Summary
Un protocolo detallado para un panel de inmunofluorescencia multiplex marcador seis es optimizado y realizado, utiliza un teñidor automático para resultados más consistentes y un menor tiempo de procedimiento. Este enfoque puede adaptarse directamente por cualquier laboratorio para estudios de inmuno-Oncología.
Abstract
Continua evolución de inmuno-Oncología requiere una mayor comprensión de los mecanismos de la inmunología del cáncer. El análisis immunoprofiling de muestras de tejido de biopsias de formalina-fijos, parafina-encajado (FFPE) se ha convertido en una herramienta clave para entender la complejidad de la inmunología tumoral y descubrimiento de nuevos biomarcadores predictivos para la inmunoterapia del cáncer. Immunoprofiling análisis de los tejidos requiere la evaluación de marcadores combinados, incluyendo las subpoblaciones de células inflamatorias y los puestos de control inmunes en el microambiente del tumor. El advenimiento de métodos inmunohistoquímicos multiplex novela permite un más eficiente Análisis multiparamétrico de secciones del tejido fino solo que hace estándar monoplex immunohistochemistry (IHC). Una inmunofluorescencia múltiplex disponible comercialmente (si) método se basa en la amplificación de la señal tyramide y, combinado con el análisis microscópico multiespectral, permite una mejor separación de señal de diversos marcadores en el tejido. Esta metodología es compatible con el uso de anticuerpos primarios no conjugados que se han optimizado para IHC estándar en las muestras de tejido FFPE. Adjunto describimos detalladamente un protocolo automatizado que permite multiplex si el etiquetado de las muestras de tejido de carcinoma con un panel de anticuerpos multiplex marcador seis compuesto por PD-L1, 1 PD, CD68, CD8, Ki-67 y citoqueratinas AE1/AE3 con 4′, 6-diamidino-2-phenylindole como una contratinción nuclear de la célula. El protocolo multiplex panel está optimizado en un teñidor automático de IHC para un tiempo de tinción es más corto que el del protocolo manual y directamente aplicado y adaptado por cualquier investigador de laboratorio para estudios de inmuno-Oncología en muestras humanas de tejido FFPE. También se describe son varios controles y herramientas, incluyendo un método de control de gota fina control de calidad de un nuevo panel multiplex de IF, que son útiles para la optimización y validación de la técnica.
Introduction
Immunoprofiling análisis de muestras de tejido FFPE tumor se ha convertido en un componente esencial de los estudios de inmuno-Oncología, particularmente para el descubrimiento y validación de nuevos biomarcadores predictivos para la inmunoterapia del cáncer en el contexto de ensayos clínicos1 ,2. IHC cromogénica, utilizando químicos cromógenos como diaminobenzidina, sigue siendo la técnica estándar en patología diagnóstica de la inmunomarcación de biopsia del tejido3. IHC estándar puede usarse también para immunoprofiling de tejido de cáncer, incluyendo la cuantificación de subpoblaciones de linfocitos tumorales asociadas y la evaluación de los niveles de expresión de checkpoints inmunes como ligando de muerte celular programada 1 (PD-L1)4 ,5. IHC estándar es limitada, sin embargo, en sólo un antígeno puede ser etiquetado según la sección de tejido. Porque immunoprofiling estudios requieren típicamente el análisis de la expresión combinada de varios marcadores, el uso de IHC estándar requiere la tinción de múltiples secciones de tejido, cada uno manchado con un marcador único y por lo tanto, sería sustancialmente limitado para el análisis de muestras de tejido pequeñas tales como las biopsias de aguja de núcleo. Estándar métodos IHC también son limitados para la evaluación de marcadores que son coexpressed por poblaciones de diversas células, como sucede con los marcadores de control inmune como PD-L1, que es expresada por macrófagos asociados a tumor y las células cancerosas. Esta limitación se ha divulgado en, por ejemplo, el uso del estándar monoplex IHC por los patólogos para el análisis cuantitativo de un marcador IHC expresado por células diversos tipos6. El desarrollo de técnicas de IHQ cromogénicos múltiplexes empleando diversos cromógenos coloreados en el mismo tejido sección representa un adelanto sobre el método estándar de monoplex IHC,7 aunque siguen siendo limitados por la inmunomarcación de unos pocos marcadores y también presenta un importante desafío técnico para la adecuada evaluación de marcadores expresados en el mismo compartimientos subcelulares de las mismas poblaciones de células.
Las salvedades mencionadas en cuanto a la disponibilidad de tejido de las muestras clínicas, así como las limitaciones de las técnicas de IHQ cromogénicos multiplexores, han dado lugar a la necesidad de desarrollar mejores métodos multiplexores para estudios de inmuno-Oncología etiquetado fluorescente combinado con sistemas que efectivamente pueden separar las señales de múltiples fluoróforos de la misma diapositiva de imágenes. Una tal técnica se basa en la amplificación de la señal de la tyramide (TSA) combinada con la proyección de imagen multiespectral de la microscopia de color eficiente separación8. Un kit disponible comercialmente basados en TSA emplea fluoróforos optimizado para imágenes multiespectrales8 (véase Tabla de materiales). Una ventaja fundamental de este sistema es su compatibilidad con los mismos anticuerpos primarios sin etiqueta que ya validadas y optimizadas para el estándar cromogénico IHC9,10,11. Esto permite no sólo la optimización más rápida sino también la flexibilidad en las optimización y el panel de modificaciones incorporando nuevos objetivos. Además, el método TSA multiplex inmunofluorescencia (mIF) puede ser optimizado para comercios IHC stainer sistemas automatizados, lo que permite una transferencia sencilla de monoplex IHC cromogénico a FOMIN.
Aquí presentamos un protocolo para un panel de FOMIN para estudios de inmuno-Oncología basada en automatizado FOMIN TSA tinción y utiliza un escáner multiespectral para la proyección de imagen. Este protocolo puede ser adaptado y modificado por cualquier usuario con acceso a la instrumentación descrita y reactivos de laboratorio. El protocolo incluye un panel de seis anticuerpos primarios para la immunoprofiling de los carcinomas: PD-L1, PD-1, CD68 (como un marcador de pan-macrófago), CD8 (células T-citotóxicas), Ki-67 y AE1/AE3 (cacerola-cytokeratin, utilizado como marcador epitelial para la identificación de células del carcinoma). Un estudio reciente describe la optimización de un protocolo de FOMIN TSA manual utilizando IHC cromogénico como referencia estándar para validar el múltiplex tinción12. El método actualizado presentado aquí ha sido desarrollado por con el equipo de TSA comercialmente disponible, siete colores optimizado en un teñidor automático, drásticamente acortando el tiempo de tinción de 3 – 5 días a 14 h, mejorando también la consistencia de la tinción. Además del protocolo principal detallado presentado aquí, una sección de Materiales complementarios incluye el método de "control de la gota", un proceso de control de calidad adicional para evaluar un nuevo panel de FOMIN, así como notas técnicas para la optimización, solución de problemas y desarrollo de nuevos paneles múltiplexes para ayudar al usuario del laboratorio para configurar y optimizar el método TSA de mIF FOMIN personalizados paneles.
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Protocol
Nota: El protocolo que presentamos describe cómo se realiza la immunoprofiling de un grupo de mIF con TSA para seis anticuerpos (CD68, ki67, PD-L1, PD-1, CD8 y AE1/AE3) en un stainer automatizado (véase Tabla de materiales). El protocolo también describe cómo realizar los controles de la caída de un control de calidad de un nuevo panel de FOMIN (ver Materiales complementarios). En este protocolo de tinción se realiza con ocho diapositivas FFPE sin mancha de la amígdala humana (control positivo) y ocho diapositivas sin manchas de adenocarcinoma pulmonar humano. La primera diapositiva se utiliza para el múltiplex completo tinción con todos los marcadores de seis, la segunda diapositiva para el control de isotipo en la que no hay anticuerpos primarios se utilizan y las restantes seis diapositivas para los controles de la gota (ver Materiales complementarios). Un control adicional de la autofluorescencia de los tejidos es altamente recomendable y siempre deben incluirse en un multicine de estudio (ver Materiales complementarios). Sin embargo, los investigadores pueden emplear otros tipos de tumores y controles según sus propios objetivos. Los usuarios de laboratorio sin experiencia previa con el FOMIN TSA método y técnicas de escáner multiespectral deben leer la guía de desarrollo de IHC Multiplex (disponible en línea en http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp). Aunque esta guía describe un protocolo de manual, también proporciona una buena introducción para el FOMIN tinción. Todas las secciones de tejido empleadas en el presente Protocolo se anonimizados y aprobadas según la declaración de Helsinki.
1. las muestras de tejido
- Seleccionar una muestra de la amígdala humana de FFPE con hiperplasia linfoide a ser utilizado como control positivo y una muestra de adenocarcinoma de pulmón humano FFPE sabido que PD-L1 positivo. Revisión de las diapositivas de hematoxilina y eosina (H & E) de los bloques de cáncer de pulmón seleccionados para confirmar la presencia de un tumor. Es importante evitar tumores con abundantes zonas de necrosis como esto puede aumentar la tinción de fondo inespecífica.
Nota: Para esta optimización, evitar el uso de bloques de parafina que se han almacenado durante 10 años o más y el tejido con un aspecto seco en el bloque de parafina (consulte con un técnico de histología). - Con un micrótomo, corte 10 secciones seriales consecutivas de cada bloque, 4 μm de espesor. Monte las secciones en un portaobjetos de vidrio cargada positivamente usado para IHC, una sección por diapositiva.
Nota: Secciones deben montarse perfectamente plana sin arrugas, como las arrugas pueden generar artefactos de tinción. Número de las diapositivas de las secciones seriadas de 1 a 10. - Preparar una nueva diapositiva de H & E en la primera sección. Revisar la diapositiva con la ayuda de un patólogo para confirmar la presencia de tumor de pulmón o tejido de amígdala, restantes en el bloque de H & E.
Nota: Esta diapositiva de H & E puede ayudar, más tarde, con la selección de las regiones de interés para el análisis multiespectral y fenotipado. - Guardar secciones sin manchas en una caja portaobjetos de plástico a 4 ° C hasta por tres meses.
2. creación de un nuevo FOMIN programa de tinción en un Stainer automatizado: registro de los reactivos
Nota: Reactivos deben agregarse a la lista de reactivos en el software de stainer automatizado antes de que estén disponibles para su uso en protocolos. Ver la Tabla de materiales para obtener información sobre el stainer automatizado modelo y versión de software.
- Haga clic en la ficha de reactivos dentro del software de stainer automatizado. Haga clic en Agregar para designar un nuevo reactivo. Introduzca el nombre (por ejemplo, "520 TSA reactivo") y el nombre abreviado (por ejemplo, "TSA 520"), tomando nota de que hay un máximo de ocho caracteres. Auxiliares en el menú desplegable y escoja ajuste directamente. No cambie la Mancha sola/doble de DS solo/secuencial. Establecer el valor predeterminado protocolo f Protocolode tinción. Configurar el protocolo HIER por defecto a 20 ER1.
- Guardar el reactivo nuevo y repita el paso 2.1 para todos los reactivos enumerados en la tabla 1.
3. automatizado Stainer: Registro de los envases
- Escriba el nombre del reactivo para ser utilizado en el lado de cada contenedor. Escanear el código de barras en el lado. En la ventana emergente, seleccione el reactivo correcto de la lista. Seleccionar una fecha de caducidad y guardar.
- Repita el procedimiento en el paso 3.1 para todos los reactivos enumerado en la tabla 1.
- Registrar el equipo de investigación abiertas. Escanear ambos códigos de barras en el lado del kit y seguir las instrucciones en pantalla. Nombre del juego "Multiplex investigación Kit 1". Registrar el 1 x tris (hidroximetil) aminometano (Tris)-tamponada con solución salina como parte de este juego (tabla 1).
4. automatizado Stainer: Creación de un FOMIN programa de protocolo
- El protocolo multiplex base está precargado con el nombre de Ópalo 7 Multiplex en teñidores automáticos nuevos (ver el modelo y versión de software en la Tabla de materiales). Localizar el protocolo de filtrado para "todos" en lugar de "preferido" en la pantalla de protocolo. Si el protocolo de base no está presente, entonces actualizar el software de stainer automatizado con ayuda del fabricante.
- Todas las modificaciones deben realizarse en las copias del protocolo original. Antes de realizar cambios, guarde el original y crear una copia haciendo clic en la ficha protocolos , luego clic derecho el protocolo Opal 7 Multiplex y seleccionar Copy.
- Cambie el nombre al Protocolo Multiplex 7 1 en la nueva ventana y seleccione la ficha asociada con el dispositivo correcto (modelo de piso o mesa). Coincide con el protocolo suplementario tablaS1. Haga clic en Añadir Reactivo para agregar un paso de 10 min de inhibición de la peroxidasa (no forma parte del protocolo estándar) y seleccione el inhibidor de la peroxidasa como el reactivo.
- Confirmar que los pasos de bloqueo utilizan un tampón de bloqueo de PKI. Asegúrese de que cada anticuerpo primario se refiere al reactivo apropiado, que pasos de anticuerpo secundario utilizan un polímero HRP, y eso 4′ espectral, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) suministrado con el kit de automatización multiespectral se utiliza. Confirmar todas las opciones marcando el reactivo que ha sido designado para cada paso correspondiente en el menú desplegable en la pantalla de protocolo.
5. automatizado Stainer: Además de los controles de la gota y Protocolo de Control de isotipo
- Copiar el nombre Protocolo Multiplex 7 1 y cambie a 7 Protocolo Multiplex 1 CD68 gota. Cambie el reactivo anticuerpo CD68 para IgG de ratón y guarde el protocolo.
- Crear seis más nuevos protocolos, uno para cada control de gota y otro para el control de isotipo completa (cambiando todos los anticuerpos a los isotipos apropiado) de la misma manera.
6. Stainer automatizado: Protocolo de preparación de diapositiva
- Copia del Protocolo de prestaining * hornear y Dewax y renombrar este protocolo multiespectral y Dewax 2 h.
- Ajuste el protocolo para que coincida con los reactivos que se muestra en la tabla 2. Diapositivas de cocer al horno durante 2 h a 60 ° C. Dewax durante 30 s a 72 ° C.
7. automatizado Stainer: Preparación de los reactivos
- Preparar un kit de detección de la investigación. Un reactivo debe asociarse permanentemente con este kit, para llenar el recipiente abierto 30 mL marcado para 1 x Tris-solución salina con tampón (TBS) con 1 x TBS y busque esta en la posición 1 (más alejado de la manija) en el kit de detección de investigación señalado Multiplex Kit de investigación 1. este reactivo se asocia permanentemente a este equipo de investigación y no debe cambiar la posición para uso futuro.
- Etiqueta de dos envases de 30 mL abierto Bloque multiespectral y Multiespectrales secundaria. Llene el recipiente de Bloque multiespectral con 30 mL de tampón de bloqueo/anticuerpo diluyente desde el kit de tinción multiespectral. Llene el contenedor Secundario multiespectral con 30 mL de polímero anti-ratón anti/anti-conejo anti anticuerpo secundario desde el kit de tinción multiespectral.
- Preparar diez contenedores abiertos de 7 mL. El volumen requerido en microlitros es de 600 + (150 x [número de diapositivas]). Cada anticuerpo se aplicará a 12 diapositivas en este caso (amígdala seis y seis de pulmón). El etiquetado y los volúmenes para todos los envases se indican en la tabla 3.
- Para cada tubo de anticuerpos, primero añadir el anticuerpo diluyente, seguido por el anticuerpo primario concentrado en los volúmenes indicados en la tabla 3. Mezclar mediante pipeteo suave.
- Preparar un recipiente abierto de 7 mL para DAPI, cuatro gotas del concentrado DAPI por mililitro de agua doble destilada; un total de 16 será teñido con DAPI (600 + [150 x 16] = 3.000 μl). Añadir 3 mL de agua destilada doble plus 12 gotas de DAPI espectral en el envase. Preparar fresco DAPI para cada serie.
- Preparar un recipiente abierto de 7 mL de inhibidor de la peroxidasa. Todas las 16 diapositivas serán tratadas con el inhibidor de la peroxidasa (600 + [150 x 16] = 3.000 μl). Añadir 3 mL de bloqueo de la peroxidasa en el envase.
- Antes de preparar el trabajo concentraciones de fluors, resuspender los fluors liofilizados añadir 75 μl de dimetilsulfóxido a cada tubo fluor proporcionado por el fabricante. Mezclar por pipeteo. Se trata de la acción del fluor TSA. Almacenar a 4 ° C.
- Prepare seis contenedores de titulación, uno para cada fluor. El volumen requerido en microlitros es de 350 + (150 x [número de diapositivas]). Cada fluor se aplicará a las 16 diapositivas en este caso (amígdala ocho y ocho de pulmón). El etiquetado y los volúmenes para todos los envases se indican en la tabla 4.
- Cuando todos los reactivos han sido registrados y preparado, colocar cada envase en cualquier posición en una parrilla y carga todos los reactivos en el stainer automatizado. El sondeo confirma el volumen de cada reactivo.
8. automatizado Stainer: Muestra la configuración y coloración multiespectral
-
En el software de stainer automatizado, haga clic en configuración de diapositiva en la parte superior de la pantalla. Haga clic en agregar estudio. Rellenar la ventana emergente con el ID de estudio nombre del estudio y comentarios.
- Seleccione el nombre del investigador de llevar a cabo el funcionamiento de la tinción de la lista desplegable. Dejar el volumen dispensado en 150 μL. Seleccione multiespectral Dewax protocolo de preparación. Haga clic en Aceptar y agregar diapositivas. En comentarios, escriba "Múltiplex 1 pulmón 123ABC." Complete los siguientes campos como se indica: Tipo de tejido = tejido de prueba; Volumen dispensado = 150 μL; Modo de tinción = simple, rutinaria; Marcador = negativo; La coloración = tipo "7 multiplexar protocolo 1"; Preparación = Bake multiespectral, Dewax 2 h; HIER = HIER 20 min con ER1.
- Haga clic en Agregar Diapositiva y cambiar los comentarios y protocolo añadir diapositivas control de gota y control deslizante de isotipo. Cuando todas las diapositivas se han añadido al estudio, cierre la ventana agregar diapositivas e imprimir etiquetas. Coloque las etiquetas en el área de la etiqueta apropiada en cada diapositiva.
- Cargue los portaobjetos en racks, aplicar azulejos de cubierta en la orientación correcta, inserte los estantes en el stainer automatizado y bajar las bandejas. El dispositivo escaneará las etiquetas diapositiva.
- Cuando todas las diapositivas y los reactivos han sido analizados y medidos. Activará el interruptor de marcha (►). Si el autostainer detecta los errores, tales como volumen insuficiente de reactivo, aparece un símbolo de advertencia amarillo por la bandeja de afectados. Si se produce un error, haga clic con el botón derecho el símbolo de precaución y remediar el error.
- Iniciar la tinción inmediatamente o programar un inicio con retardo. El protocolo es aproximadamente 14 h de duración. Nota: Asegúrese de que el protocolo se completa en un momento cuando las diapositivas pueden eliminarse inmediatamente como Teloslozhenie lavado podría afectar resultados de tinción.
9. cubreobjetos de diapositivas multiespectrales
- Quite las diapositivas de stainer automatizado y almacenarlos en un estante sumergido en 1 x cucharadas
- Montar las muestras con cubreobjetos no. 1.5 y 15 μl de los medios de montaje (véase Tabla de materiales). Eliminar las posibles burbujas presionando suavemente el cubreobjetos con una punta de pipeta.
- Deje que los portaobjetos curar durante la noche a temperatura ambiente en el Banco de laboratorio. Diapositivas pueden digitalizarse inmediatamente con el tratamiento cuidadoso.
10. multiespectral Scanner
- Encienda el escáner multiespectral y su equipo (véase Tabla de materiales información modelo y software). Inicie el software de control de microscopio. Abra la puerta frontal del escáner multiespectral con la tecla sensible al tacto en la parte frontal del dispositivo. Cada portadora por resorte en el escáner contiene cuatro diapositivas. Cargar todas las diapositivas en portadores y grabar la orden antes de los portadores de carga en el dispositivo.
- Seleccione Protocolo de edición y haga clic en nuevo...; crear el nombre de protocolo Multiplex del Panel 1 y soltar los controles. Crear el nombre de estudio Desarrollo del Panel de Multiplex, haga clic en Protocolo de creary escriba Resumen análisis filtro DAPI; a continuación, seleccione Todo Slide Scan y Pixel resolución 0.50 μm (20 X). Deben estar representadas todos los filtros y bandas. Si no, haga clic en Editar filtros y bandas, seleccione todos los cinco filtros (DAPI, FITC, CY3, Texas Red y CY5) y a continuación, haga clic en Editar exposiciones.
- El portador de carga seleccionando el portador con el múltiplex completo de adenocarcinoma de pulmón. Seleccione la diapositiva correcta mediante la interfaz gráfica de usuario. Enfocar el tejido manualmente o mediante el uso de enfoque automático. Desplazarse a cualquier zona con aceptable de la coloración de DAPI y haga clic en Auto-exponer para ajustar la exposición en milisegundos (0 – 2.000 ms).
- Repita el mismo procedimiento para los cinco juegos de filtro en columnas el escaneo todo y región de MSI. Asegúrese de navegar a un área con coloración aceptable y enfocar el microscopio antes de la exposición para cada nivel de filtro y amplificación. Auto-exponer para todos cinco filtros en un 20 x exploración general y 20 x multiespectrales regiones multiespectrales de proyección de imagen (ICM). Seleccione una resolución de pixel de 0.50 μm (20 x). Guardar el protocolo y haga clic en atrás para volver a la pantalla principal del software Vectra; a continuación, haga clic en Escanear diapositivas.
- Abre la interfaz para cada diapositiva y tarea a analizar. Establece estudio en Desarrollo del Panel de Multiplex, Protocolo Multiplex del Panel 1y soltar los controles y ID tobogán Múltiplex pulmonar ABC123, Multiplex CD68 gota pulmón ABC123, etcetera . Cuando las diapositivas han sido etiquetadas y se establecen tareas, haga clic en escanear. El escáner multiespectral automatizado realizará exploraciones de diapositiva completa de todas las diapositivas con todos los filtros de cinco.
11. multiespectral escáner: Las imágenes multiespectrales
- Una vez terminados los análisis, abra el software QPTIFF ("Phenochart") y haga clic en Diapositiva de carga en la parte superior izquierda. Se abrirá un QPTIFF, que es un filtro de cinco diapositiva todo análisis. Cada capa contiene información de más de un fluor, por lo que la utilidad es limitada, pero la estructura del tejido y los patrones de expresión amplia son evidentes y pueden utilizarse para seleccionar regiones de MSI.
- Desplácese a y abra la diapositiva correcta en el estudio usando el árbol desplegable de la izquierda. Sesión (arriba a la derecha) con las iniciales del usuario.
- Seleccione cinco regiones para MSI mediante la herramienta de sello en la parte superior de la pantalla. Consulte a un especialista si está disponible. En seleccionar, seleccione adquisición; en tamaño de campos, seleccione 1 x 1; y bajo restricción de campo, seleccione 0,5 μm (20 x). Basado en el cytokeratin (CK) tinción (principalmente en Cy5), seleccionar varias regiones con tumor (CK +) y estroma (CK-) para ser reflejada de la exploración general. Repita este procedimiento para cada diapositiva.
- Una vez seleccionada todas MSI, cerrar el software de Phenochart y volver al software Vectra . Cambiar la tarea de analizar a MSI para cada diapositiva y, a continuación, haga clic en Scan nuevamente para realizar la colección de MSI.
12. espectral idear
Nota: El paso de unmixing espectral se requiere para la separación de canal y análisis de imágenes de las diapositivas. Antes de unmixing espectral se realiza en el software de informar, debe construirse la biblioteca espectral usando diapositivas de adenocarcinoma de pulmón manchadas con cada fluor solo y con DAPI solo. Este procedimiento también se describe en el ya mencionado Multiplex IHC ensayo guía de desarrollo.
- Cuando se completa la adquisición de MSI, utilice unmixing espectral ("informar") software para abrir archivos en la carpeta MSI . Estos archivos terminan con la extensión de tipo de archivo de .im3.
- En formato de imagen, seleccione multiespectral; en formato de muestra, seleccione fluorescencia; y en fuente de la biblioteca espectral, seleccione InForm.
- Para seleccionar fluors, seleccione y cargue todos los seis fluors y DAPI de la biblioteca construida con las diapositivas de biblioteca de adenocarcinoma de pulmón. Haga clic en Preparar todo (inferior izquierda). Software unmixing espectral realiza unmixing espectral en todas las imágenes abiertas, utilizando los perfiles espectrales proporcionados.
- Con un patólogo, evaluar el patrón de tinción contra manchas solo cromogénicos del objetivo mismo en diapositivas secuenciales del mismo tejido.
13. evaluación de la intensidad de la fluorescencia y la atenuación de la señal
Nota: La herramienta de cuentas, que aparece como una flecha con una pequeña caja marrón, es la herramienta más importante para la optimización de multiplex y debe ser utilizada con frecuencia (ver Materiales complementarios). Con la herramienta de cuentas en el software de unmixing espectral, evaluar el cociente signal-to-noise, que como mínimo debe superar los 10:1 (ver Material suplementario para solucionar problemas y para la evaluación del multiplex la coloración con los controles de la gota).
- 13.1. con una imagen abierta en el software de unmixing espectral, enganche la herramienta cuentas y encuesta de imágenes para evaluar la intensidad de fluorescencia de cada canal. La intensidad de blanco en tejido pulmonar está entre 10 y 20 cuentas normalizadas. La herramienta de normalizado de la cuenta se muestra en la figura 1.
- Excluir diapositivas con cuentas de señal máxima de cuentas de área de señal de menos de 10 o normal de menos de cinco por cualquier marcador para que la autofluorescencia y la coloración fuera del objetivo no compiten con la señal auténtica.
- Diapositivas de excluir con máximo cuenta mayor de 30 para cualquier canal evitar sangrado espectral o unmixing espectral ineficiente.
- Dirección altas o bajas de cuentas normalizadas mediante el ajuste de la concentración de la TSA.
14. Análisis de la imagen multiespectral
- Abrir MSI uno o más en el software unmixing espectral y fluors sólo seleccionados de unmixing en al menos una imagen abierta. Haga clic en Preparar todo para separar todas las imágenes para producir imágenes espectral sin mezclar color actualmente abierto.
- Seleccione la herramienta de cuenta a cuenta a través de cada imagen por revoloteando sobre las áreas de interés.
- Seleccione el icono de ojo para abrir el editor de la vista. Seleccionar y ajustar la intensidad de la pantalla de cada canal independiente.
- Seleccione configurar para abrir la segmentación del tejido, segmentación de la célula, phenotyping y módulos de puntuación. Estas herramientas son necesarias para la validación objetiva de multiplex tinción contra manchas solo cromogénicos y pueden utilizarse para generar datos cuantitativos phenoptic (Figura S1).
- Utilice la ficha exportar para guardar en escala de grises, fluorescente pathview-estilo sin compresión TIFF y archivos de datos de los módulos de análisis de phenoptic para más análisis, archivo y presentaciones (Figura S1).
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Representative Results
El protocolo descrito aquí proporcionará resultados como los mostrados en la figura 2. Comenzar con una evaluación de la tinción en el control de la amígdala, comenzando con el epitelio escamoso superficial. La histología de la muestra de la amígdala puede ser revisada con un patólogo, haciendo referencia a la diapositiva de H & E. Si secciones IHC cromogénicos se realizan con los mismos marcadores en el mismo bloque de tejido, entonces estos pueden utilizarse para confirmar la densidad y la distribución de cada marcador de la diapositiva del FOMIN. Como se muestra en la figura 2A, el tejido de la amígdala debe proporcionar claramente definido cytokeratin AE1/AE3 manchas en el epitelio escamoso superficial de amígdala (figura 2A; como pseudocolor rojo), sin antecedentes en la linfoide tejido. La tinción debería citoplásmica, en ocasiones con acentuación de la membrana, y los núcleos deben ser negativos. El epitelio reticulado en las criptas debe ser positivo para citoqueratinas (rojo) y PD-L1 (figura 2A; verde pseudocolor). Luego, deben identificarse los centros germinales foliculares de la amígdala. Los centros germinales deben ser fácilmente reconocibles y deben ser ricos en linfocitos de Ki-67-positivos (figura 2A; amarillo pseudocolor). Tinción de Ki-67 siempre debe ser nuclear. Los macrófagos presentes en los centros germinales también deben ser fácilmente reconocibles, a veces como células más grandes (también llamadas "cuerpos tingibles"). Presentan coloración positivas para CD68 como una tinción citoplásmica granular (figura 2A; naranja pseudocolor). Una proporción variable de células CD68 fuera de los centros germinales es también de esperar. Los macrófagos pueden mostrar membrana para PD-L1. Esto es típicamente más pálido en la intensidad de coloración para PD-L1 en el epitelio reticulado. No debe ser nuclear CD68 tinción. CD8 debe manchar los linfocitos con una distribución del T-cell (menos en los centros germinales y una mayor proporción en las zonas interfollicular; vea la figura 2A, cian pseudocolor). Los linfocitos CD8 + son generalmente pequeñas células con escaso citoplasma, por lo que es prácticamente imposible distinguir la membrana y citoplasma de los linfocitos. PD-1 mancha fuertemente pequeños linfocitos en la zona de centro germinal, agrupados generalmente en la periferia de los centros germinales (figura 2A; magenta pseudocolor), así como dispersos de linfocitos en la región interfollicular, generalmente mostrando una menor intensidad de la tinción que en la zona del centro germinal. Como con CD8, no es posible distinguir claramente la membrana y tinción citoplasmática en pequeños linfocitos teñidos con PD-1. Porque una proporción variable de células CD8 coexpresan PD-1, se recomienda para control de calidad que el patrón de tinción y distribución de cada marcador que se tiñe en los tejidos mismos compararse con diapositivas de referencia cromogénicos IHC, como sugiere en protocolos previamente publicados12.
Después de que el patrón de coloración que se ha confirmado en el control de tejido de la amígdala, proceder a evaluar la coloración de la muestra de cáncer de pulmón (figura 2B). Porque se espera que los tejidos del tumor muestra una expresión variable y heterogénea de los marcadores, es muy importante que durante la optimización de un nuevo panel de FOMIN a comparar el patrón de coloración para cada marcador individual observada en el método de FOMIN y su expresión observa en la diapositiva IHC cromogénica estándar, evaluando la cantidad y distribución de las células positivas como se describió anteriormente12. Sin embargo, el patrón de tinción básico debe conservarse; por ejemplo, cytokeratins deben observarse en el citoplasma de las células epiteliales y nunca en un núcleo; CD68 debe aparecer como tinción citoplásmica granular en macrófagos, etcetera. Lo importante es que, en algunos marcadores, la intensidad de la tinción puede cambiar desde el control de la amígdala en el tejido del cáncer; por ejemplo, PD-1 y PD-L1 pueden mostrar manchas en el tejido del tumor en comparación con la expresión muy alta observada en el control de la amígdala de menor intensidad. Por lo tanto, es importante realizar la evaluación y optimización con la herramienta de cuentas en el software de informar, mediante ejemplos de los tejidos del tumor en lugar de los controles de la amígdala.
Por último, controles de isotipo-negativo y de gota deben evaluarse, no sólo para la detección de Autofluorescencia y de fondo, sino también para efectos de paraguas y corrimiento espectral (figura 3 y figura 4). Controles de isotipo no deben demostrar ningún inmunotinción en toda la diapositiva; Si se observa una tinción, entonces la proyección de imagen o procedimiento de tinción debe examinarse de nuevo. Controles de la gota son importantes para evaluar posibles artefactos en la coloración, tales como efectos de sangrado o paraguas espectrales, debido al método de FOMIN durante la optimización de un nuevo panel de multiplex (ver figura 5, S2 figura complementaria, Complementario de la figura S3y materiales complementarios). Fluorescente monoplex y gota de los controles deben evaluó y se comparó con el panel completo múltiplex. Cada control de gota debe mostrar el mismo patrón de coloración salvo el único anticuerpo primario, que debe quitarse en cada control específico. Más detalles se proporcionan en la sección Materiales complementarios .
Figura 1 : informar herramienta cuenta. El informe cuenta la herramienta de software se activa seleccionando el icono de la caja beige. Normalizado de la cuenta se corrige para profundidad de bits, tiempo de exposición, ganancia y binning. Las imágenes fueron tomadas en 20 aumentos; la barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Resultados representativos. Carcinoma del pulmón de la célula del nonsmall amígdala (A) y (B) se tiñeron con PD-L1 (TSA 520, verde), CD8 (TSA 540, cian), Ki67 (570 TSA, amarillo), CD68 (620 TSA, naranja), citoqueratina (650 TSA, rojo) y PD-1 (690 TSA, magenta). Canales individuales se representan por separado a continuación en pequeños paneles. El marcador se indica en la parte superior derecha de cada imagen. Las imágenes fueron tomadas en 20 aumentos; Barra de escala = 50 (o 250 μm). Indicado en el panel A es 1) folículo linfoide, centro 2) germinal, zona 3) interfollicular y 4) estratificado epitelio escamoso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Efecto de bloqueo/paraguas TSA. Este es un ejemplo de TSA 690 depositado PD-1 bloqueo de anticuerpos CD3 de una señal de una manera dependiente de la cantidad de presente de la TSA. La señal más brillante de la TSA 690 bloquea la señal TSA 620 más eficazmente (carcinoma del pulmón de la célula del nonsmall teñidas con anti-PD-1 D4W2J durante 30 min a 0.52 μg/mL o isotipo seguido por una detección de TSA de 10 min 690 en 1: 100; entonces, F7.2.38 anti-CD3 durante 30 min a 0.14 μg/mL seguido por una detección de TSA 620 de 10 min a 1: 100). Las imágenes fueron tomadas en 20 aumentos; la barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Corrimiento espectral. Tejido de carcinoma de pulmón de la célula del nonsmall estaba manchada con el protocolo de control de la gota de Ki-67 (protocolo multiplex completo con el anticuerpo Ki-67 que se omite). Se muestran el canal 540 de TSA (CD8) y el canal 570 de TSA (Ki-67). Ningún patrón de coloración nuclear es evidente, sin embargo, una copia reducida de los CD8 patrón de coloración se observa en el canal TSA 570. Esto es mejor abordado por asegurar intensidades de coloración comparables en todos los canales. En este caso, la adición de una señal robusta de Ki-67 (normalizado cuenta entre 10 y 20) corregirá el corrimiento espectral. Las imágenes fueron tomadas en 20 aumentos; la barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Gota controles. Esta figura muestra una imagen compuesta de un completo múltiplex en comparación con la misma región de diapositivas secuenciales de adenocarcinoma de pulmón con controles de gota en la que el anticuerpo primario indicado fue omitido. Las imágenes fueron tomadas en 20 aumentos; Barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre | Nombre abreviado | Tipo | Envase | Grupo |
| Tampón de bloqueo de PKI | OPALBLOK | Auxiliares | Abrir 30 mL | General |
| Opal polímero HRP | OPAL 2AB | Auxiliares | Abrir 30 mL | General |
| OPAL 1 x TBS | OPAL1TBS | Auxiliares | Abrir 30 mL | Kit det. |
| CD68 0.30 μg/mL PG-M1 Mus | OPALCD68 | Auxiliares | Abierto 7 mL | General |
| 0,61 μg/mL de Ki67 MIB-1 Mus | OPALki67 | Auxiliares | Abierto 7 mL | General |
| PD-L1 0.20 μg/mL SP263 Rab | OPALPDL1 | Auxiliares | Abierto 7 mL | General |
| PD-1 0.52 μg/mL D4W2J Rab | OPAL PD1 | Auxiliares | Abierto 7 mL | General |
| CD8 0.70 μg/mL SP239 Rab | CD8 DE ÓPALO | Auxiliares | Abierto 7 mL | General |
| 0,24 μg/mL CK AE1/AE3 Mus | CK DE ÓPALO | Auxiliares | Abierto 7 mL | General |
| IgG de ratón | MUS DE ÓPALO | Auxiliares | Abierto 7 mL | General |
| IgG de conejo | RAB DE ÓPALO | Auxiliares | Abierto 7 mL | General |
| Bloque de peroxidasa de ópalo | OPALPERX | Auxiliares | Abierto 7 mL | General |
| DAPI espectral | OPALDAPI | Auxiliares | Valoración 6 mL | General |
| Reactivo de ópalo 520 | OPAL 520 | Auxiliares | Valoración 6 mL | General |
| Reactivo de ópalo 540 | OPAL 540 | Auxiliares | Valoración 6 mL | General |
| Reactivo de ópalo 570 | OPAL 570 | Auxiliares | Valoración 6 mL | General |
| Reactivo de ópalo 620 | OPAL 620 | Auxiliares | Valoración 6 mL | General |
| Reactivo de ópalo 650 | ÓPALO 650 | Auxiliares | Valoración 6 mL | General |
| Reactivo de Opal 690 | OPAL 690 | Auxiliares | Valoración 6 mL | General |
Tabla 1: Enlace de Leica RX protocolo, reactivos de ópalo
| Reactivo de | Tiempo (h) | Temperatura (grados Celsius) | |
| 1 | No reactivo | 120:00 | 60 |
| 2 | Bonos Dewax solución | 0:30 | 72 |
| 3 | Bonos Dewax solución | 0:00 | 72 |
| 4 | Bonos Dewax solución | 0:00 | Ambiente (temperatura ambiente) |
Tabla 2: Protocolo de preparación de ópalo
| Blanco | μg/mL | Clon | Fuente | Mucho | Stock μg/mL | Μl de diluyente | ΜL AB |
| CD68 | 0.3 | PG-M1 | Dako | 20043031 | 30 | 2376 | 24 |
| Ki67 | 0,61 | MIB-1 | Dako | 20049476 | 46 | 2368.17 | 31.83 |
| PD-L1 | 0.2 | SP263 | Ventilación. | F09591 | 1.61 | 2101.86 | 298.14 |
| PD-1 | 0,52 | D4W2J | CST | 1 | 100 | 2387.52 | 12.48 |
| CD8 | 0,7 | SP239 | Ventana | 160318 | 70 | 2376 | 24 |
| CK | 0.24 | AE1/AE3 | Dako | 10129428 | 179.5 | 2396.79 | 3.21 |
| Mus de IgG | 0,61 | ||||||
| RAB IgG | 0,7 |
Tabla 3: Preparación de anticuerpos primarios.
| Fluor de ópalo | Las diapositivas | Dilución | Μl de diluyente | Fluor de ópalo μl |
| Opal 520 | 16 | 1: 200 | 2736.3 | 13.8 |
| Opal 540 | 16 | 1:700 | 2746.1 | 3.9 |
| Opal 570 | 16 | 1: 150 | 2731.7 | 18.3 |
| Opal 620 | 16 | 1: 100 | 2722.5 | 27.5 |
| Ópalo 650 | 16 | 1: 350 | 2742.1 | 7.9 |
| Opal 690 | 16 | 1: 150 | 2731.7 | 18.3 |
Tabla 4: Preparación de Fluor de ópalo.
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1 mesa adicional: bonos de Leica RX Opal protocolo Multiplex. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Suplemento tabla 2: Resumen y comparación de múltiplex completo, controles de descenso y controles de isotipo completo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
La revolución de la inmunoterapia de cáncer curso es apertura nuevas y prometedoras opciones terapéuticas para pacientes de cáncer13. Avances en el campo de la inmuno-Oncología requiere mayor conocimiento del microambiente del tumor inflamatorio, no sólo para entender la biología de los mecanismos inmunológicos involucrados en la carcinogénesis pero también para encontrar biomarcadores predictivos para el nuevo tratamientos basados en inmunoterapia1,2. Debido a la compleja biología de la inmunología del cáncer, interrogatorio de las muestras de tejido del tumor es generalmente necesaria para desarrollar una creciente lista de marcadores inmunes, que interactúan entre sí y con frecuencia son coexpressed por poblaciones de diversas células en el tejido1 ,2,5. Ensayos clínicos emplean típicamente pequeñas biopsias, como aguja de núcleo o biopsias endoscópicas, que son recogidas en diferentes puntos de la terapia para evaluar y monitorear la respuesta del paciente. Tales biopsias proporcionan una cantidad limitada de tejido, que a su vez limita el número de secciones de tejido que puede ser empleado para el cáncer immunoprofiling. Esta limitación es particularmente onerosa cuando se utilizan técnicas tradicionales, como el estándar monoplex IHC. Por lo tanto, existe una clara necesita métodos nuevos para el cáncer de immunoprofiling que hacen uso de técnicas multiplexores con la capacidad de evaluar simultáneamente el coexpression de diferentes biomarcadores y hacer un uso más eficiente de especímenes de tejido valiosa.
En la tinción multiplex y métodos de imagen multiespectrales que se describe en detalle aquí, un panel del FOMIN se utiliza para estudios de inmuno-Oncología en tejidos FFPE como biopsias de un ensayo clínico. Este método ha sido descrito previamente validado y aplicado con éxito a cáncer immunoprofiling8,9,10,11,12,14, 15. protocolos previamente publicados han descrito FOMIN similar coloración métodos con sistemas TSA, como el kit de siete colores, que es lento y requiere aproximadamente 4 días de trabajo por un dedicado laboratorio científico12 ,15. En respuesta a estas deficiencias, este protocolo se ha optimizado mediante el uso de un stainer automatizado disponible comercialmente, acortando dramáticamente la coloración hora a 14 h y eliminando la variabilidad introducida por los operadores de manual. La proyección de imagen se lleva a cabo en un escáner multiespectral capaz de separar los espectros de las señales fluorescentes siete o más en las diapositivas multiplexores, incluyendo autofluorescencia, que puede eliminarse eficientemente sin degradar la calidad de la señal. Este protocolo se puede replicar, modificada y realizada por cualquier usuario con acceso a los instrumentos y reactivos que se detallan en la Tabla de materialesde laboratorio.
Pasos críticos en este protocolo son secciones 7, 10, 11, 12. Sección 7 se refiere a la preparación de los reactivos. Una preparación cuidadosa de los reactivos para la tinción de múltiplex es esencial, que requiere la atención de un laboratorio científico o técnico para evitar la variación depende del operador. Por ejemplo, uno de los principales problemas con el método múltiplex es tinción de variabilidad, que puede ser reducida por la cuidadosa preparación de las diluciones de los reactivos, especialmente los tintes de la TSA. Las secciones 10 y 11 están relacionados con adquisición de imágenes. Un riesgo importante es la exposición excesiva o sobresaturación de imágenes, que pueden conducir a sangrado espectral, un artefacto en el cual la señal de otro canal interfiere con el canal se va a examinar (ver Materiales complementarios). Regulando cuidadosamente los tiempos de exposición puede ayudar a prevenir la sobresaturación y corrimiento espectral. Unmixing espectral se lleva a cabo en la sección 12. Esto se basa en la preparación de la biblioteca espectral (descrita en el Multiplex IHC ensayo desarrollo guía, disponible en línea). En este paso, el software inForm es "entrenado" para reconocer específicamente los colores para cada tinte TSA. La biblioteca espectral es creada mediante las secciones de un tejido de control, como la amígdala humana, teñida con un marcador uniformemente expresado, por ejemplo CD20, junto con cada tinte individual de TSA en diapositivas individuales. Además, diapositivas de Autofluorescencia (también descritos en la guía de desarrollo de ensayo de IHC Multiplex) son necesarios para entrenar el software inForm a reconocer y restar la autofluorescencia de los tejidos. Diapositivas control de Autofluorescencia deben preparados mediante el uso de muestras de los mismo tejidos en estudio (como cáncer de pulmón, etc.), tratados de la misma manera que las diapositivas de FOMIN y se incubaron con anticuerpos primarios y secundarios, pero sin el tinte de la TSA. Sólo un perfil espectral única autofluorescencia puede ser seleccionado, por lo que debe tenerse cuidado para seleccionar una representación de la autofluorescencia observable que puede provenir de colágeno, fibrosis, células de sangre rojas, pigmentos endógenos y otras fuentes. Crear una nueva biblioteca espectral al principio de cada nuevo proyecto y utilizando un espectro de Autofluorescencia que representa el estudio de especímenes de tejido, así como ejecutar los mismos bloques de tejido como control positivo para cada lote dentro del mismo proyecto, son valiosos pasos metodológicos que ayuden a mejorar la consistencia de lo espectral idear a través de diferentes muestras en el mismo proyecto.
El método múltiplex que se describe en este protocolo ofrece varias herramientas de solución de problemas, incluyendo un evaluador de señal a ruido (herramienta de cuentas), controles de gota (Materiales complementarios) y una vista de la patología para control de calidad de la tinción. La herramienta de cuentas ayuda a evaluar la intensidad de la tinción y el nivel de fondo. Si la intensidad o niveles de fondo son altos, el primer enfoque es reducir la dilución de la tintura de la TSA. Si el problema persiste, las diapositivas IHC cromogénicos utilizadas para la optimización de ese marcador particular deben revisarse con un especialista, en busca de la presencia de fondo. La vista de la patología es generada por el software de informar, mediante una representación de diaminobenzidina-como pseudocolor de la fluorescencia de la fluor TSA-ligado, así como una representación de hematoxilina imitación generados a partir de todas las señales fluorescentes, incluyendo DAPI . Imágenes de la vista de la patología ayudan con la evaluación visual de los patrones de tinción por un patólogo para mejora la coloración. Estas herramientas siempre deben ser empleadas durante la optimización de un nuevo panel y como medidas de control de calidad durante el flujo de trabajo de coloración.
El FOMIN método requiere el uso de anticuerpos primarios que han sido adecuadamente validados y optimizado para IHC cromogénico estándar de tejidos formalina-fijos. Por ejemplo, una de las principales ventajas del método TSA FOMIN es su compatibilidad con el uso de anticuerpos primarios que han sido validadas y optimizadas en el laboratorio de patología anatómica para uso clínico12. Esta ventaja significa que los paneles múltiplexes pueden personalizarse por el usuario de laboratorio para Inmunología de cáncer específico de preguntas sin necesidad de anticuerpos preconjugated, el panel rápido y dinámico desarrollo. En este sentido, el actual flujo de trabajo para la optimización de un nuevo panel comienza con la validación y optimización de los anticuerpos con estándar IHC cromogénico, buscando la mejor dilución y condiciones que proporcionarán la coloración limpia y consistente de tinción. El siguiente paso, usando las mismas diluciones optimizadas para IHC, es transferir la tinción mediante fluors TSA en lugar de diaminobenzidina y comparar los resultados de monoplex inmunofluorescente TSA con el IHC cromogénica como referencia. Por último, los anticuerpos pueden combinarse en FOMIN coloración, utilizando siempre el IHC cromogénica patrón de coloración como una referencia de control para ajustar los parámetros tinción del TSA de FOMIN, principalmente las diluciones de la tintura TSA y la secuencia de tinción. Durante este proceso, colaboración con el patólogo es fundamental para evaluar la calidad de la tinción.
Limitaciones de esta técnica son el tiempo y esfuerzo necesarios para la optimización y validación de nuevos paneles y el análisis de immunophenotyping de los paneles del FOMIN. La principal preocupación, sin embargo, es la adecuada validación de los métodos de FOMIN. La falta de una validación adecuada de estas técnicas conlleva el riesgo de generar resultados no válidos, que pueden añadir datos confusos a la literatura, de tal modo que obstaculizan los intentos para obtener una mejor comprensión de la biología de cáncer Inmunología16. Por lo tanto, es titular en el investigador para hacer todo lo posible para validar correctamente métodos multiplexores, incluyendo garantizar la estrecha participación y evaluación por los patólogos con capacitación y experiencia en validación y evaluación de los tejidos histopatología y técnicas basadas en IHC17,18,19,20. El protocolo que presentamos incluye algunas de las herramientas que pueden ayudar con la validación de un nuevo panel de multiplex, incluyendo la evaluación de la patología de diapositivas H & E tinción y análisis, el uso de IHC cromogénico como referencia para optimizar el FOMIN TSA Tinción, la gota de control control de calidad de un nuevo múltiplex de panel y el uso del isotipo, Autofluorescencia y soltar los controles. A pesar de la complejidad técnica del FOMIN métodos, tecnologías como imágenes multiespectrales con unmixing espectral, así como otras plataformas multiplexores novela, están abriendo una nueva era para el análisis de muestras de tejido de pacientes y la generación de nuevas formas de datos que no es posibles con solo estándar IHC. Por lo tanto, el desarrollo y aplicación de técnicas de FOMIN seguirá creciendo, convirtiéndose en poderosas herramientas para la immunoprofiling de cáncer de las biopsias para ensayos clínicos y ayudando a identificar nuevos biomarcadores predictivos multiparamétrico para inmunoterapia, benefician, sobre todo, el paciente de cáncer.
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Disclosures
Este trabajo fue apoyado por MedImmune, el biologics global R & D arm de AstraZeneca. C.W., K.R. y C.C.H. son empleados de Perkin Elmer, que produce los reactivos (kit de la TSA) y escáneres multiespectrales que se utilizaron en este trabajo. M.S., K.D., A.H., W.Z., C. Bagnall, C. Brown, J.C., A.L., K.S., M.R. y J.R.C. son empleados de MedImmune con participación o intereses comunes o las opciones en AstraZeneca.
Acknowledgments
Apoyo editorial fue proporcionada por Deborah Shuman de MedImmune.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
References
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