Summary
Um protocolo detalhado para um painel de seis-marcador multiplex imunofluorescência é otimizado e executado, usando um corante automatizado para resultados mais consistentes e um menor tempo de procedimento. Esta abordagem pode ser adaptada directamente por qualquer laboratório de estudos imuno-oncologia.
Abstract
Evolução contínua em imuno-Oncologia exige uma maior compreensão dos mecanismos da imunologia do câncer. A análise de immunoprofiling de amostras de tecido de biópsias de formalin-fixas, parafina (FFPE) tornou-se uma ferramenta-chave para entender a complexidade da imunologia do tumor e descobrir novos biomarcadores preditivos para imunoterapia. Immunoprofiling análise de tecidos requer a avaliação de marcadores combinadas, incluindo subpopulações de células inflamatórias e imunes, pontos de verificação, o microambiente do tumor. O advento de métodos de imuno-histoquímica multiplex romance permite uma análise mais eficiente Multiparamétrico de seções do tecido único do que o padrão monoplex imuno-histoquímica (IHC). Uma imunofluorescência multiplex comercialmente disponível (se) método é baseado na amplificação do sinal de tyramide e, combinado com a análise microscópica multiespectral, permite uma melhor separação de sinal de diversos marcadores no tecido. Esta metodologia é compatível com o uso de anticorpos primários unconjugated otimizadas para IHC padrão em amostras de tecido FFPE. Neste documento descrevemos detalhadamente um protocolo automatizado que permite multiplex se rotulagem de amostras de tecido de carcinoma, com um painel de seis-marcador anticorpo multiplex compreendendo PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67 e citoqueratinas AE1/AE3 com 4, 6-diamidino-2-phenylindole como um corante de contraste nuclear da célula. O protocolo de painel multiplex é otimizado em um corante IHC automatizado para um tempo de coloração que é mais curta que a do protocolo manual e pode ser diretamente aplicado e adaptado por qualquer investigador do laboratório de estudos imuno-oncologia em amostras de tecido humanos FFPE. Também descritos são vários controles e ferramentas, incluindo um método de gota-controle para controle de qualidade fino de um novo painel se multiplex, que são úteis para a otimização e validação da técnica.
Introduction
Immunoprofiling análise de amostras de tecido de tumor FFPE tornou-se um componente essencial de estudos imuno-oncologia, particularmente pela descoberta e validação de novos biomarcadores preditivos para imunoterapia no contexto dos ensaios clínicos1 ,2. IHC cromogênico, usando chromogens químicas tais como diaminobenzidina, continua a ser a técnica padrão no diagnóstica patologia para o immunolabeling de biópsia de tecido3. IHC padrão também pode ser usado para immunoprofiling de tecido de câncer, incluindo a quantificação de subpopulações de linfócitos tumor-associado e a avaliação dos níveis de expressão de pontos de verificação imunes como ligante de morte celular programada 1 (PD-L1)4 ,5. IHC padrão é limitada, no entanto, em que apenas um antígeno pode ser rotulado por seção de tecido. Immunoprofiling estudos normalmente requer a análise da expressão combinada de vários marcadores, o uso do IHC padrão exigiria a coloração das várias secções de tecido, cada uma manchada com um marcador único e, portanto, seria substancialmente limitado para a análise de amostras de tecido pequenas tais como biopsias de agulha. Métodos padrão de IHC também são limitados para a avaliação de marcadores que são coexpressed por populações de diversas células, como é comum com marcadores de ponto de verificação imune como PD-L1, que é expressa pelo tumor-associado de macrófagos e células cancerosas. Essa limitação tem sido relatada em, por exemplo, o uso do padrão monoplex IHC por patologistas para análise quantitativa de um marcador IHC expressado pela célula diversos tipos6. O desenvolvimento de técnicas IHC cromogênico multiplex empregando diversas chromogens coloridas sobre o mesmo tecido seção representa um avanço sobre o método padrão de IHC monoplex,7 embora permaneçam limitados pelo immunolabeling de poucos marcadores e também apresentar um desafio técnico importante para a avaliação adequada dos marcadores expressado nos compartimentos subcellular mesmos das mesmas populações de células.
Os detalhes acima mencionados sobre a disponibilidade de tecido de amostras clínicas, bem como as limitações das técnicas IHC cromogênica multiplex, deram origem à necessidade de desenvolver métodos aperfeiçoados de multiplex imuno-Oncologia estudos baseados em etiquetando fluorescente combinado com sistemas que podem efetivamente separar os sinais de vários fluorophores mesmo slide de imagens. Uma tal técnica é baseada na amplificação do sinal de tyramide (TSA) combinada com imagens multiespectrais de microscopia para cor eficiente separação8. Um kit comercialmente disponível com base em TSA emprega fluorophores otimizado para geração de imagens multiespectrais8 (ver Tabela de materiais). Uma vantagem importante deste sistema é a sua compatibilidade com os anticorpos primários sem rótulo mesmos que já tenham sido validados e otimizado para padrão cromogênico IHC9,10,11. Isto permite não só a otimização mais rápida, mas também a flexibilidade nas modificações de otimização e painel incorporando novos destinos. Além disso, o método TSA multiplex imunofluorescência (mIF) pode ser otimizado para comercialmente disponíveis sistemas automatizados de corante IHC, permitindo para uma simples transferência de monoplex cromogênico IHC a mIF.
Aqui nós apresentamos um protocolo para um painel do Fumin para estudos imuno-Oncologia baseado em automatizada do Fumin TSA coloração e usa um scanner multi-espectral para a imagem latente. Este protocolo pode ser adaptado e modificado por qualquer usuário do laboratório com acesso à instrumentação descrita e reagentes. O protocolo inclui um painel de seis anticorpos primários para o immunoprofiling de carcinomas: PD-L1, PD-1, CD68 (como um marcador de pan-macrófago), CD8 (células T citotóxicas), Ki-67 e AE1/AE3 (pancitoqueratina, usado como um marcador epitelial para a identificação de células de carcinoma). Um estudo recente descreve a otimização de um protocolo de mIF TSA manual usando IHC cromogênico como um padrão de referência para validar os cinemas coloração12. O método atualizado aqui apresentado foi desenvolvido usando um kit TSA comercialmente disponível, sete cores otimizado em um corante automatizado, drasticamente, encurtando o tempo coloração de 3 – 5 dias para 14 h, melhorando também a consistência da coloração. Além do protocolo principal detalhado apresentado aqui, uma seção de Materiais complementares inclui o método de "gota-control", um processo de controle de qualidade adicional para avaliar um novo painel de mIF, bem como notas técnicas de otimização, solução de problemas e desenvolvimento de novos painéis multiplex para ajudar o usuário de laboratório para configurar e otimizar o método TSA do Fumin para painéis personalizados do Fumin.
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Protocol
Nota: O protocolo aqui apresentado descreve como executar o immunoprofiling de um painel de mIF usando TSA para seis anticorpos (CD68, ki67, PD-L1, PD-1, CD8 e AE1/AE3) em um corante automatizado (ver Tabela de materiais). O protocolo também descreve como executar os controles de gota para um controle de qualidade de um novo painel de mIF (ver Materiais suplementares). Neste protocolo, a coloração é realizada com oito slides FFPE imaculados da amígdala humana (controle positivo) e oito slides imaculados de adenocarcinoma do pulmão humano. O primeiro slide é usado para multiplex completo mancha com todos os seis marcadores, o segundo slide para o isotipo controle no qual não há anticorpos primários são utilizados e os restantes seis slides para os controles de gota (ver Materiais suplementares). Um controle adicional para tecido autofluorescência é altamente recomendado e devem sempre ser incluído em um multiplex estudar (ver Materiais suplementares). No entanto, os investigadores podem empregar outros tipos de tumor e controles de acordo com seus próprios objetivos do projeto. Laboratório os usuários sem experiência prévia com o método TSA do Fumin e técnicas multispectral scanner devem ler o guia de desenvolvimento de IHC Multiplex (disponível online em http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp). Embora este guia descreve um protocolo manual, ele também fornece uma boa introdução para o Fumin método de coloração. Todas as secções de tecido empregadas no presente protocolo foram anonimizadas e aprovadas de acordo com a declaração de Helsinque.
1. amostras
- Seleccionar uma amostra de amígdala humana FFPE contendo hiperplasia linfoide para ser usado como um controle positivo e uma amostra de adenocarcinoma de pulmão humano FFPE conhecido por ser o PD-L1 positivo. Revise os slides hematoxilina e eosina (H & E) dos blocos de câncer de pulmão selecionado para confirmar a presença de um tumor. É importante evitar tumores com abundantes áreas de necrose, como isso pode aumentar a coloração de fundo específico.
Nota: Para essa otimização, evitar o uso de blocos de parafina que foram armazenados por 10 anos ou mais e o tecido com uma aparência seca no bloco de parafina (consulte com um técnico de histologia). - Usando um micrótomo, corte 10 seções de série consecutivas de cada bloco, 4 µm de espessura. Monte as secções em placa de vidro carregada positivamente usada para IHC, uma seção por slide.
Nota: Seções devem ser montadas perfeitamente plana, sem rugas, como as rugas podem gerar artefatos de coloração. Número de slides das seções seriais de 1 a 10. - Prepare um novo slide H & E, na primeira seção. Rever o slide H & E, com a ajuda de uma patologista para confirmar a presença de tumor de tecido ou pulmão de tonsila restantes no bloco.
Nota: Este slide H & E pode ajudar, mais tarde, com a seleção das regiões de interesse para análise multiespectral e fenotipagem. - Loja imaculadas seções em uma caixa de plástico slide a 4 ° C por até três meses.
2. criação de uma nova CIM programa de coloração em um Stainer automatizada: registo dos reagentes
Nota: Os reagentes devem ser adicionados à lista de reagente no software automatizado corante antes eles estão disponíveis para uso em protocolos. Consulte a Tabela de materiais , para obter informações sobre o corante automatizado modelo e versão do software.
- Clique na guia reagentes dentro do software automatizado de corante. Clique em Adicionar para designar um novo reagente. Digite o nome (por exemplo, "520 TSA reagente") e o nome abreviado (por exemplo, "520 TSA"), observando que há um máximo de oito caracteres. Selecionar auxiliares de menu drop-down e definir o fornecedor. Não altere Duplos/mancha de Single/Sequential DS. Defina o padrão de coloração de protocolo para Protocolo F. Defina o protocolo HIER padrão para ER1 20.
- Salve o novo reagente e repita a etapa 2.1 para todos os reagentes listados na tabela 1.
3. automatizado Stainer: Registo dos recipientes
- Escreva o nome do reagente a ser usado ao lado de cada recipiente. Digitalize o código de barras do lado. Na janela pop-up, selecione o reagente correto na lista. Selecione uma data de expiração e salvar.
- Repita o procedimento na etapa 3.1 para todos os reagentes listado na tabela 1.
- Registre o Kit de investigação aberta. Ambos os códigos de barras no lado do kit de varredura e siga as instruções na tela. Nomeie o kit "Multiplex pesquisa Kit 1." Registrar o 1 x tris (hidroximetil) aminometano (Tris)-tampão salino como parte deste kit (tabela 1).
4. automatizado Stainer: Criação de um programa de protocolo do Fumin
- O protocolo de base multiplex é pré-carregado com o nome Opala 7 Multiplex na nova mácula automatizado (Veja o modelo e versão do software na Tabela de materiais). Localize o protocolo pela filtragem para "tudo" em vez de "preferido" na tela de protocolo. Se o protocolo de base não estiver presente, em seguida, atualize o software automatizado corante com assistência do fabricante.
- Todas as modificações devem ser conduzidas em cópias do protocolo original. Antes de fazer alterações, guardar o original e criar uma cópia clicando na guia protocolos , botão direito do mouse o protocolo Opala 7 Multiplex e selecionando copiar.
- Altere o nome para protocolo Multiplex 7 1 na nova janela e selecione a guia associada com o dispositivo correto (modelo de piso ou bancada). Coincidir com o protocolo em Suplementar tabela S1. Clique em Adicionar o reagente para adicionar uma etapa de inibição de peroxidase de 10 min (não faz parte do protocolo padrão) e selecione o inibidor de peroxidase como o reagente.
- Confirme que as etapas de bloqueio utilizam um tampão de bloqueio de PKI. Certifique-se de que cada anticorpo primário refere-se o reagente adequado, que passos de anticorpo secundário utilizam um polímero HRP, e aquele espectral ′ 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) fornecido com o kit de automação multiespectral é utilizada. Confirme todas as opções, verificando o reagente que foi designado para cada etapa respectiva no menu drop-down na tela de protocolo.
5. automatizado Stainer: Adição de controles de gota e protocolo do isotipo controle
- Copiar o nome protocolo Multiplex 7 1 e mude para 7 protocolo Multiplex 1 CD68 DROP. Mudar o reagente CD68 anticorpo IgG de Rato e salvar o protocolo.
- Crie mais seis novos protocolos, um para cada controle de queda e um para o controle completo do isotipo (alterando todos os anticorpos para os apropriado isotipos) da mesma maneira.
6. Stainer automatizado: Protocolo de preparação de Slide
- Copie o protocolo prestaining * Asse e Dewax e renomear este protocolo Asse multiespectrais e Dewax 2 h.
- Ajuste o protocolo para coincidir com os reagentes mostrados na tabela 2. Slides de Asse por 2 h a 60 ° C. Dewax por 30 s a 72 ° C.
7. automatizado Stainer: Preparação dos reagentes
- Prepare um kit de deteção de pesquisa. Um reagente deve ser permanentemente associado com este kit, para preencher o recipiente aberto 30 mL marcado para 1 x salino Tris (TBS), com 1 x TBS e localizar esta na posição 1 (mais afastado o identificador) do kit de deteção de pesquisa designado Multiplex Kit de pesquisa 1. este reagente será permanentemente associado com este kit de investigação e não deve mudar de posição para uso futuro.
- Rotule dois recipientes abertos 30ml Bloco multiespectrais e Multiespectral secundário. Encha o recipiente de Bloco multiespectrais com 30 mL de buffer de bloqueio/anticorpo diluente do kit de coloração multiespectral. Encha o recipiente Multiespectral secundário com 30 mL de polímero de mouse e rabbit anticorpo secundário do kit de coloração multiespectral.
- Prepare dez recipientes abertos de 7 mL. O volume necessário em microlitros é 600 + (150 x [número de slides]). Cada anticorpo será aplicado aos 12 slides neste caso (tonsila seis e seis do pulmão). A rotulagem e volumes para todos os recipientes são indicados na tabela 3.
- Para cada tubo de anticorpo, primeiro adicione o anticorpo diluente, em seguida, o anticorpo primário concentrado nos volumes indicados na tabela 3. Misture pipetando suave.
- Prepare um recipiente aberto de 7 mL para DAPI, usando quatro gotas de concentrado DAPI por mililitro de água bidestilada; um total de 16 vai ser manchado com DAPI (600 + [150 x 16] = 3.000 µ l). Adicione 3 mL de água bidestilada, mais 12 gotas de DAPI espectral no recipiente. Prepare o DAPI fresco para cada corrida.
- Prepare um recipiente aberto de 7 mL para inibidor de peroxidase. Todos os 16 slides serão tratados com inibidor de peroxidase (600 + [150 x 16] = 3.000 µ l). Adicione 3 mL de bloco de peroxidase no recipiente.
- Antes de preparar o trabalho de concentrações dos fluors, resuspenda todos os fluors liofilizados adicionando 75 µ l de Dimetilsulfóxido para cada tubo de fluor fornecido pelo fabricante. Misture por pipetagem. Este é o estoque de fluor TSA. Loja a 4 ° C.
- Prepare-se seis recipientes de titulação, um para cada fluor. O volume necessário em microlitros é 350 + (150 x [número de slides]). Cada fluor será aplicado aos 16 slides neste caso (tonsila oito e oito do pulmão). A rotulagem e volumes para todos os recipientes são indicados na tabela 4.
- Quando todos os reagentes foram registrados e preparados, coloque cada recipiente em qualquer lugar em uma cremalheira e carregar todos os reagentes para o corante automatizado. A sonda vai confirmar o volume de cada reagente.
8. automatizado Stainer: Amostra Setup e coloração multiespectrais
-
No software automatizado stainer, clique em configuração de Slide no topo da tela. Clique em Add estudo. Preencha a janela pop-up com o estudo ID, nome de estudo e comentários.
- Selecione o nome do pesquisador realizar a coloração fugir de lista drop-down. Embora o volume de distribuição em 150 µ l. Selecione multiespectrais Dewax para protocolo de preparação. Clique Okey e Adicionar slide. Em comentários, digite "Multiplex 1 pulmão 123ABC." Preencha os seguintes campos, conforme indicado: Tecido tipo = tecido de teste; Volume de distribuição = 150 µ l; Modo de coloração = Single, rotina; Marcador = negativo; Mancha = digite "7 Multiplex protocolo 1"; Preparação = Asse multiespectral, Dewax 2 h; HIER = HIER 20 min com ER1.
- Clique em Adicionar slide e alterar os comentários e protocolo para adicionar os slides de controle de queda e slide de isotipo controle. Quando todos os slides foram adicionados ao estudo, feche a janela Adicionar slide e imprimir etiquetas. Aplique os rótulos para a área de rótulo adequado em cada slide.
- Carregar os slides em racks, aplicam-se as telhas de cobertura na orientação correta, inserir as prateleiras do corante automatizado e abaixar as bandejas. O dispositivo irá digitalizar os rótulos de slide.
- Quando todos os slides e reagentes foram verificados e medidos. O botão de arranque (►) se tornará ativo. Se a autostainer detecta erros, tais como volume de reagente insuficiente, aparecerá um símbolo de aviso amarelo por bandeja do afetado. Se ocorrer um erro, clique o símbolo de cuidado e corrigir o erro.
- Iniciar imediatamente a coloração ou agendar um início atrasado. O protocolo é aproximadamente 14 h de duração. Nota: Certifique-se de que protocolo serão concluída em um tempo quando os slides podem ser removidos imediatamente como exess lavagem poderia impactar os resultados de coloração.
9. composto dos Slides multiespectrais
- Remover as lâminas do corante automatizado e armazená-los em um rack submergido em 1 x TBS.
- Monte as amostras com lamelas de n º 1,5 e 15 µ l dos meios de comunicação de montagem (ver Tabela de materiais). Remova quaisquer bolhas pressionando suavemente no sentido do lamela com uma ponta da pipeta.
- Permitir que os slides curar durante a noite em temperatura ambiente na bancada do laboratório. Slides não polimerizadas podem ser verificados imediatamente com manuseamento cuidadoso.
10. multispectral Scanner
- Ligue o scanner multiespectral e seu computador (consulte a Tabela de materiais para informação de modelo e software). Inicie o software de controle de microscópio. Abra a porta da frente do multispectral scanner pressionando o botão sensível ao toque na frente do dispositivo. Cada transportadora com mola no scanner possua quatro slides. Carregar todos os slides em transportadoras e gravar a ordem antes de carregar as transportadoras no dispositivo.
- Selecione o Protocolo editar e clique em novo...; em seguida, crie o nome do protocolo 1 Multiplex do painel e controles Drop. Criar o nome de estudo Desenvolvimento Multiplex do painel, clique em Criar protocoloe digite Visão geral de varredura filtro DAPI; em seguida, selecione Todo Slide Scan e Pixel resolução 0,50 µm (20 X). Todos os filtros e bandas devem ser representadas. Se não, clique em Editar filtros e bandas, selecione todos os cinco filtros (DAPI, FITC, CY3, Texas Red e CY5) e clique em Editar as exposições.
- Carrega a transportadora selecionando a transportadora com multiplex completo de adenocarcinoma do pulmão. Selecione o slide correto usando a interface gráfica do usuário. Concentre-se no tecido manualmente ou usando o autofocus. Navegue em qualquer área com coloração de DAPI aceitável e clique em Autoexpor para definir a exposição em milissegundos (0 – 2.000 ms).
- Repita o mesmo procedimento para todos os cinco conjuntos de filtro nas colunas a digitalizar toda e região de MSI. Certifique-se navegar até uma área com coloração aceitável e recentrar o microscópio antes de ajustar a exposição para cada nível de filtro e ampliação. Autoexposição para todos os cinco filtros em uma varredura geral de 20x e 20 x regiões multispectral da (MSI) de imagens multiespectrais. Selecione uma resolução de pixel de 0,50 µm (x 20). Salvar o protocolo e clique em voltar para retornar à tela inicial do software Vectra; em seguida, clique em Digitalizar Slides.
- Abra a interface para cada slide e definir a tarefa para fazer a varredura. Conjunto de estudo para Desenvolvimento de painel Multiplex, definir o protocolo para Multiplex 1 painel e controles Drope definir ID de Slide para Multiplex pulmão ABC123, Multiplex CD68 Drop pulmão ABC123, etc . Quando todos os slides foram chamados e tarefas são definidas, clique em Scan. Multispectral scanner automatizado irá realizar varreduras cheio-slide de todos os slides usando todos os filtros de cinco.
11. multispectral Scanner: Imagens multiespectrais
- Uma vez que os exames terminarem, abra o software QPTIFF ("Phenochart") e clique em Load deslize no canto superior esquerdo. Isto irá abrir um QPTIFF, que é um scan de todo-slide 5-filtro. Cada camada contém informações de mais de um fluor, então a utilidade é limitada, mas a estrutura do tecido e testes padrões da expressão ampla são aparentes e podem ser usados para selecionar regiões para MSI.
- Navegue para e abra o slide correto no estudo usando a árvore de soltar-para baixo à esquerda. Logar (superior direito), com as iniciais do usuário.
- Selecione cinco regiões para MSI usando a ferramenta de carimbo na parte superior da tela. Consulte uma patologista, se disponível. Em selecionar para, selecione aquisição; em tamanho em campos, selecione 1 x 1; e sob restrição de campo, selecione 0,5 µm (x 20). Com base na citoqueratinas (CK) coloração (principalmente em Cy5), selecione várias regiões com tumor (CK +) e estroma (CK-) para ser fotografada a partir da digitalização global. Repita este procedimento para cada slide.
- Uma vez que todos os MSIs são selecionados, feche o software Phenochart e retornar para o software do Vectra . Alterar a tarefa de varredura para MSI para cada slide e, em seguida, clique em digitalizar novamente para realizar a coleta de MSI.
12. espectral de desagregação
Nota: A etapa de misturar espectral é necessária para separação de canais e análise de imagens dos slides. Antes de desagregação espectral é executada no software inForm, a biblioteca espectral deve ser construída usando slides de adenocarcinoma do pulmão manchados com cada fluor em paz e com DAPI sozinhos. Este procedimento também é descrito no referido Multiplex IHC ensaio desenvolvimento guia.
- Quando a aquisição de MSI estiver concluída, use o software de ("informar") misturar espectral para abrir arquivos na pasta MSI . Acabam com esses arquivos na extensão de tipo de arquivo de .im3.
- Em formato de imagem, selecione Multispectral; em formato de amostra, selecione fluorescência; e em fonte biblioteca espectral, selecione InForm.
- Para selecionar o fluors, selecionar e carregar todos os seis fluors e DAPI da biblioteca construída com os slides de biblioteca de adenocarcinoma de pulmão. Clique em Preparar todos (inferior esquerdo). Software de misturar espectral executará desagregação espectral em todas as imagens abertas, usando os perfis espectrais fornecidos.
- Uma patologista, para avaliar o padrão de coloração contra manchas único cromogênico do mesmo destino em slides sequenciais do mesmo tecido.
13. avaliação da intensidade de fluorescência e atenuação de sinal
Nota: A ferramenta de contagem, que aparece como uma seta com uma pequena caixa marrom, é a ferramenta mais importante para a otimização de multiplex e deve ser usada com frequência (ver Materiais suplementares). Usando a ferramenta de contagem no software misturar espectral, avalie a relação sinal-ruído, que, no mínimo, deverá exceder 10:1 (ver Materiais complementares para solução de problemas e para a avaliação de um cinema de coloração com os controles de gota).
- 13.1. com uma imagem aberta no software misturar espectral, envolver-se a ferramenta de contagem e levantamento de imagens para avaliar a intensidade de fluorescência de cada canal. A intensidade de alvo no tecido pulmonar é entre 10 e 20 contagens normalizadas. A ferramenta de contagens normalizado é mostrada na Figura 1.
- Exclua slides com contagens de sinal máximo de contagens de área menor que 10 ou normal sinal de menos de cinco anos para qualquer marcador para que autofluorescência e coloração fora do alvo não competem com o sinal de fé.
- Excluir slides com máximo conta maior que 30 para qualquer canal evitar sangramento espectral ou desagregação espectral ineficiente.
- Endereço de altas ou baixas contagens normalizadas, ajustando a concentração de TSA.
14. análise de imagem multiespectrais
- Abrir um ou mais MSI no software de misturar espectral e apenas selecionados fluors para desagregação que são representados pelo menos uma imagem aberta. Clique em Preparar todos para atrás de todas as imagens de cor aberto atualmente para produzir imagens espectralmente misturadas.
- Selecione a ferramenta de contagem para o levantamento de contagens em cada imagem pairando sobre a área (s) de interesse.
- Selecione o ícone de olho para abrir o editor de exibição. Selecione e ajuste a intensidade de exposição de cada canal independente.
- Selecione Configurar para abrir a segmentação de tecido, segmentação de célula, fenotipagem e módulos de pontuação. Essas ferramentas são necessárias para a validação objectiva do multiplex coloração contra manchas única cromogênica e podem ser usadas para gerar dados quantitativos phenoptic (Figura S1).
- Use o guia de exportação para salvar em tons de cinza, fluorescente, pathview-estilo descompactado TIFF arquivos e dados dos módulos de análise de phenoptic para nova análise, arquivamento e apresentações (Figura S1).
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Representative Results
O protocolo descrito aqui fornecerá resultados como as mostradas na Figura 2. Começar com uma avaliação da coloração no controle da amígdala, começando com o epitélio de superfície de células escamosas. A histologia da amostra da amígdala pode ser revista com uma patologista, usando o slide H & E, como uma referência. Se cromogênico seções IHC são realizadas com os mesmos marcadores do mesmo bloco de tecido, em seguida, estes podem ser usados para confirmar a densidade e a distribuição de cada marcador no slide do Fumin. Como mostrado na Figura 2, o tecido da amígdala deve fornecer claramente definido cytokeratin AE1/AE3, mancha no epitélio escamoso tonsila-superfície (Figura 2A; rotulado como pseudocolorida vermelha), sem fundo no linfoide tecido. A coloração deve ser citoplasmática, ocasionalmente com acentuação de membrana, e os núcleos devem ser negativos. O epitélio reticulado nas criptas deve ser positivo para citoqueratinas (vermelhas) e PD-L1 (Figura 2; pseudocolorida verde). Então, devem, ser identificados os centros germinativos foliculares da tonsila. Os centros germinativos devem ser facilmente reconhecíveis e devem ser ricos em linfócitos de Ki-67-positivo (Figura 2; pseudocolorida amarela). Ki-67 deve sempre ser observado nuclear. Os macrófagos presentes nos centros germinativos também devem ser facilmente reconhecíveis, às vezes como células maiores (também chamadas de "corpos tingible"). Eles vão mostrar positivos mancha para CD68 como uma mancha citoplasmática granular (Figura 2; pseudocolorida laranja). Uma proporção variável de células CD68 fora dos centros germinativos também é de se esperar. Os macrófagos podem apresentar membrana mancha para PD-L1. Isto é tipicamente mais pálido na intensidade de coloração para PD-L1 no epitélio reticulado. Não deve haver nenhum CD68 nuclear coloração. CD8 deve manchar linfócitos com uma distribuição de células T (menos os centros germinativos e uma maior proporção nas áreas interfollicular; consulte a Figura 2A, pseudocolorida ciana). Linfócitos CD8 + são geralmente pequenas células com escassa citoplasma, por isso é praticamente impossível distinguir a membrana contra o citoplasma em linfócitos. PD-1 fortemente mancharão pequenos linfócitos na área do centro germinativo, geralmente agrupados na periferia dos centros germinativos (Figura 2; pseudocolorida magenta), bem como espalhadas linfócitos na região interfollicular, geralmente mostrando uma menor intensidade de coloração do que aqueles na área de centro germinativo. Como com CD8, não é possível distinguir claramente a membrana e a coloração citoplasmática em pequenos linfócitos manchados com PD-1. Porque uma proporção variável de células CD8 coexpress PD-1, é recomendado para fins de controle de qualidade que o padrão de coloração e distribuição de cada marcador que está manchada nos tecidos mesmos ser comparado com cromogênico IHC slides de referência, tal como sugerido 12. protocolos publicados anteriormente.
Depois que o padrão de coloração esperado foi confirmado no Controlarar de tecido da amígdala, prossiga para avaliar a coloração da amostra de câncer de pulmão (Figura 2B). Porque os tecidos de tumor são esperados para mostrar uma expressão variável e heterogênea dos marcadores, é muito importante durante a otimização de um novo painel do Fumin para comparar o padrão de coloração para cada marcador individual observada no método do Fumin e sua expressão observada no padrão slide cromogênico IHC, avaliando a quantidade e a distribuição das células positivas como descrito anteriormente,12. No entanto, o padrão básico de coloração deve ser preservado; por exemplo, citoqueratinas devem ser observadas no citoplasma das células epiteliais e nunca em um núcleo; CD68 deve aparecer como coloração citoplasmática granular em macrófagos, etc.. Importante, em alguns marcadores, a intensidade de coloração pode mudar do controle da amígdala no tecido de câncer; por exemplo, o PD-1 e PD-L1 podem mostrar menor intensidade de coloração do tecido do tumor em comparação com a expressão muito alta observada no controle da amígdala. Portanto, é importante realizar a avaliação e otimização com a ferramenta conta no software inForm, usando exemplos de tecidos do tumor, em vez dos controles da amígdala.
Finalmente, controles isotipo-negativo e soltar controles precisam ser avaliadas, não só para a detecção de fundo e autofluorescência, mas também para efeitos de guarda-chuva e a sangrarem espectral (Figura 3 e Figura 4). ISOTYPE controles não devem demonstrar qualquer immunostaining através do slide; Se qualquer mancha é observada, então a imagem ou mancham o procedimento deve ser revisitado. Controles de gota são importantes para avaliar potenciais artefatos de coloração, tais como efeitos de hemorragia ou guarda-chuva espectrais, devido o método mIF durante a otimização de um novo painel multiplex (consulte a Figura 5, Complementar figura S2, Figura complementar S3e materiais suplementares). Fluorescentes monoplex e soltar controles devem ser avaliados e comparados com o painel completo multiplex. Cada controle de queda deve mostrar o mesmo padrão de coloração exceto o único anticorpo primário, que deve ser removido em cada controle específico. Mais detalhes são fornecidos na seção de Materiais complementares .
Figura 1 : informar ferramenta conta. A ferramenta de contagens de software inForm é ativada selecionando o ícone de caixa bege. Normalizado de contagens são corrigidas para a profundidade de bits, tempo de exposição, ganho e binning. As imagens foram tiradas em ampliação de 20 X; barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Resultados representativos. Carcinoma de pulmão de células nonsmall da amígdala (A) e (B) foram corados com PD-L1 (520 TSA, verde), CD8 (540 TSA, ciano), Ki67 (570 TSA, amarelo), CD68 (620 TSA, laranja), citoqueratina (650 TSA, vermelho) e PD-1 (690 TSA, magenta). Canais individuais são representados separadamente abaixo em pequenos painéis. O marcador é indicado no canto superior direito de cada imagem. As imagens foram tiradas em ampliação de 20 X; Barra de escala = 50 (ou 250 µm). Indicado no painel A estão 1) folículo linfoide, centro 2) germinal, área 3) interfollicular e epitélio escamoso 4) estratificado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Efeito de bloqueio/guarda-chuva TSA. Este é um exemplo de 690 TSA depositados por um sinal PD-1 bloqueio de anticorpo CD3 em uma maneira dependente da quantidade de TSA presente. O sinal mais brilhantes de TSA 690 bloqueia o sinal TSA 620 mais eficazmente (carcinoma de pulmão de células nonsmall manchadas com anti-PD-1 D4W2J por 30 min em 0.52 µ g/mL ou isotipo seguido de uma detecção de TSA 10min 690 em 1: 100; em seguida, o anti-CD3 F7.2.38 por 30 min em 0.14 µ g/mL seguido de uma detecção de TSA 620 10 min a 1: 100). As imagens foram tiradas em ampliação de 20 X; barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Sangramento espectral. Tecido de carcinoma de pulmão de células nonsmall estava manchado com o Ki-67 gota-controle (protocolo completo multiplex com anticorpo Ki-67 omitido). O canal TSA 540 (CD8) e o canal TSA 570 (Ki-67) são mostrados. Nenhum padrão de coloração nuclear é aparente, mas uma cópia reduzida do CD8 padrão de coloração é observada no canal 570 TSA. Esta é melhor dirigida, garantindo as intensidades de coloração comparáveis em todos os canais. Neste caso, a adição de um sinal robusto de Ki-67 (normalizados contagens entre 10 e 20) corrigirá o sangramento espectral. As imagens foram tiradas em ampliação de 20 X; barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Soltar controles. Esta figura mostra uma imagem composta de um cheio multiplex em comparação com a mesma região de slides sequenciais de adenocarcinoma do pulmão manchado com controles de queda em que o anticorpo primário indicado foi omitido. As imagens foram tiradas em ampliação de 20 x; Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome | Nome da abbr. | Tipo | Contêiner | Grupo |
| Buffer de bloqueio de PKI | OPALBLOK | Auxiliares | Abrir 30 mL | Geral |
| Opala Polymer HRP | OPALA 2AB | Auxiliares | Abrir 30 mL | Geral |
| OPALA 1 x TBS | OPAL1TBS | Auxiliares | Abrir 30 mL | Kit de Det. |
| CD68 0,30 µ g/mL PG-M1 Mus | OPALCD68 | Auxiliares | Aberto 7 mL | Geral |
| Ki67 0.61 µ g/mL MIB-1 Mus | OPALki67 | Auxiliares | Aberto 7 mL | Geral |
| PD-L1 0,20 µ g/mL SP263 Rab | OPALPDL1 | Auxiliares | Aberto 7 mL | Geral |
| PD-0,52 1 µ g/mL D4W2J Rab | OPALA PD1 | Auxiliares | Aberto 7 mL | Geral |
| CD8 0,70 µ g/mL SP239 Rab | OPALA CD8 | Auxiliares | Aberto 7 mL | Geral |
| CK 0,24 µ g/mL AE1/AE3 Mus | OPALA CK | Auxiliares | Aberto 7 mL | Geral |
| Mouse IgG | OPALA MUS | Auxiliares | Aberto 7 mL | Geral |
| IgG de coelho | OPALA RAB | Auxiliares | Aberto 7 mL | Geral |
| OPALA bloco de Peroxidase | OPALPERX | Auxiliares | Aberto 7 mL | Geral |
| DAPI espectral | OPALDAPI | Auxiliares | Titulação de 6 mL | Geral |
| Reagente de opala 520 | OPALA 520 | Auxiliares | Titulação de 6 mL | Geral |
| Reagente de opala 540 | OPALA 540 | Auxiliares | Titulação de 6 mL | Geral |
| Reagente de opala 570 | OPALA 570 | Auxiliares | Titulação de 6 mL | Geral |
| Reagente de opala 620 | OPALA 620 | Auxiliares | Titulação de 6 mL | Geral |
| Reagente de opala 650 | OPALA 650 | Auxiliares | Titulação de 6 mL | Geral |
| Reagente de opala 690 | OPALA 690 | Auxiliares | Titulação de 6 mL | Geral |
Tabela 1: Protocolo de RX Leica Bond, reagentes de opala
| Reagente | Tempo (h) | Temperatura (graus Celsius) | |
| 1 | Não reagente | 120:00 | 60 |
| 2 | Bond Dewax solução | 0:30 | 72 |
| 3 | Bond Dewax solução | 0:00 | 72 |
| 4 | Bond Dewax solução | 0:00 | Ambient (temperatura ambiente) |
Tabela 2: Protocolo de preparação de opala
| Alvo | µ g/mL | Clone | Fonte | Muito | Estoque µ g/mL | µ L diluente | Μ L AB |
| CD68 | 0.3 | PG-M1 | Damaso | 20043031 | 30 | 2376 | 24 |
| Ki67 | 0,61 | MIB-1 | Damaso | 20049476 | 46 | 2368.17 | 31.83 |
| PD-L1 | 0.2 | SP263 | Vent. | F09591 | 1,61 | 2101.86 | 298.14 |
| PD-1 | 0,52 | D4W2J | CST | 1 | 100 | 2387.52 | 12,48 |
| CD8 | 0.7 | SP239 | Ventana | 160318 | 70 | 2376 | 24 |
| CK | 0,24 | AE1/AE3 | Damaso | 10129428 | 179.5 | 2396.79 | 3.21 |
| IgG de Mus | 0,61 | ||||||
| Rab IgG | 0.7 |
Tabela 3: Preparação de anticorpos primários.
| Opala Fluor | Slides | Diluição | µ L diluente | µ L opal Fluor |
| Opala 520 | 16 | 1: 200 | 2736.3 | 13,8 |
| Opala 540 | 16 | 1:700 | 2746.1 | 3.9 |
| Opala 570 | 16 | 1:150 | 2731.7 | 18,3 |
| Opala 620 | 16 | 1: 100 | 2722.5 | 27.5 |
| Opala 650 | 16 | 1:350 | 2742.1 | 7,9 |
| Opala 690 | 16 | 1:150 | 2731.7 | 18,3 |
Tabela 4: Preparação de Fluor de opala.
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Suplementar tabela 2: Resumo e comparação da multiplex completo, gota e controles de isotipo completo. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
A revolução de imunoterapia do câncer em curso é o romance de abertura e prometendo opções terapêuticas para pacientes de câncer13. Avanços no campo da imuno-Oncologia exigirá maior conhecimento do microambiente do tumor inflamatório, não só para compreender a biologia dos mecanismos imunológicos envolvidos na carcinogênese, mas também para encontrar biomarcadores preditivos de novo tratamentos baseados em imunoterapia1,2. Devido à complexa biologia da imunologia do câncer, interrogatório de amostras de tecido do tumor é geralmente necessária para desenvolver uma lista crescente de marcadores imunes, que interagem uns com os outros e são frequentemente coexpressed por populações de diversas células do tecido1 ,2,5. Ensaios clínicos normalmente empregam pequenas biópsias, como agulha de núcleo ou biópsias endoscópicas, que são coletadas em pontos diferentes da terapia para avaliar e monitorar a resposta do doente. Tais biópsias fornecem quantidades limitadas de tecido, que por sua vez, limita o número de seções do tecido que pode ser empregado para immunoprofiling de câncer. Essa limitação é particularmente onerosa quando as técnicas tradicionais, tais como padrão monoplex IHC, são usadas. Há, portanto, uma clara precisa de novos métodos para câncer de immunoprofiling que fazem usar técnicas multiplex com capacidade de avaliar simultaneamente a coexpression de diferentes biomarcadores e fazer uso mais eficiente de amostras de valioso.
Na coloração multiplex e métodos de imagens multiespectrais, descritos em detalhes aqui, um painel de mIF é usado para estudos imuno-oncologia em tecidos FFPE tais como biópsias de um ensaio clínico. Este método tem sido descrito anteriormente, validado e aplicado com sucesso para câncer immunoprofiling8,9,10,11,12,14, 15. protocolos previamente publicados descreveram mIF semelhante coloração métodos com sistemas baseados em TSA, tais como o kit de sete cores, que é demorado e requer cerca de 4 dias de trabalho por um laboratório dedicado cientista12 ,15. Em resposta a estas deficiências, este protocolo foi otimizado usando um stainer automatizado disponível comercialmente, dramaticamente, encurtando o tempo para 14 h de coloração e eliminando a variabilidade introduzida pelos operadores manuais. Imagem é conduzida em um scanner multiespectral capaz de separar os espectros dos sete ou mais sinais fluorescentes em slides multiplex, incluindo autofluorescência, que pode ser eficientemente removida sem prejudicar a qualidade do sinal. Este protocolo pode ser replicado, modificado e executado por qualquer usuário do laboratório com acesso a instrumentos e reagentes detalhados na Tabela de materiais.
Passos críticos no presente protocolo são seções 7, 10, 11, 12. Secção 7 refere-se à preparação de reagentes. Uma cuidadosa preparação dos reagentes para coloração de multiplex é essencial, exigindo a atenção concentrada de um cientista de laboratório ou técnico para evitar variação dependente do operador. Por exemplo, um dos principais problemas com o método multiplex está manchando a variabilidade, que pode ser reduzida pela cuidadosa preparação de diluições dos reagentes, especificamente as tinturas da TSA. Seções de 10 e 11 estão relacionados com a aquisição de imagens. Um risco importante é a superexposição ou supersaturação das imagens, que pode levar a hemorragia espectral, um artefato, no qual o sinal do outro canal interfere com o canal sendo fotografado (ver Materiais suplementares). Cuidadosamente, regular os tempos de exposição pode ajudar a prevenir a supersaturação e sangramento espectral. Espectral de desagregação é realizado na seção 12. Isto baseia-se na preparação da biblioteca espectral (descrita no Multiplex IHC ensaio desenvolvimento guia, disponível on-line). Nesta etapa, o software inForm é "treinado" especificamente, reconhecer as cores para cada tintura TSA. A biblioteca espectral é criada usando seções de um tecido de controle, tais como a amígdala humana, manchada com um marcador uniformemente expressado, tais como CD20, juntamente com cada tintura individual de TSA em slides individuais. Além disso, slides de autofluorescência (também descritas no guia de desenvolvimento de ensaio de IHC Multiplex) são necessários para treinar o software inForm para reconhecer e subtrair tecido autofluorescência. Autofluorescência slides de controle devem ser preparadas usando amostras dos tecidos mesmos sendo estudados (como câncer de pulmão, etc.), tratados da mesma forma como os slides do Fumin e incubadas com anticorpos primários e secundários, mas sem o corante TSA. Somente um perfil espectral única autofluorescência pode ser selecionado, então deve ter cuidado para selecionar uma representação da autofluorescência observável que pode vir de colágeno, fibrose, glóbulos vermelhos, pigmentos endógenos e outras fontes. Criando uma nova biblioteca espectral no início de cada novo projeto e usando um espectro de autofluorescência representativo de amostras de estudo, bem como executando os mesmos blocos de tecido como o controle positivo para cada lote dentro do mesmo projeto, são valiosos passos metodológicos que ajudarão a melhorar a consistência da espectral desagregação entre amostras diferentes dentro do mesmo projeto.
O multiplex método descrito neste protocolo oferece várias ferramentas de solução de problemas, incluindo um avaliador de sinal-ruído (ferramenta de contagens), controles de gota (Materiais complementares) e uma vista de patologia para controle de qualidade da coloração. A ferramenta conta ajuda a avaliar a intensidade da coloração e o nível de fundo. Se a intensidade e/ou os níveis são elevados, a primeira abordagem é reduzir a diluição do corante TSA. Se o problema persistir, os slides IHC cromogênico usados para otimização de marcador especial devem ser reexaminados com uma patologista, que procura a presença de plano de fundo. A vista de patologia é gerada pelo software inForm, usando uma representação como diaminobenzidina pseudocolorida da fluorescência do fluor TSA-ligados, bem como uma representação de hematoxilina falso gerado a partir de todos os sinais fluorescentes, incluindo DAPI . Imagens do vista patologia ajudarem com a avaliação visual dos padrões de coloração por um patologista para coloração melhorada. Estas ferramentas sempre devem ser empregadas durante a otimização de um novo painel e como etapas de controle de qualidade durante o fluxo de trabalho de coloração.
O Fumin método requer o uso de anticorpos primários que foram devidamente validado e otimizado para IHC cromogênico padrão em tecidos fixados em formalina. Por exemplo, uma das principais vantagens do método mIF TSA é a sua compatibilidade com o uso de anticorpos primários que foram validados e otimizadas em laboratório de patologia anatômica para uso clínico12. Esta vantagem significa que os painéis multiplex podem ser personalizados pelo usuário laboratório para responder perguntas de Imunologia câncer específicos sem a necessidade de anticorpos preconjugated, fornecendo o desenvolvimento rápido e dinâmico do painel. A este respeito, o fluxo de trabalho real para a otimização de um novo painel começa com a validação e otimização dos anticorpos com padrão IHC cromogênico, procurando a melhor diluição e condições que irão fornecer a coloração limpa e consistente a coloração. O próximo passo, usando as mesmas diluições otimizadas para IHC, é transferir a mancha usando fluors TSA em vez diaminobenzidina e comparar os resultados de monoplex TSA imunofluorescência com o IHC cromogênico como referência. Finalmente, os anticorpos podem ser combinados de coloração, o Fumin, sempre usando o IHC cromogênico coloração padrão como uma referência de controle para ajustar os Fumin TSA coloração parâmetros, principalmente as diluições da tintura TSA e a sequência de coloração. Durante esse processo, a colaboração com uma patologista é instrumental para avaliar a qualidade da coloração.
As limitações desta técnica incluem o tempo e o esforço necessário para a otimização e validação de novos painéis e a análise de immunophenotyping dos painéis do Fumin. A principal preocupação, no entanto, é a adequada validação dos métodos do Fumin. A falta de adequada validação destas técnicas implica o risco de gerar resultados inválidos, que podem adicionar dados confusos com a literatura, dificultando, assim, as tentativas para uma melhor compreensão da biologia do câncer Imunologia16. Compete, portanto, o investigador envidar todos os esforços para validar corretamente multiplex métodos, incluindo a garantia de participação estreita e avaliação pelos patologistas com treinamento e experiência em validação e avaliação de tecido Histopatologia e técnicas baseadas em IHC17,18,19,20. O protocolo aqui apresentado inclui algumas das ferramentas que podem ajudar com a validação de um novo painel multiplex, incluindo a avaliação de patologia de H & E slides antes de coloração e análise, o uso do IHC cromogênico como uma referência para otimizar o Fumin TSA coloração, o método de controle de soltar para controle de qualidade de um novo multiplex, painel e o uso de isotipo, autofluorescência e soltar controles. Apesar da complexidade técnica dos métodos do Fumin, tecnologias como a imagiologia multi-espectral com desagregação espectral, bem como outras plataformas multiplex romance, estão abrindo uma nova era para a análise de amostras de pacientes e a geração de novas formas de dados que não é possíveis com padrão IHC sozinho. Portanto, o desenvolvimento e aplicação de técnicas de mIF continuarão a crescer, tornando-se ferramentas poderosas para a immunoprofiling de câncer de biópsias para ensaios clínicos e ajudando a identificar novos biomarcadores preditivos Multiparamétrico para imunoterapia, Beneficiando-se, acima de tudo, o paciente com câncer.
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Disclosures
Este trabalho foi financiado pela MedImmune, biologics global R & braço D da AstraZeneca. C.W., K.R. e HCC são empregados da Perkin Elmer, que produz os reagentes (kit de TSA) e multiespectrais scanners que foram utilizados neste trabalho. M.S., K.D., A.H., W.Z., C. Bagnall, C. Brown, J.C., A.L., K.S., M.R. e J.R.C. são os funcionários da MedImmune com posse conservada em estoque e/ou interesses de ações ou opções na AstraZeneca.
Acknowledgments
Apoio editorial foi fornecido por Deborah Shuman da MedImmune.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
References
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