af sonderne verificeret. Hvis signalet er for svagt, kan eksponeringstid pr. punkt øges. Men denne tilgang kan føre til uoverkommeligt lang scanninger eller meget lav rumlige opløsning. For at sikre reproducerbarheden og konsistens, kalibrering af Raman scanner bør udføres efter producentens anbefaling og gøres typisk ved hjælp af en fælles standard (f.eks., en silicium wafer).

En af de største styrker i denne metode er dens alsidighed. Forskellige tumortyper kan være afbildet ved hjælp af specifikke antistoffer rettet mod forskellige molekylære markører. Derudover nanoprobes beskrevet her kan gives til dyremodeller — intraperitoneal eller intravenøst — men også bruger de samme teknikker, de kan bruges til at plette væv, enten fast eller frisk skåret ud.

Selv om ratiometric teknikken giver specificitet for detektion af mikroskopiske tumorer, er fordelingen af de enkelte sonder ikke specifikke for tumor områder. Det betyder, at theranostic teknikker som photothermal/Fotodynamisk terapi eller narkotika-indlæsning ikke ville være ideelt, da terapi vil blive leveret til sunde områder samt. En potentiel terapeutisk program yder denne teknik ville være den automatiserede ablation af microtumors efter ratiometric detektering.

Vi håber, at dette lokale, ratiometric tilgang af Raman imaging kan bane vejen for ved hjælp af SERRS nanoprobes, efter de nødvendige kliniske forsøg, som en molekylær billeddannelse agent i patienter. Denne metode blev udviklet til at være kompatibel med potentielle fremtidige applikationer i mennesker, som nanopartikler kunne gives til og fjernet fra bughulen ved hjælp af enheder, der allerede i klinisk brug for HIPEC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

• M.F.K. er opført som en opfinder på flere udstedt eller verserende patentansøgninger relateret til dette arbejde. M.F.K. er medstifter af RIO Imaging, Inc., som sigter mod at omsætte SERRS nanopartikler til klinikker.

• Forfatterne erklærer, at de har ingen andre konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

De følgende finansieringskilder (til M.F.K.) anerkendes: NIH R01 EB017748, R01 CA222836 og K08 CA16396; Damon Runyon-Rachleff Innovation Award DRR-29-14, Pershing Square Sohn præmie ved Pershing Square Sohn Cancer Research Alliance og MSKCC Center for molekylær billeddannelse & nanoteknologi (CMINT) og den teknologiske udvikling giver. Bekræftelser er også udvidet til MSKCC NIH Core Grant (P30-CA008748) tilskud støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Reagent
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A5960
3-MPTMS Sigma-Aldrich 175617
Ammonium hydroxide (28%) Sigma-Aldrich 338818
Anti-Folate Receptor antibody [LK26]  AbCam ab3361
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 276855
Dimethyl sulfoxide (anhydrous) Sigma-Aldrich 276855
Ethanol Sigma-Aldrich 792780
IR140 Sigma-Aldrich 260932
IR780 perchlorate* Sigma-Aldrich 576409 Discontinued*
Isopropanol Sigma-Aldrich 650447
N.N.Dimethylformamide Sigma-Aldrich 227056
PEG crosslinker Sigma-Aldrich 757853
PEG-maleimide Sigma-Aldrich 900339
Tetrachloroauric Acid Sigma-Aldrich 244597
Tetraethyl Orthosilicate Sigma-Aldrich 86578
*IR792 Sigma-Aldrich 425982 *Alternative
Name of Equipment
Dialysis cassette (3,500 MWCO) ThermoFIsher 87724
Centrifugal filters Millipore UFC510096
inVia confocal Raman microscope Renishaw
MATLAB (v2014b) Mathworks
PLS Toolbox (v8.0) Eigenvector research

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oseledchyk, A., Andreou, C., Wall, M. A., Kircher, M. F. Folate-Targeted Surface-Enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detection of Microscopic Ovarian Cancer. ACS Nano. 11 (2), 1488-1497 (2017).
  2. Andreou, C., et al. Imaging of Liver Tumors Using Surface-Enhanced Raman Scattering Nanoparticles. ACS Nano. 10 (5), 5015-5026 (2016).
  3. Karabeber, H., et al. Guiding brain tumor resection using surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and a hand-held Raman scanner. ACS Nano. 8 (10), 9755-9766 (2014).
  4. Kircher, M. F., et al. A brain tumor molecular imaging strategy using a new triple-modality MRI-photoacoustic-Raman nanoparticle. Nature Medicine. 18 (5), 829-834 (2012).
  5. Andreou, C., Kishore, S. A., Kircher, M. F. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy: A New Modality for Cancer Imaging. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1295-1299 (2015).
  6. Harmsen, S., et al. Rational design of a chalcogenopyrylium-based surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobe with attomolar sensitivity. Nature Communications. 6, 6570 (2015).
  7. Harmsen, S., et al. Surface-enhanced resonance Raman scattering nanostars for high-precision cancer imaging. Science Translational Medicine. 7 (271), 271ra277 (2015).
  8. Harmsen, S., Wall, M. A., Huang, R., Kircher, M. F. Cancer imaging using surface-enhanced resonance Raman scattering nanoparticles. Nature Protocols. 12 (7), 1400-1414 (2017).
  9. Huang, R., et al. High Precision Imaging of Microscopic Spread of Glioblastoma with a Targeted Ultrasensitive SERRS Molecular Imaging Probe. Theranostics. 6 (8), 1075-1084 (2016).
  10. Iacono, P., Karabeber, H., Kircher, M. F. A "schizophotonic" all-in-one nanoparticle coating for multiplexed SE(R)RS biomedical imaging. Angewandte Chemie, International Edition in English. 53 (44), 11756-11761 (2014).
  11. Spaliviero, M., et al. Detection of Lymph Node Metastases with SERRS Nanoparticles. Molecular Imaging and Biology. 18 (5), 677-685 (2016).
  12. Nayak, T. R., et al. Tissue factor-specific ultra-bright SERRS nanostars for Raman detection of pulmonary micrometastases. Nanoscale. 9 (3), 1110-1119 (2017).
  13. Thakor, A. S., et al. The fate and toxicity of Raman-active silica-gold nanoparticles in mice. Science Translational Medicine. 3 (79), 79ra33 (2011).
  14. Liu, J., et al. Effects of Cd-based Quantum Dot Exposure on the Reproduction and Offspring of Kunming Mice over Multiple Generations. Nanotheranostics. 1 (1), 23-37 (2017).
  15. Wu, N., et al. The biocompatibility studies of polymer dots on pregnant mice and fetuses. Nanotheranostics. 1 (3), 261-271 (2017).
  16. Garai, E., et al. High-sensitivity real-time, ratiometric imaging of surface-enhanced Raman scattering nanoparticles with a clinically translatable Raman endoscope device. Journal of Biomedical Optics. 18 (9), 096008 (2013).
  17. Wang, Y. W., et al. Rapid ratiometric biomarker detection with topically applied SERS nanoparticles. Technology (Singap World Sci). 2 (2), 118-132 (2014).
  18. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
  19. Vergote, I. B., Marth, C., Coleman, R. L. Role of the folate receptor in ovarian cancer treatment: evidence, mechanism, and clinical implications. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 41-52 (2015).
  20. Fasolato, C., et al. Folate-based single cell screening using surface enhanced Raman microimaging. Nanoscale. 8 (39), 17304-17313 (2016).
  21. Wang, Y. W., et al. Raman-Encoded Molecular Imaging with Topically Applied SERS Nanoparticles for Intraoperative Guidance of Lumpectomy. Cancer Research. 77 (16), 4506-4516 (2017).
  22. Andreou, C., Pal, S., Rotter, L., Yang, J., Kircher, M. F. Molecular Imaging in Nanotechnology and Theranostics. Molecular Imaging and Biology. 19 (3), 363-372 (2017).
  23. Chitgupi, U., Qin, Y., Lovell, J. F. Targeted Nanomaterials for Phototherapy. Nanotheranostics. 1 (1), 38-58 (2017).
  24. Choi, D., et al. Iodinated Echogenic Glycol Chitosan Nanoparticles for X-ray CT/US Dual Imaging of Tumor. Nanotheranostics. 2 (2), 117-127 (2018).
  25. Dubey, R. D., et al. Novel Hyaluronic Acid Conjugates for Dual Nuclear Imaging and Therapy in CD44-Expressing Tumors in Mice In Vivo. Nanotheranostics. 1 (1), 59-79 (2017).
  26. Gupta, M. K., et al. Recent strategies to design vascular theranostic nanoparticles. Nanotheranostics. 1 (2), 166-177 (2017).
  27. Huang, Y. J., Hsu, S. H. TRAIL-functionalized gold nanoparticles selectively trigger apoptosis in polarized macrophages. Nanotheranostics. 1 (3), 326-337 (2017).
  28. Pal, S., Harmsen, S., Oseledchyk, A., Hsu, H. T., Kircher, M. F. MUC1 Aptamer Targeted SERS Nanoprobes. Advanced Functional Materials. 27 (32), (2017).
  29. Zanganeh, S., et al. Iron oxide nanoparticles inhibit tumour growth by inducing pro-inflammatory macrophage polarization in tumour tissues. Nat Nanotechnol. 11 (11), 986-994 (2016).
  30. Lee, J., Lee, Y. M., Kim, J., Kim, W. J. Doxorubicin/Ce6-Loaded Nanoparticle Coated with Polymer via Singlet Oxygen-Sensitive Linker for Photodynamically Assisted Chemotherapy. Nanotheranostics. 1 (2), 196-207 (2017).
  31. Li, R., Zheng, K., Yuan, C., Chen, Z., Huang, M. Be Active or Not: the Relative Contribution of Active and Passive Tumor Targeting of Nanomaterials. Nanotheranostics. 1 (4), 346-357 (2017).
  32. Lin, S. Y., Huang, R. Y., Liao, W. C., Chuang, C. C., Chang, C. W. Multifunctional PEGylated Albumin/IR780/Iron Oxide Nanocomplexes for Cancer Photothermal Therapy and MR Imaging. Nanotheranostics. 2 (2), 106-116 (2018).
  33. Roberts, S., et al. Sonophore-enhanced nanoemulsions for optoacoustic imaging of cancer. Chemical Science (Royal Society of Chemistry: 2010). 9 (25), 5646-5657 (2018).
  34. Liu, L., Ruan, Z., Yuan, P., Li, T., Yan, L. Oxygen Self-Sufficient Amphiphilic Polypeptide Nanoparticles Encapsulating BODIPY for Potential Near Infrared Imaging-guided Photodynamic Therapy at Low Energy. Nanotheranostics. 2 (1), 59-69 (2018).
  35. Liu, R., Tang, J., Xu, Y., Zhou, Y., Dai, Z. Nano-sized Indocyanine Green J-aggregate as a One-component Theranostic Agent. Nanotheranostics. 1 (4), 430-439 (2017).
  36. Sneider, A., VanDyke, D., Paliwal, S., Rai, P. Remotely Triggered Nano-Theranostics For Cancer Applications. Nanotheranostics. 1 (1), 1-22 (2017).
  37. Wall, M. A., et al. Surfactant-Free Shape Control of Gold Nanoparticles Enabled by Unified Theoretical Framework of Nanocrystal Synthesis. Advanced Materials. 29 (21), (2017).
  38. Sonali,, et al. Nanotheranostics: Emerging Strategies for Early Diagnosis and Therapy of Brain Cancer. Nanotheranostics. 2 (1), 70-86 (2018).

Tags

Kræftforskning sag 145 Raman SERS nanopartikel molekylær billeddannelse kræft i æggestokkene folat receptor ratiometry
Overflade-forstærket resonans Raman spredning Nanoprobe Ratiometry til påvisning af mikroskopiske æggestokkræft via folat Receptor målretning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Andreou, C., Oseledchyk, A.,… More

Andreou, C., Oseledchyk, A., Nicolson, F., Berisha, N., Pal, S., Kircher, M. F. Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting. J. Vis. Exp. (145), e58389, doi:10.3791/58389 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter