Summary
Aquí, presentamos un protocolo para investigar cambios en el nivel de ansiedad de modelos de animales roedores. La elevada más laberinto prueba (EPM), utilizado junto con un vídeo de seguimiento de software, proporciona un método fiable para documentar el efecto de distintos potenciales tratamientos de ansiolíticos en escenarios de laboratorio preclínicos.
Abstract
El objetivo general de este estudio es describir la metodología de la elevada más prueba del laberinto (EPM) en combinación con un software de seguimiento de video. El propósito del método es documentar el efecto de distintos potenciales tratamientos de ansiolíticos en modelos de roedores de laboratorio. La prueba EPM se basa en la propensión de los roedores hacia espacios oscuros protegidos, cerrados y miedo incondicionado de su innata motivación intensa para explorar nuevos ambientes, espacios y alturas. La prueba EPM es una prueba de comportamiento utilizada para investigar las respuestas ansiolíticas o anxiogenic de roedores reciben medicamentos que afectan el comportamiento. Observación demostrando una proporción menor de tiempo en los brazos cerrados, una mayor proporción de tiempo dedicado a brazos abiertos, un número reducido de entradas a los brazos cerrados y un número elevado de entradas abrir brazos medidos por la prueba EPM puede reflejar reducido niveles de ansiedad. Usando este método, el efecto de los suplementos de cetona exógenas en el comportamiento relacionados con la ansiedad se prueba en ratas Sprague Dawley (SPD). Suplementos exógenos de la cetona son alimentados crónicamente a las ratas durante 83 días o subchronically y gavaged aguda por vía oral, diariamente durante 7 días, antes de realizar la planificación prueba. Recogida de datos conductuales se realiza utilizando el vídeo inteligente sistema de seguimiento por un observador ciego al final de los tratamientos. Los principales hallazgos indican que la prueba EPM es un método eficaz para detectar el efecto ansiolítico inducida por suplemento de cetona y se puede considerar una medida sensible para evaluar los cambios en el comportamiento de ansiedad asociados con las drogas o metabólico basado en terapias.
Introduction
El objetivo de este artículo es describir la metodología de la prueba EPM en combinación con un vídeo de seguimiento de software para monitorear cambios en el comportamiento relacionados con la ansiedad y nuevos tratamientos en modelos de roedores de laboratorio. El EPM es un método de evaluación del comportamiento relativamente simple, que se desarrolló para la investigación de cuantificación de niveles de comportamiento de ansiedad y respuestas de ansiedad de las ratas después de la aplicación de tratamientos de drogas1. De hecho, se ha demostrado que la prueba EPM es un ensayo de conducta ampliamente utilizado y eficaz para la investigación de los cambios en los niveles de ansiedad de roedores1,2. La aplicabilidad de la prueba EPM en los roedores (principalmente ratas y ratones) se basa en su propensión hacia espacios cerrados y oscuros (enfoque), un miedo sin acondicionar espacios abiertos/alturas (evitación) y su alto nivel de motivación innata para explorar la novela ambientes. En consecuencia, la prueba EPM es una metodología bien establecida basada en un conflicto de aproximación-evitación2,3.
El EPM es un aparato en forma de plus que consiste en cuatro brazos elevados, que ha sido descrito por Handley y Mithani4 (figura 1) y consta de dos brazos opuestos que están abiertos a los alrededores (brazos abiertos), mientras que los dos cerraron los brazos enfrentados (brazos cerrados) están equipados con paredes. Después del tratamiento, si mayor es el tiempo en los brazos abiertos y un mayor número de entradas de brazo abierto en comparación con el control de animales (no tratados) se detecta en el EPM, esto indica un efecto ansiolítico2,3. La respuesta de evitación más robusta ha demostrado en los primeros 5 minutos después del comienzo (colocación de las ratas en la intersección de los cuatro brazos del EPM) del ensayo EPM5; por lo tanto, cualquier comportamiento después de un tratamiento comúnmente se registra durante 5 minutos en el EPM. Como medidas adicionales de un nivel de ansiedad, el número de inmersiones cabeza, traseros (posición vertical del roedor sobre dos patas traseras), boli fecal, así como brazo total entradas (actividad motora espontánea) y las diferentes posturas (estiramiento o congelación), también se puede grabar en la EPM2. Por lo tanto, varios parámetros conductuales pueden compilarse para proporcionar una evaluación exhaustiva del comportamiento relacionadas con la ansiedad.
Para aumentar la validez de los resultados, análisis de comportamiento de dos o tres se usan juntos, como el test de elección claro oscuro, la prueba de interacción social, y la prueba EPM, para medir los niveles de ansiedad del animal diferentes modelos6. El ensayo EPM realizado solo en roedores es también un método adecuado para investigar el efecto ansiolítico o anxiogenic de diferentes fármacos7. La prueba EPM es sensible no sólo a benzodiazepine-tipo ansiolíticos (p. ej., diazepam)8, sino también, entre otros, a los compuestos aminos ácido, inhibidores de monoamino, peptidérgicos y nucleosidergic (p. ej., antagonistas del N-metílico-D-Aspartato (NMDA) AP7, antagonista del ácido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionico (AMPA) CNQX, morfina de agonista del receptor μ-opioide, NPY1 antagonista BIBP3226, sustancia P, ghrelina, oxitocina, agonistas de los receptores de la serotonina y antagonistas como la 8-OH-DPAT y Way-100635 y β1-adrenérgico antagonista betaxolol)9,10,11,12. En consecuencia, el ensayo EPM en roedores es un método sensible y conveniente para investigar la influencia de los diferentes tratamientos que influyen en áreas del cerebro implicadas en el efecto ansiolítico (por ejemplo, la amígdala, hipocampo y áreas límbicas) y mecanismos de acción (por ejemplo, el sistema serotoninérgico GABAérgico y adenosinergic) implicados en la ansiedad2. Los agentes probados en estos estudios de la EPM incluyen suplementos de cetona exógenas que alteran el cerebro en formas sutiles que pueden requerir un método sensible para detectar cambios de comportamiento.
En este artículo, se describe la prueba EPM utilizada en combinación con un vídeo de seguimiento de software, que ayuda a eliminar el sesgo experimental y facilita la recogida y análisis de las alteraciones conductuales en respuesta a los tratamientos ansiolíticos novela.
Protocol
El tratamiento de animales y procedimientos de medición fueron realizados según las University of South Florida Animal Care y el Comité uso (IACUC) las pautas (protocolo #0006R). Se hicieron todos los esfuerzos para reducir el número de animales utilizados.
1. preparaciones
Nota: El protocolo en general, requiere ratón o ratas criadas en laboratorio para las pruebas de EPM. Sin embargo, otros animales, como conejillos de Indias, también han sido probados en EPMs13. Es importante considerar el contraste de color entre los animales en el laberinto y el laberinto al usar video seguimiento. El contraste es menos importante para los investigadores observando animales vivo o a través de video. La configuración del video tracking software deba configurarse para documentar que los animales es blanco o negro en un laberinto negro o blanco. Problemas con configuración pueden ocurrir con un laberinto de acrílico transparente, pero un laberinto gris mate puede ser óptimo para ambos colores roedores.
- Seleccione los animales para el experimento, teniendo en cuenta el potencial de influir en factores como la cepa, sexo, ciclo estral y edad, así como cuerpo peso2.
- Basado en la experiencia individual, determinar el número de animales por grupo para la prueba.
Nota: El tamaño del grupo sea dependiente en el tamaño del efecto que se espera que con el tratamiento de prueba. Análisis de la energía generalmente se realizan antes de inicia el experimento para determinar el número mínimo de temas a incluirse dada la variabilidad en las respuestas del animal en cualquier tarea dada, así como el número de grupos y condiciones experimentales. - Diseño del experimento (en el que una batería de pruebas de comportamiento diferentes, como la prueba de campo abierto, prueba EPM, prueba de la placa de orificio y test de natación forzada se utilizará) cuidadosamente.
Nota: Previa a la exposición de los roedores a un entorno de prueba nuevo (como una prueba de campo abierto) inmediatamente antes de las pruebas EPM puede cambiar el comportamiento de los animales en la EPM1,2. - Manejar todos los animales de una manera similar antes de la prueba EPM.
Nota: Se ha demostrado que la aplicación de fármacos (p. ej., las inyecciones), estrés de envío y manejo, factores de estrés diferentes puede cambiar el comportamiento y las respuestas del comportamiento de los roedores en la EPM16. Así, la habituación de los animales y una casa para animales (por ejemplo, después del envío, de 1 a 2 semanas antes de la prueba EPM), condiciones experimentales, procedimientos de tratamiento (por ejemplo, gavaging) son necesarios. También es importante que el manejo de los roedores y alguna experiencia con estrés previo, sobre todo inmediatamente antes de la prueba, es consistente a través de animales y grupos de tratamiento. - Realizar los estudios conductuales en animales nocturnos, como las ratas y ratones, utilizando un ciclo inverso de la luz, para que la evaluación del comportamiento puede realizarse cuando los animales están en su fase oscura, activo.
Nota: Los efectos de la luz y las condiciones de vivienda diferentes ritmos circadianos/ciclo sobre el comportamiento y su influencia en los resultados EPM fueron demostrados previamente17, ya que las hormonas de los animales están reguladas por el ciclo de luz. - Utilizar a los mismos experimentadores durante los procedimientos y les pedimos que evitar perfumes o jabones con un fuerte olor.
- Pregunte a los experimentadores no a hablar cerca de los animales durante el experimento o mover objetos cerca del entorno de EPM.
Nota: Es muy importante que el observador hace movimientos mínimos y sin ruido en la recogida de datos conductuales. - Limpie el EPM todo después de cada ensayo para borrar cualquier olores de los animales anteriores que puedan interferir en la exploración por el animal de prueba.
- (Recomendado) Manejar los animales por varios días antes de la prueba EPM (recoger suavemente por el torso y se mantiene durante un minuto o dos) para aclimatar al experimentador.
- Al colocar los animales en el EPM, asegúrese de que todos los animales de manera consistente y colocar cada roedor en el EPM en la misma posición ante el mismo brazo (p. ej., en el centro de la frente el brazo abierto del experimentador).
2. uso de suplementos exógenos de la cetona
- Medir el peso corporal de los animales antes de comenzar cualquier tratamiento para determinar el cálculo de dosis para el tratamiento (por ejemplo, mediante sonda intragástrica).
- Familiarizar a los animales para el método de la sonda intragástrica (periodo de adaptación) con agua por sonda nasogástrica durante 5 d antes de la suplementación de cetona (dieta chow roedores/estándar [SD] + agua por sonda nasogástrica; por ejemplo, 2,5 g/kg de peso corporal de agua al día). Excluye el uso de cualquier animal que no se adapta al método mediante sonda intragástrica.
- Después del período de adaptación, alimentar los animales crónicamente 83 d y subchronically d 7 con SD y sonda todos los días con cualquier agua (p. ej., 5 g/kg peso corporal/día; grupo control: n = 8), cetona suplementos tales como éster de cetona (KE; 1, 3 - butanodiol-acetoacetato diester; por ejemplo, 5 g/kg de peso corporal/día; n = 8), sal de la cetona (KS; Na+/+k \u2012beta-hydroxybutyrate [βHB] sal; por ejemplo, 5 g/kg de peso corporal/día; n = 8), o KS + triglicéridos de cadena media (proporción 1:1, KSMCT; n = 8)18,19,20.
Nota: Los animales que recibieron la sonda intragástrica fueron probados en la EPM 1 h después del tratamiento. Ratas alimentadas con chow roedor estándar y gavaged con agua (sin suplementación de cetona) sirvió como grupo de control.
3. ansiedad análisis
- Aparato EPM
- Utilice el mismo aparato a través de un estudio para estandarizar resultados. El EPM es un aparato en forma de plus, que consiste en cuatro brazos (p. ej., los brazos pueden ser de 10 cm de ancho y 50 cm de longitud): se abren dos brazos opuestos, y los dos cerrados frente a brazos cuentan con paredes de alta (p. ej., 30 cm). El aparato se eleva por encima del suelo (p. ej., de 55 cm)2.
Nota: Los parámetros más utilizados son el tiempo acumulado en los brazos abiertos y el número de entradas en los brazos abiertos; sin embargo, el tiempo invertido en el centro y los brazos cerrados, y se mide el número de entradas en el centro y los brazos cerrados, así como la distancia recorrida en cada área. - Iluminan la planificación mediante el uso de iluminación indirecta (es decir, dirigir la luz fuente hacia el techo en lugar de iluminar directamente el aparato EPM) y asegurar los cuatro brazos del mismo modo están iluminados (sin sombras, ver figura 2).
Nota: Cambios en el nivel de la luz alteran el comportamiento de los roedores en el EPM. Por lo tanto, se necesita iluminación similar en animales experimentales consecutivos y días (p. ej., 2.800 lúmenes en la sala)2.
- Utilice el mismo aparato a través de un estudio para estandarizar resultados. El EPM es un aparato en forma de plus, que consiste en cuatro brazos (p. ej., los brazos pueden ser de 10 cm de ancho y 50 cm de longitud): se abren dos brazos opuestos, y los dos cerrados frente a brazos cuentan con paredes de alta (p. ej., 30 cm). El aparato se eleva por encima del suelo (p. ej., de 55 cm)2.
- Sistema de seguimiento de video
Nota: Utilice un sistema con una interfaz de computadora y una cámara de vídeo para la colección de datos que se recoge automáticamente datos conductuales en ratas (de seguimiento de videoFigura 3). Para el vídeo de seguimiento sistema, una gran variedad de cámaras analógicas estándar o fuentes de imagen definida por el usuario (cámaras infrarrojas, videocámara, cámara USB compatible con WIA, webcams,etc.) puede ser utilizado. Al analizar el video grabado, el software de seguimiento de movimiento soporta todos los formatos de videos comunes, tales como .avi .vob, .wmv, .asf, .mov, .qt, .mpg, .mpeg,. MP4,. 3GP y .mkv. Si el video no no reproducir correctamente, podrían requerir un codec específico; formatos de vídeo adicionales son compatibles si está instalado el códec correspondiente en el sistema. El software de seguimiento de movimiento también puede utilizarse para analizar videos previamente adquiridos y procesar las imágenes de diferentes fuentes, como grabadoras de DVD/HD, archivos digitales de videos (.avi, .divx, .mpeg,etc.), cámaras Web, cámaras DV, y dispositivos de imágenes compatibles con WIA.-
Configuración del sistema
- Conecte la llave de la instalación del software de seguimiento de movimiento en un puerto USB 2.0 y lanzar la herramienta de instalación.
- Fijar la cámara encima de la zona experimental y asegurarse de que permanecerá inmóvil durante la duración del experimento.
- Configurar un nuevo experimento en el sistema de software de seguimiento de movimiento utilizando el manual de instrucciones. Seleccione el nuevo experimento. Haga doble clic en el icono del protocolo que el nuevo experimento debe seguir (figura 3, archivo adicional 1).
- Ingrese datos de etiqueta/describir el experimento en el cuadro de diálogo Información de experimentar .
- Especificar el origen de las secuencias de videos a procesar.
- Definir la regla de transformación para una medición correcta de distancias. El proceso de calibración permite el software de seguimiento de movimiento estar informado de las dimensiones reales del área experimental con el fin de obtener valores confiables para velocidades y distancias.
- Determinar las regiones de interés (zonas) en el área de trabajo.
- Ajustar los parámetros del proceso de detección.
- En orden para el software de seguimiento de movimiento detectar precisamente la posición del animal en la imagen, se deben establecer algunos ajustes de detección.
- El proceso de seguimiento requiere una imagen clara y bien contrastada mediante el uso de un ajuste fino de los parámetros de contraste y brillo general de la sección de brillo y contraste del panel de Configuración de la detección . Según sea necesario, modificar estos ajustes la imagen entera o para las zonas definidas por el usuario.
- Puesto una rata en cada arena para probar el proceso de detección.
- Pulse el botón Iniciar prueba para verificar si el proceso de detección puede identificar el objeto correctamente. Confirmar que la detección se activa por la aparición de un punto en la pantalla. El proceso de calibración debe ser hecho antes de comenzar la prueba.
- Detección se considera confirmado cuando el punto negro sólo que se muestra en el reproductor es el animal siendo rastreado. El rojo línea de seguimiento debe seguir de cerca los desplazamientos del animal. Seguimiento adecuado se confirma también con una etiqueta blanca listado el número de animales y sus correspondientes coordenadas basan en desplazamiento. Si no se obtiene tal detección, ajuste los parámetros de umbral y erosiones para optimizar la detección y el seguimiento.
- Ajustar los parámetros de umbral y de la erosión para obtener una imagen más nítida y sin ruido de la prueba.
- Si la ruta de seguimiento se detecta correctamente, presione el botón de Parar prueba (figura 4). Si estos ajustes se van a utilizar para cada nuevo archivo experimental, presione el botón Guardar como predeterminado . Presione el botón Aceptar para guardar la nueva configuración de la detección.
- Establecer las condiciones de tiempo de los ensayos.
- Si el protocolo experimental requiere el proceso de adquisición de la pista para iniciar al mismo tiempo que el sujeto se coloca en el área experimental, es posible configurar la unidad remota que viene con el software o usar un ratón inalámbrico.
Nota: Esta opción ofrece la posibilidad de controlar el arranque y parada.
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Configuración de los sujetos en el sistema
- Administrar la base de datos del sujeto de experimentación. Para crear una base de datos de sujetos experimentales, entrar en el administrador de Base de datos de temas pulsando el botón temas en la barra de Asistente de experimentación .
- El botón + para añadir a nuevos temas a la base de datos.
- Con la opción de un tema ya seleccionada, Introduzca Código del sujeto.
- Llene el resto de información del sujeto en la sección Propiedades del tema .
- Pulsa el botón crear para agregar al nuevo tema.
- Definir el plan de experimentación. Utilice el programador para definir las diferentes fases, sesiones, ensayos y temas previstos para ser ejecutados en el proyecto experimental. El ensayo se selecciona automáticamente como "el juicio próximo" para ser ejecutado. Esta propiedad se muestra como un tick verde en el lado izquierdo del nombre prueba.
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Adquisición de datos de grabación simultánea y seguimiento
Nota: Cuando se selecciona una fuente de la imagen en directo, el panel de reproductor proporciona un módulo de grabación integrado para capturar fácilmente el vídeo de la cámara seleccionada.- Preparar el software de seguimiento de movimiento para adquisición de datos (calibración, definición de zona, configuración de la detección, ajustes de tiempo, programador).
- Abra el panel de adquisición de datos .
- Empezar a grabar el video del experimento sin el animal presionando el botón iniciar grabación en el software.
- Coloque el animal en el área experimental.
- Iniciar el proceso de adquisición de datos presionando el botón Start en el panel de control de tiempo . El proceso de seguimiento se llevará a cabo simultáneamente con el proceso de grabación. Cuando sea necesario, pedir el experimentador para anotar manualmente las variables conductuales como traseros, cabeza caídas y caídas (figura 5).
- Recoge los datos EPM manualmente como por un observador ciego (separa el observador del EPM por una cortina) en el cuarto de prueba.
- Esperar hasta el final de la grabación del proceso de seguimiento o pulse el botón Stop en el panel de control de tiempo .
- Eliminar el animal de la zona experimental. Detener el proceso de grabación de vídeo pulsando el botón de parada disponible en el reproductor de software de seguimiento de movimiento.
- Preparar el área experimental para el siguiente animal por lavado y secado. Repetir el ciclo otra vez.
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Análisis de datos
- Para acceder a la herramienta de análisis , pulse el botón de análisis en el bar Ayudante de experimentación .
- Para generar informes de análisis de los ensayos finales, seleccionar las pruebas a analizar. Configurar y seleccione el informe de análisis. Establecer los intervalos de tiempo a analizar. Generar y revisar los informes. Exportar los resultados a un formato de hoja de cálculo o una imagen (figura 6).
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Configuración del sistema
- EPM para la medición de los niveles de ansiedad
- Realizar los experimentos EPM en condiciones nonstress (en una habitación tenuemente iluminada y tranquila) después de oral por sonda nasogástrica.
Nota: Asegúrese de que los experimentos se ejecutan en un intervalo de tiempo cercano (por ejemplo, entre 1200 y 1400) ya que el ritmo circadiano puede influir el comportamiento de los roedores en la EPM15,17. Evitar movimientos innecesarios y ruidos durante el experimento. - Antes del comienzo de la prueba, asegúrese de que el EPM es limpiado y secado y el sistema de seguimiento de video está listo para usar.
- Transferencia de las ratas en su casa jaula a la sala experimental de 30 minutos antes de comenzar el experimento.
- Lugar una rata en la intersección de los cuatro brazos del EPM, mirando el brazo abierto enfrente del experimentador.
- Ejecutar el video software de seguimiento, así como registrar manualmente el comportamiento de los animales, durante 5 minutos.
- Si el animal cae del EPM, recogerlo y colocarlo en el mismo punto del EPM donde cayó. Excluir los datos de comportamiento de este animal a partir del análisis.
Nota: Un ruido fuerte o un movimiento puede inmovilizar y congelación animales en brazos abiertos. Si se escucha un ruido fuerte durante el experimento, excluir los datos de comportamiento de los animales sometidos a experimento en ese momento del análisis. - Al final de la prueba de 5 minutos, parar el vídeo software de rastreo y quitar el animal del EPM. Coloque en su jaula casera.
- Antes el siguiente experimento animal, limpiar el EPM con un detergente desinfectante (e.g., Quatricide) seguido por el agua del grifo. Seque el aparato con toallas de papel.
- Realizar los experimentos EPM en condiciones nonstress (en una habitación tenuemente iluminada y tranquila) después de oral por sonda nasogástrica.
4. Análisis de los datos recogidos por el sistema de seguimiento de Video
- Basado en los datos registrados, analizar la cantidad de tiempo en los brazos abiertos y en los brazos cerrados; el número de entradas a los brazos abiertos, brazos cerrados, y a la zona centro; la latencia de entrada en los brazos cerrados; la distancia recorrida en los brazos abiertos, brazos cerrados y en la zona centro.
Nota: El animal se considera en una zona cuando el centro del cuerpo masa es en esa zona. - Determinar los efectos de los tratamientos en el comportamiento mediante un análisis de varianza (ANOVA) con la diferencia menos significativa de Fisher (LSD) test de comparaciones múltiples de Tukey/prueba.
Representative Results
El experimento actual investiga la hipótesis de que la suplementación exógena de cetona administrada ya sea crónico (alimentado por 83 días) o subchronically (gavaged por vía oral por 7 días) tiene un efecto ansiolítico en dos meses de edad macho () ratas Sprague-Dawley (SPD) 250-350 g). Administración crónica consistió de los siguientes suplementos de cetona: éster de cetona de dosis baja (LKE; 1, 3-butanodiol-acetoacetato diester, ~ 10 g/kg/día, LKE), éster de la cetona de la alto-dosis (HKE; ~ 25 g/kg/día, HKE), beta-hidroxibutirato-mineral sal (bHB-S; ~ 25 g / kg/día, KS) y triglicéridos de cadena bHB-S + media (MCT; ~ 25 g/kg/día, KSMCT). Para subcrónico experimentos, se utilizaron los siguientes grupos de tratamiento: KE, KS y KSMCT (5 g/kg/día). Los grupos control incluyeron SD o SD con sonda de agua (control). Todos los datos fueron representados como la media ± el error estándar de la media (SEM). Los resultados se consideraron significativos cuando p < 0.05. La importancia fue determinada por ANOVA unidireccional con prueba de LSD de Fisher.
Después de alimentación crónica, ratas en el grupo KSMCT pasaron significativamente más tiempo en los brazos abiertos (p = 0.0094) en comparación con el grupo de control. El tiempo en los brazos cerrados fue significativamente menor en los grupos LKE, KS y KSMCT (p = 0.0389 0.0077 y 0.0019, respectivamente), mientras que el grupo KS pasaron significativamente más tiempo en el centro (p = 0.0239) en comparación con el (grupo de control (SD) Figura 7A) 18.
Ratas en los grupos KS y KSMCT viajaban distancias significativamente mayor en los brazos abiertos (p = 0.036 y 0.0165), mientras que las ratas en los grupos LKE, KS y KSMCT mostraron significativamente menos distancia recorrida en los brazos cerrados (p = 0.0252, 0.00041, y 0.0032, respectivamente), en comparación con el grupo control (SD) (figura 7B). En comparación con el grupo control, los grupos KS y KSMCT tenían una mayor distancia recorrida en la zona centro (p = 0.0206 y 0.0482, respectivamente), mientras que en el grupo KSMCT, fue significativamente mayor después de la latencia a la primera entrada de los brazos cerrados crónica de alimentación (p = 0.0038)18 (figura 7).
El tiempo pasado en los brazos abiertos fue mayor en el grupo KE (p = 0.0281) después de 7 días de alimentación forzada oral, mientras que en los grupos de KE y KS KSMCT, el tiempo invertido en el centro de disminuidos (p = 0,0005, < 0.0001 y = 0.023, respectivamente), en comparación con el contro l Grupo (figura 8A)18. En los grupos KE y KS, el número de entradas a los brazos cerrados fue significativamente menor (p = 0.0436 y 0.0234, respectivamente) después de 7 días de la administración (figura 8B), mientras que las ratas en el KS grupo también entró en el centro menos con frecuencia (p) = 0.0193), en comparación con el grupo control (SD).
Figura 1: elevado además de laberinto (EPM) utilizado para las pruebas de las ratas. Cada brazo es 10 cm de ancho y 50 cm de largo, con dos brazos opuestos abrió con un borde levantado. Los dos cerrados frente a brazos cuentan con 30 cm de altura las paredes. La altura de la pista del piso es de 55 cm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: ejemplos de directa y luz indirecta. Asegúrese de que la fuente de luz está apuntando hacia el techo, mientras que se bloquea la luz directa sobre el área experimental. Es importante utilizar luz indirecta durante experimentos EPM para iluminar de manera similar los cuatro brazos sin sombras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: la barra de asistente de experimentación del software de seguimiento de movimiento. Está diseñado para proporcionar acceso a las operaciones principales. Los botones corresponden a la tarea dentro del proceso de experimentación típico, mientras que sólo las tareas actualmente permitidas son activas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: la pista del tema está marcada con una línea roja que sigue el movimiento de los animales. Ajustando el umbral, el fondo puede ser disminuido hasta sólo el animal es detectado y rastreado por la línea roja. La pista sigue el centro de la masa de la materia, y se indican las coordenadas de posición actual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: elevado además de laberinto (EPM) con una rata de Sprague Dawley (SPD) en el brazo abierto Un ejemplo del montaje experimental se demuestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: pista de movimiento acumulado del animal durante un juicio. Como parte del análisis de datos, puede verse el rastro recogen la trayectoria del sujeto en el área de seguimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: las respuestas del comportamiento de las ratas SPD en la EPM después de 83 días de alimentación crónica de suplementación exógena de cetona. Estos paneles muestran resultados representativos recogidos por el EPM y el sistema de seguimiento de movimiento18. (A) el grupo KSMCT pasado un mayor porcentaje de tiempo en los brazos abiertos, mientras que LKE, KS, y grupos KSMCT pasaron menos tiempo en los brazos cerrados, en comparación con el grupo control (SD). (B) el KS y KSMCT grupos viajaron más distancia en los brazos abiertos, mientras que LKE, KS, y grupos KSMCT viajaban menos distancia en los brazos cerrados, que reduce la ansiedad en comparación con el control de grupo (SD). (C) el KSMCT grupo entró más adelante, los brazos cerrados indicando ansiedad reducida en comparación con el control de grupo (SD). Abreviaturas: SD = chow roedor estándar + agua (25 g/kg peso corporal (peso) de agua al día); LKE = SD + LKE (1, 3-butanodiol-acetoacetato diester, b.w./day de 10 g/kg); HKE = SD + HKE (25 g/kg b.w./day); KS = SD + beta-hidroxibutirato-mineral sal (bHB-S b.w./day de 25 g/kg); KSMCT = SD + triglicéridos de cadena bHB-S + media (MCT b.w./day de 25 g/kg); SPD = rata Sprague-Dawley; EPM = elevado además de laberinto (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; *** p < 0.0001). Esta figura ha sido modificada desde Ari et al. 18. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: las respuestas del comportamiento de las ratas SPD después de 7 días de oral por sonda nasogástrica de la suplementación exógena de la cetona de. Resultados representativos fueron recogidos a través del EPM de prueba, usando un software de seguimiento de movimiento sistema18. (A) el grupo KE pasado un mayor porcentaje de tiempo en los brazos abiertos, mientras KE, KS, y grupos KSMCT pasaron menos tiempo en el centro (en comparación con el grupo control [SD]), lo que indica reducción de la ansiedad. (B) en comparación con el control de grupo (SD), menos las entradas fueron detectadas en los brazos cerrados de ratas en los grupos KE y KS. Abreviaturas: SD = chow roedor estándar + agua (5 g/kg p.v. de agua al día); KE = SD + cetona ester (1, 3-butanodiol-acetoacetato diester, b.w./day de 5 g/kg); KS = SD + beta-hidroxibutirato-mineral sal (bHB-S b.w./day de 5 g/kg); KSMCT = SD + bHB-S + MCT (5 g/kg b.w./day); SPD = rata Sprague-Dawley; EPM = elevado además de laberinto (* p < 0.05; *** p < 0.001; *** p < 0.0001). Esta figura ha sido modificada desde Ari et al. 18. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
En general, varios usan pruebas, tales como la prueba de elección claro oscuro, la prueba de interacción social y la prueba EPM, se utilizan para medir el nivel de ansiedad en diferentes modelos animales. Sin embargo, el ensayo EPM solo es un método adecuado para investigar, por ejemplo, el efecto de la cetona exógeno suplementos en ansiedad niveles18,20 roedores.
La principal ventaja del método de planificación es que se basa en la tendencia instintiva de los roedores hacia espacios oscuros, cerrados, además del incondicionada miedo a las alturas y evitación de los espacios abiertos. Por el contrario, otros métodos utilizados para el estudio de la ansiedad-como comportamiento se basan en las respuestas conductuales a ciertos estímulos nocivos, tales como choques eléctricos, privación de alimentos y agua, ruidos y exposición a depredadores olor3. Estas pruebas generalmente son el resultado de una respuesta condicionada, mientras que el EPM también representa una alternativa más humana. Además, la planificación puede ser una herramienta útil para el estudio de la participación de regiones diferentes del cerebro (por ejemplo, las regiones límbicas, hipocampo) y los mecanismos subyacentes (p. ej., GABA, glutamato, serotonina, adenosina) del comportamiento de ansiedad2.
Cuando la aplicación de tratamientos que son muy estresantes para los animales (por ejemplo, la oral por sonda nasogástrica), es importante que todos los animales se manejan del mismo modo y por la misma persona, especialmente cuando se evalúan efectos ansiolíticos potencial, sutil. Si es posible, la introducción del droga/compuesto en agua potable o a través de un apetecible 'tratar' puede ser un método preferido. Para asegurar que la misma cantidad se administra a cada animal, puede utilizarse una sonda oral. Basado en las propiedades farmacocinéticas del compuesto, es generalmente recomendable para probar a los animales en el EPM dentro de 1 hora después de gavaging. Al seleccionar a sujetos experimentales, es importante considerar su cepa, sexo, ciclo estral y edad, así como peso corporal, según los objetivos y probar sustancias2. En relación con la edad, al diseñar estudios EPM e interpretación de datos, es importante considerar el porcentaje de las entradas de brazo abierto aumenta linealmente con la edad21 y los cambios relacionados con el envejecimiento en el comportamiento de la EPM son específicos de la cepa22.
Al realizar una prueba EPM, hay problemas que deben abordarse. Los animales necesitan a veces ser excluidos del análisis debido a las tendencias de valores atípicos (por ejemplo, el animal nunca deja el área donde fue colocado, casi caídas apagado el aparato, se distrae por un ruido o evento fuera del aparato). Otras complicaciones con EPM la prueba pueden incluir tratamientos que causan sedación o hiperactividad porque estos tipos de efectos deben ser evaluados a través de parámetros EPM.
Es importante exponer a los animales a la prueba EPM sólo una vez debido a disminución de la actividad en los brazos abiertos y un tiempo total disminución en la plataforma central se demostró en la segunda exposición (repetida) de roedores en comparación con la primera exposición en la EPM 14,15. Por lo tanto, se recomienda una sola exposición de roedores a la prueba EPM. Sin embargo, si hay un mínimo de tres semanas entre la primera y segunda exposición a la planificación y el montaje EPM se traslada a otra sala (ambiente diferente), los animales pueden ser investigados por el EPM probar más de una vez2.
El EPM está disponible en diferentes materiales, tamaños (e.g., ratón o rata), y colores, que debe ser considerado al elegir temas de estudio. Es importante tener en cuenta que los olores dejados por el anterior animal sobre el aparato pueden cambiar el comportamiento de los animales posteriores. Por lo tanto, recomendamos usar un EPM hechas de un material fácil de limpiar, por ejemplo cristal de acrílico (no transparente), que no retiene olores después de lavarse. Evitar aparatos EPM de madera. Preferiblemente, utilice un color mate que es diferente del color de los animales probados en el EPM (e.g., negro si son pruebas animales blanco). Mejor el contraste entre el animal y el recinto, mejor la detección del animal y mayor será la confiabilidad y precisión de los resultados obtienen (distancia recorrida, velocidad, seguimiento). Sirven para aparatos EPM de material gris mate con blanco, negro y blancos y negros de animales.
Otra ventaja del sistema de seguimiento de video es que además del EPM, ofrece una forma flexible y fácil de configurar con una amplia variedad de pruebas de comportamiento, como el laberinto de agua, campo abierto, radial plus T/brazo-Y laberintos, preferencia de lugar, obligada a nadar y pruebas de suspensión de la cola.
En Resumen, el objetivo de este artículo es describir la prueba EPM usada en combinación con un vídeo de software de seguimiento para recopilar y analizar las alteraciones conductuales en respuesta a los tratamientos ansiolíticos novela. Las posibles aplicaciones de la EPM incluyen la preselección de nuevos agentes farmacológicos para el tratamiento de trastornos de ansiedad. Además de los agentes ansiolíticos y anxiogenic, el efecto conductual de diversas hormonas y drogas de abuso pueden también ser investigadas. También podrá evaluarse la influencia del envejecimiento y la exposición a diversos estresores. Este estudio ha concluido que cuando se toman los pasos apropiados, el uso del EPM ha demostrado para ser un método sensible para evaluar los cambios conductuales asociados con cetona suplementos18,20.
Disclosures
Agostino, D.P., Kesl, S., Arnold, p. composiciones y métodos para producir elevados y sostenidos de cetosis. # Patente internacional PCT/US2014/031237. University of South Florida.
Ari, C., D'Agostino, D.P., cetónicos exógenos suplementos para reducir comportamiento relacionadas con la ansiedad. Provisional patente #62289749. University of South Florida.
Dominic P. D'Agostino y Csilla Ari son copropietarios de la empresa cetona Technologies LLC.
Estos intereses han sido revisados y gestionados por la Universidad conforme a sus políticas institucionales y conflicto de intereses individuales. Todos los autores declaran que no hay ningún conflicto de interés adicional.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una ONR Grant N000141310062 y un GLUT1D Fundación beca #6143113500 (a Dominic P. D'Agostino), la Agencia de desarrollo nacional de Hungría (bajo la subvención no. TIOP-1.3.1.-07/2-2F-2009-2008; para Zsolt Kovács) y por el Departamento de Veterans Affairs (a marca Kindy). Los autores desean agradecer a misión nutrición LLC por apoyar la investigación en curso sobre este tema (a Csilla Ari).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elevated Plus Maze for mice and rats | Coulbourn Instruments | H10-35-EPM | |
| SMART Video Tracking Software | Harvard Apparatus | SMART 3.0 |
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