Summary
对6个标记多重免疫荧光面板的详细协议进行了优化和执行, 使用自动着色器实现更一致的结果和更短的手术时间。这种方法可以直接由任何实验室用于免疫肿瘤学研究。
Abstract
免疫肿瘤学的持续发展需要对癌症免疫学机制有更多的了解。从福尔马林固定、石蜡包埋 (ffpe) 活检中对组织样本进行免疫分析, 已成为了解肿瘤免疫学复杂性和发现癌症免疫治疗新的预测生物标志物的关键工具。组织免疫分析需要评估肿瘤微环境中的组合标志物, 包括炎性细胞亚群和免疫检查点。新型多重免疫组织化学方法的出现使得单组织切片的多参数分析比标准单次免疫组织化学 (ihc) 更有效。一种商业上可用的多重免疫荧光 (if) 方法基于钟形信号放大, 并结合多谱显微分析, 可以更好地分离组织中的各种标记物的信号。这种方法与使用未共轭的原生抗体是兼容的, 这些抗体在 ffpe 组织样本上已经为标准 ihc 进行了优化。在此, 我们详细介绍了一种自动化协议, 该协议允许用 pd-1、pd-1、cd68、cd8、ki-67 和 aeeenae3 细胞角蛋白的6个标记抗体面板对肿瘤组织样本进行多重 if 标记, 其中含有 4 '、6-二胺-2-苯二胺作为核细胞的反染色多面板协议在自动化 ihc 染色机中进行了优化, 染色时间比手动协议短, 任何实验室调查员都可以直接应用和调整多路面板协议, 以便对人体 ffpe 组织样本进行免疫肿瘤学研究。还介绍了几种控制和工具, 包括一种用于新的多重 if 面板的精细质量控制的下拉控制方法, 这些方法对于优化和验证该技术非常有用。
Introduction
ffpe 肿瘤组织样本的免疫分析已成为免疫肿瘤学研究的重要组成部分, 特别是在临床试验背景下发现和验证癌症免疫治疗的新预测生物标志物1 ,2。使用二胺苯并定等化学色素的致变色剂, 仍然是诊断活检组织3免疫标记的标准技术.标准 ihc 还可用于肿瘤组织免疫分析, 包括定量肿瘤相关淋巴细胞的亚群, 以及评估免疫检查点的表达水平, 如程序性细胞死亡配体 1 (pd-l1)4 ,5。标准 ihc 是有限的, 但是, 因为每个组织部分只能标记一种抗原。由于免疫分析研究通常需要分析几个标记的组合表达, 使用标准 ihc 将需要对多个组织切片进行染色, 每个部分都用一个标记染色, 因此,极大地限制了小组织样品的分析, 如芯针活检。标准 ihc 方法对于评估由不同细胞群体共同表达的标记也有限, 这与免疫检查标志物 (如 pd-l1) 很常见, 后者由肿瘤相关的巨噬细胞和癌细胞表达。例如, 病理学家使用标准单效 ihc 对不同类型的细胞6所表达的 ihc 标记进行定量分析时就报告了这一限制。在同一组织切片上采用不同颜色的 ihc 技术的发展代表了比标准 ihc 单次方法的进步,7尽管它们仍然受到少数人免疫标记的限制标记, 也是一个重要的技术挑战, 以正确评估标记表达在相同的亚细胞隔间相同的细胞群。
上述关于临床样本组织可用性的警告, 以及多重显色 ic 技术的局限性, 导致有必要开发改进的多重方法, 用于免疫肿瘤学研究。荧光标记与成像系统相结合, 可以有效地将多个荧光体的信号与同一幻灯片分离。其中一项技术是基于 tylab 信号放大 (tsa) 与多光谱显微镜成像相结合,以实现高效的分色8。一种市售的基于 tsa 的试剂盒采用了针对多光谱成像8进行优化的荧光 (见材料表)。该系统的一个关键优势是它与相同的未标记的原生抗体的兼容性, 这些抗体已经为标准显色 ihc9、10、11进行了验证和优化。这不仅可以实现更快的优化, 还可以灵活地进行包含新目标的优化和面板修改。此外, 多重免疫荧光 (mif) tsa 方法可以针对市售的自动化 ihc 污渍系统进行优化, 从而实现从单剂显色原 ihc 到 mif 的直接转移。
在这里, 我们提出了一个用于免疫肿瘤学研究的 mif 面板的协议, 该程序基于自动 mif tsa 染色, 并使用多光谱扫描仪进行成像。任何能够访问所述仪器和试剂的实验室用户都可以对该协议进行调整和修改。该协议包括一个由六种主要抗体组成的小组, 用于肿瘤的免疫分析: pd-l1、pd-1、cd68 (作为一种泛巨噬细胞标记)、cd8 (t-细胞毒性细胞)、ki-67 和 ae半 e3 (泛细胞角蛋白, 用作识别的上皮标记物癌细胞)。最近的一项研究描述了利用显色 ihc 作为标准参考来验证多重染色12的手动 tsa mif 协议的优化。此处介绍的更新方法是通过使用商用七色 tsa 套件在自动着色器中进行优化而开发的, 将染色时间从3-5天大幅缩短到 14小时, 同时还提高了染色的一致性。除了这里介绍的详细的主要协议外,补充材料部分还包括 "下拉控制" 方法、评估新 mif 面板的附加质量控制过程以及优化的技术说明,故障排除, 并开发新的多路面板, 以帮助实验室用户建立和优化 mif tsa 方法的定制 mif 面板。
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Protocol
请注意:本文介绍的协议描述了如何使用 tsa 对自动着色器上的六种抗体 (cd68、ki67、pd-l1、pd-1、cd8 和 aetueae3) 进行 mif 面板的免疫分析 (见材料表)。该协议还描述了如何执行放置控制以实现新 mif 面板的质量控制 (请参阅补充材料)。在这个方案中, 染色是与8个未染色 ffpe 幻灯片从人体扁桃体 (阳性控制) 和八个未染色幻灯片从人的肺腺癌进行。第一张幻灯片用于所有六个标记的完全多重染色, 第二张幻灯片用于不使用主要抗体的同型控制, 其余6张幻灯片用于掉落控制 (请参阅补充材料)。强烈建议对组织自体荧光进行额外控制, 并应始终将其纳入多重研究 (请参阅补充材料)。不过, 研究人员可以根据自己的项目目标, 使用其他肿瘤类型和控制。以前没有 mif tsa 方法和多光谱扫描仪技术经验的实验室用户应阅读《多重 ihc 开发指南》 (可在线查阅, http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp)。虽然本指南描述了手动协议, 但也很好地介绍了 mif 染色方法。该议定书中使用的所有组织部分都是匿名的, 并根据《赫尔辛基宣言》获得批准。
1. 组织样本
- 选择含有淋巴增生的 ffpe 人扁桃体样本作为阳性对照, 并选择已知为 pd-l1 阳性的 ffpe 人肺腺癌样本。回顾选定肺癌块的血红素和 eosin (h & e) 幻灯片, 以确认肿瘤的存在。重要的是要避免肿瘤与丰富的坏死区域, 因为这可能会增加非特异性背景染色。
请注意:对于此优化, 请避免使用已储存10年或10年以上的石蜡块, 以及在石蜡块中使用外观干燥的组织 (请咨询组织学技术人员)。 - 使用微孔, 从每个块中切割10个连续的串行切片, 厚度为4微米。将部分安装在用于 ihc 的带正电荷的玻璃滑块上, 每张幻灯片的截面为一段。
请注意:切片必须安装完美平坦, 没有皱纹, 因为皱纹可能会产生染色伪影。将串行节的幻灯片编号从1到10。 - 在第一部分上准备一个新的 h & e 幻灯片。在病理学家的帮助下, 回顾 h & e 滑块, 以确认扁桃体组织或肺肿瘤的存在留在块中。
请注意:这个 h & e 幻灯片可以帮助, 稍后, 为多谱分析和表型感兴趣的区域的选择。 - 在4°c 的塑料滑盒中存放未染色的部分, 时间长达三个月。
2. 在自动染色程序上创建新的 mif 染色程序: 注册试剂
请注意:必须先将试剂添加到自动着色器软件中的试剂列表中, 然后才能在协议中使用。有关自动着色器型号和软件版本的信息, 请参阅材料表。
- 单击自动着色器软件中的"试剂" 选项卡。单击"添加"指定新的试剂。输入名称 (例如, "520 tsa 试剂") 和缩写名称 (例如, "520 tsa"), 并注意到最多有8个字符。从下拉菜单中选择 "辅助" , 然后设置供应商。不要更改单-顺序 ds中的单-双污渍.将默认染色协议设置为"协议 f"。将默认的 hier 协议设置为er120。
- 保存新的试剂, 并对表 1中列出的所有试剂重复步骤2.1。
3. 自动安装器: 集装箱的注册
- 在每个容器的一侧写入要使用的试剂的名称。扫描侧面的条形码。在弹出窗口中, 从列表中选择正确的试剂。选择到期日期并保存。
- 对表 1中列出的所有试剂重复步骤3.1 中的过程。
- 注册公开研究工具包。扫描套件一侧的两个条形码, 并按照屏幕上的提示进行操作。将套件命名为 "多重研究工具包 1"。将1x 的三 (羟基甲基) 氨基甲烷 (tris) 缓冲盐水作为该试剂盒的一部分进行登记 (表 1)。
4. 自动安装程序: 创建 mif 协议程序
- 基本多路协议在新的自动着色器上预装了名称为 opal 7 多重 (请参阅"材料表" 中的型号和软件版本)。通过筛选协议屏幕上的 "全部" 而不是 "首选" 来找到协议。如果基本协议不存在, 则在制造商的协助下更新自动着色器软件。
- 所有修改都应在原始协议的副本上进行。在进行更改之前, 请保存原始文件并通过单击 "协议" 选项卡创建副本, 然后右键单击opal 7 多重协议并选择"复制"。
- 将新窗口中的名称更改为7个多重协议 1,并选择与正确设备 (地板型号或台式)关联的选项卡。匹配补充表 s1中的协议。单击 "添加试剂"添加10分钟过氧化物酶抑制步骤 (不是标准协议的一部分), 然后选择过氧化物酶抑制剂作为试剂。
- 确认阻塞步骤使用 pki 阻止缓冲区。确保每个主要抗体都是指适当的试剂, 二级抗体步骤利用 hrp 聚合物, 并利用多光谱自动化试剂盒提供的光谱 4 '、6-二胺-2-苯二苯并无酮 (dapi)。通过检查已为协议屏幕上的下拉菜单中的每个相应步骤指定的试剂来确认所有选项。
5. 自动安装器: 掉落控制和异型控制协议的添加
- 复制名称7 多重协议 1,并将其更改为7 多重协议 1 cd68 drop.将试剂cd68 抗体改为小鼠 igg 并保存该协议。
- 以同样的方式创建另外六个新的协议, 每个掉落控制一个, 另一个用于完全的同型控制 (将所有抗体更改为适当的异构)。
6. 自动安装器: 幻灯片制备协议
- 复制预染色协议* 烘焙和去蜡, 并重命名该协议的多光谱烘焙和去蜡 2 h.
- 调整协议以匹配表2中所示的试剂。在60°c 下烤滑片2小时。在72°c 下脱水30秒。
7. 自动安装器: 试剂的制备
- 准备一个研究检测试剂盒。一个试剂必须与此试剂盒永久关联, 因此, 将标记为 1x tbs 的 30 ml 开放容器与 1x tbs 一起填充, 并将其放置在指定的研究检测试剂盒中的位置 1 (距离手柄最远) 1. 本试剂将永久与本研究试剂相关联, 不得更改位置以供将来使用。
- 标记两个 30 ml 开放容器多光谱块和多光谱二次.用多光谱染色试剂盒中的30毫升阻断的缓冲抗体稀释剂填充多光谱块容器。从多光谱染色试剂盒中加入30毫升的抗鼠嘴抗兔二级抗体聚合物。
- 准备 10个7毫升打开的容器。微升所需的体积为 600 + (150 x [幻灯片数])。在这种情况下, 每个抗体将应用于12张幻灯片 (6 片扁桃体和6肺)。表 3中列出了所有容器的标签和卷。
- 对于每个抗体管, 首先加入抗体稀释剂, 然后在表 3所示体积中加入浓缩的初级抗体。通过温和的移液混合。
- 为 dapi 准备一个7毫升的开放容器, 每毫升双蒸馏水使用四滴 dapi 精矿;共有16个将被 dapi 染色 (600 + [150 x 16] = 3, 000μl)。在容器中加入3毫升的双蒸馏水, 外加12滴光谱 dapi。为每次运行准备新的 dapi。
- 准备一个7毫升开放容器的过氧化物酶抑制剂。所有16张幻灯片将使用过氧化物酶抑制剂 (600 + [150 x 16] = 3, 000μl) 进行处理。在容器中加入3毫升的过氧化物酶块。
- 在制备工作浓度的氟含量之前, 在制造商提供的每个氟管中加入75μl 的二甲基亚硫酸盐, 重新悬浮所有冻干的氟。通过移液混合。这是 tsa 的氟尔股票。存放在4°c。
- 准备六个滴定容器, 每个流动器一个。微升所需的体积为 350 + (150 x [幻灯片数])。在这种情况下, 每个流露将应用于16张幻灯片 (8 片扁桃体和8肺)。表 4中列出了所有容器的标签和卷。
- 在所有试剂都已注册和准备完毕后, 将每个容器放置在机架上的任何位置, 并将所有试剂加载到自动着色器上。探头将确认每个试剂的体积。
8. 自动染色: 样品设置和多光谱染色
-
在自动着色器软件中, 单击屏幕顶部的 "幻灯片设置"。单击 "添加学习"。使用研究 id、研究名称和注释填充弹出窗口。
- 从下拉列表中选择进行染色运行的研究人员的姓名。将点胶体积保持在150μl。选择多光谱去蜡进行准备协议。单击"确定"和"添加幻灯片"。在注释下, 键入 "多重1龙 123 abc"。完成以下字段, 如图所示: 组织类型= 测试组织;分配量= 150μl;染色模式= 单, 常规;标记= 负;染色= 类型 "7 复用协议 1";制备= 多光谱烘焙, dewax 2小时;hier = 用 er1 20分钟。
- 单击 "添加幻灯片"并更改注释和协议以添加拖放控制幻灯片和同型控制幻灯片。将所有幻灯片添加到研究中后, 关闭"添加幻灯片" 窗口并打印标签。将标签应用于每张幻灯片上相应的标签区域。
- 将幻灯片加载到机架中, 以正确的方向应用盖板, 将机架插入自动着色器, 然后降低纸盒。设备将扫描幻灯片标签。
- 当所有幻灯片和试剂都经过扫描和测量时。运行按钮 () 将变为活动状态。如果自动控制器检测到任何错误 (如试剂体积不足), 则受影响的纸盒将显示黄色警告符号。如果发生错误, 右键单击警告符号并更正错误。
- 立即开始染色或计划延迟开始。该协议的持续时间约为14小时。请注意:确保协议将在可以立即取出幻灯片的时候完成, 因为洗脱可能会影响染色结果。
9. 多光谱幻灯片的覆盖
- 从自动污渍机中取出幻灯片, 并将其存放在淹没在 1x tbs 中的机架中。
- 用1.5 盖板和15μl 的安装介质安装样品 (参见材料表)。用移液器尖端轻轻按压盖板, 以去除任何气泡。
- 允许幻灯片在室温下在实验室工作台上过夜固化。通过小心处理, 可以立即扫描未固化的幻灯片。
10. 多光谱扫描仪
- 打开多光谱扫描仪及其计算机的电源 (有关模型和软件信息, 请参阅材料表)。启动显微镜控制软件。按下设备正面的触摸感应按钮, 打开多光谱扫描仪的前门。扫描仪中的每个弹簧加载托架都有四张幻灯片。将所有幻灯片加载到托架中, 并在将托架加载到设备之前记录订单。
- 选择"编辑协议" , 然后单击 "新建...";"然后, 创建协议名称"多重面板 1" 和 "删除控件"。创建研究名称"多复用面板开发", 单击 "创建协议", 然后键入"概述扫描筛选器 dapi";然后, 选择 "整个幻灯片扫描" 和"像素分辨率0.50 微米 (20x)"。所有筛选器和波段都应表示。如果没有, 请单击"编辑筛选器和条带", 选择所有五个筛选器 (dapi、fitc、cy3、texas red 和 cy5), 然后单击"编辑暴露"。
- 通过选择肺腺癌完全倍数的载体来加载载体。使用图形用户界面选择正确的幻灯片。手动或使用自动对焦对焦组织。导航到任何具有可接受的 dapi 染色区域, 然后单击 "自动曝光" 以毫秒 (0–2000 ms) 为单位设置曝光。
- 对 "整个扫描" 和 "msi 区域" 列中的所有五个筛选器集重复相同的过程。在为每个滤光片和放大倍率设置曝光之前, 请务必导航到具有可接受染色的区域, 并重新聚焦显微镜。在20x 整体扫描和20x 多光谱成像 (msi) 多光谱区域中自动曝光所有五个滤波器。选择 0.50μm (20x) 的像素分辨率。保存协议, 然后单击"上一步" 返回到 vectra 软件的主屏幕;然后, 单击 "扫描幻灯片"。
- 打开每张幻灯片的界面, 并将"任务 " 设置为 "扫描"。将研究设置为多重面板开发,设置多路面板1和跌落控制的协议, 并将幻灯片 id设置为多重肺 abc123、多重 cd68 滴肺 abcc123等.标记了所有幻灯片并设置了任务后, 单击 "扫描"。自动多光谱扫描仪将使用所有五个滤光片对所有幻灯片进行全幻灯片扫描。
11. 多光谱扫描仪: 多光谱成像
- 扫描完成后, 打开qptiff软件 ("享图图"), 然后单击左上角的 "加载幻灯片" 。这将打开一个 qptff, 这是一个五过滤器全幻灯片扫描。每一层都包含来自多个氟度的信息, 因此效用有限, 但组织结构和广泛的表达模式是显而易见的, 可用于选择 msi 的区域。
- 使用左侧的下拉树导航到并打开研究中的正确幻灯片。使用用户首字母登录 (右上角)。
- 使用屏幕顶部的"戳" 工具为 msi 选择五个区域。如果有病理学家, 请咨询。在"选择为" 下, 选择 "获取";"在"字段中的大小" 下, 选择1x1;并在"字段限制" 下, 选择0.5μm (20x)。根据细胞角蛋白 (ck) 染色 (主要是 cy5), 选择肿瘤 (ck +) 和间质 (ck-l-) 的几个区域, 从整体扫描中进行成像。对每张幻灯片重复此过程。
- 选择所有 msi 后, 关闭phenochart软件并返回到 vectra软件。将每张幻灯片的任务从"扫描" 更改为msi , 然后再次单击 "扫描" 以执行 msi 集合。
12. 光谱解混
请注意:在滑块的通道分离和图像分析中, 需要进行光谱非混合步骤。在在 form 软件中执行光谱非混合之前, 必须使用用每个流感单独染色的肺腺癌幻灯片和单独使用 dapi 来构建光谱库。上述多重 ihc 检测开发指南中也介绍了这一过程。
- 当 msi 采集完成后, 使用频谱解混 ("inform") 软件打开msi文件夹中的文件。这些文件以. im3 文件类型扩展名结尾。
- 在"图像格式"下, 选择"多光谱"; 在 "图像格式" 下, 选择 "多光谱"在"示例格式"下, 选择"荧光";, 在"光谱库源"下, 选择 "输入"。
- 要选择流量, 请从使用肺腺癌库幻灯片构建的库中选择并加载所有六个流通量和 dapi。单击 "全部准备" (左下角)。光谱解混软件将使用所提供的光谱剖面, 对所有打开的图像执行光谱解混。
- 与病理学家一起, 在同一组织的连续幻灯片中, 评估同一目标的染色体单色污渍的染色模式。
13. 荧光强度和信号衰减的评估
请注意:计数工具, 显示为箭头与一个小棕色箱子, 是最重要的工具为多重优化并且应该频繁地使用 (参见补充材料)。使用光谱解混软件中的计数工具, 评估信噪比, 至少应超过 10: 1 (请参阅用于故障排除和使用落差控制评估多重染色的补充材料)。
- 13.1. 在光谱解混软件中打开图像后, 使用计数工具和测量图像来评估每个通道的荧光强度。肺组织的目标强度在10到20个归一化计数之间。规范化计数工具如图 1所示。
- 排除最大信号计数小于10或正常信号面积计数小于5个的幻灯片, 以便自动荧光和非目标染色不会与真实信号竞争。
- 排除任何通道最大计数大于30的幻灯片, 以避免光谱出血或低效光谱不混合。
- 通过调整 tsa 浓度来解决高或低归一化计数问题。
14. 多光谱图像分析
- 在光谱解混软件中打开一个或多个 msi, 并只选择至少在一个打开的图像中表示的用于非混合的流。单击 "全部准备" 以取消混合当前打开的所有彩色图像, 从而生成光谱式的非混合图像。
- 选择计数工具, 通过悬停在感兴趣的区域上来测量每个图像的计数。
- 选择眼睛图标以打开视图编辑器。选择并调整每个独立通道的显示强度。
- 选择"配置"以打开组织分割、细胞分割、表型和评分模块。这些工具是对致变色单色污渍进行多重染色的客观验证所必需的, 可用于生成定量的视量数据 (图 s1)。
- 使用 "导出" 选项卡可以保存灰度、荧光、路径式的未压缩 tiff 和来自视光分析模块的数据文件, 以便进一步分析、存档和演示 (图 s1)。
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Representative Results
此处描述的协议将提供如图 2所示的结果。从评估扁桃体控制中的染色开始, 从表面鳞状细胞上皮开始。扁桃体样本的组织学可与病理学家一起进行检查, 并以 h & e 幻灯片为参考。如果在同一组织块上使用相同的标记进行显色 ihc 切片, 则这些标记可用于确认 mif 幻灯片上每个标记的密度和分布。如图 2a 所示, 扁桃体组织应在扁桃体表面鳞状上皮中提供明确定义的 ee半3细胞角蛋白染色 (图 2a; 标记为红色伪结肠), 而在扁桃体淋巴淋巴细胞中没有背景组织。染色应该是细胞质, 偶尔与膜加重, 和细胞核必须是负的。隐窝中网状上皮对细胞角蛋白 (红色) 和 pd-l1 均为阳性 (图 2a; 绿色伪彩色)。因此, 应确定扁桃体的滤泡萌发中心。萌发中心应该很容易辨认, 应该富含 ki-67 阳性淋巴细胞 (图 2a; 黄色假结肠)。ke-67 染色应始终是核染色。在萌发中心存在的巨噬细胞也应该很容易识别, 有时作为更大的细胞 (也称为 "易碎的身体")。他们将显示 cd68 作为颗粒细胞质染色的阳性染色 (图 2a; 橙色伪彩色)。在萌发中心之外的 cd68 细胞的比例也会很大。巨噬细胞可能显示 pd-l1 的膜染色。这在网状上皮的强度通常比 pd-l1 染色更苍白。不应存在核 cd68 染色。cd8 应染色具有 t 细胞分布的淋巴细胞 (在萌发中心较少, 在卵泡间区域的比例较大; 见图 2a, 青色伪结肠)。cd8 + 淋巴细胞通常是细胞质稀少的小细胞, 因此几乎不可能区分淋巴细胞中的细胞膜和细胞质。pd-1 会强烈染色萌发中心区域的小淋巴细胞, 通常聚集在萌发中心的外围 (图 2a; 品红色假结肠), 以及在卵泡间区域的分散淋巴细胞, 通常染色强度低于萌发中心区域的染色强度。与 cd8 一样, 在被 pd-1 染色的小淋巴细胞中, 无法清楚地区分膜和细胞质染色。由于 cd8 细胞的比例不变, 因此为了质量控制的目的, 建议将同一组织中染色的每个标记的染色模式和分布与显色 ihc 参考幻灯片进行比较, 如建议在以前出版的协议12。
在扁桃体组织控制中确认预期的染色模式后, 继续评估肺癌样本中的染色 (图 2b)。由于肿瘤组织有望显示标记的可变和异质表达, 因此在优化新的 mif 面板时, 比较在 mif 方法中观察到的每个标记的染色模式及其表达方式是非常重要的在标准的显色 ihc 滑块中观察到, 评估阳性细胞的数量和分布, 如前面所述的12。然而, 应保留基本的染色模式;例如, 细胞角蛋白应在上皮细胞的细胞质中观察, 而不是在细胞核中观察;cd68 应以粒细胞质染色的形式出现在巨噬细胞等中.重要的是, 在某些标记中, 染色强度可能会从扁桃体控制变为癌症组织;例如, 与扁桃体对照中观察到的高表达相比, pd-1 和 pd-l1 在肿瘤组织中的染色强度较低。因此, 使用 in 软件中的计数工具, 使用肿瘤组织的例子而不是扁桃体控制, 进行评估和优化是非常重要的。
最后, 需要评估同位素负控制和下降控制, 不仅用于检测背景和自荧光, 还用于伞效应和光谱出血 (图 3和图 4)。异型对照不应显示任何免疫染色整个幻灯片;如果观察到任何染色, 则必须重新检查成像或染色程序。由于 mif 方法在优化新的多路面板过程中采用了 mif 方法, 因此, 由于 mif 方法, 下降控制对于评估染色中的潜在伪影 (如光谱出血或伞效应) 非常重要 (参见图5, 补充图 s2, 补充图 s3和补充材料)。应评估荧光单环和滴控, 并与完整的多路面板进行比较。每个滴控制应显示相同的染色模式, 但单个初级抗体除外, 应在每个特定对照中去除。更多详情见补充材料部分。
图 1: 在窗体计数工具中.通过选择米色框图标来激活 inform 软件计数工具。对位深度、曝光时间、增益和分箱进行归一化计数进行了校正。图像是以20x 放大倍率拍摄的;刻度栏 = 50μm. 请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 具有代表性的结果.(a) 扁桃体和 (b) 非小细胞肺癌被 pd-l1 (520 tsa, 绿色)、cd8 (540 tsa、青色)、ki67 (570 tsa、黄色)、cd68 (620 tsa、橙色)、细胞角蛋白 (650 tsa、红色) 和 pd-1 (690 tsa, 洋红色)。下面的小面板分别显示了各个通道。标记显示在每个图像的右上角。图像是以20x 放大倍率拍摄的;刻度杆 = 50 (或250微米)。在 a组中显示的是 1) 淋巴滤泡、2) 萌发中心、3) 卵泡间区域和 4) 分层鳞状上皮。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: tsa 封锁伞效果.这是一个由 pd-1 抗体阻滞 cd3 信号以取决于存在的 tsa 量的方式沉积 690 tsa 的示例。最亮的 690 tsa 信号最有效地阻止 620 tsa 信号 (非小细胞肺癌染色为 690, 抗降 d-1 d4w2j 30分钟, 0.52μgml 或等型, 然后在1:100 处检测 10分钟 690 tsa; 然后, 抗 cd3 F7.2.38 30分钟, 0.14μg/ml然后是在1:100 时进行10分钟的 620 tsa 检测。图像是以20x 放大倍率拍摄的;刻度栏 = 50μm. 请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 4: 光谱出血.非小细胞肺癌组织被使用 ki-67 下降控制方案 (省略了使用 ki-67 抗体的完整多路复用协议)。显示了 540 tsa 通道 (cd8) 和 570 tsa 通道 (ki-67)。没有明显的核染色模式, 但在 570 tsa 通道中观察到 cd8 染色模式的副本减少。这最好的解决方法是确保所有通道都有可比的染色强度。在这种情况下, 添加一个强大的 ki-67 信号 (10 到20之间的归一化计数) 将纠正光谱出血。图像是以20x 放大倍率拍摄的;刻度栏 = 50μm. 请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 5: 删除控件.此图显示了一个完整的多重的综合图像相比, 相同区域的肺腺癌的顺序幻灯片染色下降控制, 其中表明的原代抗体被省略。这些图像是以20x 的放大倍率拍摄的;刻度栏 = 50μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
| 名字 | abbr. 名称 | 类型 | 容器 | 组 |
| pki 阻止缓冲区 | opalblok | 辅助 | 开盘30毫升 | 一般 |
| 蛋白石聚合物 hrp | opal 2ab | 辅助 | 开盘30毫升 | 一般 |
| opal 1x tbs | opal1tbs | 辅助 | 开盘30毫升 | 套件 |
| cd68 0.30μml pg-m1 mus | opalcd68 | 辅助 | 开立7毫升 | 一般 |
| ki67 0.61μml mib-1 mus | opalki67 | 辅助 | 开立7毫升 | 一般 |
| pd-l1 0.20μgml sp263 rab | opalpdl1 | 辅助 | 开立7毫升 | 一般 |
| d-1 0.52 微克/ml d4w2j rab | opal pd1 | 辅助 | 开立7毫升 | 一般 |
| cd8 0.70μgml sp239 rab | opal cd8 | 辅助 | 开立7毫升 | 一般 |
| ck 0.24μgml ae半 3 mus | OPAL CK | 辅助 | 开立7毫升 | 一般 |
| 鼠标 igg | OPAL MUS | 辅助 | 开立7毫升 | 一般 |
| 兔 igg | 拉加禁核 | 辅助 | 开立7毫升 | 一般 |
| opal 过氧化物酶块 | opalperx | 辅助 | 开立7毫升 | 一般 |
| 光谱 dapi | opaldapi | 辅助 | 滴定6毫升 | 一般 |
| 蛋白石520试剂 | opal 520 | 辅助 | 滴定6毫升 | 一般 |
| 蛋白石540试剂 | opal 540 | 辅助 | 滴定6毫升 | 一般 |
| 蛋白石570试剂 | opal 570 | 辅助 | 滴定6毫升 | 一般 |
| 蛋白石620试剂 | opal 620 | 辅助 | 滴定6毫升 | 一般 |
| 蛋白石650试剂 | opal 650 | 辅助 | 滴定6毫升 | 一般 |
| 蛋白石690试剂 | opal 690 | 辅助 | 滴定6毫升 | 一般 |
表 1:leica bond rx 协议, 蛋白石试剂
| 试剂 | 时间 (h) | 温度 (摄氏度) | |
| 1 | 无试剂 | 120:00 | 60 |
| 2 | 邦德脱水解决方案 | 0:30 | 72 |
| 3个 | 邦德脱水解决方案 | 0:00 | 72 |
| 4个 | 邦德脱水解决方案 | 0:00 | 环境温度 (室温) |
表 2: opal 编制协议
| 目标 | μgml | 克隆 | 源 | 很多 | 库存μgml | μl 稀释剂 | μl ab |
| cd68 | 0。3 | pg-m1 | 达科 | 20043031 | 30 | 2376 | 24 |
| ki67 | 0.61 | mib-1 | 达科 | 20049476 | 46 | 236.17 | 31.83 |
| pd-l1 | 0。2 | sp263 | 发泄。 | f09591 | 1.61 | 2101.86 | 298.14 |
| pd-1 | 0.52 | d4w2j | Cst | 1 | 100元 | 2387.52 | 12.48 |
| cd8 | 0。7 | sp239 | 文塔纳 | 160318 | 70 | 2376 | 24 |
| Ck | 0.24 | aeee3 | 达科 | 10129428 | 179。5 | 236.6 79 | 3.21 |
| mus igg | 0.61 | ||||||
| 拉伯 igg | 0。7 |
表 3: 原发抗体制备。
| 蛋白石氟 | 幻灯片 | 稀释 | μl 稀释剂 | μl 蛋白石氟 |
| 蛋白石520 | 16 | 1: 200 | 2736。3 | 13。8 |
| 蛋白石540 | 16 | 1:700 | 2746。1 | 3。9 |
| 蛋白石570 | 16 | 1: 150 | 2731。7 | 18。3 |
| 蛋白石620 | 16 | 1: 100 | 2722。5 | 27。5 |
| 蛋白石650 | 16 | 1:350 | 2742。1 | 8。9 |
| 蛋白石690 | 16 | 1: 150 | 2731。7 | 18。3 |
表 4: opal 氟制备。
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Discussion
正在进行的癌症免疫治疗革命为癌症患者开辟了新的、有希望的治疗选择。免疫肿瘤学领域的进展将需要增加对炎症性肿瘤微环境的了解, 这不仅是为了了解致癌过程中免疫机制的生物学, 也是为了寻找新的预测生物标志物。免疫治疗 1,2。由于癌症免疫学的复杂性, 通常需要对肿瘤组织样本进行审讯, 以形成越来越多的免疫标记物, 这些标记物相互作用, 并经常被组织中不同的细胞群共同表达 1 ,2,5。临床试验通常采用小活检, 如核心针或内窥镜活检, 这些活检是在不同的治疗点收集的, 以评估和监测患者的反应。这种活检提供了有限的组织量, 这反过来又限制了可用于癌症免疫分析的组织切片的数量。在使用标准单人 ihc 等传统技术时, 这种限制特别繁重。因此, 显然需要新的癌症免疫分析方法, 利用多种技术, 同时评估不同生物标志物的共表达, 并更有效地利用有价值的组织标本。
在这里详细描述的多重染色和多光谱成像方法中, mif 面板用于对 ffpe 组织进行免疫肿瘤学研究, 例如临床试验的活检。这种方法已经被描述, 验证, 并成功地应用于癌症免疫分析8,9,10, 11, 12,14, 15. 以前公布的协议描述了类似于基于 tsa 的系统的 mif 染色方法, 如七色试剂盒, 这很耗时, 需要一名专门的实验室科学家进行大约4天的工作12 ,15。针对这些缺点, 该协议通过使用商用自动着色器进行了优化, 将染色时间大大缩短到 14小时, 并消除了手动操作人员引入的可变性。成像是在多光谱扫描仪上进行的, 该扫描仪能够分离多路幻灯片中七个或更多荧光信号的光谱, 包括自体荧光, 可以在不降低信号质量的情况下有效地去除这些信号。任何能够访问材料表中详细介绍的仪器和试剂的实验室用户都可以复制、修改和执行此协议。
本协议中的关键步骤是第7、10、11、12节。第7节涉及试剂的制备。必须仔细准备用于多重染色的试剂, 这需要实验室科学家或技术人员的集中关注, 以避免与操作人员相关的变化。例如, 多重方法的主要问题之一是染色变异性, 这可以通过仔细准备试剂, 特别是 tsa 染料的稀释来减少。第10节和第11节与图像采集有关。一个重要的风险是图像的过度曝光或过饱和, 这可能会导致光谱出血, 在这种文物中, 来自另一个通道的信号干扰了通道的成像 (见补充材料)。仔细调节曝光时间有助于防止过饱和和光谱出血。光谱解混是在第12节中进行的。这取决于光谱库的准备工作 (在《多重 ihc 评估开发指南》中进行了描述, 可在线查阅)。在此步骤中, in 软件经过 "训练", 可以专门识别每个 tsa 染料的颜色。光谱库是通过使用来自对照组织的部分 (如人体扁桃体) 创建的, 该部分使用均匀表示的标记 (如 cd20) 进行染色, 并与单个幻灯片上的每个单独 tsa 染料结合使用。此外, 还需要自体荧光幻灯片 (也在多重 ihc 检测开发指南中描述) 来训练 in form 软件来识别和减去组织自体荧光。自体荧光控制幻灯片应使用来自正在研究的相同组织 (如肺癌等) 的样本进行制备, 并以与 mif 幻灯片相同的方式进行处理, 并使用原生和二级抗体进行培养, 但不使用 tsa 染料。只能选择单个自体荧光光谱剖面, 因此必须注意选择可观察到的自体荧光的表示形式, 这种荧光可能来自胶原蛋白、纤维化、红细胞、内源性色素和其他来源。在每个新项目开始时创建一个新的光谱库, 并使用代表组织研究标本的自体荧光光谱, 并运行与同一项目中每个批次的阳性对照相同的组织块,是有价值的方法步骤, 将有助于提高在同一项目中不同样本之间的光谱不混合的一致性。
本协议中描述的多重方法提供了几种故障排除工具, 包括信号到噪声评估器 (计数工具)、跌落控制 (补充材料) 和用于染色质量控制的病理视图。计数工具有助于评估染色的强度和背景水平。如果强度和/或背景水平较高, 第一种方法是减少 tsa 染料的稀释。如果问题仍然存在, 用于优化该特定标记的显色 ic 幻灯片应与病理学家进行审查, 以查找背景的存在。病理视图是由 inform 软件生成的, 使用类似二胺酶的伪彩色表示来自 tsa 连接的氟化物的荧光, 以及从所有荧光信号 (包括 dapi) 生成的假血红素表示形式.病理视图中的图像有助于病理学家对染色模式进行视觉评估, 以改善染色效果。在优化新面板的过程中, 以及在染色工作流程中作为质量控制步骤, 应始终使用这些工具。
mif 方法要求使用经适当验证和优化的原代抗体, 以适应福尔马林固定组织的标准显色 ihc。例如, mif tsa 方法的主要优点之一是它与临床病理实验室已验证和优化的原代抗体的使用兼容性12。这一优势意味着, 实验室用户可以定制多路面板, 以回答特定的癌症免疫学问题, 而不需要预共轭抗体, 从而提供快速和动态的面板开发。在这方面, 优化新面板的实际工作流程从验证和优化具有标准显色 ihc 的抗体开始, 寻找最佳的稀释和染色条件, 以提供干净和一致的染色。下一步, 使用相同的稀释优化 ihc, 是转移染色使用 tsa 氟度代替二胺苯并定, 并比较单次单聚免疫荧光-tsa 的结果与显色性 ihc 作为参考。最后, 抗体可以结合 mif 染色, 始终以显色 ihc 染色模式为对照, 调整 mif tsa 染色参数, 主要是 tsa 染料稀释和染色序列。在此过程中, 与病理学家的合作有助于评估染色质量。
这种技术的局限性包括优化和验证新的面板所需的时间和精力, 以及 mif 面板的免疫表型分析。然而, 主要的关切是 mif 方法的适当验证。缺乏对这些技术的适当验证会产生无效的结果, 这可能会给文献增加令人困惑的数据, 从而阻碍更好地了解癌症免疫学生物学16的努力.因此, 调查员有责任尽一切努力适当验证多重方法, 包括确保在组织验证和评价方面具有培训和经验的病理学家密切参与和评价组织病理学和基于 ihc 的技术17,18,19, 20.这里介绍的协议包括一些工具, 可以帮助验证一个新的多面板, 包括病理评估的 h & e 幻灯片染色和分析, 使用显色 ic 作为参考, 以优化 mif tsa染色, 一种新的多路面板的质量控制的下降控制方法, 以及使用等型、自荧光和掉落控制。尽管 mif 方法技术复杂, 但多光谱成像与光谱不混合等技术以及其他新颖的多路平台, 正在为分析患者的组织标本和产生新的形式开辟了一个新的时代仅在标准 ihc 中是不可能的数据。因此, mif 技术的发展和应用将继续增长, 成为临床试验活检的癌症免疫分析的有力工具, 并有助于确定用于免疫治疗的新的多参数预测生物标志物,最重要的是, 受益于癌症患者。
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Disclosures
这项工作得到了 astrazeneca 的全球生物制剂 r & d 臂 medimune 的支持。c. w.、k. r. 和 c. c. h. 是 perkin elmer 的员工, 他们生产这项工作中使用的试剂 (tsa 套件) 和多光谱扫描仪。m. s.、k. d.、a. h.、w. z.、c. bagnall、c. brown、j. c.、a. l.、k. s.、m. r. 和 j. r. c. 是 medmune 的雇员, 在 AstraZeneca 拥有股票所有权和股票权益或期权。
Acknowledgments
medimmune 的 deborah s人提供了编辑支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
References
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