Automatiseret Multiplex immunofluorescens Panel for Immuno-onkologi undersøgelser af Formalin-fast karcinom væv prøver

Summary

En detaljeret protokol for en six-markør multiplex immunofluorescens panel er optimeret og udføres, ved hjælp af en automatiseret stainer for mere ensartede resultater og kortere procedure tid. Denne tilgang kan tilpasses direkte af ethvert laboratorium for immuno-onkologi undersøgelser.

Abstract

Fortsatte udvikling i immuno-onkologi kræver en øget forståelse af mekanismerne i kræft immunologi. Immunoprofiling analyse af vævsprøver fra formalin-fast, paraffin-embedded (FFPE) biopsier er blevet et vigtigt redskab til at forstå kompleksiteten af tumor immunologi og opdage nye prædiktive biomarkører for cancer immunterapi. Immunoprofiling analyse af væv kræver evaluering af kombinerede markører, herunder inflammatorisk celle delpopulationer og immun checkpoints, i tumor mikromiljø. Fremkomsten af nye multiplex immunhistokemiske metoder giver mulighed for en mere effektiv multiparametric analyse af enkelt væv sektioner end standard monoplex Immunhistokemi (IHC). Et kommercielt tilgængelige multiplex immunofluorescens (hvis) metode er baseret på tyramide-signal forstærkning, og kombineret med multispektrale mikroskopisk analyse, giver mulighed for et bedre signal adskillelse af forskellige markører i væv. Denne metode er kompatibel med brug af ukonjugeret primære antistoffer, der er blevet optimeret til standard IHC på FFPE vævsprøver. Heri vi beskriver i detaljer en automatiseret protokol, der tillader multiplex, hvis mærkning af karcinom vævsprøver med en seks-markør multiplex antistof panel bestående af PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67 og AE1/AE3 cytokeratins med 4′, 6-diamidino-2-phenylindole som en nuklear celle kontrastfarve. Multiplex panel-protokollen er optimeret i en automatiseret IHC stainer i en farvnings-tid, der er kortere end for manuel-protokollen og kan direkte anvendes og tilpasset af ethvert laboratorium investigator for immuno-onkologi undersøgelser på menneskelige FFPE vævsprøver. Også beskrevet er flere kontrolelementer og værktøjer, herunder en drop-kontrol metode for fine kvalitetskontrol af et nyt multiplex hvis panel, der er nyttige for optimering og validering af teknikken.

Introduction

Immunoprofiling analyse af FFPE tumor vævsprøver er blevet en væsentlig bestanddel af immuno-onkologi undersøgelser, især for opdagelse og validering af roman prædiktive biomarkører for cancer immunterapi i forbindelse med kliniske forsøg^{1 ,2}. Kromogent IHC, ved hjælp af kemiske chromogens såsom diaminobenzidine, forbliver den standard teknik i diagnostisk patologi for immunolabeling af biopsi væv³. Standard IHC kan også bruges til kræft væv immunoprofiling, herunder kvantitering af delpopulationer af tumor-associerede lymfocytter og vurdering af udtryk niveauer af immun checkpoints som programmeret celle død ligand 1 (PD-L1)^{4 ,5}. Standard IHC er begrænset, men i der kun et antigen kan være mærket pr. væv afsnit. Fordi immunoprofiling undersøgelser kræver typisk analyse af den kombinerede udtryk for flere markører, brug af standard IHC ville kræve farvning af flere væv sektioner, hver farves med et enkelt datamærke, og ville derfor være væsentligt begrænset til analyse af små vævsprøver som kerne nål biopsier. Standard IHC metoder er også begrænset til vurdering af markører, der er coexpressed af forskellige cellepopulationer, som er fælles med immun checkpoint markører som PD-L1, som er udtrykt af både tumor-associerede makrofager og kræftceller. Denne begrænsning er blevet rapporteret i, for eksempel, brug af standard monoplex IHC af patologer til kvantitativ analyse af en IHC markør udtrykt ved forskellige celle typer⁶. Udviklingen af multiplex kromogent IHC teknikker ansætte forskellige farvede chromogens på de samme væv afsnit udgør en fremgang over standard IHC monoplex metode,⁷ , selv om de fortsat er begrænset af immunolabeling af et par markører og også udgøre en vigtig teknisk udfordring for korrekt evaluering af markører udtrykt i de samme subcellulært rum i de samme cellepopulationer.

De førnævnte forbehold med hensyn til væv tilgængelighed fra kliniske prøver samt begrænsninger af multiplex kromogent IHC teknikker, har givet anledning til behovet for at udvikle forbedrede multiplex metoder til immuno-onkologi undersøgelser baseret på fluorescerende mærkning kombineret med billedsystemer, der effektivt kan adskille signaler af flere fluorophores fra den samme dias. En sådan teknik er baseret på tyramide signal forstærkning (TSA) kombineret med multispektrale mikroskopi tænkelig nemlig effektiv farve separation⁸. Et kommercielt tilgængelige TSA-baserede kit beskæftiger fluorophores optimeret til multispektrale imaging⁸ (Se Tabel af materialer). En afgørende fordel ved dette system er dens forenelighed med de samme umærkede primære antistoffer, der allerede er blevet valideret og optimeret til standard kromogent IHC^9,10,11. Dette giver mulighed for ikke blot hurtigere optimering, men også fleksibilitet i den optimering og panel ændringer indarbejde nye mål. Derudover multiplex immunofluorescens (mIF) TSA metode kan være optimeret til kommercielt tilgængelige automatiserede IHC stainer systemer, giver mulighed for en enkel overførsel fra monoplex kromogent IHC til mIF.

Her præsenterer vi en protokol til en mIF panel for immuno-onkologi undersøgelser, der er baseret på automatiseret mIF TSA farvning og anvender en multispektral scanner for billeddannelse. Denne protokol kan tilpasses og ændres af enhver laboratorium bruger med adgang til de beskrevne instrumentering og reagenser. Protokollen omfatter et panel af seks primære antistoffer for immunoprofiling af carcinomer: PD-L1, PD-1, CD68 (som pan-makrofag markør), CD8 (T-cytotoksiske celler), Ki-67 og AE1/AE3 (pan-cytokeratin, bruges som en epitelial markør til identifikation af karcinom celler). En nylig undersøgelse beskriver optimering af en manuel TSA mIF protokollen ved hjælp af kromogent IHC som standard reference til at validere multiplex farvning¹². Den opdaterede metode præsenteres her er udviklet ved hjælp af en kommercielt tilgængelig, syv-color TSA kit optimeret i en automatiseret stainer, drastisk forkorte farvning tiden fra 3-5 dage til 14 h, mens også forbedring af sammenhængen i farvning. Ud over detaljerede vigtigste protokollen præsenteres her, indeholder en Supplerende materialer sektion metoden "drop-kontrol", en ekstra kvalitetskontrol til at evaluere et nyt mIF panel, såvel som tekniske noter til optimering, fejlfinding og udvikling af nye multiplex paneler til at hjælpe laboratorium bruger til at konfigurere og optimere metoden mIF TSA for tilpassede mIF paneler.

Protocol

Bemærk: Protokollen præsenteres her beskriver hvordan man udfører immunoprofiling af en mIF panelet ved hjælp af TSA for seks antistoffer (CD68, ki67, PD-L1, PD-1, CD8 og AE1/AE3) på en automatiseret stainer (Se Tabel af materialer). Protokollen beskriver også, hvordan til at udføre slippe objekter for en kvalitetskontrol af et nyt mIF panel (Se Supplerende materialer). I denne protokol, er farvning udført med otte unstained FFPE dias fra menneskelige tonsil (positiv kontrol) og otte unstained dias fra menneskelige lunge adenocarcinom. Det første dias bruges til fuld multiplex farvning med alle seks markører, det andet dias for kontrolelementet isotype, hvor ingen primære antistoffer er udnyttet, og de resterende seks dias for dråbe kontrollen (Se Supplerende materialer). En yderligere kontrol for væv autofluorescence anbefales og bør altid være inkluderet i en multiplex undersøgelse (Se Supplerende materialer). Dog kan efterforskere ansætte andre tumortyper og kontrol efter deres eget projektmål. Laboratoriet brugere uden tidligere erfaring med mIF TSA metode og multispektral scanner teknikker bør læse guiden Multiplex IHC udvikling (tilgængelig online på http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp). Selv om denne vejledning beskriver en manuel protokol, giver det også en god introduktion til mIF farvning metode. Alle væv sektioner ansat i denne protokol var anonymiseret og godkendt i henhold til Helsinki-erklæringen.

1. vævsprøver

1. Vælg en FFPE menneskelige tonsil prøve der indeholder lymfoid hyperplasi anvendes som positiv kontrol og en FFPE menneskelige lunge adenocarcinom prøve kendt for at være PD-L1 positive. Anmeld hæmatoxylin og eosin (H & E) slides af valgte lunge kræft blokke til at bekræfte tilstedeværelsen af en tumor. Det er vigtigt at undgå tumorer med rigelige områder af nekrose, da dette kan øge uspecifikke baggrund farvning.
   Bemærk: For denne optimering, undgå at bruge paraffinblokke, der er gemt i 10 år eller mere og væv med en tørret udseende i paraffin blok (consult en tekniker, histologi).
2. Ved hjælp af en mikrotom, cut 10 på hinanden følgende seriel afsnit fra hver blok, 4 µm tykt. Montere sektionerne på en positivt ladede glas dias bruges til IHC, én afdeling per dias.
   Bemærk: Sektioner skal monteres helt fladt uden rynker, som rynker kan generere farvning artefakter. Antal dias af sektionerne serie fra 1 til 10.
3. Forberede et nyt H & E dias på den første sektion. Anmeld H & E diaset ved hjælp af en patolog til at bekræfte tilstedeværelsen af tonsil væv eller lunge tumor tilbage i blokken.
   Bemærk: Dette H & E dias kan hjælpe, senere, med udvælgelsen af områder af interesse for multispektrale analyse og fænotyper.
4. Gemme unstained sektioner i en plastic slide boks ved 4 ° C i op til tre måneder.

2. oprettelse af en ny mIF farvning Program på en automatiseret Stainer: registrering af reagenser

Bemærk: Reagenser skal føjes til reagenslisten i automatiserede stainer software, før de er tilgængelige til brug i protokoller. Se Tabel af materialer du kan finde oplysninger om den automatiserede stainer model og software version.

1. Klik på fanen reagenser inden for automatiserede stainer software. Klik på Tilføj for at udpege en ny reagens. Angiv navn (f.eks., "520 TSA reagens") og det forkortede navn (f.eks., "520 TSA"), at bemærke, at der er højst otte tegn. Vælg accessoriske fra drop-down menuen og Indstil leverandøren. Ændre ikke Enkelt/dobbelt pletten fra Enkelt/fortløbende DS. Indstille standard farvning protokol til Protokollen F. Indstil HIER standardprotokol til ER1 20.
2. Gem den nye reagens og Gentag trin 2.1 for alle reagenser der er anført i tabel 1.

3. automatiseret Stainer: Registrering af containere

1. Skriv navnet på reagenset, der skal bruges på hver beholder. Scan stregkoden på siden. I pop-up-vinduet, skal du vælge den korrekte reagens på listen. Vælg en udløbsdato og gemme.
2. Gentag fremgangsmåden i trin 3.1 for alle reagenser i tabel 1anførte.
3. Registrere åbne forskning Kit. Scanne begge stregkoder på siden af sættet og følg den på skærmen beder. Navngive sættet "Multiplex forskning Kit 1." Registrere de 1 x tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris)-bufferet saltvand som en del af dette kit (tabel 1).

4. automatiske Stainer: Oprettelsen af en mIF protokol Program

1. Base multiplex protokollen er præinstalleret med navnet Opal 7 Multiplex på nye automatiserede stainers (Se model og software gengivelse i Tabel af materialer). Find protokollen af filtrering "alle" i stedet for "foretrukne" på skærmbilledet protokol. Hvis base-protokollen ikke er til stede, derefter opdatere automatiseret stainer software med assistance fra producenten.
2. Alle ændringer bør gennemføres på kopier af de originale protokol. Før du foretager ændringer, gemme originalen og oprette en kopi ved at klikke på fanen protokoller , derefter højreklikke på Opal 7 Multiplex -protokollen og vælge kopi.
3. Ændre navn til 7 Multiplex protokol 1 i det nye vindue og vælg fanen knyttet til den korrekte enhed (gulv model eller benchtop). Matche protokollen i Supplerende tabel S1. Klik på Tilføj reagens for at tilføje en 10 min peroxidase hæmning trin (ikke en del af standard-protokol) og vælg peroxidase-hæmmer som reagens.
4. Bekræfte, at de blokerende trin udnytte en PKI blokerende buffer. Sikre, at hver primære antistof refererer til den passende reagens, at sekundær antistof trin udnytte en HRP polymer, og den spektrale 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) forsynet med multispektrale automation kit er udnyttet. Bekræfte alle valg ved at kontrollere den reagens, der er udpeget for hvert respektive trin i drop-down menuen på skærmen protokol.

5. automatiseret Stainer: Tilsætning af slippe objekter og Isotype Control Protocol

1. Kopiere navnet 7 Multiplex protokol 1 og ændre det til 7 Multiplex protokol 1 CD68 slip. Ændre reagens CD68 antistof til Musen IgG og gemme protokollen.
2. Oprette seks flere nye protokoller, én for hver dråbe kontrollen og én til komplet isotype kontrol (ændre alle antistoffer til den passende isotypes) på samme måde.

6. automatiseret Stainer: Slide forberedelse protokol

1. Afskrift den prestaining protokol * bage og afvoksning og omdøbe denne protokol multispektrale bage og afvoksning 2 h.
2. Justere protokol for at matche de reagenser, der er vist i tabel 2. Bage dias i 2 timer ved 60 ° C. Afvoksning for 30 s på 72 ° C.

7. automatiseret Stainer: Forberedelse af reagenser

1. Forberede en forskning detection kit. Et reagens skal være permanent forbundet med dette kit, så fyld 30 mL åben container mærket for 1 x Tris-bufferet saltvand (TBS) med 1 x TBS og finde dette i position 1 (længst væk fra håndtag) i den forskning detection kit udpeget Multiplex forskning Kit 1. dette reagens vil blive permanent knyttet til denne forskning kit og skal ikke ændre holdning til fremtidig brug.
2. Label to 30 mL åbne containere Multispektrale blok og Multispektrale sekundære. Fyld Multispektrale blok container med 30 mL blokerende buffer/antistof fortyndingsmiddel fra multispektrale farvning kit. Fyld Multispektrale sekundære beholderen med 30 mL af anti-mouse/anti-rabbit sekundær antistof polymer fra multispektrale farvning kit.
3. Forberede ti 7 mL åbne containere. Den nødvendige volumen i microliters er 600 + (150 x [antal dias]). Hver antistof vil blive anvendt til 12 dias i dette tilfælde (seks tonsil og seks lunge). Mærkning og diskenheder for alle beholdere er angivet i tabel 3.
4. For hver antistof tube, først føje antistoffet fortyndingsmiddel, efterfulgt af den koncentrerede primære antistof i mængderne, der er angivet i tabel 3. Mix af blid pipettering.
5. Forberede en 7 mL åben container for DAPI, ved hjælp af fire dråber DAPI koncentrat per milliliter dobbeltdestilleret vand; ialt 16 vil farves med DAPI (600 + [150 x 16] = 3.000 µL). Tilføj 3 mL dobbeltdestilleret vand plus 12 dråber af spektrale DAPI i containeren. Forberede frisk DAPI for hver kørsel.
6. Forberede peroxidase hæmmer en 7 mL åben container. Alle 16 slides vil blive behandlet med peroxidase inhibitor (600 + [150 x 16] = 3.000 µL). Tilføj 3 mL af peroxidase blok i containeren.
7. Før forberede arbejde koncentrationer af mel, resuspend alle frysetørrede mel ved at tilføje 75 µL af dimethylsulfoxid hver fluor tube fra producenten. Mix af pipettering. Dette er TSA fluor bestanden. Opbevares ved 4 ° C.
8. Forberede seks titrering containere, én for hver fluor. Den nødvendige volumen i microliters er 350 + (150 x [antal dias]). Hver fluor vil blive anvendt til 16 slides i dette tilfælde (otte tonsil og otte lunge). Mærkning og diskenheder for alle beholdere er angivet i tabel 4.
9. Når alle reagenser er blevet registreret og forberedt, placere hver beholder, i hvilken som helst placering på et rack og indlæse alle reagenser til den automatiserede stainer. Sonden vil bekræfte mængden af hver reagens.

8. automatiseret Stainer: Prøve Setup og multispektrale farvning

1. I automatiserede stainer software, skal du klikke på skub opsætning øverst på skærmen. Klik på Tilføj undersøgelse. Udfyld vinduet pop-up med undersøgelse ID, undersøgelse navn og kommentarer.
   1. Vælg navnet på forsker gennemfører farvning flugt fra drop-down listen. Forlade dispensere volumen på 150 µL. Vælg multispektrale afvoksning for forberedelse protokol. Klik på OK og Tilføj dias. Under kommentarer, skriv "Multiplex 1 lunge 123ABC." Udfyld følgende felter som anført: Vævstype = Test væv; Dispensere volumen = 150 µL; Farvning mode = enkelt rutinemæssige; Markør = negativ; Farvning = Skriv "7 Multiplex protokol 1"; Forberedelse = multispektrale bages, afvoksning 2 h; HIER = HIER 20 min med ER1.
2. Klik på Tilføj dias og ændre kommentarer og protokollen tilføjes drop kontrol dias og isotype kontrol dias. Når alle dias er blevet tilføjet til undersøgelsen, Luk vinduet Tilføj dias og udskrive etiketter. Anvende etiketter til området passende etiket på hvert dias.
3. Indlæse dias i stativer, anvendes dække fliser i den rigtige retning, indsætte stativerne i den automatiserede stainer og sænke bakkerne. Enheden vil scanne dias etiketter.
4. Når alle dias og reagenser har været scannet og målt. Knappen Kør (►) bliver aktiv. Hvis autostainer opdager eventuelle fejl, såsom utilstrækkelig reagens volumen, vises en gul advarsel symbol af den berørte bakke. Hvis der opstår en fejl, lige falde i hak advarsel symbolet og afhjælpe fejlen.
5. Indlede farvning straks eller planlægge en forsinket start. Protokollen er ca 14 h i varighed. Bemærk: Sikre, at protokollen vil fuldføre ad gangen når dias kan fjernes straks, da exess vask kan påvirke farvning resultaterne.

9. Coverslipping multispektrale dias

1. Fjern dias fra den automatiserede stainer og gemme dem i en rack nedsænket i 1 x TBS.
2. Montere prøver med no. 1,5 coverslips og 15 µL af montering media (Se Tabel af materialer). Fjerne eventuelle bobler ved at trykke forsigtigt på coverslip med en pipette spids.
3. Tillad dias til helbrede natten over ved stuetemperatur på laboratoriebænk. Uhærdet dias kan scannes straks med omhyggelig håndtering.

10. multispektral Scanner

1. Tænd den multispektral scanner og sin computer (Se Tabel af materialer for oplysninger om model og software). Start mikroskop kontrol software. Åbne hoveddøren af multispektral scanner ved at trykke på den indslag-nærtagende knap på forsiden af enheden. Hver fjederbelastede luftfartsselskab i scanneren holder fire dias. Indlæse alle dias i luftfartsselskaber og optage rækkefølgen før pålæsning luftfartsselskaber i enheden.
2. Vælg Rediger protokollen og klik på New...; derefter oprette protokolnavnet Multiplex Panel 1 og Drop objekter. Opret undersøgelse navn Multiplex Panel udvikling, klik på Opret protokol, og Skriv Oversigt Skan Filter DAPI; Marker derefter Hele dias scanning og Pixel opløsning 0,50 µm (20 X). Alle filtre og bands skal være repræsenteret. Hvis ikke, skal du klikke på Rediger filtre og Bands, vælge alle fem filtre (DAPI, FITC, CY3, Texas rød og CY5), og klik derefter på Rediger engagementer.
3. Lastholder ved at vælge luftfartsselskab med den fuld multiplex af lunge adenocarcinom. Vælg den korrekte dias ved hjælp af den grafiske brugergrænseflade. Fokusere væv, enten manuelt eller ved hjælp af autofokus. Naviger til et område med acceptabel DAPI farvning og klik på bil-udsættes for at indstille eksponeringen i millisekunder (0 – 2.000 ms).
4. Gentag den samme procedure for alle fem filter sæt i både hele scanne og MSI Region kolonner. Sørg for at navigere til et område med acceptabel farvning og koncentrere mikroskopet før du indstiller eksponering for hvert filter og forstørrelse. Bil-udsættes for alle fem filtre i en 20 x samlede scanning og 20 x multispektrale imaging (MSI) multispektrale regioner. Vælg en pixel opløsning på 0,50 µm (20 x). Gemme protokollen og klik på tilbage til at vende tilbage til startskærmbilledet Vectra programmel; Klik derefter Scanne dias.
5. Åbne grænseflade for hvert dias og indstille opgave at scanne. Indstillet undersøgelse til Multiplex Panel udvikling, indstille protokollen til Multiplex Panel 1 og slip kontrollenog sæt Dias ID til Multiplex lunge ABC123, Multiplex CD68 Drop lunge ABC123mv . Når alle dias er blevet stemplet og opgaver er angivet, skal du klikke på Skan. Den automatiserede multispektral scanner vil udføre fuld-dias scanner af alle dias ved hjælp af alle fem filtre.

11. multispektral Scanner: Multispektral Imaging

1. Når scanninger er komplet, åbne QPTIFF software ("Phenochart") og klik på Indlæs dias øverst til venstre. Dette vil åbne en QPTIFF, som er en fem-filter hele dias scanning. Hvert lag indeholder oplysninger fra mere end én fluor, så nytte er begrænset, men væv struktur og bred udtryk mønstre er synlige og kan bruges til at vælge regioner for MSI.
2. Naviger til og åbne det korrekte dias i undersøgelsen ved hjælp af drop-down-træet i venstre side. Log ind (øverst til højre) med brugeren initialer.
3. Vælg fem regioner for MSI ved hjælp af værktøjet stempel øverst på skærmen. Konsultere en patolog, hvis en sådan er tilgængelig. Vælg under Vælg erhvervelse; Vælg under størrelse i felterne, 1 x 1; og under feltet restriktion, Vælg 0,5 µm (20 x). Baseret på cytokeratin (CK) farvning (hovedsagelig i Cy5), Vælg flere regioner med både tumor (CK +) og stroma (CK-) til afbildning fra den samlede scanning. Gentag denne procedure for hvert dias.
4. Når alle MSI er valgt, lukke Phenochart software og vende tilbage til Vectra software. Ændre opgaven fra Skan til MSI for hvert dias, og klik derefter på Skan igen for at udføre samlingen MSI.

12. spektral urtåge

Bemærk: Den spektrale unmixing trin er påkrævet for kanaladskillelse og billedanalyse af dias. Før spektral urtåge udføres i informere software, skal den spektrale bibliotek bygges ved hjælp af lunge adenocarcinom dias farves med hver fluor alene og med DAPI alene. Denne procedure er også beskrevet i ovennævnte Multiplex IHC Assay udvikling Guide.

1. Når MSI erhvervelse er fuldført, skal du bruge den spektrale unmixing ("informere") software for at åbne filer i mappen MSI . Disse filer slutter i .im3 fil-type udvidelse.
2. Under billedformat, Vælg Multispectral; under prøven format, Vælg fluorescens; og under spektrale bibliotek kilde, Vælg informere.
3. Du kan vælge mel, vælge og indlæse alle seks mel og DAPI fra biblioteket bygget med lunge adenocarcinom bibliotek dias. Klik på Forberede alle (nederst til venstre). Spectral unmixing software vil udføre spektral urtåge på alle åbne billeder, ved hjælp af de medfølgende spektrale profiler.
4. Med en patolog, vurdere den farvning mønster mod kromogent enkelt pletter af den samme mål i sekventielle dias af de samme væv.

13. evalueringen af fluorescens intensitet og Signal dæmpning

Bemærk: Værktøjet tæller, der vises som en pil med en lille brun boks, er det vigtigste redskab for multiplex optimering og bør anvendes hyppigt (Se Supplerende materialer). Ved hjælp af værktøjet tæller i den spektrale unmixing software, vurdere signal / støj-forhold, der som minimum bør overstige 10:1 (Se Supplerende materialer til fejlfinding og til evaluering af multiplex farvning med knapperne på drop).

1. 13.1. med et billede, der er åben i den spektrale unmixing software, engagere værktøjet tæller og survey billeder at vurdere fluorescens-intensiteten af hver kanal. Target intensiteten i lungevæv er mellem 10 og 20 normaliseret tæller. Værktøjet normaliseret tæller er vist i figur 1.
2. Udelukke dias med maksimal signal tæller for mindre end 10 eller normal signal område tæller mindre end fem for nogen markør, så at autofluorescence og off-target farvning ikke konkurrerer med den autentiske signal.
3. Udelukke dias med maksimal tæller større end 30 for en kanal til at undgå spektrale blødning eller ineffektive spektral urtåge.
4. Adresse normaliseret højt eller lavt tæller ved at justere TSA koncentrationen.

14. multispektrale billedanalyse

1. Åbne en eller flere MSI i spektral unmixing software og kun vælge mel for urtåge der er repræsenteret i mindst én åben billede. Klik på Forberede alle for at unmix alle aktuelt åbne Farvebilleder for at give spektralt ublandet billeder.
2. Vælg værktøjet tæller til undersøgelse tæller på tværs af hvert billede ved at holde musen over det eller områder af interesse.
3. Vælg symbolet for øje at åbne visningseditoren. Vælge og justere displayet intensiteten af hver uafhængig kanal.
4. Vælg Konfigurer for at åbne væv segmentering, celle segmentering, fænotyper og scoring moduler. Disse værktøjer er nødvendige for objektiv validering af multiplex farvning mod kromogent enkelt pletter og kan bruges til at generere kvantitative phenoptic data (Figur S1).
5. Brug Eksporter under fanen gemme gråtoner, fluorescerende, pathview-stil ukomprimeret TIFF og datafiler fra phenoptic analyse modulerne for yderligere analyse, arkivering og præsentationer (Figur S1).

Representative Results

Protokollen beskrevet her vil give resultater som vist i figur 2. Start med en evaluering af farvning i kontrolelementet tonsil, begyndende med den overflade pladecellekræft epitel. Histologi af tonsil prøven kan tages op til revision med en patolog, ved hjælp af diasset H & E som reference. Hvis kromogent IHC sektioner er udført med de samme markører på samme væv blok, kan så disse bruges til at bekræfte tæthed og distribution af hver markør på mIF dias. Som vist i figur 2A, tonsil væv bør give klart definerede AE1/AE3 cytokeratin farvning i tonsil overflade planocellulære epitel (figur 2A; mærket som røde pseudocolor), uden baggrund i til lymfoid væv. Farvning bør være cytoplasmatisk, lejlighedsvis med membran accentuering, og kerner skal være negative. Retikulerede epitel i Krypter bør være positiv for både cytokeratins (rød) og PD-L1 (figur 2A, grøn pseudocolor). De follikulære Kimcentrene af tonsil bør derefter, identificeres. De Kimcentrene bør være let genkendeligt og bør være rig på Ki-67-positive lymfocytter (figur 2A, gul pseudocolor). Ki-67 farvning bør altid nukleare. Stede i de Kimcentrene makrofager bør også være let genkendelig, undertiden som større celler (også kaldet "tingible organer"). De vil vise positiv farvning for CD68 som en kornet cytoplasmatisk plet (figur 2A; orange pseudocolor). En variabel andel af CD68 celler uden for de Kimcentrene kan også forventes. Makrofager kan vise membran farvning for PD-L1. Dette er typisk blegere i intensitet end farvning for PD-L1 i retikulerede epitel. Der bør være nogen nukleare CD68 farvning. CD8 bør pletten lymfocytter med en T-celle distribution (færre i de Kimcentrene og en større andel i de interfollicular områder, se figur 2A, cyan pseudocolor). CD8 + lymfocytter er normalt små celler med ringe cytoplasma, så det er praktisk umuligt at skelne membran versus cytoplasma i lymfocytter. PD-1 vil kraftigt pletter små lymfocytter i området germinal center, normalt grupperet i periferien af Kimcentre (figur 2A; magenta pseudocolor), samt spredt lymfocytter i regionen interfollicular normalt viser en lavere farvning intensitet end dem i området germinale centrum. Som med CD8, er det ikke muligt at skelne klart mellem membran og cytoplasmatisk farvning i små lymfocytter farves med PD-1. Fordi en variabel andel af CD8 celler coexpress PD-1, anbefales det til kvalitetskontrol, farvning mønster og distribution af hver markør, der er farvet i de samme væv sammenlignes med kromogent IHC reference slides, som foreslået i tidligere publicerede protokoller¹².

Efter den forventede farvning mønster er blevet bekræftet i tonsil væv kontrol, fortsætte med at evaluere farvning i eksemplet lunge kræft (figur 2B). Fordi tumor væv forventes at udvise en variabel og heterogene udtryk af markører, er det meget vigtigt under optimering af et nyt mIF panel til at sammenligne den farvning mønster for hver enkelte markør observeret i metoden mIF og sit udtryk observeret i den standard kromogent IHC dias, evaluering af mængde og fordeling af de positive celler som tidligere beskrevet¹². Ikke desto mindre, den grundlæggende farvning mønster bør bevares; for eksempel, bør cytokeratins overholdes i cytoplasma af epitelceller og aldrig i en cellekerne; CD68 skal fremstå som kornede cytoplasmatisk farvning i makrofager, etc. Vigtigere, i nogle markører, kan farvning intensiteten ændre fra kontrolelementet tonsil til kræft væv; for eksempel, kan PD-1 og PD-L1 vise lavere intensitet farvning i tumor væv sammenlignet med meget høj udtrykket observeret i tonsil kontrol. Det er derfor vigtigt at udføre evaluering og optimering med værktøjet tæller i informere software, ved hjælp af eksempler på tumor væv snarere end tonsil kontrollen.

Endelig skal isotype-negative kontroller og slippe objekter vurderes, ikke kun for påvisning af baggrund og autofluorescence, men også for paraply effekter og spektral bløder (figur 3 og figur 4). Isotype kontrol bør ikke vise nogen immunfarvning på tværs af slide; Hvis nogen farvning er observeret, skal derefter imaging eller farvning proceduren revideres. Drop objekter er vigtigt at vurdere potentielle artefakter i farvning, såsom spektrale bløder eller paraply virkninger på grund af metoden mIF under optimering af et nyt multiplex panel (Se figur 5, Supplerende figur S2, Supplerende figur S3, og supplerende materialer). Fluorescerende monoplex og slip kontrollen bør evalueres og sammenlignes med panelet fuld multiplex. Hver dråbe kontrollen bør vise det samme farvning mønster med undtagelse af de enkelt primære antistof, der bør fjernes på hver specifik kontrol. Yderligere oplysninger findes i afsnittet Supplerende materialer .

Figur 1 : informere tæller værktøj. Værktøjet informere software tæller aktiveres ved at vælge ikonet beige boks. Normaliserede tæller er korrigeret for bitdybde, eksponeringstid, gevinst og udsmidningen. Billederne blev taget på 20 X forstørrelse; skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Repræsentative resultater. (A) Tonsil og (B) nonsmall-cellet lungekræft karcinom var plettet med PD-L1 (520 TSA, green), CD8 (540 TSA, cyan), Ki67 (570 TSA, gul), CD68 (620 TSA, orange), cytokeratin (650 TSA, red), og PD-1 (690 TSA, magenta). Enkelte kanaler er repræsenteret særskilt nedenfor i små paneler. Markør er angivet i øverste højre hjørne af hvert billede. Billederne blev taget på 20 X forstørrelse; Skalalinjen = 50 (eller 250 µm). Angivet i panelet er 1 ) lymfoide follikel, 2) germinale centrum, 3) interfollicular område og 4) stratificeret planocellulære epitel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 : TSA blokerer/paraply effekt. Dette er et eksempel på 690 TSA deponeret af en PD-1 antistof-blokerende CD3 signal på en måde, der er afhængig af mængden af TSA stede. Den lyseste 690 TSA signal blokerer 620 TSA signalet mest effektivt (nonsmall-cellet lungekræft karcinom farves med anti-PD-1 D4W2J for 30 min på 0,52 µg/mL eller isotype efterfulgt af en 10 min 690 TSA opdagelse på 1: 100, så anti-CD3 F7.2.38 for 30 min på 0,14 µg/mL efterfulgt af en 10 min 620 TSA opdagelse på 1: 100). Billederne blev taget på 20 X forstørrelse; skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4 : Spektrale bløder. Nonsmall-celle karcinom lungevæv var plettet med Ki-67 drop-control protocol (komplet multiplex protokol med Ki-67 antistof udeladt). Den 540 TSA kanal (CD8) og 570 TSA kanalen (Ki-67) er vist. Ingen nukleare farvning mønster er tilsyneladende, endnu en formindsket kopi af CD8 farvning mønster er observeret i de 570 TSA kanal. Dette er bedst behandles ved at sikre sammenlignelige farvning intensiteter i alle kanaler. I dette tilfælde, vil tilføjelsen af en robust Ki-67 signal (normaliseret tæller mellem 10 og 20) korrigere den spektrale bløder. Billederne blev taget på 20 X forstørrelse; skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5 : Slip kontrollen. Denne figur viser et sammensat billede af en fuld multiplex sammenlignet med den samme region af sekventielle dias af lunge adenocarcinom farves med slippe objekter hvori den angivne primære antistof var udeladt. Billederne blev taget på 20 x forstørrelse; Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Navn	Forkortet navn	Type	Container	Gruppe
PKI blokerende Buffer	OPALBLOK	Accessoriske	Åbn 30 mL	Generelle
Opal Polymer HRP	OPAL 2AB	Accessoriske	Åbn 30 mL	Generelle
OPAL 1 x TBS	OPAL1TBS	Accessoriske	Åbn 30 mL	Det. Kit
CD68 0,30 µg/mL PG-M1 Mus	OPALCD68	Accessoriske	Åben 7 mL	Generelle
ki67 0,61 µg/mL MIB-1 Mus	OPALki67	Accessoriske	Åben 7 mL	Generelle
PD-L1 0,20 µg/mL SP263 Rab	OPALPDL1	Accessoriske	Åben 7 mL	Generelle
PD-1 0,52 µg/mL D4W2J Rab	OPAL PD1	Accessoriske	Åben 7 mL	Generelle
CD8 0,70 µg/mL SP239 Rab	OPAL CD8	Accessoriske	Åben 7 mL	Generelle
CK 0,24 µg/mL AE1/AE3 Mus	OPAL CK	Accessoriske	Åben 7 mL	Generelle
Musen IgG	OPAL MUS	Accessoriske	Åben 7 mL	Generelle
Kanin IgG	OPAL RAB	Accessoriske	Åben 7 mL	Generelle
OPAL Peroxidase blok	OPALPERX	Accessoriske	Åben 7 mL	Generelle
Spektrale DAPI	OPALDAPI	Accessoriske	Titrering 6 mL	Generelle
Opal 520 reagens	OPAL 520	Accessoriske	Titrering 6 mL	Generelle
Opal 540 reagens	OPAL 540	Accessoriske	Titrering 6 mL	Generelle
Opal 570 reagens	OPAL 570	Accessoriske	Titrering 6 mL	Generelle
Opal 620 reagens	OPAL 620	Accessoriske	Titrering 6 mL	Generelle
Opal 650 reagens	OPAL 650	Accessoriske	Titrering 6 mL	Generelle
Opal 690 reagens	OPAL 690	Accessoriske	Titrering 6 mL	Generelle

Tabel 1: Leica Bond RX protokol, Opal reagenser

	Reagens	Tid (h)	Temperatur (grader)
1	Ingen reagens	120:00	60
2	Bond afvoksning løsning	0:30	72
3	Bond afvoksning løsning	0:00	72
4	Bond afvoksning løsning	0:00	Ambient (stuetemperatur)

Tabel 2: OPAL forberedelse protokol

Target	µg/mL	Klon	Kilde	Masse	Stock µg/mL	µL fortyndingsmiddel	ΜL AB
CD68	0,3	PG-M1	DAKO	20043031	30	2376	24
ki67	0,61	MIB-1	DAKO	20049476	46	2368.17	31.83
PD-L1	0,2	SP263	Udluftning.	F09591	1,61	2101.86	298.14
PD-1	0,52	D4W2J	CST	1	100	2387.52	12,48
CD8	0,7	SP239	Ventana	160318	70	2376	24
CK	0,24	AE1/AE3	DAKO	10129428	179.5	2396.79	3.21
Mus IgG	0,61
Rab IgG	0,7

Tabel 3: Primære antistoffer forberedelse.

Opal Fluor	Dias	Fortynding	µL fortyndingsmiddel	µL opal Fluor
Opal 520	16	1:200	2736.3	13.8
Opal 540	16	1:700	2746.1	3.9
Opal 570	16	1:150	2731.7	18.3
Opal 620	16	1: 100	2722.5	27,5
Opal 650	16	1:350	2742.1	7,9
Opal 690	16	1:150	2731.7	18.3

Tabel 4: OPAL Fluor forberedelse.

Supplerende materiale Word-dokument: Venligst klik her for at downloade dette dokument.

Supplerende figur 1: Venligst klik her for at downloade denne figur.

Supplerende figur 2: Venligst klik her for at downloade denne figur.

Supplerende figur 3: Venligst klik her for at downloade denne figur.

Supplerende tabel 1: Leica Bond RX Opal Multiplex protokol. Venligst klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 2: Oversigt og sammenligning af fuld multiplex, slippe objekter og fuld isotype kontrolelementer. Venligst klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Den igangværende cancer immunterapi revolution er åbningen roman og lovende terapeutiske muligheder for kræft patienter¹³. Fremskridt inden for immuno-onkologi vil kræve øget kendskab til den inflammatoriske tumor mikromiljø, ikke kun at forstå biologi af de immunologiske mekanismer er involveret i carcinogenese, men også at finde prædiktive biomarkører for nye immunterapi-baserede behandlinger^1,2. På grund af den komplekse biologi kræft immunologi, er forhør af tumor vævsprøver normalt kræves for at udvikle en voksende liste af immun markører, som interagerer med hinanden og er ofte coexpressed af forskellige cellepopulationer i væv^{1 ,2,5}. Kliniske forsøg anvender typisk små biopsier, såsom kerne nål eller endoskopisk biopsier, der er indsamlet på forskellige punkter i terapi for at evaluere og overvåge patientens svar. Sådanne biopsier giver begrænsede mængder af væv, hvilket igen begrænser antallet af væv sektioner, som kan være ansat for kræft immunoprofiling. Denne begrænsning er især besværlig, når traditionelle teknikker, såsom standard monoplex IHC, anvendes. Der er derfor et klart har brug for nye metoder for kræft immunoprofiling, der gør brug af multiplex teknikker med kapacitet samtidig vurdere coexpression af forskellige biomarkører og gøre mere effektiv brug af værdifulde væv enheder.

I multiplex farvning og multispektrale Billeddannende metoder beskrevet i detaljer her, bruges en mIF panel for immuno-onkologi undersøgelser på FFPE væv såsom biopsier fra et klinisk forsøg. Denne metode har været tidligere beskrevet, valideret og anvendt med succes til kræft immunoprofiling^{8,9,10,11,12,14, 15}. tidligere publicerede protokoller har beskrevet tilsvarende mIF farvning metoder med TSA-baserede systemer, som syv-color kit, som er tidskrævende og kræver ca 4 dages arbejde ved en dedikeret laboratorium videnskabsmand^{12 ,15}. Svar på disse mangler, er denne protokol blevet optimeret ved hjælp af en kommercielt tilgængelige automatiserede stainer, dramatisk afkortning farvning tid til 14 h og eliminere variabilitet indført ved manuel operatører. Imaging er udført på en multispektral scanner i stand til at adskille spektre af de syv eller flere fluorescerende signaler i multiplex dias, herunder autofluorescence, som effektivt kan fjernes uden at forringe signalkvaliteten. Denne protokol kan replikeres, ændres og udføres af enhver laboratorium bruger med adgang til instrumenter og reagenser, der er beskrevet i Tabel af materialer.

Kritiske trin i denne protokol er afsnit 7, 10, 11, 12. Afsnit 7 omhandler udarbejdelsen af reagenser. En omhyggelig forberedelse af reagenser til multiplex farvning er væsentlige, der kræver fokuseret opmærksomhed fra et laboratorium videnskabsmand eller tekniker at undgå afhænger af operatøren variation. For eksempel, en af de store problemer med metoden multiplex farvning variabilitet, som kan reduceres med den omhyggelige forberedelse af fortyndinger af reagenser, specielt TSA farvestofferne. Afsnit 10 og 11 er relateret til billede erhvervelse. En vigtig risiko er overeksponering eller oversaturation af billeder, som kan føre til spektrale bløder, et artefakt, hvor signalet fra en anden kanal forstyrrer kanalen bliver afbildet (Se Supplerende materialer). Nøje regulerer eksponering gange kan bidrage til at forhindre oversaturation og spektral bløder. Spectral urtåge er foretaget i afsnit 12. Dette bygger på forberedelsen af den spektrale bibliotek (beskrevet i den Multiplex IHC Assay udvikling Guide, tilgængelig online). I dette trin skal er informere software "uddannet" specifikt genkende farver for hver TSA farvestof. Den spektrale bibliotek er skabt ved hjælp af dele fra en kontrol væv, såsom menneskelige tonsil, farves med et ensartet udtryk markør, såsom CD20, kombineret med hver enkelte TSA farvestof på enkelte dias. Derudover autofluorescence dias (også beskrevet i Multiplex IHC Assay udvikling Guide) er nødvendige for at træne den informere software til at genkende og trække væv autofluorescence. Autofluorescence kontrol dias bør udarbejdet ved hjælp af prøver fra de samme væv undersøges (såsom lungekræft, osv.), behandles på samme måde som mIF dias og inkuberes med primære og sekundære antistoffer men uden TSA farvestof. Kun en enkelt autofluorescence spektrale profil kan vælges, så skal sørges for at vælge en repræsentation af den observerbare autofluorescence, som kan komme fra kollagen, fibrose, røde blodlegemer, endogene pigmenter og andre kilder. At skabe en ny spektrale bibliotek i begyndelsen af hver ny projekt og ved hjælp af en autofluorescence spektrum, som er repræsentant for væv undersøgelse enheder, såvel som kører de samme væv blokke som den positive kontrol for hvert parti inden for samme projekt, værdifulde metodologiske skridt, der vil bidrage til at forbedre sammenhængen i den spektrale urtåge på tværs af forskellige prøver inden for samme projekt.

Multiplex metoden i denne protokol tilbyder flere fejlfindingsværktøjer, herunder en signal-støj evaluator (tæller værktøj), slippe objekter (Supplerende materialer) og en patologi visning for kvalitetskontrol af farvning. Tæller værktøj hjælper med at vurdere intensiteten af farvning og niveau af baggrunden. Hvis intensiteten og/eller baggrundsniveauer er høje, er den første tilgang at reducere fortyndingen af TSA farvestof. Hvis problemet fortsætter, bør kromogent IHC dias anvendes til optimering af særlige mærket revideres med en patolog, på udkig efter tilstedeværelsen af baggrunden. Patologi synspunkt er genereret af inForm software, ved hjælp af en diaminobenzidine-lignende pseudocolor repræsentation af fluorescens fra den TSA-linked fluor samt en faux hæmatoxylin repræsentation genereret fra alle fluorescerende signaler, herunder DAPI . Billeder fra visningen patologi hjælpe med den visuelle vurdering af farvning mønstre af en patolog til forbedret farvning. Disse værktøjer bør altid være ansat under optimering af et nyt panel og som kvalitetskontrol trin i arbejdsprocessen til farvning.

Metoden mIF kræver brug af primære antistoffer, der er blevet korrekt valideret og optimeret til standard kromogent IHC på formalin-fast væv. For eksempel, er en af de store fordele ved metoden mIF TSA kompatibiliteten med brug af primære antistoffer, der er blevet godkendt og optimeret i anatomisk patologi laboratorium for klinisk brug¹². Denne fordel betyder at multiplex panelerne kan tilpasses af laboratorium bruger besvare specifikke kræft immunologi spørgsmål uden brug af preconjugated antistoffer, leverer hurtige og dynamiske panel udvikling. I denne forbindelse begynder den faktiske arbejdsgang for optimering af et nyt panel med validering og optimering af antistoffer med standard kromogent IHC, på udkig efter den bedste fortynding og farvning betingelser, der vil give ren og konsekvent farvning. Det næste skridt, benytter de samme fortyndinger optimeret til IHC, er at overføre farvning med TSA mel i stedet for diaminobenzidine og sammenligne resultaterne af monoplex immunfluorescent TSA med den kromogent IHC som reference. Antistofferne kan endelig kombineres i mIF farvning, altid bruge den kromogent IHC farvning mønster som kontrol reference til at justere mIF TSA farvning parametre, primært TSA farvestof fortyndinger og farvning sekvensen. Under denne proces er samarbejdet med en patolog medvirkende til at vurdere kvaliteten af farvning.

Begrænsninger af denne teknik omfatter den tid og indsats, der kræves for optimering og validering af nye paneler og Immunofænotypning analyse af mIF paneler. Den største bekymring, er imidlertid en ordentlig validering af mIF metoder. Manglen på ordentlig validering af disse teknikker indebærer risiko for generering af ugyldige resultater, som kan tilføje forvirrende data til litteratur, derved hindrer forsøg på at få en bedre forståelse af biologi kræft immunologi¹⁶. Det er derfor, påhviler investigator at gøre alt for at korrekt validere multiplex metoder, herunder at sikre tæt deltagelse og evalueringen af patologer med uddannelse og erfaring i validering og evaluering af væv histopatologisk undersøgelse og IHC-baserede teknikker^17,18,19,20. Protokollen præsenteres her indeholder nogle af de værktøjer, der kan hjælpe med validering af en ny multiplex panel, herunder patologi evaluering af H & E dias før farvning og analyse, brug af kromogent IHC som reference til at optimere mIF TSA farvning, drop kontrol metode for kvalitetskontrol af en ny multiplex panel, og brugen af isotype, autofluorescence, og drop objekter. Trods den tekniske kompleksitet af mIF metoder åbner teknologier såsom multispektrale imaging med spektrale urtåge, samt andre roman multiplex platforme, en ny æra for analysen af væv prøver fra patienter og generering af nye former af data, der ikke er muligt med standard IHC alene. Derfor, udvikling og anvendelse af mIF teknikker vil fortsætte med at vokse, at blive stærke redskaber til kræft immunoprofiling biopsier for kliniske forsøg og hjælpe med at identificere nye multiparametric prædiktive biomarkører for immunterapi, fordel frem for alt kræftpatient.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
"InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis	PerkinElmer	CLS151066	Called "spectral unmixing software" in text
"Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing	PerkinElmer	CLS151067	Called "QPTIFF software" in text
#1.5 Coverslips	Sigma Aldrich	2975246
200 Proof Ethanol	Koptec	V1001
20x Tris-Buffered Saline	VWR	J640-4L
Antibody Diluent	DAKO	S2203
Anti-CD68 Mouse Monoclonal	DAKO	M087601-2	Clone PG-M1
Anti-CD8 Rabbit Monoclonal	Ventana	M5392	Clone SP239
Anti-CK Mouse Monoclonal	DAKO	M351501-2	Clone AE1/AE3
Anti-ki67 Mouse Monoclonal	DAKO	M724001-2	Clone MIB-1
Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal	Cell Signaling	#86163	Clone D4W2J
Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal	Ventana	790-4905	Clone SP263
Bond Dewax Solution	Leica	AR9222	Called "dewax solution" in text
Bond Epitope Retrieval Solution 1	Leica	AR9961	Called "ER1" in text
Bond Epitope Retrieval Solution 2	Leica	AR9640	Called "ER2" in text
Bond Open Containers, 30 mL	Leica	OP309700	Called "30 mL open containers" in text
Bond Open Containers, 7 mL	Leica	OP79193	Called "7 mL open containers" in text
Bond Polymer Refine Detection	Leica	DS9800	Called "chromogenic detection kit" in text
Bond Research Detection Kit	Leica	DS9455	Called "research detection kit" in text
Bond Titration Kit	Leica	OPT9049	Called "titration kit" in text
Bond Universal Covertile Novocastra	Leica	S21.2001	Called "covertiles" in text
Bond Wash Solution 10X Concentrate	Leica	AR9590	Called "10x wash solution" in text
BondRX Autostainer	Leica		Called "automated stainer" in text
BondRX Software Version 5.2.1.204	Leica		Called "automated stainer software" in text
Opal 7-Color Automation IHC Kit	PerkinElmer	NEL801001KT	Called "multispectral staining kit" in text
Peroxidase Block	Leica	RE7101
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo	P36965	Called "slide mountant" in text
Starfrost Slides	Fisher	15-183-51
Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control	PerkinElmer	CLS143455	Called "microscope control software" in text