Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Overflaten forbedret resonans Raman spredning Nanoprobe Ratiometry for å oppdage mikroskopiske eggstokkreft via folat reseptor målretting

Published: March 25, 2019 doi: 10.3791/58389
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1,3,4,5,6,7
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Department of Chemistry, The Graduate Center of the City University of New York, 3Molecular Pharmacology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (CMINT), Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 5Gerstner Sloan Kettering Graduate School of Biomedical Sciences, 6Department of Radiology, Weill Cornell Medical College of Cornell University, 7Dana-Farber Cancer Institute and Harvard Medical Center

Summary

Eggstokkreft danner metastaser i bukhulen. Her presenterer vi en protokoll for å gjøre og bruk folat-reseptor målrettet overflaten forbedret resonans Raman spredning nanoprobes som avslører disse lesjoner med høy spesifisitet via ratiometric bildebehandling. Nanoprobes administreres intraperitoneally til levende mus og avledede bildene korrelerer med histology.

Abstract

Eggstokkreft representerer den dødeligste gynecologic kreft. De fleste pasienter presentere på et avansert stadium (FIGO stadium III eller IV), når lokale metastatisk spre har allerede skjedd. Eggstokkreft har imidlertid et unikt mønster av metastatisk spredning, at svulsten implantater er utgangspunktet finnes i bukhulen. Denne funksjonen kunne aktivere, i prinsippet den fullstendig fjerning av svulsten implantater med helbredende hensikt. Mange av disse metastatisk lesjonene er mikroskopiske, noe som gjør dem vanskelig å identifisere og behandle. Nøytralisere slike micrometastases antas å være et hovedmål mot eliminerer svulst regelmessighet og oppnå langsiktig overlevelse. Raman imaging med overflaten forbedret resonans Raman spredning nanoprobes kan brukes til å avgrense mikroskopiske svulster med høy følsomhet, på grunn av sin lyse og bioorthogonal spectral signaturer. Her beskriver vi syntesen av to "smak" av slike nanoprobes: en antistoff-functionalized som mål folat reseptoren, overexpressed i mange ovarian kreft, og en ikke-målrettede kontroll nanoprobe, med ulike spektra. Nanoprobes er co-administrert intraperitoneally til musen modeller av metastatisk menneskelige ovarian adenocarcinoma. Alle dyrestudier ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Bukhulen av dyrene er kirurgisk utsatt, vasket og skannet med en Raman microphotospectrometer. Deretter Raman underskriftene til de to nanoprobes er avparet benytter en klassisk minste kvadraters passende algoritmen, og deres respektive score fordelt for å gi et ratiometric signal av folat målrettede over uønskede sonder. På denne måten er mikroskopiske metastaser visualisert med høy spesifisitet. Den viktigste fordelen med denne tilnærmingen er at lokale programmet i bukhulen, som kan gjøres enkelt under kirurgiske prosedyren, kan merke svulster uten å utsette pasienten til systemisk hydrogenion eksponering. Falske positive signaler stammer fra ikke-spesifikk binding av nanoprobes på visceral overflater kan fjernes ved å følge en ratiometric tilnærming der målrettet og ikke-målrettede nanoprobes med forskjellige Raman signaturer brukes som en blanding. Prosedyren er fremdeles begrenset av mangel på en kommersiell wide-field Raman imaging som når tilgjengelig vil tillate bruk av denne teknikken i operasjonssalen.

Introduction

Raman tenkelig med 'Overflate forbedret Raman spredning' (SERS) nanopartikler har vist store løftet i grenselinje lesjoner i en rekke innstillinger og for mange forskjellige svulst typer1,2,3,4 . Den største fordelen med SERS nanopartikler er deres fingerprint som spectral signatur, affording dem udiskutable oppdagelsen som ikke blir forvirret av biologiske bakgrunn signaler5. I tillegg intensiteten av slippes ut signalet er ytterligere forsterket med bruk av reporteren molekyler (fargestoffer) med absorbansen maxima linje med eksitasjon laser, gir opphav til 'overflate forbedret resonans Raman spredning' (SERRS) nanopartikler med enda større følsomhet6,7,8,9,10,11,12.

En barriere som må tas opp for adopsjon av SE(R)RS nanopartikler13 og mange andre hydrogenion konstruksjoner14,15 for klinisk bruk er modusen for administrasjon, som intravenøs injeksjon forårsaker systemisk eksponering av agent, og nødvendiggjør omfattende tester for å utelukke potensielle bivirkninger. I denne artikkelen presenterer vi en annen paradigme basert på anvendelse av nanopartikler lokalt i vivo, direkte i bukhulen under kirurgi, etterfulgt av litt vask fjerne alle ubundet nanopartikler1. Dette er i tråd med romanen terapeutiske metoder som er under etterforskning som også gjør bruk av lokale instillasjon agenter i bukhulen, kalt hyperthermic intraperitoneal kjemoterapi (HIPEC). Derfor bør prinsippet selv være relativt enkelt å integrere i en klinisk arbeidsflyt. Vi har studert biodistribution av nanopartikler etter intraperitoneal program og har ikke observert noen synlig absorpsjon inn i systemisk sirkulasjon1. I tillegg omgår lokalt program tilnærming lagring av nanopartikler av reticuloendothelial systemet, så antallet nanopartikler nødvendig reduseres kraftig. Men når det påføres lokalt, pleier antistoff-functionalized nanopartikler å følge opp visceral overflater selv i fravær av deres mål. For å minimere falske positive signaler på grunn av ikke-spesifikk hydrogenion vedheft, forfølge vi en ratiometric tilnærming, der en molecularly målrettet nanoprobe gir spesifikke signalet og en ikke-målrettede kontroll nanoprobe, med forskjellige Raman spektrum, kontoer for ikke-spesifikke bakgrunnen16,17. Vi har vist denne metodikken av lokalt anvendt overflaten forbedret resonans Raman ratiometric spektroskopi nylig i en musemodell av diffus eggstokkreft1.

Det overordnede målet med denne metoden er å utvikle to SERRS nanoprobes, en målrettet og en ikke-spesifikk, brukes lokalt i musen modeller for å image prevalens/overuttrykte av kreft relatert biomarkør bruker ratiometric oppdagelsen av to sonder via Raman imaging. I dette arbeidet, ble folat reseptoren (FR) valgt som målet, dette er en markør upregulated i mange ovarian kreft18,19. Raman microimaging med SERS-baserte nanopartikler har også blitt demonstrert for kreft cellen identifikasjon20. To forskjellige "smaker" av Raman nanopartikler er syntetisert, hver avledet sine fingeravtrykk fra en annen organisk fargestoff. Nanopartikler består av en stjerne-formet gull kjerne omgitt av en silica skall og demonstrere overflaten plasmon resonans på ca 710 nm. Raman reporteren (organisk fargestoff) settes inn samtidig med dannelsen av silika skall. Til slutt, for FR målrettede nanoprobes (αFR-NPs) silica skallet er konjugert med antistoffer, mens de ikke-målrettede nanoprobes (nt-NPs) er paddivert med en monolayer av polyetylen-glykol (PEG).

Denne teknikken ble brukt til å tilordne mikroskopiske svulster i en mus xenograft modell av diffus metastatisk eggstokkreft (SKOV-3), demonstrere brukbarheten til i vivo bruk. Det kan også utvides for bruk i forbrukeravgift vev, svulst phenotyping eller margin besluttsomhet etter debulking som vist i en beslektet studie21.

SERRS nanoprobes gir en solid plattform for etablering av flere målrettede koder for biomarkers, syntetiserte med grei kjemiske reaksjoner som skissert skjematisk i figur 1. Her presenterer vi protokollen for syntese av de to typene SERRS nanoprobes (seksjoner 1-3), utviklingen av en egnet eggstokkreft musemodell (del 4), administrasjon av nanoprobes og bildebehandling (del 5) og endelig dataanalyse og visualisering (inndelingen 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyrestudier ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av Memorial Sloan Kettering Cancer Center (#06-07-011).

1. gull Nanostar Core syntese

Merk: Gold nanostars brukes som kjerner for begge smaker av SERRS nanoprobes i dette eksperimentet.

  1. Forberede 800 mL 60 mM askorbinsyre (C6H8O6) løsning i deionisert (DI) vann og 8 mL 20 mM tetrachloroauric syre (HAuCl4) løsning i DI vann. Cool til 4 ° C.
  2. Utføre dette trinnet reaksjon på 4 ° C. Plasser en konisk kolbe som inneholder 800 mL av askorbinsyre løsningen på en magnetic røre plate og indusere en jevn vortex. Raskt legge til 8 mL tetrachloroauric sur løsning inn i virvelen. Innen sekunder, nanostars vil danne og løsningen vil anta en mørk blå farge. Fargen helst blir rosa eller lilla, betegner dannelsen av nanospheres, suspensjon bør forkastes og syntese reattempted.
  3. Hell nanostar suspensjon i 50 mL konisk rør og sentrifuge for 20 min (4 ° C, 3,220 x g). Sug opp nedbryting forlate omtrentlig 200 µL av løsningen i hver retning. Vær forsiktig for ikke å forstyrre pellet av nanopartikler nederst på røret.
    Merk: Nedbryting bør ha en blå tone på grunn av gjenværende suspendert nanostars.
  4. Bruker brønnene, agitere løsningen å suspendere og samle nanopartikler fra hver rør. Pellet kan komprimeres på bunnen av røret og vil ikke resuspend selv med energisk pipettering-Forkast denne delen.
  5. Overføre hydrogenion suspensjon til kassetteninn dialyse (MWCO 3.5 kDa) og dialyze minst tre dager mot 2 L DI vann, endring av vann daglig. Lagre nanostars i dialyse ved 4 ° C i opptil en måned med vann endre hver 3-4 dager.
    Merk: Nanostars bør holdes i dialyse til nødvendig for silication reaksjonen, som beskrevet i del 2.

2. dannelsen av silika skallet

Merk: To utgaver av Raman nanoprobes er syntetisert. Syntese prosedyren er den samme for begge, med den eneste forskjellen er Raman reporter molekylet (farge) brukes. I dette eksperimentet brukes IR780-perklorat og IR140. Reaksjonen skal alltid utføres i plastbeholdere. Syntese er skalerbar og kan justeres for ønsket mengde injectate kreves. Her, er en middels satsvise syntese beskrevet som kan skaleres lineært til lavere eller høyere volumer til den samme konsentrasjoner og reaksjonstid. Reaksjonene for de to SERRS nanoprobe kan utføres parallelt. Ta hensyn til unngå kryss-kontaminering. Sonication skal utføres for redispersion av hydrogenion pellets etter sentrifugering vaske trinn, eller når nanopartikler lå lenger enn en time. Sonication skal utføres før nanopartikler er tydelig suspendert i løsningen, typisk for 1 s.

  1. I rør A (en 50 mL konisk rør), bland 10 mL isopropanol og 500 µL av TAKHOS, 200 µL DI vann, 60 µL fargestoff (IR780-perklorat eller IR140, 20 mM i DMF (vannistedenfor)).
  2. I rør B (15 mL konisk rør), bland 3 mL etanol og 200 µL av ammonium hydroksid. Sonicate nanostars fra trinn 1.4 spre noen klynger i løsningen og legge 1,2 mL nanostars til røret.
    Merk: ammonium hydroksid løsningen er svært flyktige og vanskelig å Pipetter nøyaktig. Lagre den på 4 ° C, inntil nødvendig, å lette pipettering.
  3. Plasser Tube A på en vortex mikser og indusere en jevn vortex. Raskt legge til innholdet i rør B inn i virvelen og holde blande for ca 5 s. øyeblikkelig overføre til en shaker og la reagerer i 15 min mens riste på 300 rpm, ved romtemperatur.
  4. Etter den 15 min inkubering, slukke reaksjonen ved å legge til etanol å fylle 50 mL tube. Sentrifuge for 20 min på 3,220 x g og 4 ° C.
  5. Sug opp nedbryting, forlater ca 0,5 mL løsning, pass på ikke å forstyrre pellet. Legg 1 mL av etanol og røre med en pipette å resuspend nanopartikler. Overføre til en 1,5 mL sentrifuge rør og vask 4 ganger med etanol sentrifugering 11.000 x g for 4 min, aspirating nedbryting og resuspending pellet av ultrasonication ca 1 s.
    Merk: På dette stadiet, kan den silicated nanopartikler functionalized, som beskrevet i del 3, eller resuspended i DI vann med en ekstra vask trinn, for lagring på 4 ° C i opptil en uke.

3. overflate Functionalization

Merk: IR780 SERRS nanoprobes vil bli bøyd med folat reseptor målretting antistoffer via en PEG crosslinker til skjemaet αFR-NPs; IR140 SERRS kontroll nanoprobes vil bli bøyd med en passivating pinne monolayer, for nt-NPs. Begge smaker dannes via en thiol-maleimide reaksjon i separate, men parallelle reaksjoner.

  1. Vask nanopartikler to ganger av sentrifugering 11.000 x g for 4 min aspirating nedbryting og resuspending pellet i 1 mL av etanol ved ultrasonication. Gjenta trinnet vask igjen, men redisperse i 1 mL av 85% etanol, 10% 3-MPTMS (3-mercaptopropyltrimethoxysilane) og 5% DI vann. Inkuber ved romtemperatur for 1-2 h å innføre thiols på partikkel overflaten.
  2. Vask thiol-functionalized-nanopartikler sentrifugering 11.000 x g for 4 min, aspirating nedbryting og resuspending pellet av ultrasonication, to ganger i etanol, to ganger i DI, og til slutt i HEPES (4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic acid) buffer (10 mM, pH 7.1), og sett til side.
    Merk: MES (2-(N- morpholino) ethanesulfonic acid) buffer eller HEPES skal brukes. Buffere med høyere saltholdighet, som PBS (fosfat-bufret saltvann), kan indusere hydrogenion aggregering.
  3. For antistoffer functionalized αFR-NPs, reagere 200 µg av antistoffer (anti-folat bindende protein antistoff klone [LK26]) med tidoblet molar overskudd av PEG-crosslinker (poly(ethylene glycol) (N-hydroxysuccinimide 5-pentanoate) Eter N′-(3- maleimidopropionyl) aminoethane (CAS: 851040-94-3), i dimethyl sulfoxide (DMSO)) i 500 µL MES bufferen (10 mM, pH 7.1) i 30 min.
  4. Fjern overflødig crosslinker og konsentrere antistoff ved sentrifugering antistoff-pinne løsningen i en sentrifugal filter (MWCO 100 kDa). De centrifugal filtrene som brukes i denne studien, utføre sentrifugering for 10 min 14.000 x g og 23 ° C. Gjenopprette konjugert antistoffer i en fersk tube invertere filteret og sentrifugering 1000 x g i 2 minutter.
  5. Pipetter IR780 nanopartikler trinn 3,2 inn i røret med antistoffer og agitere med Pipetter å blande. Inkuber blandingen for minst 30 minutter til romtemperatur, eller, alternativt på 4 ° C over natten til skjemaet αFR-NPs.
  6. Danne nt-NPs, legge til 1% w/v-metoksy-terminert (m) PEG5000-maleimide (CAS: 99126-64-4) oppløst i DMSO til IR140 SERRS nanopartikler fra trinn 3.2 og la reagerer i 500 µL MES buffer (10 mM, pH 7.1) i minst 30 min i romtemperatur, eller alternativt på 4 ° C overnatting.
  7. Administrasjonen å mus (delen 5) Nedspinning begge nanoprobe smaker 11.000 x g for 4 min, Sug opp nedbryting for å fjerne løsning med gratis Ureagert antistoffer/pinne og redisperse hver smak i MES buffer (10 mM, pH 7.1) på 600 pM konsentrasjon . Når resuspending av nanopartikler, redusere unødvendige eksponering for ultralyd, å forhindre denaturering av antistoffer.

4. mus modell utvikling

  1. Opprette en jevn kultur for menneskelig ovarian adenocarcinoma (SKOV-3) cellen linje. Eventuelt for å aktivere overvåking via bioluminescens/fluorescens, bruke transfekterte SKOV-3 Luc+/GFP+ celler. Kultur cellene i RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium med 10% fosterets kalv serum og passage to ganger i uken. Inkuber celler med 0,25% trypsin/0.05% EDTA i 3 minutter å fjerne, og deretter vaske og resuspend i PBS på 2 x 106 celler/100 µL gassløft.
  2. For å etablere ovarian micrometastasis modellen, injisere 200 µL av suspendert SKOV-3 celler intraperitoneally i athymic kvinnelige mus (FOXn1nu/FOXn1nu mus, 6-8 uker gamle). Spres peritoneal spredning skjer i ca 4 uker. Hvis bruker SKOV-3 Luc+ celler, kan tumorveksten overvåkes med bioluminescens ved å tilsette 2 mg bille luciferin i 50 µL PBS via retroorbital injeksjon.

5. Nanoprobe injeksjon og bildebehandling

  1. Forberede nanoprobes (αFR-NPs og nt-NPs) som beskrevet i delene 1-3 og bland på en 1:1 ratio, for en siste konsentrasjon av 300 pM av hver type MES buffer (10 mM, pH 7.1). Eventuelt forberede referanse standarder 30 pM av nanoprobe smaker i små (100 µL) konisk rør.
  2. Injisere intraperitoneally 1 mL av hydrogenion suspensjon i hver mus og forsiktig massasje magen for å distribuere nanopartikler i bukhulen. Tilbake musen til kabinettet. Etter 25 eller flere minutter, euthanize musen via CO2 kvelning.
  3. Fest musen på en kirurgisk plattform, i supine posisjon (for hele magen imaging plattform må være monterbar på oppreist mikroskop scenen).
    1. Bruke taggete tang og disseksjon saks, fjerne hud for å avdekke peritoneum og utføre en stor sagittal snitt (mellom 2 og 3 cm i lengde) for å avsløre hele magen. Fest peritoneal flaps på plattformen. Vask innsiden av bukhulen med minst 60 mL PBS bruker en plast sprøyting flasken.
      Merk: For å aktivere uhindret avbilding av hele magen, må tarmen mobiliseres eller excised. For excision, resect med en ligatur av hvem fartøyene for å redusere blødning i bukhulen.
    2. Alternativt bilde bestemte organer, avgiftsdirektoratet dem etter PBS vask og plassere dem i en microscope skyve.
  4. Overføre plattformen eller lysbildet til en Raman microspectrophotometer med oppreist optiske konfigurasjon og en motorisert scene for bildebehandling; bruke en kommersiell system med et 300 mW 785 nm diode laser, med en rist av 1200 grooves per mm, sentrert på 1,115 cm-1.
    1. Fokus på området av interesse med hvitt lys optikk, parfocal med Raman laser. Velg området som skal avbildes og ønsket oppløsning; i denne rapporten en høyhastighets vinningen måte ble brukt (spectra ervervet under kontinuerlig laser lys med mikroskopet scenen konstant bevegelse, med effektiv romlig oppløsning 14.2 µm ved 200 µm; på 5 x forstørrelse, 100 mW strøm på mål, og < 100 ms eksponering per poeng).
      Merk: Rør med referanse-nanoprobes fra trinn 5.1 kan plasseres innenfor fotografert området hvis ønskelig, gi intern referanse standarder for senere analyse. Kontroller at ingen uvedkommende lys kilder enn laser nå målet.
  5. Eventuelt forberede prøven for histologiske behandling og validering av fiksering på 4% paraformaldehyde i PBS overnatting på 4 ° C. Skyll med PBS på 4 ° C i 15 min minst to ganger. Holde prøven i 70% etanol i vann til standard histologiske behandling og parafin innebygging. For histologiske validering av tumorer, kan inndelinger (5 µm tykk) fra forskjellige dypet av parafin blokken være farget med hematoxylin og eosin (H & E).

6. databehandling og visualisering

Merk: Alle behandling ble utført med en grafisk bruker grenseflate egenutviklede, bruk av kommersiell programvare. Alle funksjonene som brukes har generiske ekvivalenter i andre databehandlingsmiljøer.

  1. Få referanse spectra for to smaker, ved forhører ren suspensjoner av hver. Til referanse spectra kan utledes fra punkt skanninger av nanoprobes, imaging av nanoprobes i godt-plater, eller ved å inkludere interne referanser i eksperimentell skanner i referanse rør (se trinn 5.1).
  2. Forhåndsbehandle til referanse spectra, ved hjelp av planlagte subtraksjon (Whittaker filter, λ = 200), normalisering av området under kurven og Savitzky-Golay avledede filter (annengrads polynom passer, første orden deriverte, bredde = 15 trinn). Disse preprocessed spectra vil tjene som referanser for klassisk minste kvadraters (CLS) modellen.
  3. Forhåndsbehandle eksempeldataene fra bildet på samme måte som til referanse spectra. Få CLS score for hver prøvepunkt ved hjelp av en tilgjengelig CLS algoritme. Direkte CLS (DCLER) resultatet er bare koordinatene til projeksjon av et utvalg spektrum til det lineære området definert av generalisert inverse matrisen (Moore-Penrose inverse) til referanse spectra. Andre passende algoritmer kan brukes (positiv minste kvadraters, delvis minste kvadraters eller andre).
    Merk: Noen passende algoritmer kan gi opphav til negativ score, som i denne sammenheng ikke er fysisk. Hvis dette er tilfelle, en terskel kan angis til å ekskludere negativ score, eller en begrenset positiv minste kvadraters algoritme være ansatt i stedet.
  4. Beregne pointwise forholdet mellom score på referansen for den målrettede nanopartikler (scoreαFR) over score på referansen for den ikke-målrettede nanopartikler (scorent). Hvis resultatet er positiv, kan forholdet uttrykkes i en logaritmisk mote:
    R = Logg10(scoreαFR/ scorent).
    Forholdet R vises best i en avvikende fargeskala sentrert på null, uttrykke den relative overfloden av sonder i størrelsesordener. Det resulterende bildet kan overlappes på hvitt lys bildet av prøven, å avsløre områder av folat reseptoren overuttrykte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For kvalitetskontroll, kan nanopartikler karakteriseres ved hjelp av en rekke metoder under synteseprosessen, inkludert TEM, Distribusjonslister, hydrogenion sporing analyse og UV/Vis absorbansen spektroskopi, som vist i figur 2.

På denne måten størrelsen på gull nanostar kjernen (beskrevet her i Seksjon 1), dannelsen av silika shell (inndeling 2) og påfølgende overflate functionalization (del 3) kan være bekreftet (figur 2). Vanligvis størrelsen (etter diameter) av gull nanostar kjernen forventes å være rundt 80 nm og silica skallet er rundt 20 nm tykk, gjør den totale silicated hydrogenion størrelsen rundt 120 nm og rundt 140 nm etter Bøyning med αFR-antistoffer. UV/Vis absorbansen kan også brukes til å kontrollere morfologi av nanopartikler. Nanostar kjerner i vann har vanligvis en absorbansen maksimum på 670 nm, mens etter silication maksimal skifter til rundt år 710 nm. Absorbansen maxima på lavere bølgelengder er et tegn på sfærisk morfologi eller samling. Vanlig reaksjon avkastning og konsentrasjoner er vist i tabell 1 og avhenger sterkt pipettering teknikk under vask trinnene.

Hvert punkt fra Raman søket inneholder et spektrum for en arrestert plassering. Disse spectra er en lineær superposisjon av nanoprobes' SERRS signal og noen bakgrunn fluorescens. Til spectra kan behandlet for å fjerne fluorescensen og normalisert enhet området å kompensere for signalstyrke, før du installerer CLS modellen (beskrevet i del 6), som vist i Figur 3. Representant bilder for score på hver av nanoprobe referanse spectra og deres pointwise forholdet er vist i Figur 4. Selv om hvert poeng individuelt ikke gir bestemt lokalisering av svulster, avslører forholdet tilstedeværelsen av spres mikroskopiske spredning.

Trinn Første volum Innledende konsentrasjon Siste volum Siste konsentrasjon
1. Nanostar kjernen 8 mL HAuCl4 20 mM HAuCl4 5 mL 1.3 nM
2. Silication 1.2 mL 1.3 nM 1.2 mL 0,5 nM
3.1. Thiolation 1 mL 0,5 nM 1 mL 0.43 nM
3.5. Bøyning 1 mL 0.43 nM 1 mL 0,39 nM

Tabell 1: hydrogenion avkastning etter hvert reaksjon trinn. Konsentrasjonen er omtrentlige. Utbyttet ble fastsatt hydrogenion sporing analyse, med to uavhengige synteser og 5 uavhengige målinger fra hver.

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk av syntese og anvendelse av ratiometric SERRS nanoprobe bildebehandling. (1) gull nanostars er syntetisert som beskrevet i del 1. (2) en silica skall er dannet rundt gull nanostar kjerner og Raman reporter molekyler (infrarød fargestoffer IR-780-perklorat og IR-140) brukes til å opprette to forskjellige hydrogenion smaker, som beskrevet i del 2. (3) på overflaten av nanopartikler er belagt med thiols, som beskrevet i avsnitt 3.1, aktivere ytterligere overflaten functionalization. IR-780 smaken nanopartikler er konjugert med en anti-folat reseptor antistoff, mens den IR-140 de er paddivert med et lag av PEG - 5 k som beskrevet i delene 3.3 å 3.6. (4) en musemodell av diffus intraperitoneal ovarian metastatisk spredning er utviklet som beskrevet i del 4, og når du er klar, SERRS-nanoprobes administreres på intraperitoneally. (5) mus er euthanized, og magen kirurgisk utsatt for å aktivere Raman imaging som beskrevet i seksjon 5. (6) Raman spectra analyseres pointwise for å bestemme den relative overfloden av to sonder og generere kart ratiometric av folat reseptoren overuttrykte som beskrevet i del 6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Fysiske karakterisering av SERRS nanoprobes. Nanopartikler kan utsettes for kvalitetskontroll etter hver del av syntese. Overføring elektronmikroskop (TEM) avslører form av gull kjernen og vellykket dannelsen av silika skallet uten hydrogenion samling; Skala bar = 100 nm. Dynamisk lysspredning (DLS) kan måle størrelsen og ζ-potensialet i nanopartikler bekrefte vellykket silication og functionalization. UV/Vis absorbansen kan brukes til å bekrefte tilstedeværelse av en plasmonic topp rundt 670 nm for nanostars, skifter til 710 nm etter silication. Raman målinger avsløre tilstedeværelsen av de unike spektra av hver smak gjennom syntese. Intensiteten av nanostar spekteret, med ingen karakteristiske topper, ble forsterket av 100 x for vekt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Behandling av Raman spectra. Rå spectra består av nanoprobes' SERRS signatur lagt oppå et bredt fluorescens band. Med planlagte subtraksjon fluorescens bandet er fjernet, og Raman toppene blir fremtredende. For å oppdage spectral signatur nanopartikler uansett intensitet, er hver spektrum (referanser og prøver både) normalisert til enhet. Til slutt, utjevning derivat brukes et filter for å øke Raman toppene, samtidig redusere støy. Behandlet referanse spectra brukes til å utvikle en CLS modell, for å klassifisere behandlet eksempel spectra basert på forholdet R. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Ratiometric avbildning av eggstokkreft micrometastases i magen. Raman imaging av eksponert magen av mus, med omfattende ovarian metastaser som åpenbart av bioluminescens tenkelig. Hvert punkt av skanningen har et spekter, som er behandlet (inndelingen 6 Figur 3), og scoret basert på en CLS modell å få score på de to referansene: αFR-NP vist i rødt, og nt-NP i blått. Resultatet er deretter delt pointwise, for å avsløre den relative overfloden av to sonder som et forhold. Eventuelt av terskelverdi forholdet, "positiv" områder kan være lagt på en optisk image av magen, resection eller andre fokusert behandlinger. Figur 4 er en tilpasset versjon fra referanse1, med tillatelse fra journalen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet her gir instruksjoner for syntese av to "smak" av SERRS nanoprobes og deres arbeid i mus for Raman imaging ovarian svulst overexpressing folat reseptoren, bruker en ratiometric algoritme. Den største fordelen med Raman imaging over andre optisk tenkelig teknikker (som fluorescens) er høy spesifisitet av nanoprobe signalet som ikke kan gjøres til skamme med noen signaler av biologisk opprinnelse. I denne legemliggjørelsen av Raman imaging, administreres nanopartikler ikke intravenøst, men lokalt, via en intraperitoneal injeksjon etterfulgt av et enkelt vask skritt. Denne metodikken, når oversatt til kliniske arena, vil representere en elegant løsning å aktivere kirurger å visualisere og dermed resect alle eggstokkreft implantater, selv de som er for liten til å oppdage med det blotte øye, og som ikke kan rettes med en systemisk injisert tenkelig agent på grunn av deres manglende nærings-fartøy koblet til systemisk sirkulasjon. Samtidig, som våre SERRS nanopartikler ikke er resorbed i systemisk sirkulasjonen, er organisasjonen for bivirkninger minimert. Vår studie er et eksempel på økende bevis for at designet nanoconstructs kan gi unike fordeler fremfor konvensjonelle bildebehandling og terapi teknologier22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35,36,37,38.

SERRS-nanoprobes beskrevet her er biologisk inert og har vært ansatt svulst avgrensning i musen modeller av flere typer kreft. Reaksjonen for dannelsen av silika skallet (samtidig med reporter fargestoff innkapsling) er en forbedret versjon av vår tidligere rapportert syntese1,7,8, som er mindre utsatt for hydrogenion aggregering og dannelsen av "gratis silica" nanopartikler (uten gull kjerne). Reaksjonen kan brukes med en rekke kommersielt tilgjengelige infrarød organisk fargestoffer, enn de som presenteres her, for å gi en stor samling av Raman smaker. Den resulterende signal intensiteten, er imidlertid avhengig av fargestoffs affinitet til gull og andre faktorer. I tillegg bør mengden farge lagt til reaksjonen fastsettes på per-dye basis, visse molekyler og deres counterions forårsake samling av gull nanostars mer enn andre. Ved alvorlig hydrogenion aggregering, bør mengden av fargestoff brukes reduseres. Samling av gull kjernene er uønsket, som kan føre til alvorlig variasjon i Raman signal intensitet og komplisere de hentede dataene. Dannelsen av gratis silika er for det meste harmløse, som det gir ingen Raman signal. Men under functionalization vil antistoffer følge silica nanopartikler, reduseres målretting effektiviteten av metoden. Tykkelsen på skallet silika, avhenger av reaksjonstid, temperatur og mengden vann lagt (trinn 2.1). Hvis det resulterende silica skallet anses for tynn (figur 1, øverst til høyre), kan en eller flere av parameterne økes riktig.

Med hensyn til datainnsamling avhenger kvalitet sterkt lysstyrken på nanoprobes. Dette blir spesielt tydelig når utføre raske Raman oppkjøp, som beskrevet i seksjon 5. For å sikre at dataene er tilstrekkelig merkbar fra støy, til spectra bør undersøkes, og tilstedeværelsen av representant Raman topper sonder bekreftet. Hvis signalet er for svakt, kan du øke eksponeringstiden per poeng. Men kan denne tilnærmingen føre til uoverkommelig lang skanner eller svært lav romlig oppløsning. For å sikre reproduserbarhet og konsistens, kalibrering av Raman skanneren skal utføres i henhold til produsentens anbefaling og gjøres vanligvis ved hjelp av en felles standard (f.eks, en silicon wafer).

En av de største styrkene til denne metoden er dens allsidighet. Forskjellige svulst typer kan avbildes ved hjelp av spesifikke antistoffer målretting ulike molekylære markører. I tillegg nanoprobes beskrevet her kan administreres til dyremodeller-intraperitoneally eller intravenøst, men også bruker samme teknikker, de kan brukes stain vev, fast eller ferske excised.

Selv om ratiometric teknikken gir spesifisitet for påvisning av mikroskopiske svulster, er distribusjon av individuelle sonder ikke spesifikke for svulst områdene. Dette betyr at theranostic teknikker som photothermal/Fotodynamisk terapi eller stoff lasting ikke ville være ideelt, som terapi vil bli levert til sunn områder også. Én potensielle terapeutiske bruken by av denne teknikken ville være den automatiserte ablation av microtumors etter ratiometric.

Vi håper at denne lokale, ratiometric tilnærming til Raman imaging kan bane vei for bruk av SERRS nanoprobes, etter den nødvendige kliniske forsøk, som molekylær tenkelig agent hos pasienter. Denne metoden ble utviklet for å være kompatible med fremtidige bruksmuligheter hos mennesker, som nanopartikler kan være administrert til og fjernet fra bukhulen med enheter som allerede er klinisk bruk for HIPEC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

• MFK er oppført som en oppfinner på flere utstedt eller patentsøknader knyttet til dette arbeidet. MFK er medgrunnlegger av RIO Imaging, Inc., som tar sikte på å oversette SERRS nanopartikler til klinikkene.

• Forfatterne erklærer at de har ingen andre konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Følgende finansiering kilder (til MFK) er anerkjent: NIH R01 EB017748, R01 CA222836 og K08 CA16396; Damon Runyon-Rachleff Innovation Award DRR-29-14, Pershing Square Sohn premie Pershing Square Sohn Cancer Research Alliansen og MSKCC senter for molekylær bildebehandling & nanoteknologi (CMINT) og teknologiutvikling gir. Takk er også utvidet til støtte finansiering støtte fra MSKCC NIH Core Grant (P30-CA008748).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Reagent
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A5960
3-MPTMS Sigma-Aldrich 175617
Ammonium hydroxide (28%) Sigma-Aldrich 338818
Anti-Folate Receptor antibody [LK26]  AbCam ab3361
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 276855
Dimethyl sulfoxide (anhydrous) Sigma-Aldrich 276855
Ethanol Sigma-Aldrich 792780
IR140 Sigma-Aldrich 260932
IR780 perchlorate* Sigma-Aldrich 576409 Discontinued*
Isopropanol Sigma-Aldrich 650447
N.N.Dimethylformamide Sigma-Aldrich 227056
PEG crosslinker Sigma-Aldrich 757853
PEG-maleimide Sigma-Aldrich 900339
Tetrachloroauric Acid Sigma-Aldrich 244597
Tetraethyl Orthosilicate Sigma-Aldrich 86578
*IR792 Sigma-Aldrich 425982 *Alternative
Name of Equipment
Dialysis cassette (3,500 MWCO) ThermoFIsher 87724
Centrifugal filters Millipore UFC510096
inVia confocal Raman microscope Renishaw
MATLAB (v2014b) Mathworks
PLS Toolbox (v8.0) Eigenvector research

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oseledchyk, A., Andreou, C., Wall, M. A., Kircher, M. F. Folate-Targeted Surface-Enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detection of Microscopic Ovarian Cancer. ACS Nano. 11 (2), 1488-1497 (2017).
  2. Andreou, C., et al. Imaging of Liver Tumors Using Surface-Enhanced Raman Scattering Nanoparticles. ACS Nano. 10 (5), 5015-5026 (2016).
  3. Karabeber, H., et al. Guiding brain tumor resection using surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and a hand-held Raman scanner. ACS Nano. 8 (10), 9755-9766 (2014).
  4. Kircher, M. F., et al. A brain tumor molecular imaging strategy using a new triple-modality MRI-photoacoustic-Raman nanoparticle. Nature Medicine. 18 (5), 829-834 (2012).
  5. Andreou, C., Kishore, S. A., Kircher, M. F. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy: A New Modality for Cancer Imaging. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1295-1299 (2015).
  6. Harmsen, S., et al. Rational design of a chalcogenopyrylium-based surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobe with attomolar sensitivity. Nature Communications. 6, 6570 (2015).
  7. Harmsen, S., et al. Surface-enhanced resonance Raman scattering nanostars for high-precision cancer imaging. Science Translational Medicine. 7 (271), 271ra277 (2015).
  8. Harmsen, S., Wall, M. A., Huang, R., Kircher, M. F. Cancer imaging using surface-enhanced resonance Raman scattering nanoparticles. Nature Protocols. 12 (7), 1400-1414 (2017).
  9. Huang, R., et al. High Precision Imaging of Microscopic Spread of Glioblastoma with a Targeted Ultrasensitive SERRS Molecular Imaging Probe. Theranostics. 6 (8), 1075-1084 (2016).
  10. Iacono, P., Karabeber, H., Kircher, M. F. A "schizophotonic" all-in-one nanoparticle coating for multiplexed SE(R)RS biomedical imaging. Angewandte Chemie, International Edition in English. 53 (44), 11756-11761 (2014).
  11. Spaliviero, M., et al. Detection of Lymph Node Metastases with SERRS Nanoparticles. Molecular Imaging and Biology. 18 (5), 677-685 (2016).
  12. Nayak, T. R., et al. Tissue factor-specific ultra-bright SERRS nanostars for Raman detection of pulmonary micrometastases. Nanoscale. 9 (3), 1110-1119 (2017).
  13. Thakor, A. S., et al. The fate and toxicity of Raman-active silica-gold nanoparticles in mice. Science Translational Medicine. 3 (79), 79ra33 (2011).
  14. Liu, J., et al. Effects of Cd-based Quantum Dot Exposure on the Reproduction and Offspring of Kunming Mice over Multiple Generations. Nanotheranostics. 1 (1), 23-37 (2017).
  15. Wu, N., et al. The biocompatibility studies of polymer dots on pregnant mice and fetuses. Nanotheranostics. 1 (3), 261-271 (2017).
  16. Garai, E., et al. High-sensitivity real-time, ratiometric imaging of surface-enhanced Raman scattering nanoparticles with a clinically translatable Raman endoscope device. Journal of Biomedical Optics. 18 (9), 096008 (2013).
  17. Wang, Y. W., et al. Rapid ratiometric biomarker detection with topically applied SERS nanoparticles. Technology (Singap World Sci). 2 (2), 118-132 (2014).
  18. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
  19. Vergote, I. B., Marth, C., Coleman, R. L. Role of the folate receptor in ovarian cancer treatment: evidence, mechanism, and clinical implications. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 41-52 (2015).
  20. Fasolato, C., et al. Folate-based single cell screening using surface enhanced Raman microimaging. Nanoscale. 8 (39), 17304-17313 (2016).
  21. Wang, Y. W., et al. Raman-Encoded Molecular Imaging with Topically Applied SERS Nanoparticles for Intraoperative Guidance of Lumpectomy. Cancer Research. 77 (16), 4506-4516 (2017).
  22. Andreou, C., Pal, S., Rotter, L., Yang, J., Kircher, M. F. Molecular Imaging in Nanotechnology and Theranostics. Molecular Imaging and Biology. 19 (3), 363-372 (2017).
  23. Chitgupi, U., Qin, Y., Lovell, J. F. Targeted Nanomaterials for Phototherapy. Nanotheranostics. 1 (1), 38-58 (2017).
  24. Choi, D., et al. Iodinated Echogenic Glycol Chitosan Nanoparticles for X-ray CT/US Dual Imaging of Tumor. Nanotheranostics. 2 (2), 117-127 (2018).
  25. Dubey, R. D., et al. Novel Hyaluronic Acid Conjugates for Dual Nuclear Imaging and Therapy in CD44-Expressing Tumors in Mice In Vivo. Nanotheranostics. 1 (1), 59-79 (2017).
  26. Gupta, M. K., et al. Recent strategies to design vascular theranostic nanoparticles. Nanotheranostics. 1 (2), 166-177 (2017).
  27. Huang, Y. J., Hsu, S. H. TRAIL-functionalized gold nanoparticles selectively trigger apoptosis in polarized macrophages. Nanotheranostics. 1 (3), 326-337 (2017).
  28. Pal, S., Harmsen, S., Oseledchyk, A., Hsu, H. T., Kircher, M. F. MUC1 Aptamer Targeted SERS Nanoprobes. Advanced Functional Materials. 27 (32), (2017).
  29. Zanganeh, S., et al. Iron oxide nanoparticles inhibit tumour growth by inducing pro-inflammatory macrophage polarization in tumour tissues. Nat Nanotechnol. 11 (11), 986-994 (2016).
  30. Lee, J., Lee, Y. M., Kim, J., Kim, W. J. Doxorubicin/Ce6-Loaded Nanoparticle Coated with Polymer via Singlet Oxygen-Sensitive Linker for Photodynamically Assisted Chemotherapy. Nanotheranostics. 1 (2), 196-207 (2017).
  31. Li, R., Zheng, K., Yuan, C., Chen, Z., Huang, M. Be Active or Not: the Relative Contribution of Active and Passive Tumor Targeting of Nanomaterials. Nanotheranostics. 1 (4), 346-357 (2017).
  32. Lin, S. Y., Huang, R. Y., Liao, W. C., Chuang, C. C., Chang, C. W. Multifunctional PEGylated Albumin/IR780/Iron Oxide Nanocomplexes for Cancer Photothermal Therapy and MR Imaging. Nanotheranostics. 2 (2), 106-116 (2018).
  33. Roberts, S., et al. Sonophore-enhanced nanoemulsions for optoacoustic imaging of cancer. Chemical Science (Royal Society of Chemistry: 2010). 9 (25), 5646-5657 (2018).
  34. Liu, L., Ruan, Z., Yuan, P., Li, T., Yan, L. Oxygen Self-Sufficient Amphiphilic Polypeptide Nanoparticles Encapsulating BODIPY for Potential Near Infrared Imaging-guided Photodynamic Therapy at Low Energy. Nanotheranostics. 2 (1), 59-69 (2018).
  35. Liu, R., Tang, J., Xu, Y., Zhou, Y., Dai, Z. Nano-sized Indocyanine Green J-aggregate as a One-component Theranostic Agent. Nanotheranostics. 1 (4), 430-439 (2017).
  36. Sneider, A., VanDyke, D., Paliwal, S., Rai, P. Remotely Triggered Nano-Theranostics For Cancer Applications. Nanotheranostics. 1 (1), 1-22 (2017).
  37. Wall, M. A., et al. Surfactant-Free Shape Control of Gold Nanoparticles Enabled by Unified Theoretical Framework of Nanocrystal Synthesis. Advanced Materials. 29 (21), (2017).
  38. Sonali,, et al. Nanotheranostics: Emerging Strategies for Early Diagnosis and Therapy of Brain Cancer. Nanotheranostics. 2 (1), 70-86 (2018).

Tags

Kreftforskning problemet 145 Raman SERS hydrogenion molekylær bildebehandling eggstokkreft folat reseptor ratiometry
Overflaten forbedret resonans Raman spredning Nanoprobe Ratiometry for å oppdage mikroskopiske eggstokkreft via folat reseptor målretting
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Andreou, C., Oseledchyk, A.,… More

Andreou, C., Oseledchyk, A., Nicolson, F., Berisha, N., Pal, S., Kircher, M. F. Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting. J. Vis. Exp. (145), e58389, doi:10.3791/58389 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter