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Cancer Research

स्वचालित मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस इंयूनो के लिए पैनल-Formalin पर ऑन्कोलॉजी अध्ययन-फिक्स्ड कार्सिनोमा ऊतक नमूनों

Published: January 21, 2019 doi: 10.3791/58390
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 3, 3, 1, 2, 1, 1, 4, 3, 1
1Laboratory of Pathology, MedImmune, 2Laboratory of Pathology, MedImmune, 3Akoya Biosciences Inc., 4Department of Translational Molecular Pathology, University of Texas - MD Anderson Cancer Center

Summary

एक छह मार्कर मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस पैनल के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल अनुकूलित और प्रदर्शन किया है, और अधिक सुसंगत परिणाम और एक छोटी प्रक्रिया समय के लिए एक स्वचालित दाग का उपयोग कर । यह दृष्टिकोण सीधे इंयूनो-ऑन्कोलॉजी अध्ययन के लिए किसी भी प्रयोगशाला द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है ।

Abstract

इंयूनो में जारी घटनाक्रम-ऑन्कोलॉजी कैंसर इम्यूनोलॉजी के तंत्र की एक वृद्धि की समझ की आवश्यकता होती है । formalin से ऊतक के नमूनों के immunoprofiling विश्लेषण-फिक्स्ड, आयल-एंबेडेड (FFPE) बायोप्सी ट्यूमर इम्यूनोलॉजी की जटिलता को समझने और कैंसर immunotherapy के लिए उपंयास पूर्वानुमानात्मक अचिह्नकों की खोज के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है । ऊतकों के Immunoprofiling विश्लेषण ट्यूमर microenvironment में, भड़काऊ कोशिका उपआबादी और प्रतिरक्षा चौकियों सहित संयुक्त मार्करों के मूल्यांकन की आवश्यकता है । उपंयास मल्टीप्लेक्स immunohistochemical तरीकों का आगमन एकल ऊतक वर्गों के एक अधिक कुशल multiparametric विश्लेषण के लिए अनुमति देता है से मानक monoplex immunohistochemistry (आइएचसी) करता है । एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस (IF) विधि tyramide-संकेत प्रवर्धन पर आधारित है और, multispectral सूक्ष्म विश्लेषण के साथ संयुक्त, ऊतक में विविध मार्कर के एक बेहतर संकेत जुदाई के लिए अनुमति देता है । इस पद्धति unconjugated प्राथमिक एंटीबॉडी कि FFPE ऊतक नमूनों पर मानक आइएचसी के लिए अनुकूलित किया गया है के उपयोग के साथ संगत है । इस के साथ हम विस्तार से एक स्वचालित प्रोटोकॉल है कि मल्टीप्लेक्स की अनुमति देता है अगर कार्सिनोमा ऊतक नमूनों की एक छह मार्कर मल्टीप्लेक्स एंटीबॉडी पीडी-L1 शामिल पैनल के साथ लेबल का वर्णन, पीडी-1, CD68, सीडी 8, Ki-६७, and AE1/AE3 cytokeratins विथ 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole के रूप में एक परमाणु सेल counterstain । मल्टीप्लेक्स पैनल प्रोटोकॉल एक धुंधला समय है कि मैनुअल प्रोटोकॉल की तुलना में कम है और सीधे लागू किया जा सकता है और मानव FFPE ऊतक नमूनों पर इंयूनो-ऑन्कोलॉजी अध्ययन के लिए किसी भी प्रयोगशाला अन्वेषक द्वारा अनुकूलित करने के लिए एक स्वचालित आइएचसी दाग में अनुकूलित है । यह भी वर्णित कई नियंत्रण और उपकरण, एक नया मल्टीप्लेक्स के ठीक गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक बूंद नियंत्रण विधि सहित अगर पैनल, कि अनुकूलन और तकनीक के सत्यापन के लिए उपयोगी होते हैं ।

Introduction

FFPE ट्यूमर ऊतक नमूनों के Immunoprofiling विश्लेषण नैदानिक परीक्षण 1 के संदर्भ में कैंसर immunotherapy के लिए उपंयास पूर्वानुमानात्मक मार्क्स की खोज और सत्यापन के लिए विशेष रूप से इंयूनो-ऑन्कोलॉजी अध्ययन का एक अनिवार्य घटक बन गया है ,2. Chromogenic आइएचसी, diaminobenzidine के रूप में रासायनिक chromogens का उपयोग, बायोप्सी ऊतक के immunolabeling के लिए नैदानिक विकृति में मानक तकनीक रहता है3. मानक आइएचसी कैंसर ऊतक immunoprofiling के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है, ट्यूमर से संबंधित लिम्फोसाइटों की उपजनसंख्या के quantitation और जैसे क्रमादेशित सेल मौत ligand 1 (पीडी-L1) 4 प्रतिरक्षा चौकियों के अभिव्यक्ति स्तर के आकलन सहित ,5. मानक आइएचसी सीमित है, हालांकि, में है कि केवल एक प्रतिजन ऊतक अनुभाग प्रति लेबल किया जा सकता है । क्योंकि immunoprofiling अध्ययन आमतौर पर कई मार्करों के संयुक्त अभिव्यक्ति के विश्लेषण की आवश्यकता होती है, मानक आइएचसी का उपयोग कई ऊतक वर्गों के धुंधला की आवश्यकता होगी, एक एक मार्कर के साथ सना हुआ, और इसलिए होगा, इस तरह के कोर सुई बायोप्सी के रूप में छोटे ऊतक नमूनों के विश्लेषण के लिए काफी सीमित. मानक आइएचसी तरीके भी विभिंन कोशिका आबादी द्वारा coexpressed है कि मार्करों के आकलन के लिए सीमित हैं, जैसे पीडी-L1, जो दोनों ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज और कैंसर की कोशिकाओं द्वारा व्यक्त की है के रूप में प्रतिरक्षा चौकी मार्करों के साथ आम है । इस सीमा में सूचित किया गया है, उदाहरण के लिए, एक आइएचसी मार्कर के विविध सेल प्रकार द्वारा व्यक्त की मात्रात्मक विश्लेषण के लिए पैथोलॉजिस्ट द्वारा मानक monoplex आइएचसी का उपयोग6. मल्टीप्लेक्स chromogenic आइएचसी तकनीक का विकास एक ही ऊतक खंड पर विविध रंग chromogens रोजगार मानक आइएचसी monoplex विधि पर एक उंनति का प्रतिनिधित्व करता है,7 हालांकि वे सिर्फ कुछ के immunolabeling द्वारा सीमित रह मार्करों और भी एक ही सेल आबादी के एक ही उपसेलुलर डिब्बों में व्यक्त मार्करों के उचित मूल्यांकन के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीकी चुनौती मौजूद ।

नैदानिक नमूनों से ऊतक की उपलब्धता के बारे में aforementioned निरंतर, साथ ही मल्टीप्लेक्स chromogenic आइएचसी तकनीकों की सीमाओं, के आधार पर इंयूनो-ऑन्कोलॉजी अध्ययन के लिए बेहतर मल्टीप्लेक्स तरीकों विकसित करने की आवश्यकता को जंम दिया है फ्लोरोसेंट इमेजिंग सिस्टम है कि प्रभावी ढंग से एक ही स्लाइड से एकाधिक fluorophores के संकेतों को अलग कर सकते है के साथ संयुक्त लेबलिंग । ऐसा ही एक तकनीक tyramide संकेत प्रवर्धन (TSA) कुशल रंग जुदाई8के लिए multispectral माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के साथ संयुक्त पर आधारित है । एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध TSA-आधारित किट fluorophores multispectral इमेजिंग8 के लिए अनुकूलित ( सामग्री की तालिकादेखें) कार्यरत हैं । इस प्रणाली का एक महत्वपूर्ण लाभ है कि पहले से ही मांय है और मानक chromogenic आइएचसी9,10,11के लिए अनुकूलित किया गया है कि एक ही अनलेबल प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ अपनी अनुकूलता है । यह न केवल तेजी से अनुकूलन पर भी अनुकूलन और पैनल नए लक्ष्यों को शामिल संशोधनों में लचीलापन की अनुमति देता है । इसके अलावा, मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस (mIF) TSA विधि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्वचालित आइएचसी दाग प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, monoplex chromogenic आइएचसी से mIF के लिए एक सीधा हस्तांतरण के लिए अनुमति देता है ।

यहां हम इंयूनो-ऑन्कोलॉजी अध्ययन है कि स्वचालित mIF TSA धुंधला पर आधारित है और इमेजिंग के लिए एक multispectral स्कैनर का उपयोग करता है के लिए एक mIF पैनल के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद । इस प्रोटोकॉल और अनुकूलित किया जा सकता है वर्णित इंस्ट्रूमेंटेशन और रिएजेंट के लिए उपयोग के साथ किसी भी प्रयोगशाला उपयोगकर्ता द्वारा संशोधित । प्रोटोकॉल कार्सिनोमा के immunoprofiling के लिए छह प्राथमिक एंटीबॉडी के एक पैनल में शामिल हैं: पीडी-L1, पीडी-1, CD68 (एक पान-मैक्रोफेज मार्कर के रूप में), सीडी 8 (टी साइटोटोक्सिक कोशिकाओं), Ki-६७, और AE1/AE3 (पान cytokeratin, की पहचान के लिए एक उपकला मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया कार्सिनोमा कोशिकाओं) । एक ताजा अध्ययन एक मानक संदर्भ के रूप में chromogenic आइएचसी का उपयोग करके एक मैनुअल TSA mIF प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए मल्टीप्लेक्स धुंधला12मांय का वर्णन करता है । अद्यतन विधि यहां प्रस्तुत एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, सात रंग TSA एक स्वचालित दाग में अनुकूलित किट का उपयोग करके विकसित किया गया है, तेजी से 3 से धुंधला समय छोटा-5 दिन से 14 घंटे, जबकि भी धुंधला की निरंतरता में सुधार । विस्तृत मुख्य यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के अलावा, एक पूरक सामग्री अनुभाग "ड्रॉप नियंत्रण विधि", एक अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रिया के लिए एक नया mIF पैनल, साथ ही अनुकूलन के लिए तकनीकी नोटों का मूल्यांकन भी शामिल है, समस्या निवारण, और नए मल्टीप्लेक्स पैनलों के विकास के लिए प्रयोगशाला उपयोगकर्ता की स्थापना की मदद और अनुकूलित mIF पैनलों के लिए mIF TSA विधि का अनुकूलन ।

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Protocol

नोट: प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत वर्णन कैसे छह एंटीबॉडी के लिए TSA का उपयोग करके एक mIF पैनल के immunoprofiling प्रदर्शन के लिए (CD68, ki67, पीडी-L1, पीडी-1, सीडी 8, और AE1/AE3) एक स्वचालित दाग पर ( सामग्री की तालिकादेखें) । प्रोटोकॉल भी का वर्णन कैसे एक नया mIF पैनल के एक गुणवत्ता नियंत्रण के लिए ड्रॉप नियंत्रण करने के लिए ( पूरक सामग्रीदेखें) । इस प्रोटोकॉल में, दाग मानव tonsil (सकारात्मक नियंत्रण) और मानव फेफड़ों ग्रंथिकर्कटता से आठ unstain हुआ स्लाइड से आठ unstain हुआ FFPE स्लाइड के साथ किया जाता है । पहली स्लाइड सभी छह मार्करों के साथ पूर्ण मल्टीप्लेक्स धुंधला के लिए प्रयोग किया जाता है, जिसमें कोई प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर रहे हैं isotype नियंत्रण के लिए दूसरी स्लाइड, और छोड़ नियंत्रण के लिए शेष छह स्लाइड ( पूरक सामग्रीदेखें). ऊतक autofluorescence के लिए एक अतिरिक्त नियंत्रण अत्यधिक की सिफारिश की है और हमेशा एक मल्टीप्लेक्स अध्ययन में शामिल किया जाना चाहिए ( पूरक सामग्रीदेखें). हालांकि, जांचकर्ताओं अंय ट्यूमर प्रकार और नियंत्रण अपने स्वयं के परियोजना लक्ष्यों के अनुसार काम कर सकते हैं । mIF TSA विधि और multispectral स्कैनर तकनीक के साथ पिछले अनुभव के बिना प्रयोगशाला उपयोगकर्ताओं मल्टीप्लेक्स आइएचसी विकास गाइड (http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp पर ऑनलाइन उपलब्ध) पढ़ा जाना चाहिए । हालांकि इस गाइड एक मैनुअल प्रोटोकॉल का वर्णन, यह भी mIF धुंधला विधि के लिए एक अच्छा परिचय प्रदान करता है । इस प्रोटोकॉल में कार्यरत सभी ऊतक वर्गों को हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार अनाम और अनुमोदित किया गया.

1. ऊतक के नमूने

  1. एक सकारात्मक नियंत्रण और एक FFPE मानव फेफड़ों ग्रंथिकर्कटता नमूना ज्ञात करने के लिए पीडी-L1 सकारात्मक रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए लसीकावत् हाइपरप्लासिया युक्त एक FFPE मानव tonsil नमूना का चयन करें. एक ट्यूमर की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए चयनित फेफड़ों के कैंसर ब्लॉकों की hematoxylin और eosin (एच & ई) स्लाइड की समीक्षा करें । यह गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला बढ़ सकता है के रूप में परिगलन के प्रचुर मात्रा में क्षेत्रों के साथ ट्यूमर से बचने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    नोट: इस अनुकूलन के लिए, आयल ब्लॉक है कि 10 साल या अधिक के लिए संग्रहीत किया गया है का उपयोग करने से बचें और तेल खंड में एक सूखे उपस्थिति के साथ ऊतक (एक प्रोटोकॉल तकनीशियन के साथ परामर्श) ।
  2. एक microtome का प्रयोग, प्रत्येक ब्लॉक, 4 µm मोटी से लगातार 10 धारावाहिक वर्गों में कटौती । माउंट आइएचसी, स्लाइड प्रति एक अनुभाग के लिए इस्तेमाल एक सकारात्मक चार्ज गिलास स्लाइड पर वर्गों ।
    नोट: वर्गों झुर्रियों के बिना पूरी तरह से फ्लैट घुड़सवार होना चाहिए, के रूप में झुर्रियां धुंधला कलाकृतियों उत्पंन कर सकते हैं । क्रमांक 1 से 10 तक के सीरियल अनुभागों की स्लाइड्स ।
  3. पहले खंड पर एक नया H & E स्लाइड तैयार करें । खंड में शेष tonsil ऊतक या फेफड़े के ट्यूमर की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए एक पैथोलॉजिस्ट की मदद से एच & ई स्लाइड की समीक्षा करें ।
    नोट: इस एच & ई स्लाइड multispectral विश्लेषण और phenotyping के लिए ब्याज के क्षेत्रों के चयन के साथ, बाद में, मदद कर सकते हैं ।
  4. तीन महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक प्लास्टिक स्लाइड बॉक्स में दाग वर्गों की दुकान ।

2. एक स्वचालित दाग पर एक नया mIF धुंधला कार्यक्रम का निर्माण: रिएजेंट के पंजीकरण

नोट: प्रोटोकॉल में उपयोग के लिए उपलब्ध होने से पहले रिएजेंट स्वचालित दाग़ी सॉफ़्टवेयर में एजेंट सूची में जोड़ा जाना चाहिए । स्वचालित दाग मॉडल और सॉफ्टवेयर संस्करण के बारे में जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें ।

  1. स्वचालित दाग सॉफ्टवेयर के भीतर रिएजेंट टैब पर क्लिक करें । एक नया एजेंट निर्दिष्ट करने के लिए जोड़ें क्लिक करें । नाम दर्ज करें (जैसे, "५२० tsa एजेंट") और संक्षिप्त नाम (जैसे, "५२० tsa"), टिप्पण है कि वहां आठ अक्षरों की एक अधिकतम है । ड्रॉप-डाउन मेनू से सहायक चुनें और आपूर्तिकर्ता सेट करें. एक/ अनुक्रमिक डी एससे एकल/ प्रोटोकॉल Fकरने के लिए डिफ़ॉल्ट धुंधला प्रोटोकॉल सेट करें डिफ़ॉल्ट HIER प्रोटोकॉल ER1 20करने के लिए सेट करें ।
  2. नया रिएजेंट सहेजें और तालिका 1में सूचीबद्ध सभी reagent के लिए २.१ चरण को दोहराएँ ।

3. स्वचालित दाग: कंटेनरों के पंजीकरण

  1. प्रत्येक संग्राहक के पक्ष में उपयोग करने के लिए रिएजेंट का नाम लिखें । बारकोड को साइड पर स्कैन करें । पॉप-अप विंडो में, सूची से सही एजेंट का चयन करें । किसी समय सीमा समाप्ति दिनांक का चयन करें और सहेजें ।
  2. तालिका 1में सूचीबद्ध सभी एजेंट के लिए चरण ३.१ में कार्यविधि को दोहराएँ ।
  3. ओपन रिसर्च किट रजिस्टर । किट की ओर दोनों बारकोड को स्कैन करें और स्क्रीन पर संकेतों का अनुसरण करे । किट का नाम "मल्टीप्लेक्स अनुसंधान किट 1." 1x tris (hydroxymethyl) aminomethane (tris)-इस किट (तालिका 1) के भाग के रूप में बफर खारा रजिस्टर ।

4. स्वचालित दाग: एक mIF प्रोटोकॉल कार्यक्रम का निर्माण

  1. बेस मल्टीप्लेक्स प्रोटोकॉल का नाम दूधिया पत्थर 7 मल्टीप्लेक्स पर नए स्वचालित दाग (मॉडल और सामग्री की तालिकामें सॉफ्टवेयर संस्करण देखें) के साथ लोड है । प्रोटोकॉल की स्थिति जानें प्रोटोकॉल स्क्रीन पर "पसंदीदा" के बजाय "सभी" के लिए फ़िल्टर कर रहा है । यदि आधार प्रोटोकॉल मौजूद नहीं है, तो निर्माता से सहायता के साथ स्वचालित दाग सॉफ्टवेयर अद्यतन करें ।
  2. सभी संशोधनों को मूल प्रोटोकॉल की प्रतियां पर आयोजित किया जाना चाहिए । परिवर्तन करने से पहले, मूल सहेजें और प्रोटोकॉल टैब क्लिक करके एक प्रतिलिपि बनाएं, फिर दूधिया पत्थर 7 मल्टीप्लेक्स प्रोटोकॉल पर राइट क्लिक करें और प्रतिलिपिका चयन करें ।
  3. नई विंडो में 7 मल्टीप्लेक्स प्रोटोकॉल 1 में नाम बदलें और सही डिवाइस (तल मॉडल या benchtop) के साथ जुड़े टैब का चयन करें । पूरक तालिका एसमें प्रोटोकॉल मैच । एक 10 मिनट peroxidase निषेध कदम जोड़ने के लिए एजेंट जोड़ें क्लिक करें (मानक प्रोटोकॉल का हिस्सा नहीं) और रिएजेंट के रूप में peroxidase अवरोधक चुनें ।
  4. पुष्टि करें कि ब्लॉकिंग चरण एक PKI ब्लॉकिंग बफ़र का उपयोग । सुनिश्चित करें कि प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी उचित एजेंट को संदर्भित करता है, कि माध्यमिक एंटीबॉडी कदम एक एचआरपी बहुलक का उपयोग, और है कि वर्णक्रमीय 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) multispectral स्वचालन किट के साथ प्रदान का उपयोग किया जाता है । प्रोटोकॉल स्क्रीन पर ड्रॉप-डाउन मेनू में प्रत्येक संबंधित चरण के लिए निर्दिष्ट किया गया है जो एजेंट की जाँच करके सभी विकल्पों की पुष्टि करें ।

5. स्वचालित दाग: ड्रॉप नियंत्रण के अलावा, और Isotype नियंत्रण प्रोटोकॉल

  1. नाम की कॉपी 7 मल्टीप्लेक्स प्रोटोकॉल 1 और इसे बदलने के लिए 7 मल्टीप्लेक्स प्रोटोकॉल 1 CD68 ड्रॉप। परिवर्तित करेंएजेंट CD68 एंटीबॉडी करने के लिए माउस आईजीजी और प्रोटोकॉल को सहेजें ।
  2. छह और नए प्रोटोकॉल, एक बूंद नियंत्रण के लिए एक और पूरा isotype नियंत्रण के लिए एक ही तरीके से (उचित isotypes के लिए सभी एंटीबॉडी बदलने) बनाएं ।

6. स्वचालित दाग: स्लाइड तैयारी प्रोटोकॉल

  1. की प्रतिलिपि बना रहा है, तो * सेंकना प्रोटोकॉल और Dewax और इस प्रोटोकॉल Multispectral सेंकना और Dewax 2 एचका नाम बदलें ।
  2. तालिका 2में दिखाए गए एजेंट से मेल खाने के लिए प्रोटोकॉल समायोजित करें । ६० डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए स्लाइड सेंकना । ७२ डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए Dewax ।

7. स्वचालित दाग: रिएजेंट की तैयारी

  1. एक अनुसंधान जांच किट तैयार करें । एक रिएजेंट स्थाई रूप से इस किट के साथ जुड़ा होना चाहिए, तो 1x Tris के लिए चिह्नित 30 मिलीलीटर खुले कंटेनर भरें-बफर खारा (टीबीएस) 1x टीबीएस के साथ और स्थिति 1 में यह पता लगाने (संभाल से दूर) में अनुसंधान जांच किट नामित मल्टीप्लेक्स अनुसंधान किट 1. इस एजेंट स्थाई रूप से इस शोध किट के साथ जुड़ा होगा और भविष्य के उपयोग के लिए स्थिति में परिवर्तन नहीं करना चाहिए ।
  2. लेबल २ ३० एमएल ओपन कंटेनर Multispectral ब्लॉक और Multispectral सेकंडरी। Multispectral ब्लॉक कंटेनर के साथ 30 मिलीलीटर अवरुद्ध बफर/एंटीबॉडी मंदक से Multispectral धुंधला किट भरें । विरोधी के 30 मिलीलीटर माउस/Multispectral धुंधला किट से विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी बहुलक के साथ Multispectral माध्यमिक कंटेनर भरें ।
  3. दस 7 मिलीलीटर खुले कंटेनर तैयार करें । microliters में आवश्यक मात्रा ६०० + (१५० x [स्लाइड की संख्या]) है । प्रत्येक एंटीबॉडी इस मामले में 12 स्लाइड (छह tonsil और छह फेफड़ों) के लिए लागू किया जाएगा । लेबलिंग और सभी कंटेनरों के लिए वॉल्यूम तालिका 3में चिह्नित हैं ।
  4. प्रत्येक एंटीबॉडी ट्यूब के लिए, पहले एंटीबॉडी मंदक, तालिका 3में इंगित खंड में केंद्रित प्राथमिक एंटीबॉडी के बाद जोड़ें । कोमल pipetting द्वारा मिश्रण ।
  5. DAPI के लिए एक 7 मिलीलीटर खुले कंटेनर तैयार करें, DAPI की चार बूंदों का उपयोग कर दोहरे आसुत जल के milliliter प्रति ध्यान केंद्रित; कुल 16 DAPI (६०० + [१५० x 16] = ३,००० µ एल) के साथ दाग हो जाएगा । डबल आसुत जल प्लस कंटेनर में वर्णक्रमीय DAPI के 12 बूंदें के 3 मिलीलीटर जोड़ें । प्रत्येक रन के लिए ताजा DAPI तैयार करें ।
  6. peroxidase अवरोध करनेवाला के लिए एक 7 मिलीलीटर खुले कंटेनर तैयार करें । सभी 16 स्लाइड peroxidase अवरोध करनेवाला के साथ इलाज किया जाएगा (६०० + [१५० x 16] = ३,००० µ l). कंटेनर में peroxidase ब्लॉक के 3 मिलीलीटर जोड़ें ।
  7. fluors की सांद्रता काम करने से पहले, निर्माता द्वारा प्रदान की गई प्रत्येक dimethyl ट्यूब के लिए sulfoxide fluor के ७५ µ l को जोड़कर सभी lyophilized fluors को पुनर्निलंबित करें । pipetting द्वारा मिश्रण । यह TSA fluor स्टॉक है । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  8. छह अनुमापन कंटेनर, प्रत्येक fluor के लिए एक तैयार करें । microliters में आवश्यक मात्रा ३५० + (१५० x [स्लाइड की संख्या]) है । प्रत्येक fluor इस मामले में 16 स्लाइड के लिए लागू किया जाएगा (आठ tonsil और आठ फेफड़े). सभी कंटेनरों के लिए लेबलिंग और वॉल्यूम तालिका 4में चिह्नित हैं ।
  9. जब सभी एजेंट पंजीकृत और तैयार किया गया है, एक रैक पर किसी भी स्थान में प्रत्येक कंटेनर जगह और स्वचालित दाग पर सभी एजेंट लोड । जांच प्रत्येक एजेंट की मात्रा की पुष्टि करेगा ।

8. स्वचालित दाग: नमूना सेटअप और Multispectral धुंधला

  1. स्वचालित दाग सॉफ्टवेयर में, स्क्रीन के शीर्ष पर स्लाइड सेटअप क्लिक करें । क्लिक करें, अध्ययन जोड़ें । पॉप-अप विंडो को अध्ययन ID, अध्ययन नाम और टिप्पणियों के साथ पॉप्युलेट करें.
    1. ड्रॉप-डाउन सूची से चलने वाले दाग का संचालन करने वाले शोधकर्ता के नाम का चयन करें । १५० µपर औषधालय मात्रा छोड़ l तैयारी प्रोटोकॉलके लिए Multispectral Dewax चयन करें । ठीक क्लिक करें और स्लाइड जोड़ें। टिप्पणीके तहत, "मल्टीप्लेक्स 1 लंग 123ABC" लिखें । संकेत के रूप में निंनलिखित क्षेत्रों को पूरा करें: ऊतक प्रकार = परीक्षण ऊतक; वितरण मात्रा = १५० µ l; धुंधला मोड = एकल, दिनचर्या; मार्कर = नकारात्मक; सना = प्रकार "7 मल्टीप्लेक्स प्रोटोकॉल 1"; वडा = Multispectral सेंकना, Dewax २ ज; HIER = ER1 के साथ HIER 20 मिनट ।
  2. स्लाइड जोड़ें क्लिक करें और ड्रॉप नियंत्रण स्लाइड और isotype नियंत्रण स्लाइड जोड़ने के लिए टिप्पणियां और प्रोटोकॉल बदलें । जब सभी स्लाइड् स को अध् ययन में जोड़ा गया है, तो स्लाइड विंडो जोड़ें और लेबल मुद्रित करें बंद कर ᱶ । प्रत्येक स्लाइड पर उपयुक्त लेबल क्षेत्र पर लेबल्स लागू करें ।
  3. रैक में स्लाइड लोड, सही अभिविन्यास में कवर टाइल्स लागू, स्वचालित दाग में रैक डालने, और कम ट्रे । डिवाइस स्लाइड लेबल्स को स्कैन करेगा ।
  4. जब सभी स्लाइड और रिएजेंट स्कैन और मापा गया है । रन बटन (►) सक्रिय हो जाएगा । अगर दाग किसी भी त्रुटि का पता लगाता है, जैसे अपर्याप्त एजेंट मात्रा, एक पीला चेतावनी प्रतीक प्रभावित ट्रे द्वारा दिखाई देगा । यदि कोई त्रुटि होती है, तो ठीक क्लिक करें चेतावनी प्रतीक और त्रुटि उपाय ।
  5. तुरंत दाग शुरू या एक देरी शुरू अनुसूची । प्रोटोकॉल की अवधि में लगभग 14 एच है । नोट: सुनिश्चित करें कि प्रोटोकॉल एक समय था जब स्लाइड तुरंत हटा दिया जा सकता है के रूप में exess वॉशिंग धुंधला परिणाम प्रभाव सकता है पर पूरा होगा ।

9. Coverslipping की Multispectral स्लाइड

  1. स्वचालित दाग से स्लाइड निकालें और उन्हें 1x टीबीएस में जलमग्न एक रैक में स्टोर ।
  2. माउंट नहीं १.५ coverslips और बढ़ते मीडिया के 15 µ एल के साथ नमूनों ( सामग्री की तालिकादेखें) । एक पिपेट टिप के साथ coverslip पर धीरे दबाकर किसी भी बुलबुले निकालें ।
  3. स्लाइड को प्रयोगशाला पीठ पर कमरे के तापमान पर रात भर इलाज के लिए अनुमति दें । तुरंत सावधानी से निपटने के साथ स्कैन किया जा सकता है स्लाइड ।

10. Multispectral स्कैनर

  1. multispectral स्कैनर और उसके कंप्यूटर पर बिजली (मॉडल और सॉफ्टवेयर जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें) । माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर शुरू करो । डिवाइस के फ्रंट पर टच-सेंसिटिव बटन दबाकर multispectral स्कैनर के फ्रंट डोर को ओपन करें । स्कैनर में प्रत्येक स्प्रिंग-लोड वाहक चार स्लाइड रखती है । वाहकों में सभी स्लाइड्स लोड करें और वाहक को डिवाइस में लोड करने से पहले ऑर्डर रिकॉर्ड करे ।
  2. प्रोटोकॉल संपादित करें चुनें और नयाक्लिक करें...; फिर, प्रोटोकॉल नाम मल्टीप्लेक्स पैनल 1 और ड्रॉप नियंत्रणबनाएं । अध्ययन का नाम बनाएं मल्टीप्लेक्स पैनल विकास, क्लिक करें प्रोटोकॉल बनाएं, और प्रकार अवलोकन स्कैन फ़िल्टर DAPI; उसके बाद, पूरे स्लाइड स्कैन और पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन ०.५० µm (20X)का चयन करें । सभी फिल्टर और बैंड का प्रतिनिधित्व किया जाना चाहिए । यदि नहीं, तो फ़िल्टर और बैंड संपादितकरेंक्लिक करें, सभी पाँच फ़िल्टर्स (DAPI, FITC, CY3, टेक्सास लाल, और CY5) का चयन, और उसके बाद, एक्सपोज़र संपादितकरेंक्लिक करें ।
  3. फेफड़े ग्रंथिकर्कटता के पूर्ण मल्टीप्लेक्स के साथ वाहक का चयन करके वाहक लोड । ग्राफ़िक उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस का उपयोग करके सही स्लाइड का चयन करें । ऊतक या तो मैंयुअल रूप से ध्यान केंद्रित का उपयोग करके या । स्वीकार्य DAPI धुंधला के साथ किसी भी क्षेत्र में नेविगेट करें और (0-2000 ms) मिलीसेकंड में एक्सपोज़र सेट करने के लिए स्वत:-expose ।
  4. दोनों पूरे स्कैन और MSI क्षेत्र स्तंभ में सभी पांच फ़िल्टर सेट्स के लिए एक ही कार्यविधि को दोहराएँ । स्वीकार्य धुंधला के साथ एक क्षेत्र में नेविगेट करने के लिए सुनिश्चित करें और प्रत्येक फिल्टर और आवर्धन स्तर के लिए जोखिम की स्थापना से पहले माइक्रोस्कोप refocus. 20x समग्र स्कैन और 20x multispectral इमेजिंग (MSI) multispectral क्षेत्रों में सभी पाँच फ़िल्टर्स के लिए स्वत:-अरक्षित करें । ०.५० µm (20x) के पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन का चयन करें । प्रोटोकॉल सहेजें और वापस क्लिक करें वेक्ट्रा सॉफ़्टवेयर की होम स्क्रीन पर लौटने के लिए; उसके बाद, स्लाइड स्कैनकरेंक्लिक करें ।
  5. प्रत्येक स्लाइड के लिए इंटरफ़ेस खोलें और स्कैनकरने के लिए कार्य सेट करें । मल्टीप्लेक्स पैनल विकासके लिए सेट अध्ययन , मल्टीप्लेक्स पैनल के लिए प्रोटोकॉल सेट 1 और नियंत्रण ड्रॉप, और मल्टीप्लेक्स फेफड़े ABC123, मल्टीप्लेक्स CD68 ड्रॉप फेफड़ों ABC123, आदि के लिए स्लाइड आईडी सेट . जब सभी स्लाइडों को लेबल किया गया हो और कार्य सेट हों, तो स्कैनक्लिक करें । स्वचालित multispectral स्कैनर सभी पांच फ़िल्टर का उपयोग कर सभी स्लाइड का पूर्ण-स्लाइड स्कैन निष्पादित करेगा ।

11. Multispectral स्कैनर: Multispectral इमेजिंग

  1. स्कैन पूर्ण होने के बाद, QPTIFF सॉफ़्टवेयर ("Phenochart") खोलें और ऊपरी बाईं ओर लोड स्लाइड क्लिक करें । यह एक QPTIFF, जो एक पांच फिल्टर पूरी स्लाइड स्कैन है खुल जाएगा । प्रत्येक परत एक से अधिक fluor से जानकारी होती है, तो उपयोगिता सीमित है, लेकिन ऊतक संरचना और व्यापक अभिव्यक्ति पैटर्न स्पष्ट है और MSI के लिए क्षेत्रों का चयन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  2. नेविगेट करें और बाईं ओर ड्रॉप-डाउन ट्री का उपयोग करके अध्ययन में सही स्लाइड को खोलें । उपयोगकर्ता प्रथमाक्षर के साथ लॉग इन करें (ऊपरी दाईं ओर) ।
  3. स्क्रीन के शीर्ष पर स्टांप उपकरण का उपयोग कर MSI के लिए पाँच क्षेत्रों का चयन करें । एक पैथोलॉजिस्ट से परामर्श अगर एक उपलब्ध है । के लिए चयन करें केअंतर्गत, प्राप्तिका चयन करें; फ़ील्ड्स में आकारके तहत, 1x1का चयन करें; और फ़ील्ड प्रतिबंधके अंतर्गत, ०.५ µm (20x)का चयन करें । cytokeratin (ck) धुंधला (मुख्य रूप से Cy5 में) पर आधारित है, दोनों ट्यूमर (ck +) और स्ट्रोमा (ck-) के साथ कई क्षेत्रों का चयन करने के लिए समग्र स्कैन से छवि हो । प्रत्येक स्लाइड के लिए इस कार्यविधि को दोहराएं ।
  4. सभी MSIs चयनित होने के बाद, Phenochart सॉफ़्टवेयर बंद करें और वेक्ट्रा सॉफ़्टवेयर पर वापस जाएं । कार्य प्रत्येक स्लाइड के लिए स्कैन करने के लिए msi से परिवर्तित करें, और उसके बाद, msi संग्रह करने के लिए पुन: स्कैन करेंक्लिक ।

12. वर्णक्रमीय मिश्रण

नोट: वर्णक्रमीय मिश्रण कदम चैनल जुदाई और स्लाइड की छवि विश्लेषण के लिए आवश्यक है । वर्णक्रमीय मिश्रण से पहले सूचित सॉफ्टवेयर में किया जाता है, वर्णक्रमीय पुस्तकालय अकेले और अकेले DAPI के साथ एक fluor के साथ दाग फेफड़े ग्रंथिकर्कटता स्लाइड का उपयोग करके बनाया जाना चाहिए । इस प्रक्रिया को aforementioned मल्टीप्लेक्स आइएचसी परख विकास गाइड में भी वर्णित है ।

  1. msi अर्जन पूर्ण होने पर, msi फ़ोल्डर में फ़ाइलें खोलने के लिए वर्णक्रमीय मिश्रण ("सूचना") सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें । इन फ़ाइलों को. im3 फ़ाइल-प्रकार एक्सटेंशन में समाप्त ।
  2. छवि स्वरूपके अंतर्गत, Multispectralका चयन करें; नमूना स्वरूपके अंतर्गत, प्रतिदीप्तिचयन करें; और वर्णक्रमीय पुस्तकालय स्रोतके तहत, सूचितकरेंका चयन करें ।
  3. fluors का चयन करने के लिए, लंग ग्रंथिकर्कटता लाइब्रेरी स्लाइड्स के साथ निर्मित लाइब्रेरी से सभी छह fluors और DAPI को चुनें और लोड करें । सभी तैयार करें (निचली बाईं ओर) वर्णक्रमीय मिश्रण सॉफ्टवेयर प्रदान की वर्णक्रमीय प्रोफाइल का उपयोग कर, सभी खुले छवियों पर वर्णक्रमीय मिश्रण प्रदर्शन करेंगे ।
  4. एक पैथोलॉजिस्ट के साथ, एक ही ऊतक के अनुक्रमिक स्लाइड में एक ही लक्ष्य के chromogenic एकल दाग के खिलाफ धुंधला पैटर्न का आकलन करें ।

13. प्रतिदीप्ति तीव्रता और संकेत क्षीणन का मूल्यांकन

नोट: गिनती उपकरण है, जो एक छोटे भूरे रंग के बॉक्स के साथ एक तीर के रूप में प्रकट होता है, मल्टीप्लेक्स अनुकूलन के लिए सबसे महत्वपूर्ण उपकरण है और अक्सर इस्तेमाल किया जाना चाहिए ( पूरक सामग्रीदेखें) । वर्णक्रमीय मिश्रण सॉफ्टवेयर में गिनती उपकरण का उपयोग करना, संकेत करने वाली शोर अनुपात का आकलन, जो कम से कम 10:1 से अधिक होना चाहिए (समस्या निवारण के लिए पूरक सामग्री को देखने के लिए और ड्रॉप नियंत्रण के साथ मल्टीप्लेक्स धुंधला के मूल्यांकन के लिए).

  1. १३.१. वर्णक्रमीय मिश्रण सॉफ्टवेयर में एक छवि खुला के साथ, प्रत्येक चैनल की प्रतिदीप्ति तीव्रता का आकलन करने के लिए गिनती उपकरण और सर्वेक्षण छवियों संलग्न । फेफड़ों के ऊतकों में लक्ष्य तीव्रता 10 और 20 के बीच सामान्यीकृत मायने रखता है । सामान्यीकृत गणना उपकरण चित्रा 1में दिखाया गया है ।
  2. किसी भी मार्कर के लिए पांच से कम की संख्या से कम 10 या सामान्य संकेत क्षेत्र की गिनती के अधिकतम संकेत के साथ स्लाइड्स को शामिल न करें ताकि autofluorescence और ऑफ-टारगेट धुंधला प्रामाणिक सिग्नल के साथ प्रतिस्पर्धा नहीं है ।
  3. किसी भी चैनल के लिए अधिकतम 30 से अधिक संख्या के साथ स्लाइड्स को शामिल न करें वर्णक्रमीय रक्तस्राव या अक्षम वर्णक्रमीय मिश्रण से बचने के लिए ।
  4. TSA एकाग्रता का समायोजन करके उच्च या कम सामान्यीकृत गिनती पता.

14. Multispectral छवि विश्लेषण

  1. वर्णक्रमीय मिश्रण सॉफ्टवेयर में एक या एक से अधिक MSI खोलें और केवल unmixing के लिए चयन करें कि एक खुली छवि में प्रतिनिधित्व कर रहे है मिश्रण के लिए । सभी वर्तमान में खोला रंग छवियों को unmix के लिए सभी तैयार क्लिक करें वर्णक्रमीय मिश्रित छवियों उपज ।
  2. ब्याज के क्षेत्र (ओं) पर मंडरा द्वारा प्रत्येक छवि भर में गिनती सर्वेक्षण करने के लिए गिनती उपकरण का चयन करें ।
  3. दृश्य संपादक को खोलने के लिए आँख आइकन का चयन करें । चुनें और प्रत्येक स्वतंत्र चैनल के प्रदर्शन तीव्रता समायोजित करें ।
  4. ऊतक विभाजन, सेल विभाजन, phenotyping, और स्कोरिंग मॉड्यूल खोलने के लिए कॉन्फ़िगर करेंका चयन करें । इन उपकरणों chromogenic एकल दाग के खिलाफ मल्टीप्लेक्स धुंधला के उद्देश्य सत्यापन के लिए आवश्यक है और मात्रात्मक phenoptic डेटा (चित्र एसएक) उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  5. आगे विश्लेषण, संग्रह, और प्रस्तुतियों के लिए phenoptic विश्लेषण मॉड्यूल से ग्रेस्केल, फ्लोरोसेंट, pathview-शैली संकुचित TIFF, और डेटा फ़ाइलों को सहेजने के लिए निर्यात टैब का उपयोग करें (चित्र एसएफ) ।

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Representative Results

यहां वर्णित प्रोटोकॉल चित्रा 2में दिखाए गए लोगों की तरह परिणाम प्रदान करेगा । टॉन्सिल नियंत्रण में धुंधला के एक मूल्यांकन के साथ शुरू, सतह स्क्वैमस कोशिका उपकला के साथ शुरुआत. प्रोटोकॉल tonsil नमूने के एक संदर्भ के रूप में एच & ई स्लाइड का उपयोग कर, एक पैथोलॉजिस्ट के साथ समीक्षा की जा सकती है । यदि chromogenic आइएचसी वर्गों एक ही ऊतक ब्लॉक पर एक ही मार्करों के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं, तो इन mIF स्लाइड पर प्रत्येक मार्कर के घनत्व और वितरण की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । के रूप में चित्रा 2एमें दिखाया गया है, tonsil ऊतक स्पष्ट रूप से परिभाषित AE1/AE3 cytokeratin tonsil सतह स्क्वैमस उपकला में धुंधला (चित्रा 2a; लाल pseudocolor के रूप में लेबल), लसीकावत् में पृष्ठभूमि के बिना प्रदान करना चाहिए ऊतक. धुंधला cytoplasmic होना चाहिए, कभी-कभार झिल्ली का चिह्न के साथ, और नाभिक नकारात्मक होना चाहिए । तहखाने में reticulated उपकला cytokeratins (लाल) और पीडी-L1 (चित्रा 2ए; ग्रीन pseudocolor) दोनों के लिए सकारात्मक होना चाहिए. टॉन्सिल के तोंसिल्लितिस कीटाणु केन्द्रों, तो, की पहचान की जानी चाहिए । कीटाणु केन्द्रों को आसानी से पहचानने योग्य होना चाहिए और अमीरी-६७-पॉजिटिव लिम्फोसाइटों (चित्रा 2A; पीला pseudocolor) होना चाहिए । Ki-६७ दाग हमेशा परमाणु होना चाहिए । कीटाणु केन्द्रों में मौजूद मैक्रोफेज को भी आसानी से पहचानने योग्य होना चाहिए, कभी-कभार बड़ी कोशिकाओं के रूप में (जिसे "tingible बॉडीज" भी कहा जाता है). वे एक दानेदार cytoplasmic दाग (चित्रा 2a; ऑरेंज pseudocolor) के रूप में CD68 के लिए सकारात्मक दाग दिखाएगा । कीटाणु केन्द्रों के बाहर CD68 कोशिकाओं का चर अनुपात भी अपेक्षित है । मैक्रोफेज पीडी-L1 के लिए झिल्ली धुंधला दिखा सकता है । यह आमतौर पर reticulated उपकला में पीडी-L1 के लिए दाग से तीव्रता में paler है. कोई परमाणु CD68 धुंधला होना चाहिए । सीडी 8 टी-सेल के वितरण के साथ लिम्फोसाइटों दाग होना चाहिए (कीटाणु केंद्रों में कम और तोंसिल्लितिस वाले क्षेत्रों में अधिक से अधिक अनुपात; चित्रा 2ए, सियान pseudocolor) देखें । सीडी 8 + लिम्फोसाइटों अल्प कोशिका द्रव्य के साथ आमतौर पर छोटे कोशिकाओं रहे हैं, तो यह लिम्फोसाइटों में झिल्ली बनाम कोशिका द्रव्य भेद करने के लिए व्यावहारिक रूप से असंभव है । पीडी-1 दृढ़ता से कीटाणु केंद्र क्षेत्र में छोटे लिम्फोसाइटों दाग होगा, आमतौर पर कीटाणु केंद्रों की परिधि में संकुल (चित्रा 2A; रानी pseudocolor), साथ ही साथ तोंसिल्लितिस क्षेत्र में बिखरे हुए लिम्फोसाइटों, आमतौर पर कीटाणु केंद्र क्षेत्र में उन लोगों की तुलना में एक कम धुंधला तीव्रता दिखा । सीडी 8 के साथ के रूप में, यह स्पष्ट रूप से पीडी-1 के साथ दाग छोटे लिम्फोसाइटों में झिल्ली और cytoplasmic दाग भेद करने के लिए संभव नहीं है । क्योंकि पीडी-1 coexpress सीडी 8 कोशिकाओं का एक चर अनुपात, यह गुणवत्ता नियंत्रण प्रयोजनों के लिए सिफारिश की है कि धुंधला पैटर्न और एक ही ऊतकों में दाग है कि एक मार्कर के वितरण chromogenic आइएचसी संदर्भ स्लाइड के साथ तुलना में, के रूप में सुझाव दिया में पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल12।

उंमीद धुंधला पैटर्न tonsil ऊतक नियंत्रण में पुष्टि की गई है के बाद, फेफड़ों के कैंसर के नमूने (चित्रा 2ख) में धुंधला का मूल्यांकन करने के लिए आगे बढ़ें । क्योंकि ट्यूमर के ऊतकों को एक चर और मार्कर के विषम अभिव्यक्ति दिखाने की उंमीद कर रहे हैं, यह एक नया mIF पैनल के अनुकूलन के दौरान बहुत महत्वपूर्ण है mIF विधि और उसकी अभिव्यक्ति में मनाया प्रत्येक व्यक्ति मार्कर के लिए धुंधला पैटर्न की तुलना मानक chromogenic आइएचसी स्लाइड में स्वीकार्य है, जो पहले वर्णित12के रूप में सकारात्मक कोशिकाओं की मात्रा और वितरण का मूल्यांकन । फिर भी, बुनियादी धुंधला पैटर्न संरक्षित किया जाना चाहिए; उदाहरण के लिए, cytokeratins उपकला कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य में और कभी नहीं एक नाभिक में मनाया जाना चाहिए; CD68 के रूप में दानेदार cytoplasmic धुंधला मैक्रोफेज में प्रकट होना चाहिए, आदि. महत्वपूर्ण बात, कुछ मार्करों में, धुंधला तीव्रता tonsil नियंत्रण से कैंसर के ऊतकों को बदल सकता है; उदाहरण के लिए, पीडी-1 और पीडी-L1 के रूप में बहुत उच्च अभिव्यक्ति tonsil नियंत्रण में मनाया के साथ तुलना में ट्यूमर ऊतक में कम तीव्रता दाग दिखा सकते हैं । यह है, इसलिए, महत्वपूर्ण सॉफ्टवेयर में गिनती उपकरण के साथ मूल्यांकन और अनुकूलन प्रदर्शन करने के लिए, ट्यूमर के ऊतकों के उदाहरण का उपयोग करने के बजाय tonsil नियंत्रण.

अंत में, isotype-नकारात्मक नियंत्रण और ड्रॉप नियंत्रण न केवल पृष्ठभूमि और autofluorescence का पता लगाने के लिए, लेकिन यह भी छाता प्रभाव और वर्णक्रमीय भरो (चित्रा 3 और चित्रा 4) के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए । Isotype नियंत्रण स्लाइड में कोई भी immunostaining प्रदर्शित नहीं करना चाहिए; यदि किसी भी धुंधला देखा है, तो इमेजिंग या धुंधला प्रक्रिया फिर से आना चाहिए । ड्रॉप नियंत्रण ऐसे वर्णक्रमीय खून या छाता प्रभाव, एक नया मल्टीप्लेक्स पैनल के अनुकूलन के दौरान mIF विधि के कारण के रूप में धुंधला में संभावित कलाकृतियों का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं ( चित्रा 5, अनुपूरक आंकड़ा S2देखें, अनुपूरक आंकड़ा S3, और पूरक सामग्री) । फ्लोरोसेंट monoplex और ड्रॉप नियंत्रण का मूल्यांकन किया जाना चाहिए और पूर्ण मल्टीप्लेक्स पैनल के साथ तुलना में । प्रत्येक ड्रॉप नियंत्रण एक प्राथमिक एंटीबॉडी, जो प्रत्येक विशिष्ट नियंत्रण पर हटाया जाना चाहिए के अलावा एक ही धुंधला पैटर्न दिखाना चाहिए । अधिक जानकारी के पूरक सामग्री अनुभाग में प्रदान की जाती हैं ।

Figure 1
चित्रा 1 : गिनती उपकरण सूचित करें । सूचित सॉफ्टवेयर गिनती उपकरण बेज रंग बॉक्स आइकन का चयन करके सक्रिय है. सामान्यीकृत गिनती बिट गहराई, जोखिम समय, लाभ, और बिन्नी के लिए सही कर रहे हैं । चित्र 20X आवर्धन पर ले जाया गया; स्केल बार = ५० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : प्रतिनिधि परिणाम । (A) Tonsil और (B) गैर-सेल फेफड़ों कार्सिनोमा पीडी-L1 के साथ दाग थे (५२० TSA, ग्रीन), सीडी 8 (५४० tsa, सियान), Ki67 (५७० tsa, पीला), CD68 (६२० tsa, नारंगी), cytokeratin (६५० tsa, लाल), और पीडी-1 (६९० tsa, रानी). व्यक्तिगत चैनल अलग छोटे पैनलों में नीचे प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । मार्कर प्रत्येक छवि के ऊपरी दाएँ में संकेत दिया है. चित्र 20X आवर्धन पर ले जाया गया; स्केल पट्टी = ५० (या २५० µm) । एक पैनल में संकेत दिया 1 हैं) लसीकावत् कूप, 2) कीटाणु केंद्र, 3) तोंसिल्लितिस क्षेत्र, और 4) स्तरीकृत स्क्वैमस उपकला । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : TSA अवरुद्ध/ यह ६९० tsa वर्तमान tsa की मात्रा पर निर्भर तरीके से एक पीडी-1 एंटीबॉडी अवरुद्ध CD3 संकेत द्वारा जमा की एक उदाहरण है । प्रतिभाशाली ६९० tsa संकेत ब्लॉक ६२० TSA संकेत सबसे प्रभावी ढंग से (छोटे सेल फेफड़े कार्सिनोमा विरोधी पीडी-1 D4W2J के साथ दाग ०.५२ µ जी पर 30 मिनट के लिए/एमएल या isotype पर एक 10 मिनट ६९० TSA पता लगाने के बाद 1:100; फिर, एंटी CD3 एफ 7.2.38 30 मिनट के लिए ०.१४ µ g/mL पर 1:100 पर एक 10 मिनट ६२० TSA पता लगाने के द्वारा पीछा किया) । चित्र 20X आवर्धन पर ले जाया गया; स्केल बार = ५० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4 : वर्णक्रमीय भरो. गैर-सेल फेफड़े कार्सिनोमा ऊतक के साथ दाग था ki-६७ ड्रॉप नियंत्रण प्रोटोकॉल (के साथ पूरा मल्टीप्लेक्स प्रोटोकॉल-६७ एंटीबॉडी लोप) । ५४० tsa चैनल (सीडी 8) और ५७० tsa चैनल (Ki-६७) दिखाया गया है । कोई परमाणु धुंधला पैटर्न स्पष्ट है, अभी तक सीडी 8 धुंधला पैटर्न के एक कम प्रति ५७० TSA चैनल में मनाया जाता है । यह सबसे अच्छा सभी चैनलों में तुलनीय धुंधला तीव्रता सुनिश्चित करने के द्वारा संबोधित किया है । इस मामले में, एक मजबूत Ki-६७ संकेत के अलावा (सामान्यीकृत गिनती 10 और 20 के बीच) वर्णक्रमीय खून सही होगा । चित्र 20X आवर्धन पर ले जाया गया; स्केल बार = ५० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5 : ड्रॉप नियंत्रण । यह आंकड़ा एक पूर्ण मल्टीप्लेक्स की एक समग्र छवि से पता चलता है की तुलना में फेफड़ों ग्रंथिकर्कटता की अनुक्रमिक स्लाइड के एक ही क्षेत्र में ड्रॉप नियंत्रण जिसमें संकेत प्राथमिक एंटीबॉडी लोप किया गया था के साथ दाग । चित्र 20x आवर्धन पर ले जाया गया; स्केल बार = ५० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नाम Abbr नाम प्रकार कंटेनर समूह
PKI ब्लॉकिंग बफ़र OPALBLOK सहायक ओपन 30 एमएल सामान्य
दूधिया पत्थर बहुलक एचआरपी दूधिया 2AB सहायक ओपन 30 एमएल सामान्य
दूधिया पत्थर 1x टीबीएस OPAL1TBS सहायक ओपन 30 एमएल Det. संच
CD68 ०.३० µ g/मिलि PG-M1 मस OPALCD68 सहायक ओपन 7 एमएल सामान्य
ki67 ०.६१ µ g/mL MIB-1 मस OPALki67 सहायक ओपन 7 एमएल सामान्य
पीडी-L1 ०.२० µ g/मिलि SP263 ऄब OPALPDL1 सहायक ओपन 7 एमएल सामान्य
पीडी-1 ०.५२ µ g/मिलि D4W2J ऄब दूधिया PD1 सहायक ओपन 7 एमएल सामान्य
सीडी 8 ०.७० µ g/मिलि SP239 ऄब दूधिया सीडी 8 सहायक ओपन 7 एमएल सामान्य
CK ०.२४ µ g/मिलि AE1/AE3 मस दूधिया CK सहायक ओपन 7 एमएल सामान्य
माउस आईजीजी दूधिया से मस सहायक ओपन 7 एमएल सामान्य
खरगोश आईजीजी दूधिया पत्थर ऄब सहायक ओपन 7 एमएल सामान्य
दूधिया Peroxidase ब्लॉक OPALPERX सहायक ओपन 7 एमएल सामान्य
वर्णक्रमीय DAPI OPALDAPI सहायक अनुमापन 6 एमएल सामान्य
दूधिया रोशनी ५२० एजेंट दूधिया रोशनी ५२० सहायक अनुमापन 6 एमएल सामान्य
दूधिया रोशनी ५४० एजेंट दूधिया रोशनी ५४० सहायक अनुमापन 6 एमएल सामान्य
दूधिया रोशनी ५७० एजेंट दूधिया रोशनी ५७० सहायक अनुमापन 6 एमएल सामान्य
दूधिया रोशनी ६२० एजेंट दूधिया रोशनी ६२० सहायक अनुमापन 6 एमएल सामान्य
दूधिया रोशनी ६५० एजेंट दूधिया रोशनी ६५० सहायक अनुमापन 6 एमएल सामान्य
दूधिया रोशनी ६९० एजेंट दूधिया रोशनी ६९० सहायक अनुमापन 6 एमएल सामान्य

तालिका 1: Leica बॉण्ड RX प्रोटोकॉल, दूधिया पत्थर रिएजेंट

अभिकर्मक समय (h) तापमान (डिग्री सेल्सियस)
1 कोई रिएजेंट नहीं 120:00 ६०
2 बांड Dewax समाधान 0:30 ७२
3 बांड Dewax समाधान 0:00 ७२
4 बांड Dewax समाधान 0:00 परिवेश (कमरे का तापमान)

तालिका 2: दूधिया पत्थर तैयारी प्रोटोकॉल

लक्ष्य µ g/mL क्लोन स्रोत समझौता ज्ञापन स्टॉक µ g/mL µ l मंदक µ l AB
CD68 ०.३ PG-M1 दको २००४३०३१ 30 २३७६ 24
ki67 ०.६१ MIB-1 दको २००४९४७६ ४६ २३६८.१७ ३१.८३
पीडी-L1 ०.२ SP263 वेंट. F09591 १.६१ २१०१.८६ २९८.१४
पीडी-1 ०.५२ D4W2J Cst 1 १०० २३८७.५२ १२.४८
सीडी 8 ०.७ SP239 Ventana १६०३१८ ७० २३७६ 24
Ck ०.२४ AE1/AE3 दको १०१२९४२८ १७९.५ २३९६.७९ ३.२१
मस आईजीजी ०.६१
ऄब आईजीजी ०.७

तालिका 3: प्राथमिक एंटीबॉडी तैयारी ।

दूधिया Fluor स्लाइड पतलापन µ l मंदक µ l दूधिया पत्थर Fluor
दूधिया रोशनी ५२० 16 1:200 २७३६.३ १३.८
दूधिया रोशनी ५४० 16 1:700 २७४६.१ ३.९
दूधिया रोशनी ५७० 16 1:150 २७३१.७ १८.३
दूधिया रोशनी ६२० 16 1:100 २७२२.५ २७.५
दूधिया रोशनी ६५० 16 1:350 २७४२.१ ७.९
दूधिया रोशनी ६९० 16 1:150 २७३१.७ १८.३

तालिका 4: दूधिया पत्थर Fluor तैयारी ।

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पूरक तालिका 1: Leica बॉण्ड RX दूधिया पत्थर मल्टीप्लेक्स प्रोटोकॉल । कृपया यहां क्लिक करें इस तालिका डाउनलोड करने के लिए ।

पूरक तालिका 2: पूर्ण मल्टीप्लेक्स, ड्रॉप नियंत्रण, और पूर्ण isotype नियंत्रणों की सारांश और तुलना । कृपया यहां क्लिक करें इस तालिका डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

चल रहे कैंसर immunotherapy क्रांति उपंयास खोल रहा है और कैंसर रोगियों के लिए चिकित्सकीय विकल्प का वादा13। इंयूनो के क्षेत्र में अग्रिम-ऑन्कोलॉजी भड़काऊ ट्यूमर microenvironment की वृद्धि हुई ज्ञान की आवश्यकता होगी, न केवल कैंसरजनन में शामिल प्रतिरक्षा तंत्र के जीव विज्ञान को समझने के लिए, लेकिन यह भी नए के लिए पूर्वानुमानित मार्क्स खोजने के लिए immunotherapy-आधारित उपचार1,2. कैंसर इम्यूनोलॉजी के जटिल जीव विज्ञान के कारण, ट्यूमर ऊतक नमूनों की पूछताछ आमतौर पर प्रतिरक्षा मार्करों की बढ़ती सूची है, जो एक दूसरे के साथ बातचीत और अक्सर ऊतक 1 में विविध कोशिका आबादी द्वारा coexpressed है विकसित करने के लिए आवश्यक है ,2,5. नैदानिक परीक्षणों आमतौर पर ऐसे मुख्य सुई या इंडोस्कोपिक बायोप्सी, जो चिकित्सा के विभिन्न बिंदुओं पर एकत्र कर रहे हैं मूल्यांकन करने के लिए और रोगी प्रतिक्रिया की निगरानी के रूप में छोटे बायोप्सी, रोजगार. इस तरह के बायोप्सी ऊतक है, जो बारी में ऊतक वर्गों है कि कैंसर immunoprofiling के लिए नियोजित किया जा सकता की संख्या सीमा सीमित मात्रा प्रदान करते हैं । इस सीमा विशेष रूप से नौनिहालों जब पारंपरिक तकनीक, जैसे मानक monoplex आइएचसी, उपयोग किया जाता है । इसलिए, कैंसर immunoprofiling के लिए नए तरीकों के लिए एक स्पष्ट की जरूरत है कि क्षमता के साथ मल्टीप्लेक्स तकनीक का उपयोग करने के लिए एक साथ विभिंन coexpression के मार्क्स का मूल्यांकन करने के लिए और मूल्यवान ऊतक नमूनों का अधिक कुशल उपयोग कर ।

मल्टीप्लेक्स धुंधलान और multispectral इमेजिंग तरीकों में यहां विस्तार से वर्णित है, एक mIF पैनल एक नैदानिक परीक्षण से बायोप्सी के रूप में FFPE ऊतकों पर इंयूनो-ऑन्कोलॉजी अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है । इस विधि पहले वर्णित किया गया है, मांय, और सफलतापूर्वक कैंसर immunoprofiling8,9,10,11,12,14, के लिए लागू 15. पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल ऐसी सात रंग किट, जो समय लेने वाली है और लगभग 4 काम के दिन की आवश्यकता है के रूप में TSA-आधारित सिस्टम, के साथ mIF धुंधला तरीकों का वर्णन किया है एक समर्पित प्रयोगशाला वैज्ञानिक12 द्वारा ,15. इन कमियों के जवाब में, इस प्रोटोकॉल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्वचालित दाग का उपयोग करके अनुकूलित किया गया है, नाटकीय रूप से 14 घंटे के लिए धुंधला समय छोटा और मैनुअल ऑपरेटरों द्वारा शुरू की परिवर्तनशीलता को नष्ट करने । इमेजिंग कुशलतापूर्वक सिग्नल की गुणवत्ता अपमानजनक बिना हटाया जा सकता है, जो autofluorescence सहित मल्टीप्लेक्स स्लाइड में सात या अधिक फ्लोरोसेंट संकेतों के स्पेक्ट्रा को अलग करने में सक्षम एक multispectral स्कैनर पर आयोजित किया जाता है । इस प्रोटोकॉल दोहराया जा सकता है, संशोधित, और उपकरण और सामग्री की तालिकामें विस्तृत एजेंट के लिए उपयोग के साथ किसी भी प्रयोगशाला उपयोगकर्ता द्वारा प्रदर्शन किया ।

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में 7, 10, 11, 12 अनुभाग हैं । सेक्शन 7 रिएजेंट की तैयारी से संबंधित है । मल्टीप्लेक्स धुंधलाने के लिए रिएजेंटों की सावधानी से तैयारी जरूरी है, एक प्रयोगशाला वैज्ञानिक या तकनीशियन के ध्यान केंद्रित करने की आवश्यकता है ऑपरेटर निर्भर भिंनता से बचने के लिए । उदाहरण के लिए, मल्टीप्लेक्स विधि के साथ प्रमुख मुद्दों में से एक है धुंधला परिवर्तनशीलता, जो रिएजेंट के कमजोर पड़ने की सावधान तैयारी से कम किया जा सकता है, विशेष रूप से TSA रंजक । धारा 10 और 11 छवि अधिग्रहण से संबंधित हैं । एक महत्वपूर्ण जोखिम चित्र है, जो वर्णक्रम खून, एक विरूपण साक्ष्य है जिसमें एक और चैनल से संकेत के लिए नेतृत्व कर सकते है के अधिक जोखिम या संतृप्ति है छवि जा रहा है ( पूरक सामग्रीदेखें) । ध्यान से जोखिम बार विनियमित करने के लिए संतृप्ति और वर्णक्रमीय खून को रोकने में मदद कर सकते हैं । वर्णक्रमीय मिश्रण धारा 12 में आयोजित किया जाता है । यह वर्णक्रमीय पुस्तकालय की तैयारी पर निर्भर करता है (मल्टीप्लेक्स आइएचसी परख विकास गाइड में वर्णित है, उपलब्ध ऑनलाइन) । इस कदम में, सूचित सॉफ्टवेयर है "प्रशिक्षित" विशेष रूप से प्रत्येक TSA डाई के लिए रंग पहचान करने के लिए । वर्णक्रमीय पुस्तकालय ऐसे मानव tonsil के रूप में एक नियंत्रण ऊतक, से वर्गों का उपयोग करके बनाया जाता है, CD20 के रूप में एक समान रूप से व्यक्त मार्कर, के साथ सना हुआ, व्यक्तिगत स्लाइड पर प्रत्येक व्यक्ति TSA डाई के साथ युग्मित । इसके अलावा, autofluorescence स्लाइड (भी मल्टीप्लेक्स आइएचसी परख विकास गाइड में वर्णित) को पहचानने और ऊतक autofluorescence घटाना सॉफ्टवेयर को प्रशिक्षित करने की जरूरत है । Autofluorescence नियंत्रण स्लाइड एक ही ऊतकों से नमूने का उपयोग करके तैयार किया जाना चाहिए (जैसे फेफड़ों के कैंसर के रूप में, आदि), mIF स्लाइड के रूप में उसी तरह से इलाज किया जा रहा है, और प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ, लेकिन TSA डाई के बिना मशीन । केवल एक एकल autofluorescence वर्णक्रमीय प्रोफ़ाइल का चयन किया जा सकता है, तो देखभाल के लिए चौकस autofluorescence जो कोलेजन, फाइब्रोसिस, लाल रक्त कोशिकाओं, अंतर्जात pigments, और अंय स्रोतों से आ सकता है की एक प्रतिनिधित्व का चयन लिया जाना चाहिए । प्रत्येक नई परियोजना की शुरुआत में एक नया वर्णक्रमीय पुस्तकालय बनाना और एक autofluorescence स्पेक्ट्रम का उपयोग कर जो ऊतक अध्ययन नमूनों का प्रतिनिधि है, साथ ही साथ एक ही परियोजना के भीतर प्रत्येक बैच के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक ही ऊतक ब्लॉकों चल रहा है, मूल्यवान methodological कदम है कि एक ही परियोजना के भीतर विभिन्न नमूनों में वर्णक्रमीय मिश्रण की निरंतरता में सुधार करने में मदद मिलेगी रहे हैं ।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित मल्टीप्लेक्स विधि कई समस्या निवारण उपकरण प्रदान करती है, जिसमें एक सिग्नल-टू-शोर विश्लेषक (गिनता उपकरण), ड्रॉप नियंत्रण (पूरक सामग्री), और धुंधला होने की गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक विकृति दृश्य शामिल है । गिनती उपकरण धुंधला और पृष्ठभूमि के स्तर की तीव्रता का मूल्यांकन करने में मदद करता है । यदि तीव्रता और/या पृष्ठभूमि स्तर उच्च हैं, पहले दृष्टिकोण को TSA डाई के कमजोर पड़ने को कम करने के लिए है । यदि समस्या बनी रहती है, तो उस विशेष मार्कर के ऑप्टिमाइज़ेशन के लिए उपयोग की गई chromogenic आइएचसी स्लाइड्स की पृष्ठभूमि की मौजूदगी की तलाश में एक पैथोलॉजिस्ट के साथ समीक्षा की जानी चाहिए । पैथोलॉजी देखने को सूचित सॉफ्टवेयर के द्वारा उत्पंन होता है, एक diaminobenzidine-TSA से जुड़े fluor से प्रतिदीप्ति की तरह pseudocolor प्रतिनिधित्व का उपयोग कर, साथ ही साथ एक अशुद्ध hematoxylin सभी फ्लोरोसेंट संकेतों से उत्पंन प्रतिनिधित्व, DAPI सहित . विकृति दृश्य से छवियां धुंधला हो जाना बेहतर धुंधला के लिए एक पैथोलॉजिस्ट द्वारा दाग पैटर्न के दृश्य मूल्यांकन के साथ मदद करते हैं । इन उपकरणों हमेशा एक नया पैनल के अनुकूलन के दौरान और गुणवत्ता नियंत्रण कदम के रूप में धुंधला कार्यप्रवाह के दौरान कार्यरत होना चाहिए ।

mIF विधि प्राथमिक एंटीबॉडी के उपयोग की आवश्यकता है कि ठीक से मान्य किया गया है और formalin पर मानक chromogenic आइएचसी के लिए अनुकूलित-निश्चित ऊतकों. उदाहरण के लिए, mIF TSA विधि के प्रमुख लाभों में से एक प्राथमिक एंटीबॉडी कि मान्य किया गया है और नैदानिक उपयोग12के लिए शारीरिक पैथोलॉजी प्रयोगशाला में अनुकूलित के उपयोग के साथ अपनी अनुकूलता है. इसका मतलब यह है कि मल्टीप्लेक्स पैनलों प्रयोगशाला उपयोगकर्ता द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है preconjugated एंटीबॉडी के लिए आवश्यकता के बिना विशिष्ट कैंसर इम्यूनोलॉजी सवालों के जवाब, तेजी से और गतिशील पैनल विकास प्रदान करते हैं । इस संबंध में, एक नए पैनल के अनुकूलन के लिए वास्तविक कार्यप्रवाह मानक chromogenic आइएचसी के साथ सत्यापन और एंटीबॉडी के अनुकूलन के साथ शुरू होता है, सबसे अच्छा कमजोर पड़ने और दाग शर्तों है कि स्वच्छ और सुसंगत प्रदान करेगा के लिए देख धुंधला. अगले कदम, एक ही आइएचसी के लिए अनुकूलित कमजोर पड़ने का उपयोग कर, के बजाय diaminobenzidine के TSA fluors का उपयोग करके धुंधला हस्तांतरण और संदर्भ के रूप में immunofluorescent chromogenic के साथ monoplex आइएचसी TSA के परिणामों की तुलना है । अंत में, एंटीबॉडी mIF धुंधला में जोड़ा जा सकता है, हमेशा एक नियंत्रण संदर्भ के रूप में chromogenic आइएचसी धुंधला पैटर्न का उपयोग कर mIF tsa धुंधला मापदंडों को समायोजित करने के लिए, मुख्य रूप से tsa डाई कमजोर पड़ने और धुंधला अनुक्रम । इस प्रक्रिया के दौरान, एक पैथोलॉजिस्ट के साथ सहयोग के लिए धुंधला की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है ।

इस तकनीक की सीमाएं समय और नए पैनलों और mIF पैनलों के immunophenotyping विश्लेषण के अनुकूलन और सत्यापन के लिए आवश्यक प्रयास शामिल हैं । मुख्य चिंता का विषय है, तथापि, mIF तरीकों की उचित सत्यापन है । इन तकनीकों के उचित सत्यापन के अभाव अवैध परिणाम पैदा करने का खतरा है, जो साहित्य के लिए भ्रामक डेटा जोड़ सकते हैं, जिससे कैंसर के जीव विज्ञान के एक बेहतर समझ हासिल करने के प्रयास में बाधा16इम्यूनोलॉजी । इसलिए, अंवेषक पर वर्तमान में ठीक से मल्टीप्लेक्स तरीकों को मान्य करने के लिए हर संभव प्रयास करना शामिल है, जिसमें प्रशिक्षण और अनुभव के साथ पैथोलॉजिस्ट द्वारा सत्यापन और ऊतक के मूल्यांकन में निकटता सुनिश्चित करने सहित histopathology और आइएचसी आधारित तकनीक17,18,19,20। प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत उपकरण है कि एक नए मल्टीप्लेक्स पैनल के सत्यापन के साथ मदद कर सकता है की कुछ भी शामिल है, धुंधला और विश्लेषण से पहले एच & ई स्लाइड के पैथोलॉजी मूल्यांकन सहित, एक संदर्भ के रूप में chromogenic आइएचसी का उपयोग करने के लिए mIF TSA अनुकूलित धुंधला, एक नया मल्टीप्लेक्स पैनल के गुणवत्ता नियंत्रण के लिए ड्रॉप नियंत्रण विधि, और isotype, autofluorescence, और ड्रॉप नियंत्रण का उपयोग करें । mIF तरीकों की तकनीकी जटिलता के बावजूद, वर्णक्रमीय मिश्रण के साथ multispectral इमेजिंग के रूप में प्रौद्योगिकियों, साथ ही साथ अंय उपंयास मल्टीप्लेक्स प्लेटफार्मों, रोगियों से ऊतक नमूनों के विश्लेषण और नए रूपों की पीढ़ी के लिए एक नए युग खोल रहे है डेटा की है कि अकेले मानक आइएचसी के साथ संभव नहीं है । इसलिए, mIF तकनीक के विकास और अनुप्रयोग विकसित करने के लिए जारी रहेगा, नैदानिक परीक्षणों के लिए बायोप्सी के कैंसर immunoprofiling के लिए शक्तिशाली उपकरण बनने और immunotherapy के लिए नए multiparametric पूर्वानुमानात्मक मार्कर्स की पहचान करने में मदद, लाभ, सब से ऊपर, कैंसर रोगी ।

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Disclosures

इस काम को MedImmune द्वारा समर्थित किया गया था, जो वैश्विक AstraZeneca के आर & डी आर्म है । C.W., K.R., और C.C.H. Perkin Elmer, जो रिएजेंट (TSA किट) और multispectral स्कैनर है कि इस काम में इस्तेमाल किया गया उत्पादन के कर्मचारी हैं । M.S., K.D., A.H., W.Z., सी. Bagnall, सी. ब्राउन, J.C., अल, कृष्णसिंह, यूननट, और J.R.C. स्टॉक स्वामित्व और/या शेयर हितों या MedImmune में विकल्प के साथ AstraZeneca के कर्मचारी हैं ।

Acknowledgments

संपादकीय समर्थन MedImmune के दबोरा शुमन द्वारा प्रदान की गई थी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
"InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis PerkinElmer CLS151066 Called "spectral unmixing software" in text
"Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing PerkinElmer CLS151067 Called "QPTIFF software" in text
#1.5 Coverslips Sigma Aldrich 2975246
200 Proof Ethanol Koptec V1001
20x Tris-Buffered Saline VWR J640-4L
Antibody Diluent DAKO S2203
Anti-CD68 Mouse Monoclonal DAKO M087601-2 Clone PG-M1
Anti-CD8 Rabbit Monoclonal Ventana M5392 Clone SP239
Anti-CK Mouse Monoclonal DAKO M351501-2 Clone AE1/AE3
Anti-ki67 Mouse Monoclonal DAKO M724001-2 Clone MIB-1
Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal Cell Signaling #86163 Clone D4W2J
Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal Ventana 790-4905 Clone SP263
Bond Dewax Solution Leica AR9222 Called "dewax solution" in text
Bond Epitope Retrieval Solution 1 Leica AR9961 Called "ER1" in text
Bond Epitope Retrieval Solution 2 Leica AR9640 Called "ER2" in text
Bond Open Containers, 30 mL Leica OP309700 Called "30 mL open containers" in text
Bond Open Containers, 7 mL Leica OP79193 Called "7 mL open containers" in text
Bond Polymer Refine Detection Leica DS9800 Called "chromogenic detection kit" in text
Bond Research Detection Kit Leica DS9455 Called "research detection kit" in text
Bond Titration Kit Leica OPT9049 Called "titration kit" in text
Bond Universal Covertile Novocastra Leica S21.2001 Called "covertiles" in text
Bond Wash Solution 10X Concentrate Leica AR9590 Called "10x wash solution" in text
BondRX Autostainer Leica Called "automated stainer" in text
BondRX Software Version 5.2.1.204 Leica Called "automated stainer software" in text
Opal 7-Color Automation IHC Kit PerkinElmer NEL801001KT Called "multispectral staining kit" in text
Peroxidase Block Leica RE7101
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo P36965 Called "slide mountant" in text
Starfrost Slides Fisher 15-183-51
Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control PerkinElmer CLS143455 Called "microscope control software" in text

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References

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कैंसर रिसर्च इश्यू १४३ मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस multispectral इमेजिंग immunohistochemistry इंयूनो-ऑन्कोलॉजी immunoprofiling लंग कैंसर
स्वचालित मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस इंयूनो के लिए पैनल-Formalin पर ऑन्कोलॉजी अध्ययन-फिक्स्ड कार्सिनोमा ऊतक नमूनों
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Surace, M., DaCosta, K., Huntley, A., Zhao, W., Bagnall, C., Brown, C., Wang, C., Roman, K., Cann, J., Lewis, A., Steele, K., Rebelatto, M., Parra, E. R., Hoyt, C. C., Rodriguez-Canales, J. Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens. J. Vis. Exp. (143), e58390, doi:10.3791/58390 (2019).

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