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Cancer Research

Raman exaltée de surface résonance diffusion Nanoprobe Ratiometry pour détecter le Cancer de l’ovaire microscopique par l’intermédiaire de récepteurs de l’acide folique ciblage

Published: March 25, 2019 doi: 10.3791/58389
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1,3,4,5,6,7
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Department of Chemistry, The Graduate Center of the City University of New York, 3Molecular Pharmacology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (CMINT), Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 5Gerstner Sloan Kettering Graduate School of Biomedical Sciences, 6Department of Radiology, Weill Cornell Medical College of Cornell University, 7Dana-Farber Cancer Institute and Harvard Medical Center

Summary

Cancer de l’ovaire forme des métastases dans toute la cavité péritonéale. Ici, nous présentons un protocole pour faire et utilisation folate-récepteur ciblé exaltée de surface résonance Raman scattering nanosondes qui révèlent ces lésions avec une spécificité élevée via ratiométrique imagerie. Les nanosondes sont administrés par voie intrapéritonéale à des souris vivantes, et les images dérivées correspondent bien aux histologie.

Abstract

Cancer de l’ovaire représente la malignité gynécologique plus meurtrière. La plupart des patients présentent à un stade avancé (stade III ou IV de la FIGO), quelle local métastatique se propager a déjà eu lieu. Cependant, cancer de l’ovaire a un modèle unique de métastases, tumeur implants sont initialement contenus dans la cavité péritonéale. Cette caractéristique pourrait permettre, en principe, la résection complète de la tumeur implants avec intention curative. Bon nombre de ces lésions métastatiques sont microscopiques, ce qui les rend difficile à identifier et à traiter. Neutraliser ces micrométastases est censé être un objectif majeur pour éliminer une récidive tumorale et assurer la survie à long terme. Imagerie avec surface améliorée résonance Raman scattering nanosondes Raman peut servir à délimiter des tumeurs microscopiques avec la sensibilité élevée, en raison de leur brillant et bioorthogonal signatures spectrales. Nous décrivons ici la synthèse de deux « saveurs » de ces nanosondes : un anticorps fonctionnalisés qui cible le récepteur de l’acide folique — surexprimé dans de nombreux cancers de l’ovaire et un nanoprobe de contrôle non ciblés, avec les spectres distincts. Les nanosondes sont administrés simultanément par voie intrapéritonéale à des modèles de souris d’un adénocarcinome ovarien métastatique humain. Toutes les études animales ont été approuvées par le Comité utilisation du Memorial Sloan Kettering Cancer Center et d’institutionnels animalier. La cavité péritonéale des animaux est chirurgicalement exposée, lavée et scannée avec un microphotospectrometer Raman. Par la suite, les signatures de Raman des deux nanosondes sont découplés en utilisant un algorithme d’ajustement classique moindres carrés, et leurs scores respectifs divisée pour fournir un signal de ratiométrique de folate ciblée sur les sondes non ciblées. De cette façon, les métastases microscopiques sont visualisés avec grande spécificité. Le principal avantage de cette approche est que l’application locale dans la cavité péritonéale, qui peut être fait idéalement au cours de la procédure chirurgicale — peut baliser des tumeurs sans soumettre le patient à une exposition systémique nanoparticule. Faux positif des signaux issus de liaisons non spécifiques de la nanosondes sur surfaces viscérales peuvent être éliminés en suivant une approche ratiométrique où nanosondes ciblés et non ciblés avec des signatures distinctes de Raman sont appliquées sous forme d’un mélange. La procédure est actuellement toujours limitée par l’absence d’un commercial Raman de grand champ d’imagerie système de caméra, qui une fois disponible permettra l’application de cette technique dans le théâtre d’opération.

Introduction

Raman d’imagerie avec « Surface améliorée Raman scattering » nanoparticules (SERS) a montré très prometteur dans la délimitation des lésions dans différents contextes et pour beaucoup de tumeurs différentes types1,2,3,4 . L’avantage principal de la SERS nanoparticules est leur signature spectrale d’empreintes digitales-like, offrant leur détection incontestable qui n’est pas confondue par signaux de fond biologique5. En outre, l’intensité du signal émis est encore amplifiée avec l’utilisation de molécules de journaliste (colorants) avec des maxima d’absorption en ligne avec le laser d’excitation, donnant naissance à la « diffusion Raman de surface renforcée par résonance » (SERRS) nanoparticules avec une plus grande sensibilité6,7,8,9,10,11,12.

Une barrière qui doit être traitée pour l’adoption de nanoparticules de SE(R)RS13 et nombreux autres nanoparticules constructions14,15 pour l’usage clinique sont leur mode d’administration, comme l’injection intraveineuse des causes systémiques exposition de l’agent et nécessite des tests approfondis afin d’exclure les effets négatifs potentiels. Dans cet article, nous présentons un paradigme différent fondé sur l’application des nanoparticules localement en vivo, directement dans la cavité péritonéale pendant une intervention chirurgicale, suivie d’une étape de lavage pour enlever n’importe quel indépendant nanoparticules1. Cette approche est conforme à nouvelles approches thérapeutiques qui sont actuellement sous enquête qui font aussi l’utilisation de l’instillation locale d’agents dans la cavité péritonéale, appelée hyperthermique chimiothérapie intrapéritonéale (Chip). Ainsi, le principe lui-même devrait être relativement facile à intégrer dans un flux de travail clinique. Nous avons étudié la biodistribution des nanoparticules après application intrapéritonéale et n’a observé aucune absorption détectable dans la circulation systémique1. En outre, l’approche d’application locale contourne la séquestration des nanoparticules par le système réticulo-endothélial, donc le nombre de nanoparticules requis est nettement réduit. Toutefois, lorsqu’il est appliqué par voie topique, nanoparticules fonctionnalisés anticorps ont tendance à adhérer sur les surfaces viscérales même en l’absence de leur cible. Afin de minimiser les fausses signaux positifs en raison de l’adhérence de nanoparticules non spécifiques, nous poursuivons une approche ratiométrique, où un nanoprobe moléculairement ciblée fournit le signal spécifique et un nanoprobe de contrôle non ciblée, avec différent spectre Raman, comptes pour non-spécifiques fond16,17. Nous avons démontré cette méthodologie de la résonance améliorée surface application topique sur la spectroscopie Raman ratiométrique récemment dans un modèle murin de cancer de l’ovaire diffuse1.

L’objectif général de cette méthode consiste à développer deux nanosondes SERRS, une cible et un non spécifique, à appliquer localement dans des modèles murins, afin de la prévalence/surexpression d’un cancer d’images connexes biomarqueur ratiométrique détection des deux sondes par l’intermédiaire Imagerie Raman. Dans cet ouvrage, le récepteur de l’acide folique (FR) a été choisi comme cible, car il s’agit d’un surexprimés marqueur dans de nombreux cancers de l’ovaire18,19. Raman microimaging avec des nanoparticules axée sur les « sers » a également été démontrée pour le cancer cellule identification20. Deux « saveurs » distincts des nanoparticules de Raman sont synthétisées, chacun dérivant un colorant organique différent de son empreinte. Les nanoparticules sont constitués d’un en forme d’étoile or entouré d’une capsule de silice et de démontrer la résonance plasmonique de surface à environ 710 nm. Le journaliste de Raman (colorant organique) est déposé en même temps que la formation de la coquille de la silice. Enfin, pour les nanosondes FR ciblées (αFR-NPs) la coquille de silice est conjuguée avec des anticorps, alors que les nanosondes indifférenciés (nt-NPs) sont passivés avec une monocouche de polyéthylène glycol (PEG).

Cette technique a été utilisée avec succès pour mapper les tumeurs microscopiques dans un modèle murin de xénogreffe de cancer ovarien métastatique diffus (SKOV-3), démontrant son applicabilité pour utilisation in vivo. Il peut également être étendu pour utilisation dans les tissus excisés, pour phénotypage de tumeur, ou de la détermination de la marge après compactage comme le montre une étude apparentés21.

SERRS nanosondes fournissent une plate-forme solide pour la création de plusieurs balises ciblées pour les biomarqueurs, synthétisés par des réactions chimiques simples comme indiqué schématiquement à la Figure 1. Nous présentons ici le protocole pour la synthèse de ces deux types de nanosondes SERRS (chapitres 1-3), le développement d’un modèle de souris de cancer de l’ovaire approprié (article 4), l’administration de nanosondes et imagerie (section 5) et enfin l’analyse des données et visualisation (section 6).

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Protocol

Toutes les études animales ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité du Memorial Sloan Kettering Cancer Center (# 07/06/11).

1. or Nanostar Core synthèse

Remarque : Nanostars or servent de noyaux pour les deux saveurs de nanosondes SERRS utilisé dans cette expérience.

  1. Préparer les 800 mL de 60 mM d’acide ascorbique (C6H8O6) solution dans l’eau désionisée (DI) et 8 mL de la solution (HAuCl4) acide de 20 mM tetrachloroauric dans l’eau distillée. Laisser refroidir à 4 ° C.
  2. Effectuez cette étape de réaction à 4 ° C. Placer une fiole conique contenant 800 mL de la solution de l’acide ascorbique sur une plaque d’agitation magnétique et induire un vortex stable. Rapidement, ajoutez 8 mL de solution d’acide tetrachloroauric dans le tourbillon. Quelques secondes, formeront à le nanostars et la solution prendra une couleur bleu foncé. Dans le cas où la couleur à tout moment devient rose ou violet, signifiant que la formation des nanosphères, la suspension doit être jetée et la synthèse renvoyés.
  3. Versez la suspension nanostar dans 50 mL tubes coniques et centrifuger pendant 20 min (4 ° C, 3 220 x g). Aspirer le surnageant laissant environ 200 µL de la solution dans chaque tube. Faire attention à ne pas déranger le culot de nanoparticules au fond du tube.
    Remarque : Le liquide surnageant doit avoir une teinte bleue à cause de nanostars suspension restantes.
  4. À l’aide d’une micropipette, agiter la solution pour suspendre et recueillir les nanoparticules de chaque éprouvette. Partie du culot peut-être être compacté au fond du tube et sera resuspendre pas même avec vigoureux de pipetage-jeter cette partie.
  5. Transférer la suspension de nanoparticules dans une cassette de dialyse (MWCO 3.5 kDa) et dialyser au moins trois jours, contre 2 L de l’eau distillée, en changeant l’eau tous les jours. Magasin nanostars en dialyse à 4 ° C pendant un mois avec les changements d’eau tous les 3-4 jours.
    Remarque : Le nanostars convient en dialyse jusqu'à ce que nécessaire pour la réaction de silication, tel que décrit à l’article 2.

2. formation de la coquille de silice

Remarque : Deux saveurs de nanosondes Raman sont synthétisées. La procédure de synthèse est la même pour les deux, avec la seule différence étant la molécule de journaliste Raman (colorant) utilisée. Dans cette expérience, perchlorate de IR780 et IR140 sont utilisées. La réaction doit toujours être effectuée dans des récipients en plastique. La synthèse est évolutive et peut être ajustée pour la quantité désirée d’injection co-set requis. Ici, une synthèse du lot moyen est décrite, qui peut évoluer linéairement aux volumes inférieures ou supérieures au besoin, avec les mêmes concentrations et les temps de réaction. Les réactions pour les deux types de nanoprobe SERRS peuvent être effectuées en parallèle. Faites attention à éviter la contamination croisée. Sonication devrait être effectuée pour la redispersion de nanoparticules pellets après centrifugation pendant les étapes de lavage, ou après que les nanoparticules ont été conservés pendant plus d’une heure. Sonication doit être effectuée jusqu'à ce que les nanoparticules sont clairement suspendus dans la solution, en général pour 1 s.

  1. En Tube A (un tube conique de 50 mL), mélanger 10 mL d’isopropanol, 500 µL de TEOS, 200 µL d’eau DI et 60 µL de colorant (perchlorate de IR780 ou IR140, DMF (diméthylformamide) de 20 mM).
  2. B Tube (tube de 15 mL conique), mélanger 3 mL d’éthanol et 200 µL d’hydroxyde d’ammonium. Laisser agir la nanostars étape 1.4 pour disperser des grappes en solution et ajouter 1,2 mL de nanostars dans le tube.
    Remarque : la solution d’hydroxyde d’ammonium est très volatil et difficile à pipeter avec précision. Conserver à 4 ° C, jusqu'à ce que nécessaire, pour faciliter le pipetage.
  3. Placer le Tube A sur un vortex et d’induire un vortex stable. Rapidement ajouter le contenu du Tube B dans le tourbillon et garder le mélange pendant environ 5 s. transférer immédiatement à un réagissent shaker et laissez pendant 15 minutes en agitant à 300 tr/min, à température ambiante.
  4. Après l’incubation de 15 min, étancher la réaction par l’ajout d’éthanol pour remplir le tube de 50 mL. Centrifuger pendant 20 min à 3 220 x g et 4 ° C.
  5. Aspirer le surnageant, laissant environ 0,5 mL de solution, en veillant à ne pas déranger le culot. Ajouter 1 mL d’éthanol et agiter avec une pipette pour remettre en suspension les nanoparticules. Transférer dans un tube à centrifuger 1,5 mL et laver 4 fois avec de l’éthanol par centrifugation à 11 000 x g pendant 4 min, aspirer le surnageant et resuspendant le culot par sonication pour environ 1 s.
    Remarque : À ce stade, les nanoparticules silicatés peuvent être fonctionnalisés, tel que décrit à l’article 3, ou remis en suspension dans l’eau distillée avec une étape de lavage supplémentaire, pour le stockage à 4 ° C pendant une semaine.

3. surface fonctionnalisation

Remarque : IR780 SERRS nanosondes va se conjuguer avec des anticorps de folate-ciblant les récepteurs via une reticulation PEG à forme αFR-NPs ; IR140 SERRS contrôle nanosondes va se conjuguer avec une passivation PEG monocouche, pour nt-NPs. Les deux saveurs sont formées par une réaction de thiol-maléimide dans réactions distinctes mais parallèles.

  1. Laver les nanoparticules deux fois par centrifugation à 11 000 x g pendant 4 min, aspirer le surnageant et resuspendant le culot dans 1 mL d’éthanol par sonication. Répétez l’étape de lavage une fois de plus, mais redisperse dans 1 mL d’éthanol de 85 %, 10 % 3-MPTMS (3-mercaptopropyltrimethoxysilane) et 5 % de l’eau distillée. Incuber à température ambiante pendant 1-2 h d’introduire des thiols sur la surface de la particule.
  2. Laver les nanoparticules thiol fonctionnalisées par centrifugation à 11 000 x g pendant 4 min, aspirer le surnageant et resuspendant le culot par sonication, deux fois dans de l’éthanol, deux fois de DI et enfin en HEPES (4-(2-hydroxyéthyl) -1- tampon de l’acide piperazineethanesulfonic) (10 mM, pH 7.1) et mettre de côté.
    Remarque : MES (2-(N- morpholino) ethanesulfonic acide) tampon ou HEPES doit être utilisé. Tampons avec une salinité plus élevée, tels que PBS (tampon phosphate salin), peuvent causer l’agrégation de nanoparticules.
  3. Pour les anticorps fonctionnalisés αFR-NPs, réagissent 200 µg d’anticorps (anti-acide folique liaison protéine anticorps clone en [LK26]) avec excès molaire décuplée de reticulation PEG (éther de poly(ethylene glycol) (5-pentanoate de N-hydroxysuccinimide) N′-(3- maleimidopropionyl) aminoéthanethiol (No CAS : 851040-94-3), dans le diméthylsulfoxyde (DMSO)) dans 500 µL de tampon MES (10 mM, pH 7.1) pendant 30 min.
  4. Retirez l’excès reticulation et concentrer des anticorps par centrifugation de la solution d’anticorps-PEG dans un filtre centrifuge (MWCO 100 kDa). Pour les filtres centrifuges utilisées dans cette étude, effectuer la centrifugation pendant 10 min à 14 000 x g et 23 ° C. Récupérer les anticorps conjugués dans un nouveau tube en inversant le filtre et centrifugation à 1 000 x g pendant 2 min.
  5. Pipeter les nanoparticules de IR780 de l’étape 3.2 dans le tube avec les anticorps et agiter à l’aide de la pipette pour mélanger. Incuber le mélange pendant au moins 30 min à température ambiante, ou, alternativement, à 4 ° C jusqu’au lendemain pour former les αFR-NPs.
  6. Pour former les nt-NPs, ajouter 1 % w/v terminée par méthoxy (m) PEG5000-maléimide (No CAS : 99126-64-4) dissolvant dans le DMSO pour les nanoparticules IR140 SERRS étape 3.2 et laisser réagir dans 500 µL MES de tampon (10 mM, pH 7.1) pendant au moins 30 min à température ambiante, ou encore à 4 ° C du jour au lendemain.
  7. Pour l’administration à des souris (section 5), centrifuger les deux saveurs de nanoprobe à 11 000 x g pendant 4 min, aspirer le surnageant pour supprimer la solution avec libre n’ayant pas réagie anticorps/PEG et redisperse chaque saveur dans un tampon MES (10 mM, pH 7.1) à la concentration de h 600 . Quand resuspendant les nanoparticules, minimiser l’exposition inutile à l’échographie, pour éviter la dénaturation de l’anticorps.

4. élaboration d’un modèle de souris

  1. Établir une culture régulière de la lignée de cellules d’adénocarcinome ovarien humain (SKOV-3). Éventuellement, pour permettre un suivi par l’intermédiaire de bioluminescence/fluorescence, utiliser les cellules transfectées de Luc SKOV-3+/GFP+ . Cellules en culture dans un milieu RPMI (Roswell Park Memorial Institute) avec 10 % de sérum de veau foetal et passage deux fois par semaine. Pour injection, incuber les cellules avec 0,25 % trypsin/0.05% EDTA pendant 3 min à détacher, puis laver et remettre en suspension dans du PBS à 2 x 106 cellules/100 µL.
  2. Pour établir le modèle de micrométastase ovarienne, injecter 200 µL de suspension SKOV-3 cellules par voie intrapéritonéale dans des souris femelles athymiques (FOXn1nu/FOXn1nu souris, âgés de 6 à 8 semaines). Dissémination péritonéale disséminée aura lieu dans environ 4 semaines. Si vous utilisez Luc SKOV-3+ cellules, croissance de la tumeur peut être contrôlée avec bioluminescence par l’administration de 2 mg de luciférine beetle dans 50 µL de PBS par injection retroorbital.

5. Nanoprobe Injection et imagerie

  1. Préparer les nanosondes (αFR-NPs et nt-NPs) tel que décrit dans les chapitres 1 à 3 et le mélange à un ratio de 1:1, pour une concentration finale de 300 h de chaque type dans le tampon MES (10 mM, pH 7.1). Vous pouvez également préparer des étalons de référence de 30 h de chacune des saveurs nanoprobe en petits tubes coniques (100 µL).
  2. Injecter par voie intrapéritonéale de 1 mL de la suspension de nanoparticules à chaque souris et masser doucement le ventre pour distribuer les nanoparticules dans la cavité péritonéale. Retourner la souris à son logement. Au bout de 25 minutes, euthanasier la souris via CO2 asphyxie.
  3. Fixer la souris sur une plateforme chirurgicale, à la position allongée (pour l’abdomen entier d’imagerie, la plate-forme doit être montable sur la platine du microscope verticale).
    1. Avec des ciseaux de dissection et de pinces dentelées, enlever la peau pour exposer le péritoine et réaliser une grande incision sagittale (entre 2 et 3 cm de longueur) pour exposer l’abdomen entier. Fixez les rabats péritonéales sur la plate-forme. Lavez l’intérieur de la cavité péritonéale avec au moins 60 mL de PBS à l’aide d’un vaporisateur en plastique.
      Remarque : Pour activer la vue dégagée d’imagerie de l’abdomen entier, les intestins doivent être mobilisés ou excisé. Pour l’excision, résection avec une ligature des vaisseaux mésentériques afin de réduire l’hémorragie dans la cavité abdominale.
    2. Par ailleurs, à l’image des organes spécifiques, les accises après le lavage de PBS et placez-les sur une lame de microscope.
  4. Transfert de la plate-forme ou la diapositive à un microspectrophotomètre Raman avec configuration optique verticale et une platine motorisée pour l’imagerie ; utiliser un système commercial avec un 300 mW 785 nm diode laser, avec une grille de 1 200 grooves par mm, centrée à 1 115 cm-1.
    1. Concentrer sur la zone d’intérêt en utilisant des optiques light blanc, parfocale avec le laser de Raman. Sélectionnez la zone à être photographié et la résolution souhaitée ; dans le présent rapport a été utilisé un mode d’acquisition rapides (spectres acquis sous illumination laser continu avec la platine du microscope en perpétuel mouvement, avec une résolution spatiale efficace 14,2 µm par 200µm ; grossissement x 5, puissance de 100 mW à l’objectif, et < 100 ms exposition par point).
      Remarque : Les tubes avec les nanosondes de référence d’étape 5.1 peuvent être placées dans la zone image si vous le souhaitez, d’étalons de référence interne pour l’analyse ultérieure. Veillez à ce qu’aucune sources lumineuses externes autres que le laser n’atteint l’objectif.
  5. Eventuellement, préparation des échantillons pour traitement histologique et validation par la fixation de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant une nuit à 4 ° C. Rincez avec du PBS à 4 ° C pendant 15 min au moins deux fois. Conserver l’échantillon dans l’éthanol à 70 % dans l’eau jusqu’au traitement histologique standard et enrobage de paraffine. Pour la validation histologique des tumeurs, des sections (5 µm d’épaisseur) de différentes profondeurs du bloc de paraffine peuvent être colorées à l’hématoxyline et éosine (H & E).

6. traitement des données et visualisation

Remarque : Tout traitement de données a été réalisé avec une interface utilisateur graphique développée en interne, à l’aide de logiciels commerciaux. Toutes les fonctions utilisées ont des équivalents génériques disponibles dans d’autres environnements informatiques.

  1. Obtenir des spectres de référence pour les deux saveurs, en interrogeant des suspensions pures de chacun. Les spectres de référence peuvent être dérivés de point des scans de la nanosondes, imagerie de la nanosondes en plaques à puits, ou en incluant des références internes dans les analyses expérimentales dans les tubes de référence (voir étape 5.1).
  2. Prétraitez les spectres de référence, à l’aide de soustraction de base (filtre de Whittaker, λ = 200), normalisation par l’aire sous la courbe et les dérivés filtre Savitzky-Golay (polynôme du secon degré fonction, premier ordre dérivé, largeur = 15 étapes). Ces spectres prétraités serviront de références pour le modèle classique des moindres carrés (CLS).
  3. Prétraitez les exemples de données de l’image de la même manière que les spectres de référence. Obtenir des scores CLS pour chaque point d’échantillonnage à l’aide d’un algorithme CLS disponible. Les scores de CLS (DSAP) direct sont tout simplement les coordonnées de la projection d’un spectre de l’échantillon sur l’espace linéaire défini par la matrice inverse généralisée (inverse de Moore-Penrose) des spectres de référence. Autre raccord algorithmes peuvent être utilisés (non négatifs moindres carrés, moindres carrés partiels ou autres).
    Remarque : Certains algorithmes de raccord peuvent donner lieu à des scores négatifs, qui, dans ce contexte, ne sont pas physiques. Si c’est le cas, un seuil peut être affectée à exclure des scores négatifs, ou un algorithme de contrainte non négatifs moindres carrés seront utilisées à la place.
  4. Calculer le ratio lenveloppe des scores sur la référence pour les nanoparticules ciblées (marqueαFR) sur les scores sur la référence pour les nanoparticules indifférenciés (partitions,nt). Si les scores sont non négatifs, le rapport peut être exprimé de façon logarithmique :
    R = log10(ScoresαFR/ntdes Scores).
    Le rapport R est mieux affiché dans une échelle de couleurs divergentes centrée à zéro, pour exprimer l’abondance relative des sondes dans les ordres de grandeur. L’image résultante peut être superposée sur l’image de lumière blanche de l’échantillon, de révéler des zones de la surexpression du récepteur acide folique.

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Representative Results

À des fins de contrôle de la qualité, les nanoparticules peuvent être caractérisées à l’aide de diverses méthodes au cours du processus de synthèse, y compris le TEM, DLS, nanoparticules suivi analyse et spectroscopie d’absorbance UV/Vis, comme illustré à la Figure 2.

De cette façon, la taille du noyau nanostar or (décrit dans la section 1), la formation de la coquille de silice (section 2) et fonctionnalisation de surface suivante (article 3) peuvent être vérifié (Figure 2). En général, la taille (diamètre hydrodynamique) du noyau nanostar or devrait atteindre environ 80 nm et la coquille de silice est environ 20 nm d’épaisseur, faisant la taille de la nanoparticule silicaté total environ 120 nm et environ 140 nm après conjugaison avec l’anticorps αFR. Absorbance UV/Vis peut également être utilisé pour vérifier la morphologie des nanoparticules. Nanostar carottes dans l’eau ont généralement un maximum d’absorbance à 670 nm, tandis qu’après silication le maximum se déplace à environ 710 nm. Maxima d’absorption à des longueurs d’onde inférieures est un signe de morphologie sphérique ou agrégation. Concentrations et des rendements des réactions typiques sont présentées au tableau 1 et dépendent fortement technique de pipetage au cours des étapes de lavage.

Chaque point obtenu à partir de l’analyse Raman contienne un spectre pour un emplacement interrogé. Ces spectres sont une superposition linéaire SERRS signal des nanosondes et aucune fluorescence de fond. Les spectres peuvent être traitées pour supprimer la fluorescence et normalisées à l’unité de surface afin de compenser la force du signal, avant d’appliquer le modèle CLS (voir section 6), comme illustré à la Figure 3. Des images représentatives pour les scores sur les spectres de référence nanoprobe et leur ratio lenveloppe sont indiquées dans la Figure 4. Bien que chaque partition individuellement ne fournit pas de localisation spécifique des tumeurs, le rapport révèle la présence de propagation microscopique disséminée.

Étape Volume initial Concentration initiale Volume final Concentration finale
1. Nanostar base 8 mL HAuCl4 20 mM HAuCl4 5 mL 1,3 nM
2. Silication 1,2 mL 1,3 nM 1,2 mL 0,5 nM
3.1. Thiolation 1 mL 0,5 nM 1 mL 0,43 nM
3.5. la conjugaison 1 mL 0,43 nM 1 mL 0,39 nM

Tableau 1 : rendement de nanoparticules après chaque étape de la réaction. Les concentrations sont approximatifs. Le rendement a été déterminé par nanoparticules suivi d’analyse, avec deux synthèses indépendants et 5 mesures indépendantes de chacun.

Figure 1
Figure 1 : Schéma de synthèse et l’application de l’imagerie ratiométrique SERRS nanoprobe. (1) nanostars or sont synthétisés comme décrit à l’article 1. (2) une coquille de silice est formée autour des cœurs d’or nanostar et journaliste Raman des molécules (perchlorate de colorants infrarouge IR-780 et IR-140) sont utilisés pour créer deux saveurs de nanoparticules distinct, tel que décrit à l’article 2. (3) la surface des nanoparticules est revêtue avec les thiols, tel que décrit à la section 3.1, pour permettre plus de fonctionnalisation de surface. Les nanoparticules de saveur IR-780 sont conjugués avec un anticorps anti-Folate, tandis que le IR-140 ceux sont passivés avec une couche de PEG - 5 k, tel que décrit dans les sections 3.3 à 3.6. (4) un modèle murin de métastases ovariennes intrapéritonéale diffus est développé tel que décrit à l’article 4, et une fois prêt, les nanosondes SERRS sont administrés par voie intrapéritonéale. (5) les souris sont euthanasiés, et l’abdomen chirurgicalement exposé pour activer Raman d’imagerie comme décrit dans la section 5. (6) les spectres Raman sont redressées analysées afin de déterminer l’abondance relative des deux sondes et générer une carte ratiométrique de surexpression du récepteur de folate tel que décrit à l’article 6. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Caractérisation physique des SERRS nanosondes. Les nanoparticules peuvent être soumis à contrôle de la qualité après chaque partie de la synthèse. Microscopie électronique à transmission (TEM) révèle la forme du noyau or et à la formation réussie de la coquille de silice sans nanoparticules agrégation ; Echelle = 100 nm. Diffusion dynamique de la lumière (DLS) peut mesurer la taille et le potentiel ζ des nanoparticules pour vérifier la fonctionnalisation et silication avec succès. Absorbance UV/Vis peut être utilisé pour confirmer la présence d’un pic plasmonique environ 670 nm pour la nanostars, passant à 710 nm après silication. Les mesures de Raman révèlent la présence des spectres uniques de chaque saveur tout au long de la synthèse. L’intensité du spectre nanostar, avec aucun pics caractéristiques, a été amplifiée par le x 100 pour l’accent. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Traitement des spectres Raman. Les spectres brutes consistent en signature SERRS des nanosondes, superposée sur une bande large de fluorescence. Avec soustraction de base la bande de fluorescence est enlevé, et les sommets de Raman deviennent importantes. Afin de détecter la signature spectrale des nanoparticules indépendamment intensité, chaque spectre (références et exemples semblables) est normalisé à l’unité de surface. Enfin, un filtre de lissage-dérivé est appliqué pour stimuler les pics Raman, tout en réduisant le bruit. Les spectres de référence transformés sont utilisés pour développer un modèle CLS, afin de classer les spectres de l’échantillon traité basés sur le rapport de R. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Ratiométrique imagerie du cancer de l’ovaire micrométastases dans l’abdomen. Raman d’imagerie de l’abdomen exposée d’une souris, mettant en vedette une vaste métastases ovariennes telle que révélée par l’imagerie de la bioluminescence. Chaque point de l’analyse met en vedette une gamme, qui est traité (article 6, Figure 3) et a marqué basé sur un modèle CLS, à obtenir des scores sur les deux références : αFR-NP montré en rouge et nt-NP en bleu. Les scores sont divisés puis redressées, pour révéler l’abondance relative des deux sondes sous forme de ratio. Facultativement, par seuillage le rapport, les zones « positives » peuvent être superposées sur une optique de l’image de l’abdomen, pour permettre la résection ou autre axé sur les traitements. La figure 4 est une version adaptée de référence1, avec la permission de la revue. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le protocole décrit ici donne des instructions pour la synthèse de deux « saveurs » de nanosondes SERRS et leur emploi chez les souris pour Raman imagerie de tumeur ovarienne surexprimant le récepteur de l’acide folique, en utilisant un algorithme ratiométrique. Le principal avantage de l’imagerie au cours d’autres techniques d’imagerie optiques (par exemple, fluorescence) Raman est la grande spécificité du signal nanoprobe qui ne peuvent pas être confondue avec les signaux d’origine biologique. Dans cette réalisation d’imagerie Raman, les nanoparticules ne sont pas administrés par voie intraveineuse, mais localement, par une injection intrapéritonéale, suivie d’une étape de lavage unique. Cette méthodologie, une fois traduite dans le domaine clinique, représenterait une solution élégante pour permettre aux chirurgiens de visualiser et de résection par conséquent tous les implants de cancer de l’ovaire, même ceux qui sont trop petits pour détecter à le œil nu, et qui ne peut pas être ciblé avec un agent d’imagerie systémiquement injecté en raison de leur manque de navires d’alimentation relié à la circulation systémique. Dans le même temps, comme notre SERRS nanoparticules ne sont pas résorbés dans la circulation systémique, problèmes possibles en matière d’effets secondaires sont réduits au minimum. Notre étude est un exemple des preuves croissantes qui soigneusement conçu nanoconstructs peut fournir des avantages uniques sur l’imagerie conventionnelle et thérapie technologies22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35,36,37,38.

Les nanosondes SERRS décrites ici sont biologiquement inertes et ont été employées pour la délimitation de la tumeur dans des modèles murins de plusieurs types de cancer. La réaction de formation de la coquille de silice (parallèlement à l’encapsulation de colorant de journaliste) est une version améliorée de notre synthèse précédemment signalés1,7,8, qui est moins enclin à l’agrégation de nanoparticules et la formation de nanoparticules « free silice » (sans noyau or). La réaction peut être utilisée avec une variété des colorants organiques infrarouges disponibles dans le commerce, en plus de celles présentées ici, pour donner une grande collection de saveurs de Raman. L’intensité du signal qui en résulte, cependant, dépend d’affinité de la teinture d’or et d’autres facteurs. En outre, la quantité de colorant ajouté à la réaction devrait être déterminée sur une base de par-dye, que certaines molécules et leurs contre-ions provoquent l’agrégation de l’or nanostars plus que d’autres. Dans le cas de l’agrégation de nanoparticules sévère, la quantité de colorant utilisé devrait être réduite. Agrégation des noyaux or n’est pas souhaitable, car il peut causer de grave variabilité dans le Raman intensité du signal et compliquer les données acquises. La formation de silice libre est la plupart du temps inoffensive, puisqu’il ne fournit aucun signal Raman. Cependant, au cours de la fonctionnalisation les anticorps adhéreront aux nanoparticules de silice, diminuant l’efficacité globale de ciblage de la méthode. L’épaisseur de la coquille de silice dépend du temps de réaction, la température et la quantité d’eau ajoutée (point 2.1). Si le shell de silice qui en résulte est jugé trop mince (Figure 1, coin supérieur droit), une ou plusieurs de ces paramètres peuvent être augmentée correctement.

En ce qui concerne l’acquisition de données, sa qualité dépend grandement de la luminosité de la nanosondes. Cela devient particulièrement évidente lorsque vous effectuez l’acquisition rapide de Raman, tel que décrit à l’article 5. Pour s’assurer que les données sont suffisamment perceptibles du bruit, le spectre doit être inspecté et vérifié la présence des pics Raman représentatifs des sondes. Si le signal est trop faible, le temps d’exposition par point peut être augmenté. Toutefois, cette approche peut conduire à des numérisations prohibitivement longues ou très faible résolution spatiale. Afin de garantir la reproductibilité et cohérence, calibrage du scanner Raman doit être effectué conformément à la recommandation du manufacturier et est généralement effectuée à l’aide d’une norme commune (par exemple, un silicium gaufrette).

L’un des principaux atouts de cette méthode est sa polyvalence. Types de tumeurs différentes peuvent être photographiées en utilisant des anticorps spécifiques ciblant différents marqueurs moléculaires. En outre, les nanosondes décrites ici peuvent être administrés à des modèles animaux — par voie intrapéritonéale ou intraveineuse — mais aussi, en utilisant les mêmes techniques, ils peuvent servir pour colorer les tissus, soit fixe, soit fraîchement excisées.

Bien que la technique ratiométrique fournit la spécificité pour la détection de tumeurs microscopiques, la distribution des sondes individuels n’est pas spécifique aux secteurs tumeur. Cela signifie que théranostiques techniques comme la thérapie photodynamique/photothermique ou chargement de drogue ne serait pas idéales, car la thérapie serait livrée à des zones saines ainsi. Une application thérapeutique potentielle qu’offre cette technique serait l’ablation automatisée de microtumors après détection ratiométrique.

Nous espérons que ce local, ratiométrique approche d’imagerie Raman peut ouvrir la voie pour l’utilisation de nanosondes SERRS, après des essais cliniques nécessaires, comme agent d’imagerie moléculaire chez les patients. Cette méthode a été développée pour être compatible avec les applications futures potentielles chez l’homme, que les nanoparticules pourraient être administrés à et retirés de la cavité abdominale à l’aide d’appareils qui sont déjà en usage clinique pour Chip.

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Disclosures

• M.F.K. est répertorié comme un inventeur sur plusieurs émis ou dans l’attente de demandes de brevet relatives à ce travail. M.F.K. est co-fondateur de RIO Imaging, Inc., qui vise à traduire SERRS nanoparticules dans les cliniques.

• Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun autres intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Les sources de financement suivantes (à M.F.K.) sont reconnus : NIH R01 EB017748, R01 CA222836 et K08 CA16396 ; Damon Runyon-Rachleff Innovation Award DRR-29-14, Pershing Square Sohn prix par l’Alliance de recherche pour le Cancer Sohn Pershing Square et MSKCC Center for Molecular Imaging & nanotechnologie (CMINT) et subventions de développement de la technologie. Remerciements sont également adressés au support subventions fourni par la subvention de base de NIH MSKCC (P30-CA008748).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Reagent
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A5960
3-MPTMS Sigma-Aldrich 175617
Ammonium hydroxide (28%) Sigma-Aldrich 338818
Anti-Folate Receptor antibody [LK26]  AbCam ab3361
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 276855
Dimethyl sulfoxide (anhydrous) Sigma-Aldrich 276855
Ethanol Sigma-Aldrich 792780
IR140 Sigma-Aldrich 260932
IR780 perchlorate* Sigma-Aldrich 576409 Discontinued*
Isopropanol Sigma-Aldrich 650447
N.N.Dimethylformamide Sigma-Aldrich 227056
PEG crosslinker Sigma-Aldrich 757853
PEG-maleimide Sigma-Aldrich 900339
Tetrachloroauric Acid Sigma-Aldrich 244597
Tetraethyl Orthosilicate Sigma-Aldrich 86578
*IR792 Sigma-Aldrich 425982 *Alternative
Name of Equipment
Dialysis cassette (3,500 MWCO) ThermoFIsher 87724
Centrifugal filters Millipore UFC510096
inVia confocal Raman microscope Renishaw
MATLAB (v2014b) Mathworks
PLS Toolbox (v8.0) Eigenvector research

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References

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Recherche sur le cancer numéro 145 Raman SERS nanoparticules imagerie moléculaire cancer de l’ovaire récepteur de l’acide folique ratiometry
Raman exaltée de surface résonance diffusion Nanoprobe Ratiometry pour détecter le Cancer de l’ovaire microscopique par l’intermédiaire de récepteurs de l’acide folique ciblage
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