Summary
자세한 프로토콜 6-마커 멀티플렉스 면역 형광 패널 최적화 수행 위한 더 일관 된 결과를 짧은 절차 시간 자동된 염색기를 사용. 이 방법은 종양 면역 연구에 대 한 모든 실험실에 의해 직접 적응 될 수 있다.
Abstract
종양 면역에서에서 지속적인된 개발 암 면역학의 메커니즘의 증가 이해를 필요합니다. 포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) 생 검에서 조직 샘플의 immunoprofiling 분석 종양 면역학의 복잡성을 이해 하 고 암 immunotherapy에 대 한 소설 예측 바이오 마커의 발견을 위한 주요 도구가 되고있다. Immunoprofiling 분석 조직 등 염증 성 세포 모집단 면역 검사, 종양 microenvironment에 결합 된 마커의 평가 필요 합니다. 소설 멀티플렉스 immunohistochemical 방법의 출현 보다 표준 수염 immunohistochemistry (IHC) 단일 조직 단면도의 더 효율적인 multiparametric 분석에 대 한 수 있습니다. 한 상용 멀티플렉스 면역 형광 (경우) 메서드는 tyramide 신호 증폭에 따라, multispectral 현미경 분석, 결합 조직에서 다양 한 마커의 더 나은 신호 분리에 대 한 수 있습니다. 이 방법론 표준 IHC FFPE 조직 샘플에 대 한 최적화 된 결합형된 기본 항 체의 사용과 호환 됩니다. 여기 우리가 자세하게에서 설명 멀티플렉스 수 있는 자동화 프로토콜 6-마커 다중 항 체 패널 구성 된 PD-L1, 암 조직 샘플의 라벨 경우 PD-1, CD68, CD8, 기-67, 및 4와 AE1/AE3 cytokeratins 6-diamidino-2-phenylindole 로 핵 셀 counterstain. 멀티플렉스 패널 프로토콜 착 시간을 수동 프로토콜의 보다 짧은 수 있습니다 직접 적용 고 인간의 FFPE 조직 샘플에 대 한 면역-종양학 연구에 대 한 모든 실험실 조사에 의해 적응에 대 한 자동된 IHC 염색기에 최적화 되어 있습니다. 또한 몇몇 컨트롤 및 도구, 새로운 다중 경우 패널의 좋은 품질 관리에 대 한 드롭-제어 방법을 포함 하 여 최적화 및 검증 기법에 대 한 유용한 있다.
Introduction
FFPE 종양 조직 샘플의 Immunoprofiling 분석 특히 발견 및 암 immunotherapy 임상 시험1의 맥락에 대 한 소설 예측 바이오 마커의 유효성 검사에 대 한 면역-종양학 연구의 필수 요소가 되고있다 ,2. 발 IHC, diaminobenzidine, 등 화학 chromogens를 사용 하 여 진단 병리학 생 검 조직의3의 immunolabeling에 대 한 표준 기술에 남아 있다. 표준 IHC 암 조직 immunoprofiling, 종양 관련 된 림프 톨의 부분 모집단 그리고 프로그램 된 세포 죽음 ligand 1 등 면역 검사점의 식 수준 평가 (PD-L1)4의 정량 등도 사용할 수 있습니다. ,5. 그러나 표준 IHC 제한 됩니다,, 그 하나의 항 원 조직 섹션 당 표시 될 수 있습니다. Immunoprofiling 연구는 일반적으로 여러 마커의 결합된 식의 분석 필요, 표준 IHC 사용 여러 조직 단면도의 얼룩이 지기 요구, 각 하나의 표식으로 물 될 것 이다, 실질적으로 중 핵 바늘 생 검 같은 작은 조직 샘플의 분석에 대 한 제한. 표준 IHC 방법 다양 한 세포 인구, PD L1, 종양 관련 된 대 식 세포와 암 세포에 의해 표현 된다와 같은 면역 검사점 마커로 일반적인 coexpressed 마커의 평가 대 한 제한도 있습니다. 이 제한에, 표준 수염 IHC의 사용 예를 들어, 다양 한 세포 유형6표현 IHC 마커의 정량 분석에 대 한 병리학 자에 의해 보고 되었습니다. 멀티플렉스 발 IHC 기술 채용 같은 조직 섹션 나타냅니다에 다양 한 컬러 chromogens 전진 표준 IHC 수염 방법,7 에 그들은 남아 있지만 개발의 불과 immunolabeling에 의해 제한 마커 또한 동일한 세포 인구의 동일한 subcellular 구획에서 표현 하는 마커의 적절 한 평가 위한 중요 한 기술 과제를 제시.
멀티플렉스 발 IHC 기법의 제한 뿐만 아니라 임상 샘플에서 조직 여부에 관한 상기 주의 에겐 있다 면역-종양학 연구 기반 향상 된 다중 방법을 개발 하는 필요 형광 라벨 결합 이미징 시스템을 효과적으로 동일한 슬라이드에서 여러 fluorophores의 신호를 분리할 수 있습니다. 1 개의 그런 기술은 tyramide 신호 증폭 (TSA) 효율적인 색상 분리8multispectral 현미경 이미징 결합을 기반으로 합니다. TSA 기반 상용 키트 사용 fluorophores multispectral 이미징8 최적화 ( 재료의 표참조). 이 시스템의 중요 한 이점은 이미 검증 되 고 표준 발 IHC9,,1011에 최적화 된 동일한 레이블 없는 기본 항 체와의 호환성 이다. 이 새로운 목표를 통합 최적화 및 패널 수정에서 빠른 최적화 뿐만 아니라 유연성 수 있습니다. 또한, 다중 면역 형광 검사 (mIF) TSA 메서드 수염에서 간단한 전송에 대 한 수 있도록 자동화 된 상용 IHC 염색기 시스템, 최적화 될 수 있습니다 비 IHC mIF.
여기 선물이 프로토콜 기반 면역-종양학 연구 mIF 패널 mIF TSA 얼룩 자동 고 이미징 multispectral 스캐너를 사용 하 여. 이 프로토콜 적응 고 설명된 계측 및 시 약에 대 한 액세스 있는 실험실 사용자에 의해 수정 될 수 있습니다. Carcinomas의 immunoprofiling에 대 한 6 주 항 체의 패널을 포함 하는 프로토콜: PD-L1, PD-1, CD68 (마커로 팬-대 식 세포), CD8 (세포 독성 T 세포), 기-67, 및 AE1/AE3 (팬 cytokeratin, 신분의 상피 표식으로 사용 암 세포)입니다. 최근 연구는 멀티 플렉스12얼룩을 확인 하기 위해 표준 참조로 발 IHC를 사용 하 여 수동 TSA mIF 프로토콜의 최적화를 설명 합니다. 여기에 제시 된 업데이트 메서드는 자동된 염색기, 크게는 착 시간 단축 3-5 일에서 14 h, 또한은 얼룩의 일관성을 향상 시키는 동시에 최적화 된 상용, 일곱 색 TSA 키트를 사용 하 여 개발 되었습니다. 여기에 제시 된 세부 주요 프로토콜 뿐만 아니라 보충 자료 섹션 포함 하는 "드롭-제어" 방법, 새 mIF 패널 뿐만 아니라, 최적화에 대 한 기술 노트를 평가 하는 추가적인 품질 관리 프로세스 문제 해결, 그리고 설정 하 고 사용자 정의 mIF 패널의 mIF TSA 방법 최적화 실험실 사용자 있도록 새로운 다중 패널의 개발.
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Protocol
참고: 여기에 제시 된 프로토콜 6 항 체에 대 한 TSA를 사용 하 여 mIF 패널의 immunoprofiling를 수행 하는 방법에 설명 합니다 (CD68, ki67, PD-L1, PD-1, CD8, 및 AE1/AE3) 자동된 염색기에 ( 재료의 표참조). 프로토콜에는 새 mIF 패널의 품질 관리에 대 한 드롭 컨트롤을 수행 하는 방법을 설명 합니다 ( 보충 자료참조). 이 프로토콜을 얼룩이 지 인간의 편도 선 (긍정적인 제어)에서 8 개의 흠 없는 FFPE 슬라이드와 8 개의 흠 없는 슬라이드 인간 폐 선 암에서 수행 됩니다. 첫 번째 슬라이드 전체 멀티플렉스 모든 6 개의 마커, isotype 컨트롤에 없는 기본 항 체는 활용 하 고, 두 번째 슬라이드와 드롭 컨트롤 ( 보충 자료참조)에 대 한 나머지 6 슬라이드 얼룩에 사용 됩니다. 조직 autofluorescence에 대 한 추가 제어 좋습니다 및 멀티플렉스에 항상 포함 되어야 연구 ( 보충 자료참조). 그러나, 조사는 다른 종양 유형 및 그들의 자신의 프로젝트의 목표에 따라 컨트롤을 고용 수 있습니다. MIF TSA 메서드와 multispectral 스캐너 기술 이전 경험 없이 실험실 사용자 다중 IHC 개발 가이드를 읽어야 한다 (사용 가능한 온라인 http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp에). 이 가이드에서는 수동 프로토콜에 설명 합니다, 하지만 그것은 또한 방법 얼룩 mIF에 대 한 좋은 소개를 제공 합니다. 이 프로토콜에서 고용 하는 모든 조직 단면도 익명 그리고 헬싱키 선언에 따라 승인.
1. 조직 샘플
- 림프 증식 긍정적인 제어 및 PD L1 알려져 FFPE 인간 폐 선 암 샘플으로 사용을 포함 하는 FFPE 인간의 편도 선 샘플 선택 긍정적인. 종양의 존재를 확인 하기 위해 선택 된 폐 암 블록의 hematoxylin과 오신 (H & E) 슬라이드를 검토 합니다. 이 일반적인 배경 얼룩을 증가 수 있습니다 종양 괴 사의 풍부한 영역을 피하기 위해 중요 하다.
참고: 이 최적화에 대 한 10 년 이상 저장 된 파라핀 블록을 사용 하지 마십시오와 조직을 파라핀 블록 (조직학 기술자와 상담)에 말린 모습. - 톰을 사용 하 여, 각 블록에서 10 연속 직렬 섹션, 4 µ m 두께 절단. IHC, 슬라이드 당 한 부분에 사용 되는 충전 된 유리 슬라이드에 섹션을 탑재 합니다.
참고: 으로 주름 얼룩 아티팩트를 생성할 수 있습니다, 주름 없이 완벽 하 게 평평 섹션을 탑재 해야 합니다. 번호 1에서 10 직렬 부분의 슬라이드. - 첫 번째 섹션에 새로운 H & E 슬라이드를 준비 합니다. 블록에 남아 있는 편도 선 조직 또는 폐 종양의 존재를 확인 하는 병리학의 도움으로 H & E 슬라이드를 검토 합니다.
참고: 이 H & E 슬라이드 multispectral 분석 및 형질에 대 한 관심 영역의 선택과 함께, 나중에, 도울 수 있다. - 최대 3 개월까지 4 ° C에서 플라스틱 슬라이드 상자에 흠 없는 섹션을 저장 합니다.
2. 자동 염색기에 얼룩 프로그램 새 mIF의 창조: 등록 된 시 약의
참고: 프로토콜에 사용 하기 위해 사용할 수 있습니다 전에 시 약 시 약 목록 자동된 염색기 소프트웨어에 추가 되어야 합니다. 자동된 염색기 모델 및 소프트웨어 버전에 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
- 자동된 염색기 소프트웨어 내의 시 약 탭을 클릭 하십시오. 새로운 시를 지정 하려면 추가 클릭 합니다. 이름 (예: "520 TSA 시 약") 및 최대 8 자는 주의 약식된 이름 (예: "520 TSA"), 입력 합니다. 보조 드롭-다운 메뉴에서 선택한 공급자를 설정 합니다. 변경 하지 마십시오 싱글/더블 얼룩 단일/순차 DS에서. 얼룩 프로토콜 프로토콜 F을 기본을 설정 합니다. ER120 기본 여기 프로토콜을 설정 합니다.
- 새로운 시 약 및 표 1에 나열 된 모든 시 약에 대 한 반복 단계 2.1 저장 합니다.
3. 자동된 염색기: 컨테이너의 등록
- 각 컨테이너의 측에 사용 될 시 약의 이름을 작성 합니다. 측면에 바코드를 스캔. 팝업 창에서 목록에서 올바른 시 약을 선택 합니다. 만료 날짜를 선택 하 고 저장 합니다.
- 표 1에 나열 된 모든 시 약에 대 한 3.1 단계에서 절차를 반복 합니다.
- 등록 오픈 연구 키트. 키트 측면 모두 바코드를 스캔 하 고 따라는 화면에 나타나는 메시지. 이름을 키트 "멀티플렉스 연구 키트 1." 1 x tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) 등록-이 키트 (표 1)의 일환으로 식 염 수를 버퍼.
4. 자동된 염색기: 창조는 mIF 프로토콜 프로그램의
- 기본 다중 프로토콜은 새로운 자동화 된 stainers (참조 자료의 테이블에에서는 모델 및 소프트웨어 버전)에 오 팔 7 다중 이름으로 사전 로드 된다. 프로토콜 화면에 "선호" 대신 "모든"에 대 한 필터링을 통해 프로토콜을 찾습니다. 없으면 기본 프로토콜, 다음 제조 업체의 도움으로 자동된 염색기 소프트웨어를 업데이트 합니다.
- 모든 수정 내용이 원래 프로토콜의 복사본에서 실시 한다. 를 변경 하기 전에 원래 저장 하 고 프로토콜 탭을 클릭, 다음 오 팔 7 다중 프로토콜을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 복사를 선택 하 여 복사본을 만듭니다.
- 7 다중 프로토콜 1 새 창에서 이름을 변경 하 고 올바른 장치 (전시품 또는 벤치탑)와 관련 된 탭을 선택 합니다. 추가 테이블 s 1에서 프로토콜을 일치 합니다. 추가 시 약 10 분 과산화 효소 억제 단계 (표준 프로토콜의 일부가 아닌)을 추가 하 고 시 약으로 과산화 효소 억제제를 선택을 클릭 합니다.
- 블로킹 단계 PKI 블로킹 버퍼 활용을 확인 합니다. 각 1 차 항 체는 것 적절 한 시 약, 이차 항 체 단계는 HRP 폴리머를 활용 하 고 그 스펙트럼 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) multispectral 자동화 키트와 함께 제공 되는 사용 확인 하십시오. 프로토콜 화면에 드롭 다운 메뉴에서 각 각 단계에 대 한 지정 된 시 약을 선택 하 여 모든 선택 항목을 확인 합니다.
5. 자동된 염색기: 추가 드롭 컨트롤과 Isotype 제어 프로토콜
- 이름 7 다중 프로토콜 1 복사 하 고 1 CD68 드롭 7 다중 프로토콜변경 합니다. 마우스 IgG 를 시 약 CD68 항 체 를 변경 하 고 저장 프로토콜.
- 같은 방식으로 6 개의 새로운 프로토콜, 각 드롭 컨트롤 및 완전 한 isotype 컨트롤 (적절 한 isotypes 모든 항 체 변경)을 만듭니다.
6. 자동된 염색기: 슬라이드 준비 프로토콜
- Prestaining 프로토콜을 복사 * 빵과 Dewax Multispectral 구워 및 Dewax 2 h이이 프로토콜 이름을 바꿉니다.
- 표 2에 표시 된 시 약에 맞게 프로토콜을 조정 합니다. 60 ° c.에 2 h에 대 한 슬라이드를 구워 30 dewax 72 ° c.에 s
7. 자동된 염색기: 준비는 시 약의
- 한 연구 탐지 키트를 준비 합니다. 채우기 30 mL 오픈 컨테이너 1 x TBS 1 x Tris 버퍼 염 분 (TBS)에 대 한 표시 및 연구 탐지 키트 지정 다중 연구 키트 (핸들)에서 멀리 위치 1에서에서이 찾을 그래서 한 시 약이이 키트와 함께 영구적으로 연결 되어야 합니다. 1. 시이 약이 영구적으로이 연구 장비와 연결 되며 나중에 사용할 위치를 변경 하면 안.
- 두 개의 30 mL 오픈 컨테이너 Multispectral 블록 및 Multispectral 보조라벨. 블로킹 버퍼/희석제 multispectral 얼룩 키트에서 항 체의 30 mL로 Multispectral 블록 컨테이너를 채우십시오. Multispectral 얼룩 키트에서 안티 mouse/안티 rabbit 이차 항 체 폴리머의 30 mL로 Multispectral 보조 용기를 채우십시오.
- 10 7 mL 오픈 컨테이너를 준비 합니다. Microliters에 필요한 볼륨은 600 + (150 x [슬라이드 번호]). 각 항 체 (6 편도 선 및 6 폐)이이 경우에 12 슬라이드에 적용 됩니다. 라벨 및 모든 컨테이너에 대 한 볼륨은 표 3에 표시 됩니다.
- 각 항 체 튜브에 대 한 항 체를 추가 먼저 희석제, 뒤에 볼륨에 집중된 1 차 항 체는 표 3에 표시 된. 부드러운 pipetting으로 혼합.
- 7 mL 오픈 컨테이너 DAPI, DAPI 집중 이중 증 류 물;의 밀리 리터 당 4 개의 방울을 사용 하 여에 대 한 준비 16의 총 DAPI로 물 들일 것 이다 (600 + [150 x 16] = 3000 µ L). 컨테이너에 두 번 증 류 물의 3 mL 플러스 스펙트럼 DAPI 12 방울을 추가 합니다. 각 실행에 대 한 신선한 DAPI를 준비 합니다.
- 과산화 효소 억제제에 대 한 7 mL 오픈 컨테이너를 준비 합니다. 모든 16 슬라이드 과산화 효소 억제 물으로 취급 됩니다 (600 + [150 x 16] = 3000 µ L). 컨테이너에 과산화 효소 블록의 3 mL를 추가 합니다.
- Fluors의 작업 농도 준비 하기 전에 각 fluor 튜브 제조 업체에 의해 제공에 디 메 틸 sulfoxide의 75 µ L을 추가 하 여 동결 건조 된 모든 fluors를 resuspend. Pipetting으로 혼합. 이것은 TSA fluor 주식 이다. 4 ° c.에 게
- 각 형 석 한 6 적정 용기를 준비 합니다. Microliters에 필요한 볼륨은 350 + (150 x [슬라이드 번호]). 각 형 석 16 슬라이드 (8 편도 선 및 8 개의 폐)이이 경우에 적용 됩니다. 라벨 및 모든 컨테이너에 대 한 볼륨은 표 4에 표시 됩니다.
- 모든 시 약 등록 되어 있고 준비를 하는 경우 각 컨테이너 선반에 어떤 위치에 놓고 자동된 염색기에 모든 시 약을 로드 합니다. 프로브는 각 시의 볼륨을 확인 합니다.
8. 자동된 염색기: 샘플 설치 및 Multispectral 얼룩
-
자동된 염색기 소프트웨어에서 화면 위쪽에 슬라이드 설치를 클릭 합니다. 추가 연구를 클릭 합니다. 연구 ID, 연구 이름 및 코멘트와 함께 팝업 창을 채웁니다.
- 드롭-다운 목록에서 얼룩 실행을 수행 하는 연구원의 이름을 선택 합니다. 150 µ L에서 디스 펜스 볼륨을 둡니다. 선택 Multispectral Dewax 준비 프로토콜에 대 한. 확인 및 추가 슬라이드를 클릭 합니다. 의견, 입력 "1 폐 123ABC 멀티플렉스할." 표시 된 대로 다음 필드를 입력: 조직 유형 = 테스트 조직; 디스 펜스 볼륨 = 150 µ L; 얼룩 모드 = 단일, 일상적인; 표식 = 네거티브; 얼룩이 = 입력 "7 다중 프로토콜 1"; 준비 Multispectral 빵 = 2 h; Dewax 여기 = 여기 ER1와 20 분.
- 추가 슬라이드 를 클릭 하 고 의견 및 드롭 컨트롤 슬라이드와 isotype 제어 슬라이드를 추가 하려면 프로토콜 변경. 연구에 모든 슬라이드를 추가한 경우 추가 슬라이드 창을 닫고 레이블을 인쇄 합니다. 레이블을 적절 한 레이블 영역 각 슬라이드에 적용 됩니다.
- 랙 슬라이드 로드, 올바른 방향에서 표지 타일을 적용 자동된 염색기에 선반을 삽입 하 고 트레이 낮은. 장치는 슬라이드 레이블 검색 합니다.
- 때 모든 슬라이드와 시 약 검색 하 고 되었습니다 측정. (►) 실행된 버튼은 활성화 될 것입니다. autostainer 부족 시 볼륨, 같은 모든 오류를 감지 하는 경우 영향을 받는 트레이으로 노란색 주의 기호 표시 됩니다. 오류가 발생 하는 경우 주의 기호를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 하 고 오류 해결.
- 얼룩 즉시 시작 하거나 일정 지연된 시작 합니다. 프로토콜 기간에 약 14 h입니다. 참고: 확인 프로토콜 때 슬라이드 제거할 수 있습니다 즉시 exess 세척 얼룩 결과 영향을 수 시간에 완료 됩니다.
9입니다. Multispectral 슬라이드 Coverslipping
- 자동된 염색기에서 슬라이드를 제거 하 고 랙 1에 빠져들에 저장할 tbs. x
- No. 1.5 coverslips와 ( 재료의 표참조)는 설치 미디어의 15 µ L 샘플을 탑재 합니다. 피 펫 팁 coverslip에 부드럽게 눌러 모든 거품을 제거 합니다.
- 실험실 벤치에 실 온에서 하룻밤 치료를 슬라이드 수 있습니다. Uncured 슬라이드 주의 처리 즉시 검색할 수 있습니다.
10. multispectral 스캐너
- Multispectral 스캐너와 컴퓨터에 전원 (모델 및 소프트웨어 정보에 대 한 재료의 표 참조). 현미경 제어 소프트웨어를 시작 합니다. 장치의 전면에 터치 버튼을 누르면 multispectral 스캐너의 앞 도어를 엽니다. 각 스프링 캐리어 스캐너에는 4 개의 슬라이드를 보유 하고있다. 캐리어로 모든 슬라이드를 로드 하 고 장치에 반송파를 로드 하기 전에 순서를 기록 합니다.
- 편집 프로토콜 을 선택 하 고 뉴...; 그런 다음, 다중 패널 1과 드롭 컨트롤프로토콜 이름을 만듭니다. 멀티플렉스 패널 개발연구 이름 만들려면 프로토콜을 클릭 만들고 입력 개요 검색 필터 DAPI; 그런 다음 전체 슬라이드 스캔 및 픽셀 해상도 0.50 µ m (20 X)를선택 합니다. 모든 필터와 밴드를 대표 한다. 아니라면, 밴드 필터 편집을 클릭, 모든 5 개의 필터 (DAPI, FITC, CY3, 텍사스 레드와 CY5), 선택한 다음 노출 편집을 클릭 합니다.
- 폐 선 암의 전체 멀티플렉스와 캐리어를 선택 하 여 캐리어를 로드 합니다. 그래픽 사용자 인터페이스를 사용 하 여 올바른 슬라이드를 선택 합니다. 수동으로 또는 자동 초점을 사용 하 여 조직 초점. 허용 DAPI 얼룩과 어떤 영역으로 이동 하 고 자동 노출 노출 밀리초 단위로 설정 하려면 클릭 합니다 (0-2000 ms).
- 전체 검사와 MSI 지역 열에 모든 5 개의 필터 집합에 대해 동일한 절차를 반복 합니다. 수락 가능한 얼룩과 영역으로 이동 하 고 각 필터와 확대 수준에 대 한 노출을 설정 하기 전에 현미경을 촛점을 해야 합니다. 전체 스캔 x 20와 multispectral 이미징 (MSI) multispectral 지역 x 20에 모든 5 개의 필터에 대 한 자동 노출. 0.50 μ m (20 배)의 픽셀 해상도 선택 합니다. 프로토콜 저장 하 고 다시 Vectra 소프트웨어;의 홈 화면으로 돌아가려면 클릭 합니다 다음, 슬라이드 스캔을 클릭 합니다.
- 각 슬라이드에 대 한 인터페이스를 열고 스캔 작업 을 설정 합니다. 멀티플렉스 패널 개발에 연구 를 설정합니다, 그리고 다중 패널 1 및 드롭 다운 컨트롤, 프로토콜 을 설정합니다 하 고 다중 폐 ABC123, 멀티플렉스 CD68 드롭 폐 ABC123, 등 슬라이드 ID 설정 . 모든 슬라이드 표시 된 작업은 설정 하는 경우 검색을 클릭 합니다. 자동된 multispectral 스캐너는 모든 5 개의 필터를 사용 하 여 모든 슬라이드의 전체 슬라이드 스캔을 수행 합니다.
11. multispectral 스캐너: Multispectral 이미징
- 스캔 완료 되 면 QPTIFF 소프트웨어 ("Phenochart")을 왼쪽 상단에 로드 슬라이드 를 클릭 합니다. 이 5-필터 전체 슬라이드 스캔 QPTIFF, 열 것 이다. 각 레이어 정보가 둘 이상의 fluor에서 유틸리티는 제한 된, 하지만 조직 구조와 광범위 한 식 패턴 명백한 고 MSI에 대 한 영역을 선택 하는 데 사용 될 수 있습니다.
- 이동 하 고 왼쪽에 드롭-다운 트리를 사용 하 여 연구에서 정확한 슬라이드를 엽니다. (오른쪽 위)에 사용자의 이니셜이 로그인.
- 화면 상단에서 도장 도구 사용 하 여 MSI에 대 한 5 개 영역을 선택 합니다. 사용 가능한 경우는 병리학을 참조 하십시오. 선택, 선택 수집; 필드에는 크기, 선택 1 x 1; 그리고 필드 제한에서 0.5 µ m (20 x)를선택 합니다. Cytokeratin (CK) (주로 Cy5)에 착 색에 따라 달라 집니다, 여러 지역 종양 (CK +)와 기질 (CK-) 전반적인 검색에서 이미지를 선택 합니다. 각 슬라이드에 대해이 절차를 반복 합니다.
- 일단 모든 Msi를 선택 Phenochart 소프트웨어 닫고 Vectra 소프트웨어를 반환 합니다. 각 슬라이드에 대 한 MSI 작업 스캔 에서 변경 그리고, 다음 MSI 컬렉션을 수행 하기 위해 다시 검사 를 클릭 합니다.
12. 스펙트럼 Unmixing
참고: 스펙트럼 unmixing 단계는 채널 분리 및 슬라이드의 이미지 분석에 대 한 필요 합니다. 정보 소프트웨어에서 스펙트럼 unmixing을 수행 하기 전에 스펙트럼 라이브러리로 얼룩진 각 fluor와 DAPI 혼자 혼자 폐 선 암 슬라이드를 사용 하 여 건설 한다. 이 절차는 상기 다중 IHC 분석 결과 개발 가이드에도 설명 되어 있습니다.
- MSI 인수 완료 되 면 스펙트럼 unmixing (이 하 "정보") 소프트웨어를 사용 하 여 MSI 폴더에 있는 파일을 열려면. 이러한 파일은.im3 파일 형식 확장명에 끝.
- 이미지 형식에서 선택 Multispectral; 샘플 서식에서 선택 형광; 스펙트럼 라이브러리 소스에서 정보를 선택 하 고.
- Fluors를 선택 하려면 선택 하 고 내장 폐 선 암 도서관 슬라이드 라이브러리에서 모든 6 개의 fluors와 DAPI를 로드 합니다. 모든 준비 (왼쪽 아래)를 클릭 합니다. 스펙트럼 unmixing 소프트웨어 제공된 스펙트럼 프로필을 사용 하 여 모든 오픈 이미지에 스펙트럼 unmixing 수행 합니다.
- 병리학 자와 같은 조직의 순차적 슬라이드에 동일한 대상의 비 단일 얼룩에 대 한 얼룩 패턴을 평가 합니다.
13. 형광 강도 및 신호 감쇄의 평가
참고: 으로 나타나는 작은 갈색 상자와 화살표, 카운트 도구 다중 최적화를 위한 가장 중요 한 도구 이며 자주 사용 한다 ( 보충 자료참조). 계산 도구를 사용 하 여 스펙트럼 unmixing 소프트웨어에, 평가 최소 10:1 (문제 해결 및 드롭 컨트롤과 얼룩 멀티플렉스의 평가 대 한 보충 자료 참조)를 초과 한다 신호 대 잡음 비율.
- 13.1. 이미지 스펙트럼 unmixing 소프트웨어에 오픈, 카운트 도구 교전을 각 채널의 형광 강도 평가 하기 위해 이미지를 조사. 폐 조직에 대상 강도 10 및 20 정규화 된 수 사이입니다. 정규화 된 계산 도구는 그림 1에 표시 됩니다.
- Autofluorescence 및 오프 대상 얼룩 정통 신호와 경쟁 하지 않습니다 있도록 최대 신호 카운트의 모든 표식에 대 한 미만 5 미만 10 또는 정상적인 신호 지역의 슬라이드를 제외 합니다.
- 최대 제외 슬라이드 30 스펙트럼 출혈 또는 비효율적인 스펙트럼 unmixing 방지 하려면 어떤 채널에 대 한 보다 큰 계산 합니다.
- TSA 농도 조정 하 여 높은 또는 낮은 정규화 된 카운트를 주소.
14. multispectral 이미지 분석
- 하나 이상의 MSI를 스펙트럼 unmixing 소프트웨어 에서 열고 unmixing을 위한 유일한 선택 fluors 하나 이상의 오픈 이미지에 표시 됩니다. 모든 준비 unmix 괴기 하 게 순수한 이미지를 모든 현재 열린된 컬러 이미지를 클릭 합니다.
- 관심의 영역 위로 이동 하 여 각 이미지에 걸쳐 건의 조사를 조사 도구를 선택 합니다.
- 눈 아이콘 보기 편집기를 열려면 선택 합니다. 선택 하 고 각 채널의 디스플레이 강도 조정 합니다.
- 구성 조직 세분화, 셀 분할, 형질, 및 득점 모듈을 열려면 선택 합니다. 이러한 도구 비 단일 얼룩에 얼룩이 멀티플렉스의 객관적인 유효성 검사에 필요한 고 양적 phenoptic 데이터 (그림 S1)를 생성 하기 위해 사용할 수 있습니다.
- 회색, 형광을 저장 하려면 내보내기 탭, pathview-스타일 비압축 TIFF 및 phenoptic 분석 모듈에서 데이터 파일을 사용 하 여 추가 분석, 보관 및 프레 젠 테이 션 (그림 S1)에 대 한.
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Representative Results
여기에 설명 된 프로토콜은 그림 2에 표시 된 것과 같은 결과 제공할 것입니다. 편도 선 컨트롤, 표면 편평 세포 상피로 시작에 얼룩의 평가로 시작 합니다. 편도 선 샘플의 조직학 병리학 자, H & E 슬라이드를 참조 하 여 함께 검토할 수 있습니다. 비 IHC 섹션을 동일한 조직 블록에 동일한 표식으로 수행 하 고, 다음이 사용할 수 있습니다 밀도 및 mIF 슬라이드에 각 마커의 유통 확인 하. 그림 2A같이 편도 선 조직 명확 하 게 정의 된 AE1/AE3 cytokeratin 편도 선 표면 편평 상피에 얼룩을 제공 해야 한다 (그림 2A; 빨간 모조 색상으로 표시), 림프는에 배경 없이 조직입니다. 얼룩 세포질 막 음의 억양 법와 때때로 고 핵 제외 되어야 합니다. 지하실에 reticulated 상피 cytokeratins (빨간색)와 PD-L1 (그림 2A; 녹색 모조 색상)에 대 한 긍정적인 되어야 합니다. 편도 선의 follicular 어린 싹 센터, 식별 합니다. 어린 싹 센터 쉽게 인식할 수 있어야 하 고 풍부한 기-67-긍정적인 세포 (그림 2A; 노란색 모조 색상) 이어야 한다. 기-67 얼룩 항상 핵 이어야 한다입니다. 대 식 세포는 어린 싹 센터에도 쉽게 인식할 수 있는, 때로는 더 큰 셀 ("tingible 시체" 라고도 함)로 해야 합니다. 그들은 CD68에 대 한 (그림 2A; 오렌지 모조 색상)과 립 상 세포질 얼룩으로 얼룩이 긍정적인 표시 됩니다. 어린 싹 센터 외부 CD68 셀의 가변 비율 예정 이기도 합니다. 세포 막 PD L1에 얼룩이 나타날 수 있습니다. 이것은 일반적으로 강도에 reticulated 상피에 PD L1에 얼룩이 보다 더 창백한입니다. 아니 핵 CD68 해야 얼룩. CD8 T 세포의 분포와 세포 얼룩 한다 (어린 싹 센터 및 interfollicular 지역;에서 더 큰 비율에 적은 그림 2A, 시안색 모조 색상 참조). CD8 + 세포 부족 한 세포질, 일반적으로 작은 셀 되므로 그것은 막 대 세포질 세포에서 구별 하기 실제적으로 불가능 합니다. PD-1 (그림 2A; 마젠타 모조 색상), 본 원 센터의 주변에 일반적으로 클러스터 된 어린 싹 센터 지역에서 작은 세포 얼룩 강하게 것으로 보통 세포 interfollicular 지역에 흩어져 어린 싹 센터 지역에 비해 낮은 착 강도 표시. CD8, 것과 같이 명확 하 게 구별 막 PD-1 물 작은 세포에서 세포질 얼룩 수는. CD8 세포의 가변 비율 coexpress PD-1, 때문에 것이 좋습니다 얼룩 패턴 및 배포 같은 조직에 얼룩진 각 마커의 제안 비 IHC 참조 슬라이드와 비교 될 품질 제어 목적 이전에 게시 프로토콜12.
예상된 얼룩 패턴 편도 선 조직 제어에 확인 된, 후 폐 암 샘플 (그림 2B)에서 얼룩을 평가를 진행 합니다. 종양 조직 마커 변수 및 이기종 표현의 표시 예상 된다, 때문에 그것은 매우 중요 동안 mIF 방법과 그 표현에서 각 개별 마커 얼룩 패턴을 비교 하는 새 mIF 패널의 최적화 표준 발 IHC 슬라이드, 수량 및 앞에서 설명한12긍정적인 세포의 분포에서에서 관찰 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 기본적인 얼룩 패턴을 유지 한다; 상피 세포의 세포질 그리고 핵; 결코 cytokeratins는 관찰 해야 합니다 예를 들어 CD68 세포, 세분화 된 세포질 얼룩으로 표시 등. 중요 한 것은, 일부 표식에서 착 강도를 변경할 수 있습니다 편도 선 컨트롤에서 암 조직; 예를 들어 PD-1과 PD L1 낮은-강도 매우 높은 식 편도 선 제어에 비해 종양 조직에 얼룩을 표시할 수 있습니다. 그것은, 따라서, 종양 조직 보다는 편도 선 컨트롤의 예제를 사용 하 여 정보 소프트웨어에서 평가 및 계산 도구로 최적화를 수행 하는 것이 중요.
마지막으로, isotype 음수가 컨트롤 및 드롭 컨트롤 배경 및 autofluorescence의 검출을 위한 뿐만 아니라 우산 효과 스펙트럼 출혈 (그림 3 및 그림 4)에 대 한 평가를 해야 합니다. Isotype 컨트롤 슬라이드;에서 어떤 immunostaining를 입증 해야 어떤 얼룩을 관찰 하는 경우 다음는 이미징 또는 프로시저 얼룩 해야 합니다 되어야 재검토. 드롭 컨트롤은 잠재적인 아티팩트는 얼룩, 새로운 다중 패널의 최적화 하는 동안 mIF 메서드 인해 스펙트럼 도련 또는 우산 효과 등을 평가 하는 것이 중요 ( 그림 5, 그림 S2 보충, 참조 보충 그림 S3, 및 보충 자료). 형광 수염 및 드롭 컨트롤 평가 하 고 전체 다중 패널와 비교 해야 합니다. 각 드롭 컨트롤 각 특정 컨트롤에 제거 한다 단일 기본 항을 제외 하 고 동일한 얼룩 패턴을 표시 합니다. 자세한 내용은 보충 자료 섹션에서 제공 됩니다.
그림 1 : 계산 도구 정보. 정보 소프트웨어 계산 도구는 베이지색 상자 아이콘을 선택 하 여 활성화 됩니다. 정규화 된 계산 비트 심도, 노출 시간, 이득, 및 범주화에 대 한 수정 됩니다. 이미지 20 배 확대;에서 찍은 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 대표적인 결과. 편도 선 (A)와 (B) nonsmall-세포 폐 암은 물 들일 PD L1 (520 TSA, 녹색), CD8 (540 TSA, 청록색), Ki67 (570 TSA, 노랑), CD68 (620 TSA, 오렌지), cytokeratin (650 TSA, 레드), 및 PD-1 (690 TSA, 자홍). 개별 채널은 작은 패널에서 아래 별도로 표시 됩니다. 마커는 각 이미지의 오른쪽 상단에 표시 됩니다. 이미지 20 배 확대;에서 찍은 눈금 막대 = 50 (또는 250 µ m). A 1는 패널에 표시 된) 림프 여 포, 2) 새싹 센터, 3) interfollicular 지역, 및 4) 층 화 편평 상피. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : TSA 차단/우산 효과. 이 방식으로 현재 TSA의 금액에 따라 PD-1 항 체 차단 CD3 신호에서 690 TSA의 예입니다. 밝은 690 TSA 신호 620 TSA 신호를 가장 효과적으로 차단 (nonsmall 세포 폐 암 물 0.52 µ g/mL 또는 isotype 1: 100; 다음, 안티-CD3 F7.2.38 0.14 µ g/mL에서 30 분에서 10 분 690 TSA 검색 뒤에 30 분에 대 한 안티-PD-1 D4W2J 다음 1: 100에 10 분 620 TSA 검색). 이미지 20 배 확대;에서 찍은 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 스펙트럼 도련. Nonsmall-세포 폐 암 조직 기-67 드롭 제어 프로토콜 (기-67 항 체 생략으로 완전 한 다중 프로토콜)와 스테인드 했다. 540 TSA 채널 (CD8)와 570 TSA 채널 (기-67) 표시 됩니다. 핵 얼룩 패턴은 분명 아직 패턴을 얼룩이 지는 CD8의 저하 복사본 570 TSA 채널에서 관찰 됩니다. 이 모든 채널에 비해 착 색 농도 함으로써 최고의 해결 됩니다. 이 경우에, 강력한 기-67 신호 (표준화 된 카운트 10와 20 사이)의 추가 스펙트럼 피를 수정 합니다. 이미지 20 배 확대;에서 찍은 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 컨트롤. 이 그림의 전체 복합 이미지 다중 폐 선 암 드롭 컨트롤과 지정 된 기본 항 체 생략 되었다 스테인드의 순차적 슬라이드의 같은 지역에 비해. 이미지 20 배 확대;에서 찍은 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 이름 | 약식 이름 | 유형 | 컨테이너 | 그룹 |
| PKI 차단 버퍼 | OPALBLOK | 보조 | 오픈 30 mL | 일반 |
| 오 팔 폴리머 HRP | 오 팔 2AB | 보조 | 오픈 30 mL | 일반 |
| 오 팔 1 x TBS | OPAL1TBS | 보조 | 오픈 30 mL | 외교 키트 |
| CD68 0.30 µ g/mL PG M1 뮤 스 | OPALCD68 | 보조 | 오픈 7 mL | 일반 |
| ki67 0.61 µ g/mL MIB-1 머 스 | OPALki67 | 보조 | 오픈 7 mL | 일반 |
| PD-L1 0.20 µ g/mL SP263 랩 | OPALPDL1 | 보조 | 오픈 7 mL | 일반 |
| PD-1 0.52 µ g/mL D4W2J 랩 | 오 팔 PD1 | 보조 | 오픈 7 mL | 일반 |
| CD8 0.70 µ g/mL SP239 랩 | 오 팔 CD8 | 보조 | 오픈 7 mL | 일반 |
| CK 0.24 µ g/mL AE1/AE3 머 스 | 오 팔 CK | 보조 | 오픈 7 mL | 일반 |
| 마우스 IgG | 오 팔 머 스 | 보조 | 오픈 7 mL | 일반 |
| 토끼 IgG | 오 팔이 랩 | 보조 | 오픈 7 mL | 일반 |
| 오 팔 과산화 효소 블록 | OPALPERX | 보조 | 오픈 7 mL | 일반 |
| 스펙트럼 DAPI | OPALDAPI | 보조 | 적정 6 mL | 일반 |
| 오 팔 520 시 약 | 오 팔 520 | 보조 | 적정 6 mL | 일반 |
| 오 팔 540 시 약 | 오 팔 540 | 보조 | 적정 6 mL | 일반 |
| 오 팔 570 시 약 | 오 팔 570 | 보조 | 적정 6 mL | 일반 |
| 오 팔 620 시 약 | 오 팔 620 | 보조 | 적정 6 mL | 일반 |
| 오 650 팔 시 약 | 오 팔 650 | 보조 | 적정 6 mL | 일반 |
| 오 팔 690 시 약 | 오 팔 690 | 보조 | 적정 6 mL | 일반 |
표 1: Leica 본드 RX 프로토콜, 오 팔 시 약
| 시 약 | 시간 (h) | 온도 (섭씨도) | |
| 1 | 아니 시 약 | 120:00 | 60 |
| 2 | 채권 솔루션 Dewax | 0:30 | 72 |
| 3 | 채권 솔루션 Dewax | 0:00 | 72 |
| 4 | 채권 솔루션 Dewax | 0:00 | 주위 (실내 온도) |
표 2: 오 팔 준비 프로토콜
| 대상 | µ g/mL | 클론 | 소스 | 많은 | 재고 µ g/mL | µ L 희석제 | Μ L AB |
| CD68 | 0.3 | PG-M1 | Dako | 20043031 | 30 | 2376 | 24 |
| ki67 | 0.61 | MIB-1 | Dako | 20049476 | 46 | 2368.17 | 31.83 |
| PD-L1 | 0.2 | SP263 | 환기입니다. | F09591 | 1.61 | 2101.86 | 298.14 |
| PD-1 | 0.52 | D4W2J | 중부 표준시 | 1 | 100 | 2387.52 | 12.48 |
| CD8 | 0.7 | SP239 | Ventana | 160318 | 70 | 2376 | 24 |
| CK | 0.24 | AE1/AE3 | Dako | 10129428 | 179.5 | 2396.79 | 3.21 |
| 머 스 IgG | 0.61 | ||||||
| 랩 IgG | 0.7 |
표 3: 1 차 항 체 준비입니다.
| 오 팔 형 석 | 슬라이드 | 희석 | µ L 희석제 | µ L 오 팔 형 석 |
| 오 팔 520 | 16 | 1: 200 | 2736.3 | 13.8 |
| 오 팔 540 | 16 | 1:700 | 2746.1 | 3.9 |
| 오 팔 570 | 16 | 1:150 | 2731.7 | 18.3 |
| 오 팔 620 | 16 | 1: 100 | 2722.5 | 27.5 |
| 오 팔 650 | 16 | 1:350 | 2742.1 | 7.9 |
| 오 팔 690 | 16 | 1:150 | 2731.7 | 18.3 |
표 4: 오 팔 형 석 준비입니다.
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보충 표 2: 요약 및 전체 멀티플렉스, 드롭 컨트롤 및 전체 isotype 컨트롤의 비교. 이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
지속적인 암 immunotherapy 혁명은 오프닝 소설과 유망 암 환자13에 대 한 치료 옵션. 면역-종양학 분야에서 발전 새로운 예측 생체를 찾을 뿐만 아니라 발암에 관여 하는 면역 메커니즘의 생물학을 이해 하는 것 뿐만 아니라 염증 성 종양 microenvironment의 증가 지식 필요 합니다. immunotherapy 기반 치료1,2. 때문에 암 면역학의 복잡 한 생물학, 종양 조직 샘플의 심문 일반적으로 하는 데 필요한 면역 표식, 서로 상호 작용 하 고 자주 조직1에에서 다양 한 세포 인구에 의해 coexpressed의 성장 목록을 개발합니다 ,,25. 임상 시험 일반적으로 작은 biopsies 코어 바늘 또는 평가 하 고 환자 반응을 모니터링 치료의 다른 지점에서 수집 되는 내 시경 생 검 등을 사용 합니다. 이러한 biopsies 제한 된 양의 조직, 차례 차례로 암 immunoprofiling에 대 한 사용할 수 있는 조직 단면도의 수를 제한 제공 합니다. 이 제한은 표준 수염 IHC, 같은 전통적인 기술을 사용 하는 경우 특히 성가신입니다. 저기, 따라서 명확한 필요 암에 대 한 새로운 방법을 하는 immunoprofiling 사용 용량 다중 기술을 동시에 다른 biomarkers의 coexpression를 평가 하 고 가치 있는 조직 표본 보다 효율적으로 사용할 수 있도록.
멀티플렉스 얼룩 및 여기에서 설명 하는 multispectral 이미징 방법, mIF 패널 면역-종양학 연구 임상 실험에서 생 검 같은 FFPE 직물에 사용 됩니다. 이 메서드는 앞에서 설명한, 검증, 및 암 immunoprofiling8,,910,11,,1214, 에 성공적으로 적용 15. 이전에 게시 프로토콜 비슷한 mIF 얼룩 TSA 기반 시스템 전용된 실험실 과학자12 작업의 약 4 일 하며 소모는 7 색 키트와 방법 설명 15. 이러한 단점에 대응,이 프로토콜은 상용 자동된 염색기, 극적으로 단축 14 h 시간을 얼룩이 지 고 제거 수동 연산자에 의해 소개 하는 다양성을 사용 하 여 최적화 되었습니다. 영상 신호 품질 저하 없이 효율적으로 제거 될 수 있는 autofluorescence를 포함 한 다중 슬라이드에 7 개 이상의 형광 신호의 스펙트럼을 분리 수 있는 multispectral 스캐너에 실시 됩니다. 이 프로토콜은 복제, 수정, 고 악기와 시 약 재료의 테이블에있는 실험실 사용자에 의해 수행 될 수 있습니다.
이 프로토콜의 중요 한 단계는 섹션 7, 10, 11, 12. 7 시 약의 준비에 적용 됩니다. 멀티플렉스 얼룩에 시 약의 주의 준비는 연산자 종속 변형 방지 실험실 과학자 또는 기술자의 관심을 집중된 필요로 필수 이다. 예를 들어, 변화, 시 약, 특히 TSA 염료의 희석의 주의 깊은 준비로 감소 될 수 있다 얼룩는 멀티플렉스 방법으로 주요 문제 중 하나. 섹션 10 및 11 이미지 수집을 관련이 있습니다. 중요 한 위험 인지 과도 스펙트럼 도련, 아티팩트는 다른 채널에서 신호 방해 되 고 몇 군데 채널을 이어질 수 있습니다 이미지의 oversaturation ( 보충 자료참조). 조심 스럽게 노출 시간 조절 oversaturation 및 스펙트럼 출혈을 방지 하기 위해 수 있습니다. 스펙트럼 unmixing 섹션 12에에서 실시 됩니다. 이 스펙트럼 라이브러리 (가이드에 설명 된는 멀티플렉스 IHC 분석 결과 개발, 사용 가능한 온라인)의 준비에 사용 합니다. 이 단계에서는 정보 소프트웨어는 "훈련" 특별히 각 TSA 염료에 대 한 색상을 인식. 스펙트럼 라이브러리 인간의 편도 선 등 컨트롤 조직에서 섹션을 사용 하 여 만든, CD20 등 균일 하 게 표현된 표식으로 물, 개별 슬라이드에 각 개별 TSA 염료와 결합. 또한, autofluorescence 슬라이드 (또한 멀티플렉스 IHC 분석 결과 개발 가이드에 설명 된)는 인식 하 고 조직 autofluorescence 빼기 알려주는 소프트웨어 훈련 필요 합니다. Autofluorescence 제어 슬라이드 한다 (예: 폐 암, 등) 공부 되 고 동일한 조직에서 샘플을 사용 하 여 준비, mIF 슬라이드도 같은 방식에서으로 처리 되며 1 차 및 이차 항 체 하지만 TSA 염료 없이 알을 품. 않으므로 주의 해야 합니다 콜라겐, 섬유 증, 적혈구, 내 인 성 안료 및 기타 소스에서 올 수 있는 관찰 autofluorescence의 표현을 선택 하는 단일 autofluorescence 스펙트럼 프로필을 선택할 수 있습니다. 각각의 새 프로젝트의 시작 부분에 새로운 스펙트럼 라이브러리를 만들기와 조직 연구 표본의 대리인 autofluorescence 스펙트럼을 사용 하 여 뿐만 아니라 같은 프로젝트 내에서 각 일괄 처리에 대 한 긍정적인 통제 같은 조직 블록 실행 가치 방법론 단계는 스펙트럼의 일관성을 개선 하기 위해 도움이 될 것입니다 동일한 프로젝트 내에서 서로 다른 샘플에 걸쳐 unmixing는.
이 프로토콜에서 설명 하는 다중 방법을 신호 대 잡음 계산 (계산 도구), 드롭 컨트롤 (보충 자료), 그리고는 얼룩의 품질 관리에 대 한 병 리 보기를 포함 하 여 몇 가지 문제 해결 도구를 제공 합니다. 카운트 도구는 얼룩의 강도와 배경 수준 평가에 도움이 됩니다. 강도 및 배경 수준이 높은 경우, 첫 번째 방법은 TSA 염료의 희석을 줄이는 것입니다. 문제가 지속 되는 경우 해당 특정 표시의 최적화에 사용 하는 비 IHC 슬라이드 병리학 자, 백그라운드의 존재에 대 한 보고와 함께 검토 되어야 한다. 병 리 뷰는 TSA 연결 fluor에서 형광의 diaminobenzidine와 같은 모조 색상 표현 뿐만 아니라 DAPI를 포함 한 모든 형광 신호에서 생성 된 가짜 되며 표현을 사용 하 여 정보 소프트웨어에 의해 생성 됩니다. . 병 리 보기에서 이미지는 병리학 자에 의해 얼룩 패턴의 시각적 평가 향상 된 얼룩에 대 한 도움이 됩니다. 이러한 도구 항상 얼룩 워크플로 중 최적화는 새로운 패널의 그리고 품질 관리 단계 동안 고용 해야 합니다.
MIF 방법 제대로 확인 및 표준 발 IHC 조직 포 르 말린 고정에 대 한 최적화 된 기본 항 체의 사용을 해야 합니다. 예를 들어, mIF TSA 방법의 주요 장점 중의 호환성 검증 및 임상 사용12에 대 한 해 부 병 리 실험실에서 최적화 된 기본 항 체의 사용을 이다. 이 장점은 다중 패널을 신속 하 고 동적 패널 개발을 제공 하는 preconjugated 항 체에 대 한 필요 없이 특정 암 면역학 질문에 답변을 실험실 사용자의 사용자 지정할 수 있습니다 의미 합니다. 이와 관련, 새로운 패널의 최적화에 대 한 실제 워크플로 유효성 검사와 표준 발 IHC, 최고의 희석에 대 한 보고 하 고 깨끗 하 고 일관 된 조건을 제공할 것입니다 얼룩과 항 체의 최적화 시작 얼룩. IHC, 최적화 같은 희석을 사용 하 여 다음 단계는 diaminobenzidine 대신 TSA fluors를 사용 하 여 얼룩을 전송 하 고 수염의 결과 비교 기준으로 비 IHC와 immunofluorescent TSA. 마지막으로, 항 체는 mIF TSA 얼룩 매개 변수를 조정, 주로 TSA 염료 희석 및 얼룩 시퀀스 발 IHC 컨트롤 참조 패턴을 얼룩이 지를 사용 하 여 항상 mIF 얼룩에 결합할 수 있습니다. 이 과정 동안, 협력 병리학 자는 얼룩이 지기의 품질을 평가 수단 이다.
이 기술의 한계는 최적화 및 새로운 패널의 유효성 검사 및 mIF 패널의 immunophenotyping 분석에 필요한 노력과 시간을 포함 합니다. 그러나 주요 관심사는, mIF 메서드의 적절 한 유효성 검사입니다. 이러한 기술의 적절 한 유효성 검사 부족 암 면역학16의 생물학의 더 나은 이해를 얻기 위해 시도 방해 함으로써 문학에 혼란 데이터를 추가할 수 있습니다 잘못 된 결과 생성의 위험을 운반 합니다. 그것은, 그러므로,에 가까운 참여 및 병리학 교육 및 유효성 검사에는 경험에 의해 평가 및 조직 평가 등 멀티플렉스 방법의 유효성을 올바르게 검사 하도록 모든 노력을 조사 histopathology 그리고 IHC 기반 기술17,18,,1920. 여기에 제시 된 프로토콜을 얼룩이 지 고 분석, 비 IHC mIF TSA를 최적화에 대 한 참조로 사용 하기 전에 H & E 슬라이드의 병리학 평가 포함 하 여 새로운 다중 패널의 유효성 검사와 함께 도울 수 있는 도구 중 일부 포함 얼룩, 새로운의 품질 관리에 대 한 드롭 제어 방법 다중화 패널과 isotype, autofluorescence, 사용 하 고 컨트롤. MIF 방법의 기술적인 복잡성에도 불구 하 고 다른 소설 다중 플랫폼 뿐만 아니라 스펙트럼 unmixing와 multispectral 이미징 등 기술 환자에서 조직 표본의 분석 및 새로운 형태의 생성을 위한 새로운 시대를 여는 데이터의 그건 표준 IHC 혼자 가능. 따라서, 개발 및 mIF 기술의 응용 계속 증가할 것 이다, 임상 시험 및 immunotherapy에 대 한 새로운 multiparametric 예측 바이오 마커를 식별 하는 데 도움에 대 한 검의 암 immunoprofiling에 대 한 강력한 도구가 되 고 혜택, 무엇 보다도 암 환자.
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Disclosures
이 작품은 MedImmune, 글로벌 biologics R & D 팔 아 스 트 라의에 의해 지원 되었다. C.W., K.R., 및 C.C.H.는 Perkin Elmer (TSA kit) 시 약을 생산 하 고이 작품에 사용 했던 multispectral 스캐너의 직원이 있습니다. 석사, K.D., 아, W.Z., C. Bagnall, C. 브라운, J.C., 앨 러 배 마, 캔사스, M.R., 및 J.R.C.는 주식 소유권 및 재고 관심사 또는 아 스 트 라 옵션 MedImmune의 직원.
Acknowledgments
편집 지원 MedImmune의 데보라 Shuman에 의해 제공 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
References
- Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
- Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).
- Idikio, H. A. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).
- Rebelatto, M. C., et al. Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma. Diagnostic Pathology. 11 (1), 95 (2016).
- Parra, E. R., et al. Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors. Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).
- Rehman, J. A., et al. Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer. Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).
- Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47 (2015).
- Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48 (2018).
- Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. Unvalidated antibodies and misleading results. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).
- Baskin, D. G., Hewitt, S. M. Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).
- Freedman, L. P., et al. The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices. Biotechniques. 61 (1), Letter to the Editor 16-18 (2016).
- Hewitt, S. M. Reproducibility: it is just good science. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223 (2016).
- Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
