Summary
Yumurtalık kanseri metastaz peritoneal kavite oluşturur. Burada, biz yapmak için bir iletişim kuralı mevcut ve kullanım folat reseptör yüzey gelişmiş rezonans yüksek özgüllük ile ratiometric görüntüleme ile bu lezyonlar ortaya Raman saçılması Nano sondaları hedef. Nano-sondalar intraperitoneally yaşayan fareler için yönetilen ve türetilmiş görüntüleri de Histoloji ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir.
Abstract
Yumurtalık kanseri en ölümcül jinekolojik malignite temsil eder. Çoğu hasta bir ileri aşamada (FIGO Aşama III veya IV), mevcut ne zaman yerel metastatik yaymak zaten oluştu. Ancak, yumurtalık kanseri tümörü implantlar başlangıçta peritoneal kavite içinde yer alan benzersiz bir desen metastatik yayılan sahiptir. Bu özellik, ilke olarak, tümör implantlar iyileştirici niyetiyle tam rezeksiyon sağlayabilir. Mikroskobik, yapım onları teşhis ve tedavi etmek zor bu metastatik lezyonlar çoğu. Böyle micrometastases nötralize tümörün nüks ortadan kaldırarak ve uzun süreli sağkalım sağlanması yolunda önemli bir hedef olduğuna inanılıyor. Yüzey gelişmiş rezonans Raman saçılması nano-sondalar Imaging Raman onların parlak nedeniyle yüksek hassasiyet ile mikroskobik tümör ve bioorthogonal spektral imza betimlemek için kullanılabilir. Burada, biz iki 'tatlar' böyle nano-sondalar sentezi tarif: folat reseptör hedefleyen bir antikor functionalized — birçok yumurtalık kanserleri overexpressed — ve farklı spectra ile bir sigara hedefli denetim nanoprobe. Nano-sondalar co intraperitoneally fare modelleri metastatik insan yumurtalık adenokarsinom için yönetilen vardır. Tüm hayvan çalışmaları kurumsal hayvan bakım ve Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi, kullanım Komitesi tarafından kabul edildi. Hayvanlar Periton boşluğuna cerrahi olarak maruz, yıkanmış ve Raman microphotospectrometer ile inceden inceye gözden geçirmek. Daha sonra iki nano-sondalar Raman imzalarını klasik en küçük kareler uygun algoritmasıyla bilgisini iletmiyor ve folat hedefli bir ratiometric sinyal üzerinde hedeflenmemiş probları sağlamak için ilgili puanları bölünmüş. Bu şekilde, mikroskobik metastaz yüksek özgüllük ile görüntülenir. Bu yaklaşımın ana parası peritoneal kavite içine yerel uygulama böyle — hangi-ebilmek kılınmak kolayca cerrahi işlem sırasında — tümörler hasta sistemik nanopartikül maruz tabi olmadan etiketleyebilirsiniz. Yanlış pozitif nano-sondalar visseral yüzeyler üzerine belirsiz bağlama kaynaklanan farklı Raman imza ile hedeflenen ve sigara hedefli Nano sondaları bir karışımı uygulandığı bir ratiometric yaklaşım izleyerek elimine edilebilir sinyalleri. İşlem şu anda hala bir ticari geniş alanlı Raman görüntüleme sağlayacak bir kez kullanılabilir tiyatrodan Bu teknikte uygulanması için kamera sistemi eksikliği ile sınırlıdır.
Introduction
Raman 'Yüzey gelişmiş Raman saçılma ile' Imaging (SERS) nano tanecikleri büyük söz çeşitli ayarları lezyonlarının operasyona göstermiştir ve birçok farklı tümör türleri1,2,3,4 . Ana SERS nano tanecikleri onları biyolojik arka plan sinyalleri5tarafından şaşırmış değil tartışılmaz algılama saglayan onların parmak izi gibi spektral imza avantajdır. Ayrıca, verilmiş sinyalin yoğunluğunu daha fazla ile belgili tanımlık kullanma (boya) muhabir moleküllerin Absorbans maxima 'yüzey gelişmiş rezonans Raman saçılma için' sebebiyet veren uyarma lazer doğrultusunda AMPLİFİKATÖRLÜ (SERRS) nano tanecikleri ile daha fazla hassasiyet6,7,8,9,10,11,12.
İntravenöz enjeksiyon sistemik neden olur SE(R)RS nano tanecikleri13 kabulü için ele alınması gereken bir bariyer ve birçok diğer nanopartikül yapıları14,15 klinik kullanım için onların yönetim modudur Aracısı, pozlama ve olası yan etkileri dışlamak için kapsamlı testler gerektirmektedir. Bu makalede, biz farklı bir paradigma nano tanecikleri uygulama dayalı mevcut yerel olarak vivo içindeameliyat sırasında Periton boşluğu içine doğrudan takip herhangi bir ilişkisiz nano tanecikleri1kaldırmak için çamaşır adım. Ayrıca yapmak, şu anda soruşturma altında yeni tedavi yaklaşımları doğrultusunda bu yaklaşımdır aracıları yerel korumak hyperthermic mayi kemoterapi (HIPEC) denilen Periton boşluğu içine kullanın. Böylece, prensip kendisini klinik bir iş akışı içine entegre nispeten kolay olmalıdır. Biz nano tanecikleri biodistribution sonra mayi uygulama inceledik ve sistemik dolaşımı1içine herhangi bir tespit emme tekniği değil. Nano tanecikleri gerekli sayıda belirgin azalır bu yüzden ek olarak, yerel uygulama yaklaşım nano tanecikleri haciz retiküloendotelyal sistem tarafından kaçınmanızı sağlar. Ancak, topikal uygulanan, antikor functionalized nano tanecikleri bile yokluğunda onların hedef, visseral yüzeyler üzerine uygun eğilimindedir. Yanlış pozitif sinyaller non-spesifik nanopartikül yapışma nedeniyle en aza indirmek için biz nerede bir tatlı hedeflenen nanoprobe belirli sinyal ve farklı Raman spektrumu ile bir sigara hedefli denetim nanoprobe sağlar bir ratiometric yaklaşım, takip, non-spesifik arka plan16,17için hesaplar. Bu metodoloji topikal uygulanan yüzey gelişmiş rezonans Raman ratiometric spektroskopisi son dağınık yumurtalık kanseri1bir fare modeli olarak göstermiştir.
Bu yöntem genel amacı iki SERRS nano-sondalar, bir hedef geliştirmektir ve bir yerel olarak fare modellerinde, yaygınlık/overexpression bir kanser görüntü için uygulanmış olması için belirsiz, ratiometric hafiye-in iki problar kullanarak biyomarker ilgili yolu ile Raman görüntüleme. Bu bir işaret upregulated birçok yumurtalık kanserleri18,19olarak bu çalışmada, folat reseptör (FR) hedef olarak seçildi. Raman microimaging SERS tabanlı nano tanecikleri ile de kanser hücre kimliği20için göstermiştir. İki ayrı "tatlar" Raman nano tanecikleri sentezlenmiş, her farklı bir organik boya onun parmak izi türetme. Nano tanecikleri bir yıldız şeklinde altın çekirdek bir silika kabuk tarafından çevrili oluşur ve yüzey plasmon rezonans yaklaşık 710, göstermek nm. Raman muhabir (organik boya) silis kabuk oluşumu ile aynı anda yatırılır. Son olarak, Sigara hedefli nano-sondalar (nt-NPs) polietilen glikol (PEG) monolayer ile düzgünleştirilecek ise FR hedefli nano-sondalar için (αFR-NPs) antikorları ile silis kabuk Birleşik.
Bu tekniği başarıyla içinde vivo kullanım için onun uygulanabilirliği gösteren diffüz metastatik yumurtalık kanseri (SKOV-3), bir fare xenograft model içinde mikroskobik tümör eşleştirmek için kullanılır. Ayrıca tümör fenotipleme veya bir soydaş çalışma21' de gösterilen gibi debulking sonra kenar boşluğu tayin için çıkarılan dokular, kullanmak için genişletilebilir.
SERRS nano-sondalar biyolojik, şematik Resim 1' de özetlenen basit kimyasal reaksiyonlar ile sentezlenmiş için birden çok hedef etiket oluşturmak için sağlam bir platform sağlamaktadır. Burada, SERRS nano-sondalar (Bölüm 1-3) iki tür sentezi için protokol, uygun yumurtalık kanseri fare modeli (Bölüm 4) geliştirilmesi, nano-sondalar ve görüntüleme (Bölüm 5) İdaresi ve son olarak veri analizi mevcut ve görselleştirme (Bölüm 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan çalışmaları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi (#06-07-011) tarafından kabul edildi.
1. altın Nanostar çekirdek sentezi
Not: Altın nanostars SERRS nano-sondalar bu deneyde kullanılan her iki tatlar için çekirdek kullanılır.
- 800 mL deiyonize (DI) su ve 8 mL 20 mM tetrachloroauric asit (HAuCl4) çözeltisi DI suda 60 mM askorbik asit (C6H8O6) çözeltisi hazırlamak. 4 ° C'ye serin
- Bu reaksiyon adımıysa 4 ° C'de 800 mL manyetik heyecan tabakta askorbik asit çözeltisi içeren bir konik şişesi yerleştirin ve sabit bir girdap teşvik. Hızlı bir şekilde 8 mL tetrachloroauric asit çözeltisi girdap içine ekleyin. Saniye içinde nanostars oluşturacak ve çözüm koyu mavi renk üstlenecek. Herhangi bir zamanda rengi pembe ya da mor, nanospheres, süspansiyon oluşumu atılmalıdır belirten ve reattempted sentezi olur diye.
- Nanostar süspansiyon 50 mL konik boru ve santrifüj 20 dk (4 ° C, 3,220 x g) için içine dökün. Yaklaşık 200 µL çözümün her tüpün içinde bırakarak süpernatant Aspire edin. Tüpün dibinde nano tanecikleri Pelet bozmamaya dikkat ödemek.
Not: Süpernatant mavi bir renk nedeniyle kalan asma nanostars olmalıdır. - Bir micropipette kullanarak, askıya alma ve nano tanecikleri her tüp sizden toplamak için çözüm tahrik. Pelet parçası tüpün dibinde sıkıştırılmış ve hatta güçlü pipetting-atma ile bu bölümü resuspend değil.
- Nanopartikül süspansiyon diyaliz kaset (MWCO 3.5 kDa) aktarmak ve en az üç gün DI su, 2 su her gün değişen L karşı diyaliz. Nanostars diyaliz 4 ° C'de için su değişikliklerle bir ay kadar her 3-4 gün saklayın.
Not: Nanostars silication reaksiyon için gerekli kadar diyaliz 2 bölümünde açıklandığı gibi tutulmalıdır.
2. silis kabuk oluşumu
Not: Raman nano-sondalar iki tatlar sentezledim. Sentez kullanılan Raman muhabir molekül (boya) olmanın tek farkı ile her ikisi için aynı işlemdir. Bu deneyde, IR780 perklorat ve IR140 kullanılır. Tepki her zaman plastik kaplarda yapılmalıdır. Sentez yüksek oranda ölçeklenebilir ve gerekli injectate istenilen miktarda için ayarlanabilir. Burada, bir orta toplu sentez, hangi daha düşük veya daha yüksek olan birimler, aynı konsantrasyonları ve tepki süreleri ile gerektiği gibi doğrusal olarak ölçeklendirilebilir açıklanmıştır. İki SERRS nanoprobe türü için tepkiler paralel olarak gerçekleştirilebilir. Çapraz bulaşma önlemek için dikkat. Sonication için nanopartikül granül redispersion Santrifüjü adımları yıkama sırasında veya nano tanecikleri bir saat daha uzun süre saklanan vardı, sonra sonra yapılmalıdır. Sonication nano tanecikleri açıkça genellikle 1 için çözüm içine askıya alınır kadar gerçekleştirilen s.
- Tüp A (bir 50 mL konik tüp), isopropanol, TEOS, DI su, 200 µL 500 µL ve boya (IR780 perklorat veya IR140, DMF (dimethylformamide) 20 mM) 60 µL 10 mL karıştırın.
- Tüp B (15 mL konik tüp), 3 mL etanol ve amonyum hidroksit 200 µL karıştırın. Kimden adım herhangi bir çözüm kümelerinde dağıtmak ve nanostars 1.2 mL tüp eklemek için 1.4 nanostars solüsyon içeren temizleyicide.
Not: amonyum hidroksit son derece değişken ve doğru bir şekilde pipet zor bir çözümdür. Kadar pipetting kolaylaştırmak için gerekli 4 ° C'de depolayın. - Bir girdap karıştırıcı tüp A yerleştirin ve sabit bir girdap teşvik. Hızla tüp B içeriği girdap içine ekleyin ve yaklaşık 5 için karıştırma tutun s. hemen oda sıcaklığında 300 devirde sallayarak süre bir sarsıcı ve izin tepki 15dk için transfer.
- 15 dk kuluçka sonra reaksiyon etanol doldurmak 50 mL tüp ekleyerek gidermek. 3,220 x g ve 4 ° c, 20 dk santrifüj
- Yaklaşık 0.5 mL çözüm, pelet değil rahatsız etmek için dikkatli olmak bırakarak süpernatant, Aspire edin. 1 mL etanol ekleyin ve nano tanecikleri resuspend bir pipet ile tahrik. Aktarım 1,5 mL santrifüj tüpü ve yıkama 4 kez etanol ile 11.000 x g 4 dk için de centrifuging, süpernatant aspirating ve Pelet tarafından yaklaşık 1 için ultrasonication resuspending s.
Not: Bu aşamada silicated nano tanecikleri, functionalized madde 3 te açıklandığı gibi veya bir hafta için 4 ° C, depolama için bir ilave çamaşır adım ile DI suda resuspended.
3. yüzey Functionalization
Not: IR780 SERRS nano-sondalar folat reseptör hedefleme antikorlar formu αFR-NPS'ye bir PEG crosslinker üzerinden ile Birleşik; IR140 SERRS kontrol nano-sondalar nt-NPs için passivating PEG monolayer ile Birleşik. Her iki tatlar ayrı ama paralel reaksiyonlarda thiol maleimide reaksiyon ile meydana gelir.
- Nano tanecikleri 11.000 x g 4 dk için de centrifuging, süpernatant aspirating ve Pelet 1 mL etanol ultrasonication tarafından resuspending tarafından iki kez yıkayın. Çamaşır adım bir kez daha yineleyin, ancak 1 mL % 85 etanol, %10 3-MPTMS (3-mercaptopropyltrimethoxysilane) ve % 5 DI su redisperse. 1-2 h thiols parçacık yüzey üzerinde tanıtmak için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- 11.000 x g 4 dk için de centrifuging, süpernatant aspirating ve Pelet tarafından ultrasonication, etanol, DI, iki kez, iki kez resuspending thiol functionalized nano tanecikleri yıkayın ve nihayet HEPES içinde (4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic asit) (10 mM, pH 7.1) tampon ve bir kenara koyun.
Not: MES (2-(N- morpholino) ethanesulfonic asit) arabellek veya HEPES kullanılmalıdır. Arabellekleri PBS (fosfat tamponlu tuz), gibi daha yüksek tuzluluk ile nanopartikül toplama neden olabilir. - Functionalized antikor αFR-olabilmesi için antikorlar (Anti-folat bağlayıcı protein antikoru klon [LK26]) 200 µg PEG crosslinker (poly(ethylene glycol) (N-hydroxysuccinimide 5-pentanoate) eter N′-(3-on kat molar fazlalığı ile tepki. maleimidopropionyl) aminoethane (CAS: 851040-94-3), Dimetil sülfoksit (DMSO) içinde) 500 µL MES arabelleği (10 mM, pH 7.1) 30 dakika içinde.
- Aşırı crosslinker kaldırın ve antikor antikor-PEG çözüm santrifüj filtre (MWCO 100 kDa) centrifuging tarafından konsantre. Bu çalışmada kullanılan santrifüj filtreler için 14.000 x g , 10 min ve 23 ° c için aralıklarla gerçekleştirmek Taze bir tüp konjuge antikorlar filtre ters çevirme ve 1000 x g 2 min için de centrifuging tarafından yeniden elde etmek.
- Antikorlar ile tüp içine adım 3.2 IR780 nano tanecikleri pipette ve karıştırmak için pipet ile tahrik. En az 30 dakika karışım kuluçkaya Oda sıcaklığı veya alternatif olarak 4 ° C'de gecede forma αFR-NPs.
- NT-NPs formunda, % 1 w/v metoksi sonlandırılmış (m) PEG5000-maleimide eklemek için (CA: 99126-64-4) adım 3.2 ve 500 µL MES arabelleği (10 mM, pH 7.1) oda sıcaklığında en az 30 dk için izin tepki IR140 SERRS nano tanecikleri DMSO içinde çözünmüş veya alternatif olarak 4 ° c bir gecede.
- Yönetim farelere (Bölüm 5), her iki nanoprobe tatlar 11.000 x g 4 dk için de aşağı spin için ücretsiz unreacted antikorlar/PEG Çözümle kaldırmak için süpernatant Aspire edin ve her lezzet MES arabelleği (10 mM, pH 7.1) 600 pM konsantrasyon, redisperse . Nano tanecikleri resuspending, antikor denatürasyon önlemek için ultrason, gereksiz maruz en aza indirmek.
4. fare modeli geliştirme
- İnsan yumurtalık adenokarsinom (SKOV-3) hücre kültürünü sürekli kültürü oluşturmak. İsteğe bağlı olarak, bioluminescence/floresan izleme etkinleştirmek için transfected SKOV-3 Luc+/GFP+ hücreler kullanın. RPMI (Roswell Park Memorial Enstitüsü) orta % 10 fetal buzağı serum ve geçiş haftada iki kez ile Kültür hücreleri. Enjeksiyon için %0,25 trypsin/0.05% ayırmak ve daha sonra yıkayın ve PBS içinde 2 x 106 hücreler/100 µL resuspend 3 dk için EDTA içeren hücreleri kuluçkaya.
- Yumurtalık micrometastasis modeli kurmak için 200 µL askıya alınmış SKOV-3 hücre intraperitoneally korele dişi fareler (FOXn1nu/FOXn1nu fareler, 6-8 haftalık) enjekte. Dissemine Periton yayılmış yaklaşık 4 hafta içinde ortaya çıkar. Retroorbital enjeksiyon yolu ile 50 µL PBS böceği biyoluminesans 2 mg yönetmek olarak SKOV-3 Luc+ hücreleri kullanıyorsanız, tümör büyüme bioluminescence ile izlenebilir.
5. Nanoprobe enjeksiyon ve görüntüleme
- Nano-sondalar (αFR-NPs ve nt-NPs) bölümleri 1-3 ve 1:1 oranında, 300 son bir konsantrasyon için mix açıklandığı şekilde hazırlayın pM her tür MES arabelleği (10 mM, pH 7.1). İsteğe bağlı olarak, 30 kullanılan standartlar hazırlamak pM her küçük (100 µL) konik tüpler nanoprobe tatlar.
- Her fare nanopartikül süspansiyon intraperitoneally 1 mL enjekte ve hafifçe masaj nano tanecikleri peritoneal kavite içinde dağıtmak için göbek. Fareyi onun konut için dönmek. Dakika sonra 25 veya daha fazla CO2 Havasızlıktan Boğulma yoluyla fare ötenazi.
-
Sırtüstü pozisyonda (için tüm karin görüntüleme, platform dik mikroskop sahneye monte edilebilir olması gereken) cerrahi bir platform üzerinde fareyi bağlayın.
- Tırtıklı forseps ve diseksiyon makası kullanarak, karın zarını ortaya çıkarmak ve tüm karın ortaya çıkarmak için büyük bir sagittal kesi (arasında 2 ve 3 cm uzunluğunda) gerçekleştirmek için cilt kaldırın. Periton flep platformu üzerine ekleyin. Peritoneal kavite içine en az 60 mL plastik fışkırmak şişe kullanarak PBS ile yıkayın.
Not: Engelsiz görüntüleme tüm karın etkinleştirmek için bağırsak seferber eden ya da gerekir. Eksizyon için karın içine kanama azaltmak amacıyla Mezenterik damarları ligasyonu ile çıkarabileceğim. - Alternatif olarak, belirli organ görüntü, onları PBS yıkama sonra tüketim ve onları bir mikroskop slayt yerleştirmek için.
- Tırtıklı forseps ve diseksiyon makası kullanarak, karın zarını ortaya çıkarmak ve tüm karın ortaya çıkarmak için büyük bir sagittal kesi (arasında 2 ve 3 cm uzunluğunda) gerçekleştirmek için cilt kaldırın. Periton flep platformu üzerine ekleyin. Peritoneal kavite içine en az 60 mL plastik fışkırmak şişe kullanarak PBS ile yıkayın.
-
Platform veya slayt Raman microspectrophotometer dik optik yapılandırması ve görüntüleme için bir motorlu sahne aktarın; ticari bir sistem ile bir 300 mW 785 nm diode lazer, mm, 1,115 cm-1merkezli başına 1200 oluklar bir ızgara ile kullanın.
- Beyaz ışık optik, parfocal Raman lazer ile kullanarak ilgi alanı odaklanmaktadır. Yansıması için alanı ve istediğiniz çözünürlüğü seçin; Bu raporda bir yüksek hızlı satın alma modu kullanıldı (sürekli 200 µm; 5 x büyütmede etkili Uzaysal çözünürlük 14,2 µm ile 100 mW gücünde amaç, hareketli, mikroskop sahne ile sürekli lazer aydınlatma altında elde spectra ve < 100 ms pozlama her noktası).
Not: Başvuru nano-sondalar kimden adım 5.1 tüplerini daha sonraki analiz için iç başvuru standartları sağlamak isterseniz, görüntülü alanı içinde yerleştirilebilir. Lazer dışında hiçbir yabancı ışık kaynağı amaca ulaşmak emin olun.
- Beyaz ışık optik, parfocal Raman lazer ile kullanarak ilgi alanı odaklanmaktadır. Yansıması için alanı ve istediğiniz çözünürlüğü seçin; Bu raporda bir yüksek hızlı satın alma modu kullanıldı (sürekli 200 µm; 5 x büyütmede etkili Uzaysal çözünürlük 14,2 µm ile 100 mW gücünde amaç, hareketli, mikroskop sahne ile sürekli lazer aydınlatma altında elde spectra ve < 100 ms pozlama her noktası).
- İsteğe bağlı olarak, örnek histolojik işleme ve doğrulama için PBS içinde %4 paraformaldehyde gecede 4 ° C'de fiksasyonu hazırlayın PBS ile en az iki kez 15 dakika 4 ° C'de durulayın. Örnek % 70 etanol suda standart histolojik işleme ve parafin katıştırma kadar tutun. Tümörlerin histolojik doğrulamak için parafin blok bölümlerini (5 mikron kalınlığında) farklı derinliklerinden Hematoksilen ve Eozin (H & E) ile lekeli.
6. veri işleme ve görselleştirme
Not: Tüm veri işleme ticari yazılım kullanarak şirket içinde gelişmiş bir grafik kullanıcı arayüzü ile gerçekleştirildi. Tüm işlevleri kullanılan genel eşdeğeri diğer bilgi işlem ortamlarında kullanılabilir vardır.
- Başvuru spectra iki tatlar için saf süspansiyonlar her sorguya alın. Başvuru spectra nano-sondalar, noktası taramaları elde edilebilir iyi-tabaklar içinde ya da iç başvuru (bkz. Adım 5.1) başvuru tüpler deneysel taramaları dahil nano-sondalar, görüntüleme.
- Temel çıkarma kullanarak başvuru spectra önişlem (Whittaker filtre, λ = 200), normalleştirme Çetinkaya-deniyordun türev filtre ve eğri altındaki alan tarafından (ikinci derece polinom uygun, birinci dereceden Türev, genişlik 15 adımları =). Bu Önişlenmiş spectra başvurular için klasik en küçük kareler (CLS) modeli olarak görev yapacak.
- Başvuru spectra aynı şekilde örnek verileri görüntüden önişlem. CLS puanları her örnek için kullanılabilir bir CLS algoritma kullanarak elde. Doğrudan CLS (DLC'ler) puanları sadece bir örnek spektrum Genelleştirilmiş ters matris başvuru spectra ürününün tarafından (Moore-Penrose ters) tanımlanan doğrusal alana projeksiyon koordinatlar. Algoritmalar-ebilmek var olmak diğer montaj (negatif olmayan en küçük kareler, kısmi en küçük kareler veya diğerleri) kullanılır.
Not: Bazı uydurma algoritmalar olmayan bu bağlamda fiziksel negatif puanları çıkmasına neden olabilir. Bu durumda, bir eşik olumsuz puanları dışlamak için ayarlayabilirsiniz veya kısıtlanmış negatif olmayan en küçük kareler algoritması olmak yerine istihdam. - Hedeflenen nano tanecikleri başvurusunu puanları pointwise oranını hesaplama (puanlarıαFR) sigara hedefli nano tanecikleri (puanlarınt) için başvuru üzerinde puanları üzerinde. Puanları negatif ise, oranı logaritmik bir biçimde ifade edilebilir:
R = günlüğüne10(puanlarıαFR/ puanlarınt).
R oranı en iyi sıfırda probları büyüklük içinde göreli bolluk hızlı merkezli kesintisiz bir renk ölçeği görüntülenir. Ortaya çıkan görüntü folat reseptör overexpression alanlarında ortaya çıkarmak için örnek, beyaz ışık görüntü üzerine bindirilmiş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kalite kontrol amaçlı nano tanecikleri TEM, DLS, nanopartikül izleme analizi ve UV/Vis Absorbans spektroskopisi, Şekil 2' de gösterildiği gibi sentez işlemi sırasında çeşitli yöntemler kullanarak karakterize edilebilir.
Bu şekilde, altın nanostar çekirdek (anlatıldığı Bölüm 1) boyutunu, Silis kabuk (Bölüm 2) oluşumu ve sonraki yüzey functionalization (Bölüm 3) olabilir (Şekil 2) doğrulanmadı. Tipik olarak, altın nanostar çekirdek (hidrodinamik çapı) boyutunu yaklaşık 80 olması bekleniyor nm ve silis kabuk olduğunu 20 civarında nm kalın, toplam silicated nanopartikül boyutu yaklaşık 120 yapma nm ve yaklaşık 140 nm konjugasyon αFR-antikor ile sonra. UV/Vis Absorbans nano tanecikleri morfolojisi doğrulamak için de kullanılabilir. Su Nanostar çekirdek genellikle sahip bir Absorbans maksimum 670 nm, silication sonra en fazla yaklaşık 710 vardiya ise nm. Absorbans maxima daha düşük dalga boylarında, küresel Morfoloji veya toplama bir işareti vardır. Tipik tepki verimleri ve konsantrasyonları Tablo 1 ' de gösterilen ve güçlü yıkama adımlar sırasında pipetting tekniğine bağlıdır.
Raman taramasından elde edilen her noktası bir spektrum interrogated bir konum için içerir. Bu spectra doğrusal süperpozisyon nano-sondalar SERRS sinyal ve herhangi bir arka plan Floresans vardır. Spectra Floresans kaldırmak için işlenen ve birim alanına (6 bölümünde açıklanan) CLS modeli uygulamadan önce sinyal gücü, şekil 3' te gösterilen telafi etmek için normalleştirilmiş. Temsilcisi görüntüler puanları her nanoprobe başvuru spectra ve onların pointwise oranı için şekil 4' te gösterilmiştir. Her puan ayrı ayrı tümörlerin belirli yerelleştirme sağlamasa da, oranı Dissemine mikroskobik yayılmış varlığını ortaya koymaktadır.
| Adım | İlk birim | İlk toplama | Son hacim | Son konsantrasyonu |
| 1. Nanostar çekirdek | 8 mL HAuCl4 | 20 mM HAuCl4 | 5 mL | 1.3 nM |
| 2. Silication | 1.2 mL | 1.3 nM | 1.2 mL | 0.5 nM |
| 3.1. Thiolation | 1 mL | 0.5 nM | 1 mL | 0,43 nM |
| 3.5. konjugasyon | 1 mL | 0,43 nM | 1 mL | 0,39 nM |
Tablo 1: nanopartikül verim her tepki adım sonra. Konsantrasyonları yaklaşık değerlerdir. Verim izleme çözümlemesi, iki bağımsız immobilizasyonu ve her birinden 5 bağımsız ölçümleri nanopartikül tarafından tespit edilmiştir.
Resim 1 : Sentez ve uygulama ratiometric SERRS nanoprobe görüntüleme şematik. (1) altın nanostars 1 bölümünde açıklandığı gibi sentezledim. (2) çevrede belgili tanımlık altın nanostar çekirdek ve Raman muhabir molekülleri (kızılötesi boya IR-780 perklorat ve IR-140) 2 bölümünde açıklandığı gibi iki ayrı nanopartikül tatlar, oluşturmak için kullanılır bir silika kabuk oluşur. (3) nano tanecikleri yüzeyi daha fazla yüzey functionalization etkinleştirmek için bölümde 3.1, açıklandığı gibi thiols ile kaplanır. IR-780 lezzet nano tanecikleri olanlar bir tabaka, PEG - 5 k ile 3,3 3,6 bölümlerinde açıklandığı gibi düzgünleştirilecek IR-140 iken bir anti-folat reseptör antikor ile Birleşik. (4) diffüz mayi yumurtalık metastatik yayılmış bir fare modeli 4 bölümde açıklandığı gibi gelişmiş ve hazır olduğunuzda, SERRS nano-sondalar intraperitoneally uygulanmaktadır. (5 fareler are euthanized ve cerrahi olarak Imaging Raman etkinleştirmek için maruz karın 5 bölümünde açıklanan. (6) Raman spectra pointwise iki problar göreli bolluk belirlemek ve 6 bölümde açıklandığı gibi folat reseptör overexpression ratiometric haritası oluşturmak için analiz edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : SERRS nano-sondalar fiziksel karakterizasyonu. Nano tanecikleri kalite kontrol için sentez her parçası sonra tabi. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) altın çekirdek şekli ve silis kabuk nanopartikül toplama olmadan başarılı oluşumu ortaya koymaktadır; Ölçek çubuğu = 100 nm. Dinamik ışık saçılma (DL), ζ-başarılı silication ve functionalization doğrulamak için nano tanecikleri potansiyelini ve boyutu ölçebilirsiniz. UV/Vis Absorbans Plazmonik tepe yaklaşık 670 varlığını doğrulamak için kullanılabilir için 710 için değişen nanostars, nm nm silication sonra. Raman ölçümler her lezzet sentez boyunca benzersiz spectra varlığını ortaya koyuyor. Nanostar spektrum karakteristik hiçbir tepeler ile yoğunluğunu vurgu için 100 x tarafından güçlendirilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Raman spectra işleme. Nano-sondalar SERRS imza, geniş floresan bant üzerine bindirilen ham spectra oluşur. Temel çıkarma ile floresan bant kaldırılır ve Raman doruklarına önemli olmak. Nano tanecikleri yoğunluğu ne olursa olsun spektral imza algılamak için her spektrum (referanslar ve örnekler hem) birim alana için normalleştirilmiş. Son olarak, yumuşatma-türev filtre süre gürültü azaltma Raman doruklarına artırmak için uygulanır. İşlenmiş başvuru spectra CLS model geliştirmek için R. oranına göre işlenmiş örnek spectra sınıflandırmak için kullanılan Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Yumurtalık kanseri micrometastases karın Ratiometric görüntüleme. Bir fare maruz kalan karın Imaging, geniş yumurtalık Metastazlari bioluminescence görüntüleme tarafından ortaya featuring Raman. Tarama her noktası olan bir spektrum özellikleri (Bölüm 6, şekil 3) işlenen ve puanları iki başvuru elde etmek için bir CLS modeli tabanlı attı: αFR-NP kırmızı ve nt-NP mavi gösterilen. Puanları pointwise, iki problar göreli bereket bir oranı olarak ortaya çıkarmak için ayrılır. İsteğe bağlı olarak, eşik oranı tarafından "olumlu" alanlarda karın bir optik görüntü bindirilmiş olabilir, rezeksiyon veya diğer izin vermek için Tedaviler duruldu. Şekil 4 günlüğünden alınan izinle başvuru1, bir adapte sürümüdür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol iki "tatlar" SERRS nano-sondalar sentezi ve onların istihdam farelerde talimatı Raman için sağlar ratiometric algoritmasıyla folat reseptör overexpressing yumurtalık tümörü Imaging. Raman (floresan gibi) optik diğer görüntüleme teknikleri üzerinde görüntüleme büyük avantajı ile biyolojik kökenli herhangi bir sinyal şaşırmış nanoprobe sinyal yüksek özgüllüğü olduğunu. Bu şekillenme Imaging Raman nano tanecikleri intravenöz, ancak yerel olarak, bir tek çamaşır adım gelir bir mayi enjeksiyon yoluyla yönetilen değil. Bir kez klinik arenaya tercüme Bu metodoloji görselleştirmek ve bu nedenle tüm yumurtalık kanseri implantlar, hatta çıplak gözle tespit etmek için çok küçük olan ve hangi hedeflenemediği çıkarabileceğim cerrahlar etkinleştirmek için şık bir çözüm temsil eder damarları beslenme onların eksikliği nedeniyle sistemik enjekte görüntüleme aracı ile sistemik dolaşıma bağlı. Aynı zamanda, bizim SERRS nano tanecikleri sistemik dolaşıma resorbed değil gibi yan etkileri için olası sorunları en aza indirilir. Bizim çalışma dikkatle tasarlanmış nanoconstructs büyüyen kanıt bir örnek konvansiyonel görüntüleme ve tedavi teknolojileri22,23,24,25benzersiz avantajlar sağlayabilir mi, 26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35,36,37,38.
Burada açıklanan SERRS nano-sondalar biyolojik olarak inert ve tümör tarif fare modelleri çeşitli kanser türleri için istihdam edilmiştir. (Muhabir boya kapsülleme ile eşzamanlı) silis kabuk oluşumu için bizim daha önce raporlanmış sentez1,7,8, geliştirilmiş bir versiyonu nanopartikül toplamak için daha az eğilimli olan tepkidir ve "serbest silis" nano tanecikleri (olmadan altın çekirdek) oluşumu. Reaksiyon piyasada bulunan kızılötesi organik boya, Raman tatlar geniş bir koleksiyon vermeye burada anlatılan olanlar yanı sıra çeşitli kullanılabilir. Elde edilen sinyal şiddeti, ancak, boya 's benzeşme altın ve diğer faktörlere bağlıdır. Ayrıca, bazı moleküller ve onların counterions altın nanostars diğerlerinden daha fazla toplama neden tepki eklendi boya miktarını bir boya başına bazında tespit edilmelidir. Şiddetli nanopartikül toplama söz konusu olduğunda, kullanılan boya miktarı azalmıştır. Ciddi değişkenlik Raman içinde sinyal şiddeti neden olarak karmaşık hale Edinsel veri toplama altın çekirdek istenmeyen, olduğunu. Bu Raman sinyal olarak serbest silis oluşumu çoğunlukla zararsız olur. Ancak, functionalization sırasında antikorlar yönteminin genel hedefleme etkinliği azalan silis nano tanecikleri için uygun olacaktır. Silis kabuk kalınlığı reaksiyon zamanı, sıcaklık ve su (Adım 2.1) eklendi miktarı bağlıdır. Elde edilen silis kabuğu çok ince (şekil 1, sağ üst) sayılır, bir veya daha fazla bu parametreler uygun şekilde artırılabilir.
Veri toplama açısından kalitesini büyük ölçüde nano-sondalar parlaklığı üzerinde bağlıdır. Bu hızlı Raman satın alma işlemi sırasında 5 bölümde açıklandığı gibi özellikle belirgin hale gelir. Verileri yeterince gürültü fark edilebilir olduğundan emin olmak için spectra kontrol edilmelidir ve sondalar temsilcisi Raman doruklarına varlığı doğrulandı. Sinyal çok zayıfsa, pozlama süresi her noktası artırılabilir. Ancak, bu yaklaşım aşırı derecede uzun inceden inceye gözden geçirmek veya çok düşük uzamsal çözünürlük yol açabilir. Tekrarlanabilirlik ve tutarlılık sağlamak için kalibrasyon Raman inceden inceye gözden geçirmek üreticinin tavsiye göre yapılmalıdır ve genelde ortak bir standart kullanarak (örneğin, bir silikon gofret).
Bu yöntemin ana güçlü, çok yönlü biridir. Farklı tümör türleri belirli antikor farklı moleküler işaretleyiciler hedefleme kullanarak yansıma. Ayrıca, burada açıklanan nano-sondalar hayvan modelleri için yönetilebilir — intraperitoneally veya intravenöz — ama aynı zamanda, aynı teknikleri kullanarak, onlar sabit ya da taze eksize dokular, leke için kullanılabilir.
Ratiometric tekniği özgüllük mikroskobik tümör tespiti sağlasa da, bireysel probları dağıtımını tümör alanlarına özgü değildir. Bu terapi de sağlıklı alanlarına teslim gibi theranostic teknikleri photothermal/Fotodinamik Tedavi veya ilaç-yükleme gibi ideal, olmayacağını anlamına gelir. Bu tekniği ile tanınan bir potansiyel terapötik uygulama mikrotümörler otomatik ablasyon ratiometric algılama sonra olur.
O bu yerel umduğumuz Imaging Raman yaklaşımın ratiometric SERRS nano-sondalar, gerekli klinik sonra hastalarda moleküler görüntüleme aracı olarak kullanmak için önünü. Bu yöntem nano tanecikleri için yönetilen olabilir ve zaten HIPEC için klinik kullanımda olan aygıtları'nı kullanarak karın boşluğu kaldırıldı olarak insanlarda, gelecekteki potansiyel uygulamalar ile uyumlu olacak şekilde geliştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bir mucit birkaç verilen veya bekleyen patent başvuruları için bu iş ile ilgili olarak • MFK listelenir. MFK RIO görüntüleme, Inc SERRS nano tanecikleri ve klinikler çeviri amaçlamaktadır kurucu olduğunu.
• Yazarlar onlar hiçbir rakip diğer mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Aşağıdaki finansman kaynakları (için MFK) kabul vardır: NIH R01 EB017748, R01 CA222836 ve K08 CA16396; Damon Runyon'un-Rachleff yenilik ödülü DRR-29-14, Pershing Square Sohn ödül Pershing Square Sohn kanser araştırma İttifak ve MSKCC moleküler görüntüleme & nanoteknoloji (CMINT) ve Teknoloji Geliştirme Merkezi tarafından verir. İlgili kaynaklar da MSKCC NIH çekirdek Grant (P30-CA008748) tarafından sağlanan hibe fon desteği için genişletilir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent | |||
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| 3-MPTMS | Sigma-Aldrich | 175617 | |
| Ammonium hydroxide (28%) | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| Anti-Folate Receptor antibody [LK26] | AbCam | ab3361 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Dimethyl sulfoxide (anhydrous) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| IR140 | Sigma-Aldrich | 260932 | |
| IR780 perchlorate* | Sigma-Aldrich | 576409 | Discontinued* |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
| N.N.Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| PEG crosslinker | Sigma-Aldrich | 757853 | |
| PEG-maleimide | Sigma-Aldrich | 900339 | |
| Tetrachloroauric Acid | Sigma-Aldrich | 244597 | |
| Tetraethyl Orthosilicate | Sigma-Aldrich | 86578 | |
| *IR792 | Sigma-Aldrich | 425982 | *Alternative |
| Name of Equipment | |||
| Dialysis cassette (3,500 MWCO) | ThermoFIsher | 87724 | |
| Centrifugal filters | Millipore | UFC510096 | |
| inVia confocal Raman microscope | Renishaw | ||
| MATLAB (v2014b) | Mathworks | ||
| PLS Toolbox (v8.0) | Eigenvector research |
References
- Oseledchyk, A., Andreou, C., Wall, M. A., Kircher, M. F. Folate-Targeted Surface-Enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detection of Microscopic Ovarian Cancer. ACS Nano. 11 (2), 1488-1497 (2017).
- Andreou, C., et al. Imaging of Liver Tumors Using Surface-Enhanced Raman Scattering Nanoparticles. ACS Nano. 10 (5), 5015-5026 (2016).
- Karabeber, H., et al. Guiding brain tumor resection using surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and a hand-held Raman scanner. ACS Nano. 8 (10), 9755-9766 (2014).
- Kircher, M. F., et al. A brain tumor molecular imaging strategy using a new triple-modality MRI-photoacoustic-Raman nanoparticle. Nature Medicine. 18 (5), 829-834 (2012).
- Andreou, C., Kishore, S. A., Kircher, M. F. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy: A New Modality for Cancer Imaging. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1295-1299 (2015).
- Harmsen, S., et al. Rational design of a chalcogenopyrylium-based surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobe with attomolar sensitivity. Nature Communications. 6, 6570 (2015).
- Harmsen, S., et al. Surface-enhanced resonance Raman scattering nanostars for high-precision cancer imaging. Science Translational Medicine. 7 (271), 271ra277 (2015).
- Harmsen, S., Wall, M. A., Huang, R., Kircher, M. F. Cancer imaging using surface-enhanced resonance Raman scattering nanoparticles. Nature Protocols. 12 (7), 1400-1414 (2017).
- Huang, R., et al. High Precision Imaging of Microscopic Spread of Glioblastoma with a Targeted Ultrasensitive SERRS Molecular Imaging Probe. Theranostics. 6 (8), 1075-1084 (2016).
- Iacono, P., Karabeber, H., Kircher, M. F. A "schizophotonic" all-in-one nanoparticle coating for multiplexed SE(R)RS biomedical imaging. Angewandte Chemie, International Edition in English. 53 (44), 11756-11761 (2014).
- Spaliviero, M., et al. Detection of Lymph Node Metastases with SERRS Nanoparticles. Molecular Imaging and Biology. 18 (5), 677-685 (2016).
- Nayak, T. R., et al. Tissue factor-specific ultra-bright SERRS nanostars for Raman detection of pulmonary micrometastases. Nanoscale. 9 (3), 1110-1119 (2017).
- Thakor, A. S., et al. The fate and toxicity of Raman-active silica-gold nanoparticles in mice. Science Translational Medicine. 3 (79), 79ra33 (2011).
- Liu, J., et al. Effects of Cd-based Quantum Dot Exposure on the Reproduction and Offspring of Kunming Mice over Multiple Generations. Nanotheranostics. 1 (1), 23-37 (2017).
- Wu, N., et al. The biocompatibility studies of polymer dots on pregnant mice and fetuses. Nanotheranostics. 1 (3), 261-271 (2017).
- Garai, E., et al. High-sensitivity real-time, ratiometric imaging of surface-enhanced Raman scattering nanoparticles with a clinically translatable Raman endoscope device. Journal of Biomedical Optics. 18 (9), 096008 (2013).
- Wang, Y. W., et al. Rapid ratiometric biomarker detection with topically applied SERS nanoparticles. Technology (Singap World Sci). 2 (2), 118-132 (2014).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
- Vergote, I. B., Marth, C., Coleman, R. L. Role of the folate receptor in ovarian cancer treatment: evidence, mechanism, and clinical implications. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 41-52 (2015).
- Fasolato, C., et al. Folate-based single cell screening using surface enhanced Raman microimaging. Nanoscale. 8 (39), 17304-17313 (2016).
- Wang, Y. W., et al. Raman-Encoded Molecular Imaging with Topically Applied SERS Nanoparticles for Intraoperative Guidance of Lumpectomy. Cancer Research. 77 (16), 4506-4516 (2017).
- Andreou, C., Pal, S., Rotter, L., Yang, J., Kircher, M. F. Molecular Imaging in Nanotechnology and Theranostics. Molecular Imaging and Biology. 19 (3), 363-372 (2017).
- Chitgupi, U., Qin, Y., Lovell, J. F. Targeted Nanomaterials for Phototherapy. Nanotheranostics. 1 (1), 38-58 (2017).
- Choi, D., et al. Iodinated Echogenic Glycol Chitosan Nanoparticles for X-ray CT/US Dual Imaging of Tumor. Nanotheranostics. 2 (2), 117-127 (2018).
- Dubey, R. D., et al. Novel Hyaluronic Acid Conjugates for Dual Nuclear Imaging and Therapy in CD44-Expressing Tumors in Mice In Vivo. Nanotheranostics. 1 (1), 59-79 (2017).
- Gupta, M. K., et al. Recent strategies to design vascular theranostic nanoparticles. Nanotheranostics. 1 (2), 166-177 (2017).
- Huang, Y. J., Hsu, S. H. TRAIL-functionalized gold nanoparticles selectively trigger apoptosis in polarized macrophages. Nanotheranostics. 1 (3), 326-337 (2017).
- Pal, S., Harmsen, S., Oseledchyk, A., Hsu, H. T., Kircher, M. F. MUC1 Aptamer Targeted SERS Nanoprobes. Advanced Functional Materials. 27 (32), (2017).
- Zanganeh, S., et al. Iron oxide nanoparticles inhibit tumour growth by inducing pro-inflammatory macrophage polarization in tumour tissues. Nat Nanotechnol. 11 (11), 986-994 (2016).
- Lee, J., Lee, Y. M., Kim, J., Kim, W. J. Doxorubicin/Ce6-Loaded Nanoparticle Coated with Polymer via Singlet Oxygen-Sensitive Linker for Photodynamically Assisted Chemotherapy. Nanotheranostics. 1 (2), 196-207 (2017).
- Li, R., Zheng, K., Yuan, C., Chen, Z., Huang, M. Be Active or Not: the Relative Contribution of Active and Passive Tumor Targeting of Nanomaterials. Nanotheranostics. 1 (4), 346-357 (2017).
- Lin, S. Y., Huang, R. Y., Liao, W. C., Chuang, C. C., Chang, C. W. Multifunctional PEGylated Albumin/IR780/Iron Oxide Nanocomplexes for Cancer Photothermal Therapy and MR Imaging. Nanotheranostics. 2 (2), 106-116 (2018).
- Roberts, S., et al. Sonophore-enhanced nanoemulsions for optoacoustic imaging of cancer. Chemical Science (Royal Society of Chemistry: 2010). 9 (25), 5646-5657 (2018).
- Liu, L., Ruan, Z., Yuan, P., Li, T., Yan, L. Oxygen Self-Sufficient Amphiphilic Polypeptide Nanoparticles Encapsulating BODIPY for Potential Near Infrared Imaging-guided Photodynamic Therapy at Low Energy. Nanotheranostics. 2 (1), 59-69 (2018).
- Liu, R., Tang, J., Xu, Y., Zhou, Y., Dai, Z. Nano-sized Indocyanine Green J-aggregate as a One-component Theranostic Agent. Nanotheranostics. 1 (4), 430-439 (2017).
- Sneider, A., VanDyke, D., Paliwal, S., Rai, P. Remotely Triggered Nano-Theranostics For Cancer Applications. Nanotheranostics. 1 (1), 1-22 (2017).
- Wall, M. A., et al. Surfactant-Free Shape Control of Gold Nanoparticles Enabled by Unified Theoretical Framework of Nanocrystal Synthesis. Advanced Materials. 29 (21), (2017).
- Sonali,, et al. Nanotheranostics: Emerging Strategies for Early Diagnosis and Therapy of Brain Cancer. Nanotheranostics. 2 (1), 70-86 (2018).
