Summary
Burada, kemirgen hayvan modelleri anksiyete düzeyindeki değişiklikleri öğrenmek için bir protokol mevcut. Yükseltilmiş artı labirent takip yazılımı, bir video ile birlikte kullanılan (EPM) testi, çeşitli olası anksiyolitik tedaviler preklinik laboratuvar senaryolarda etkisini belgelemek için güvenilir bir yöntem sağlar.
Abstract
Bu çalışmada genel amacı yükseltilmiş metodolojisi tarif etmektir artı labirent (EPM) testi bir video izleme yazılımı ile birlikte. Laboratuvar kemirgen modelleri çeşitli potansiyel anksiyolitik tedavilerin etkisi belgelemek için yönteminin amacı budur. EPM test kemirgenler meyil karanlık alanlarda korumalı, kapalı ve açık alanlarda ve yükseklikleri ve Roman ortamlar keşfetmek için doğuştan gelen yoğun motivasyonlarını koşulsuz korku doğru temel alır. EPM testi anksiyolitik veya anxiogenic yanıt davranışını etkilemek için bilinen uyuşturucu verilen kemirgen bir soruşturma için yaygın olarak kullanılan bir davranış testidir. Gözlem gösteren kapalı kollar, kollarını açarak, girişleri kapalı silah azaltılmış bir dizi ve yükseltilmiş bir silah EPM testi ile ölçülen açmak için girdi sayısı harcanan zamanın yüzdesi yüksek bir oran üzerinde harcanan süre azalan bir oranda azaltılmış yansıtıyor olabilir anksiyete düzeyleri. Bu yöntemi kullanarak, eksojen keton takviyeleri anksiyete ile ilgili davranışı üzerinde etkisi de, Sprague Dawley (SPD) fareler mercek altına alındı. Eksojen keton takviyeleri kronik 83 gün veya subchronically fareler için beslenir ve akut sözlü olarak gavaged, EPM iletken önce 7 günlük, günlük test. Davranışsal veri toplama akıllı video izleme sistemi kullanılarak tedavi sonunda kör bir gözlemci tarafından gerçekleştirilir. EPM test Keton ek kaynaklı anksiyolitik etkisi tespit etmek için etkili bir yöntemdir ve uyuşturucu veya metabolik-tabanlı terapiler ile ilgili anksiyete davranış değişiklikleri değerlendirmek için hassas bir ölçü olarak kabul edilebilir ana bulgular göstermektedir.
Introduction
Bu makalenin amacı takip yazılımı anksiyete ile ilgili davranış değişiklikleri ve laboratuvar kemirgen modelleri yeni tedavi sonuçlarının karşılaştırılması izlemek için bir video ile birlikte EPM test metodolojisi tarif etmektir. EPM testi anksiyete davranış düzeyleri ve anksiyete yanıt sıçan ilaç tedavileri1uygulama sonra miktarının soruşturma için geliştirilmiş bir nispeten basit davranışsal değerlendirme yöntemidir. Nitekim, EPM testi anksiyete düzeyleri kemirgenler1,2değişimler incelenmesi için yaygın olarak kullanılan ve etkili davranış tahlil olduğunu kanıtlanmıştır. Kemirgenler (esas olarak sıçanlar ve fareler) EPM testinde uygulanabilirliği onların meyil doğru kapalı, karanlık alanlarda (yaklaşım), açık alanlarda/yükseklik (kaçınma) koşulsuz bir korkusu ve Roman keşfetmek için doğuştan gelen motivasyon yüksek düzeydeki dayalı ortamlar. Sonuç olarak, iyi kurulmuş bir metodoloji bir yaklaşım-kaçınma çatışması2,3dayalı EPM testidir.
EPM açıklanan Handley ve Mithani4 tarafından (Şekil 1) ve iki zıt silah kapalı ise çevresi (kollarını açarak), açık olan iki ters kolu oluşur dört yükseltilmiş kollarından oluşan bir artı şeklindeki aparatı olduğunu (kapalı kol) duvarlar ile donatılmıştır. Kullanımdan sonra artan zaman açık silah harcanmaktadır ve/veya açık kol girişleri (işlenmemiş) hayvan kontrol göre artan sayıda EPM üzerinde algılanan Bu bir anksiyolitik etkisi2,3gösterir. En sağlam kaçınma yanıt (EPM dört kol kesiştiği fareler yerleşimini) EPM tahlil5başladıktan ilk 5 dakika içinde göstermiştir; Bu nedenle, herhangi bir davranış bir tedaviden sonra EPM üzerinde 5 min için yaygın olarak kaydedilir. Anksiyete düzeyini ek önlemler, baş dips, rears (dikey duran iki arka ayakları üzerinde kemirgen), dışkı boli yanı sıra toplam kol sayısı yazılar (spontan motor aktivite) ve (germe veya dondurma), farklı duruşlar da kaydedilebilir EPM tarihinde2. Böylece, birden çok davranış parametreleri anksiyete ile ilgili davranış kapsamlı bir değerlendirmesini sağlamak için derlenebilir.
Sonuçlar geçerliliğini artırmak için iki ya da üç davranış deneyleri sık birlikte, koyu seçim testi gibi sosyal etkileşim testi, kullanılır ve6farklı hayvan anksiyete düzeylerini ölçmek için EPM test modelleri. Yalnız kemirgenler üzerinde gerçekleştirilen EPM tahlil de farklı uyuşturucu7anksiyolitik veya anxiogenic etkisini araştırmak için uygun bir yöntemdir. EPM amino asit, monoamin, peptidergic ve nucleosidergic bileşikler için (Örneğin, N-metil-D-aspartat (NMDA) antagonisti diğerleri arasında sadece benzodiazepin türü Anksiyolitikler (Örneğin, diazepam)8' e, ama aynı zamanda hassas testtir AP7, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic asit (AMPA) antagonisti CNQX, µ opioid reseptör agonist morfin, NPY1 antagonisti BIBP3226, madde P, ghrelin, oksitosin, serotonin reseptör agonistleri ve antagonistleri 8-OH-DPAT gibi ve Way-100635 ve β1 adrenergic antagonisti betaxolol)9,10,11,12. Sonuç olarak, kemirgenler EPM tahlil beyin bölgeleri anksiyolitik etkisi (Örneğin, amigdala, hipokampus ve limbik alanları) dahil etkisi farklı tedaviler etkisini araştırmak için bir uygun ve duyarlı bir yöntemdir ve anksiyete2' de karıştığı mekanizmaları eylem (Örneğin, serotonerjik, GABAergic ve adenosinergic sistemi). Bu EPM çalışmalarda test aracıları davranış değişiklikleri algılamak için hassas bir yöntem gerektirebilir ince yöntemlerle sinyal beyin alter eksojen keton takviyeleri içerir.
Bu makalede, biz takip yazılımı, hangi deneysel önyargı ortadan kaldırmak için yardımcı olur ve toplama ve analiz davranış değişikliklerini roman anksiyolitik tedavilere yanıt kolaylaştıran bir video ile birlikte kullanılan EPM testi tanımlamak.
Protocol
Hayvan tedavi ve yordamlar ölçme Güney Florida Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) yönergeleri uyarınca (iletişim kuralı #0006R) yapıldı. Tüm çabaları kullanılan hayvan sayısını azaltmak için yapılmıştır.
1. hazırlıkları
Not: Protokol genellikle laboratuvar bred rats veya fare EPM test etmek için gerekir. Ancak, eskiden şiling şimdi pigs gibi diğer hayvanlar da EPMs13üzerinde test edilmiştir. Labirent hayvanlarda ve labirent renk arasındaki renk kontrast video izleme kullanırken dikkate almak önemlidir. Kontrast hayvanların canlı ya da üzerinden video izlerken araştırmacılar için daha az önemlidir. Bu durumu belgeleyecek yapılandırılacak yazılım gerek hayvanlar izleme video siyah ya da beyaz siyah ya da beyaz labirent ayarlarıdır. Yapılandırma ayarlarıyla açık akrilik bir labirent ile sorunlara neden olabilir, ancak bir mat gri labirent her iki kemirgen renkler için en uygun olabilir.
- Hayvanlar için deneme, vücut ağırlığı2yanı sıra zorlanma, seks, estrus döngüsü ve yaş gibi faktörler etkileme potansiyeli dikkate alınarak seçin.
- Bireysel deney üzerinde tabanlı, hayvan grubu test için başına sayısını belirleyin.
Not: Grup boyutu ile test tedavi bekleniyor etkisi boyutu bağımlı olacaktır. Deneme konuları dahil edilecek en az sayısını belirlemek için hayvanın yanıtlarında herhangi bir verilen görev, hem de deneysel grupları/koşulların sayısını değişkenliği göz önüne alındığında başlatılan önce güç analizler genellikle yapılır. - (Hangi açık-alan testi, EPM testi, delik Pansiyon test ve zorla-yüzme testi gibi farklı davranış testi kullanılacaktır) deney tasarımı dikkatle.
Not: Ön kemirgenler maruz bir roman test ortamı (örneğin bir açık alan testi) hemen önce EPM testleri EPM1,2hayvanların davranış değiştirebilirler. - Bütün hayvanlar EPM testi daha önce benzer bir şekilde başa.
Not: Farklı stres faktörlerine, ilaçlar (Örneğin, iğne), Sevkiyat stres ve işleme davranış ve kemirgenler EPM16davranışsal yanıt değiştirebilirsiniz kanıtlanmıştır. Böylece, bir hayvan ev (Örneğin, sevk irsaliyesi, EPM test önce 1-2 hafta sonra), deneysel koşullar ve tedavi yöntemleri (Örneğin, gavaging) hayvanların habituation gerekli. Kemirgenler ve özellikle hemen önce sınama, önceden stresler, herhangi bir deneyiminiz işlenmesi hayvanlar ve tedavi grupları arasında tutarlı olması önemlidir. - Sıçanlar ve fareler, hayvanlar onların karanlık, aktif aşamasında olduğunda davranış değerlendirme yapılabilir bir ters ışık döngüsü kullanılarak gibi gece hayvan davranış araştırmaları yapmak.
Not: Farklı konut koşullarını ve ışık etkileri davranışı üzerinde döngü/sirkadiyen ritimler ve EPM sonuçları onların etkisi gösterdi hayvanların hormon ışık-siklet tarafından düzenlenir bu yana daha önce17,. - İşlemler sırasında aynı Denemecileri kullanın ve parfüm veya sabun ile güçlü bir koku önlemek için isteyin.
- Hayvan deneme sırasında konuşmak ya da yakınındaki EPM ortam nesneleri taşıma Denemecileri sor.
Not: Eleştirel gözlemci en az hareketleri ve gürültü davranış veri toplarken yapar önemlidir. - Herhangi bir koku testi hayvan tarafından keşif ile etkileşebilir önceki hayvanların silmek için her deneme sonra tüm EPM temiz.
- (Önerilen) Hayvanlar (gövde tarafından hafifçe alacak ve bir dakika ya da iki holding) EPM testi önce birkaç gün idare için deneyci alışmana için.
- Hayvanlar üzerinde EPM yerleştirirken, her kemirgen EPM aynı kol (Örneğin, açık kol deneyci uzak bakan Merkezi) karşı karşıya aynı pozisyonda yerleştirin ve tüm hayvanlar tutarlı bir şekilde işlemek emin olun.
2. uygulama eksojen keton ilave
- Hayvanların vücut ağırlığı (Örneğin, intragastric sonda ile besleme) tedavisi için doz hesaplama belirlemek için herhangi bir tedavi başlamadan önce ölçmek.
- Keton takviyesi (Standart kemirgen chow/standart diyet [SD] + su gavaj; önce 5 d için sonda ile besleme tarafından su kullanarak hayvanlar intragastric sonda ile besleme yöntemi (adaptasyon dönemi) için hakkında bilgi edinin Örneğin, 2.5 g/kg vücut ağırlığı su/gün). İntragastric sonda ile besleme yönteminin uyum değil herhangi bir hayvan kullanımı hariç.
- Adaptasyon döneminden sonra yem hayvanlar kronik 83 d ve 7 d ile SD ve sonda ile besleme ya da suyla her gün için subchronically (Örneğin, 5 g/kg vücut ağırlığı/gün; kontrol grubu: n = 8), keton takviyeleri gibi keton ester (KE; 1,3 - butanediol-phyiscally diester; Örneğin, 5 g/kg vücut ağırlığı/gün; n = 8), keton tuz (KS; Na+/K+\u2012beta-hydroxybutyrate [βHB] mineral tuz; Örneğin, 5 g/kg vücut ağırlığı/gün; n = 8), veya KS + Orta zincirli trigliserid (1:1 oran, KSMCT; n = 8)18,19,20.
Not: intragastric sonda ile besleme alınan hayvanlar tedaviden sonra EPM 1 s test edildi. Fareler standart kemirgen chow ile gavaged kontrol grubu görev yaptı (keton takviyesi hariç) su ile beslenen.
3. anksiyete tahlil
- EPM aparatı
- Aynı cihaz üzerinde bir çalışma sonuçları standardize etmek için kullanın. EPM dört kol oluşur bir artı şeklindeki aparatı olduğunu (Örneğin, silah 10 cm genişliğinde ve 50 cm uzunluğunda olabilir): iki karşıt kolu açtı ve iki silah kapalı (Örneğin, 30 cm) yüksek duvarlar ile donatılmıştır. Aparatı yerden (Örneğin, x 55 cm) yükseltilmiş2.
Not: Kollarını açarak ve kollarını açarak içine girdi sayısı birikmiş geçirdiğim en sık kullanılan parametreler; Ancak, zaman harcanan kapalı kol ve merkezi ve kapalı kol ve merkezi içine girdi sayısı, hem de mesafe ölçülür her alanda seyahat. - Dolaylı ışık kullanarak EPM yanar (yani, doğrudan ışık kaynağı doğrudan EPM aparatı aydınlatıcı yerine tavana doğru) ve tüm dört kol benzer şekilde aydınlatılmış sağlamak (gölgeler, bkz: Şekil 2).
Not: Işık düzeyini değişimler kemirgenler EPM üzerinde davranışını değiştirebilirsiniz. Bu nedenle, benzer aydınlatma ardışık deneysel hayvan ve gün (Örneğin, odasında 2.800 lümen)2gereklidir.
- Aynı cihaz üzerinde bir çalışma sonuçları standardize etmek için kullanın. EPM dört kol oluşur bir artı şeklindeki aparatı olduğunu (Örneğin, silah 10 cm genişliğinde ve 50 cm uzunluğunda olabilir): iki karşıt kolu açtı ve iki silah kapalı (Örneğin, 30 cm) yüksek duvarlar ile donatılmıştır. Aparatı yerden (Örneğin, x 55 cm) yükseltilmiş2.
- Video izleme sistemi
Not: bir video izleme sistemi ile bir bilgisayar arayüzü ve bir video kamera otomatik olarak fareler (davranışsal verileri toplayacak veri toplama için kullanmaŞekil 3). İzleme sistemi, çeşitli standart analog kameralar veya Kullanıcı tanımlı görüntü kaynakları (kızılötesi kameralar, video kamera, WIA uyumlu USB kamera, Web Kamerası, video içinetc.) kullanılabilir. Kaydedilen videoyu analiz ederken, hareket izleme yazılımı .avi, .vob, .wmv, .asf, .mov, .qt, .mpg, .mpeg, .mp4, .3gp ve .mkv gibi tüm yaygın video formatlarını destekler. Video oynatma değil doğru yaparsa, belirli bir codec gerektirebilir; ilgili codec sistemde yüklüyse, ek video biçimleri desteklenir. Hareket izleme yazılımı daha önce alınan videolar analiz ve DVD/HD kayıt cihazları, dijital video dosyalarını (.avi, .divx, .mpeg, gibi farklı kaynaklardan görüntüleri işlemek için de kullanılabiliretc.), Web Kamerası, DV kameralar, ve WIA uyumlu aygıtları görüntüleme.-
Sistem Kurulumu
- Hareket izleme yazılım yükleme anahtar bir USB 2.0 bağlantı noktasına takın ve yükleme aracını başlatın.
- Kamera deneysel alanının üzerinde fix ve deneme süresi için hareketsiz kalır emin olun.
- Yeni bir deneme oluşturmak hareket izleme yazılım sistemi kullanım kılavuzu kullanarak ayarlayın. Yeni deneyseçin. Protokol simgesine çift tıklayın yeni deneme (Şekil 3, ek dosya 1) takip etmelidir.
- Etiket/Deneme bilgi iletişim deneyde açıklamak için ayrıntıları girin.
- İşlemek için video dizileri kaynağını belirtin.
- Bir doğru mesafe ölçüm için dönüştürme kural tanımlayın. Kalibrasyon işlemi deneysel alanının gerçek boyutları mesafeler ve hızları için güvenilir değerleri elde etmek için bilgi sahibi olmak hareket izleme yazılımı sağlar.
- Çalışma alanı (bölgeler) ilgi bölgeleri belirlemek.
- Algılama işlemi parametreleri ayarlamak.
- Sırayla tam görüntü hayvan konumunu algılamak hareket izleme yazılım, bazı algılama ayarlamalar olarak ayarlanmalıdır.
- İzleme işleminin net ve iyi karşıtlığı görüntü Algılama ayarları paneli parlaklık ve kontrast bölümünde hassas bir ayar, genel parlaklık ve kontrast parametreleri kullanarak gerektirir. Resmin tamamını veya Kullanıcı tanımlı bölgeler için bu ayarları gerektiği şekilde değiştirin.
- Bir fare algılama işlemi sınamak için her arenaya koymak.
- Algılama işlemi konu doğru tanımlamak Eğer doğrulamak için Testi Başlat düğmesine basın. Ekranda bir nokta görünümüne göre algılama etkinleştirilir onaylayın. Kalibrasyon işlemi test başlamadan önce yapılması gerekiyor.
- Algılama Player'da gösterilen sadece siyah nokta izlenen hayvan olduğunda doğruladı olarak kabul edilir. İzleme satırı kırmızı hayvan talebiyle yakından takip etmek gerekiyor. Uygun izleme de koordinatları deplasman üzerinde temel hayvan numarası listesi ve karşılık gelen beyaz etiket ile doğrulanır. Böyle bir algılama değil aldıysanız, algılama en iyi duruma getirme ve takip süreci için eşik ve erozyonlar parametrelerini ayarlamak.
- Bir test daha keskin ve noise etkisinden uzak görüntü almak için eşik ve erozyon parametrelerini ayarlamak.
- İzleme yolu doğru algılanırsa, (Şekil 4) Test durdur düğmesine basın. Bu ayarlamaların her yeni deneysel dosya için kullanılacak kullanacaksanız, Varsayılan olarak kaydet düğmesine basın. Yeni algılama ayarları kaydetmek için kabul et düğmesine basın.
- Denemeler zaman şartları ayarlayın.
- Deneysel protokol konu deneysel alanına yerleştirilir aynı zamanda başlatmak için parça edinme işlemi gerektiriyorsa yazılımla birlikte gelir uzak birim ayarlamak için veya bir kablosuz fare kullanmak mümkündür.
Not: Bu seçenek start ve stop uzaktan kontrol imkanı sağlar.
-
Kur sisteminde konuların
- Deneme ilgilinin veritabanını yönet. Deneysel konuların bir veritabanı oluşturmak için Deneme Yardımcısı barda konular düğmesine basarak Konular veritabanı Yöneticisi girin.
- Yeni konular veritabanına eklemek için düğmesine basın + .
- Zaten seçeneği seçili olarak bir konu, konunun kodunu girin.
- Konuyu bilgiler Konu özellikleri bölümündeki kalan doldurun.
- Yeni konu eklemek için Oluştur düğmesine basın.
- Deneme planı tanımlayın. Zamanlayıcı farklı aşamalarında, oturumlar, denemeler ve deneysel proje içinde yürütülecek planlanan konular tanımlamak için kullanın. Deneme "sonraki deneme" olarak otomatik olarak seçilir yürütülecek. Bu özellik deneme adının sol tarafında yeşil bir onay olarak gösterilir.
-
Eş zamanlı kayıt ve izleme tarafından veri toplama
Not: canlı görüntü kaynağı seçildiğinde Player masasındaki bir katıştırılmış kayıt modülü kolayca seçili kameradan gelen video yakalamak için sağlar.- Hareket izleme yazılım veri toplama (kalibrasyon, dilimi tanımı, algılama ayarları, saat ayarları, zamanlayıcı) için hazır olun.
- Veri toplama Masası'nı açın.
- Yazılımda kullanılabilir kayıt işlemini başlatmak düğmesine basarak deney hayvanı olmadan video kaydı başlatın.
- Hayvan deneysel yerleştirin.
- Veri alma işlemi zaman kontrol panelindeki Başlat düğmesine basarak başlatın. İzleme işlemi eşzamanlı kayıt işlemi ile yapılacaktır. Gerektiği, el ile davranışsal değişkenler unutmamak deneyci sormak rears gibi dips ve falls (Şekil 5) gidin.
- EPM veri toplamak el ile hem de test odasında kör bir gözlemci (ayrı bir perde tarafından EPM üzerinden gözlemci) tarafından.
- İzleme süreci kayıt sonuna kadar bekleyin veya zaman kontrol Paneli'nde Durdur düğmesine basın.
- Hayvan deneysel alanından kaldırın. Video kayıt işlemi Durdur düğmesi kullanılabilir hareket izleme yazılım çaların basarak durdurabilirsiniz.
- Deneysel alan için sonraki hayvan yıkama ve kurutma hazırlamak. Tekrar döngüsünü tekrarlayın.
-
Veri Analizi
- Analiz araca erişmek için Deneme Yardımcısı çubuğunda Analysis düğmesine basın.
- Bitmiş denemeler analiz raporları oluşturmak için analiz etmek için denemeler seçin. Yapılandırmak ve analiz raporu seçin. Çözümlenmesi için zaman aralıklarını ayarlayın. Oluşturmak ve raporları gözden geçirin. Sonuçlar verme için elektronik tablo veya görüntü biçimleri (Şekil 6).
-
Sistem Kurulumu
- EPM anksiyete düzeyleri ölçümü için
- EPM deneyler (bir odada loş aydınlatılmış ve sessiz) nonstress koşullarda sonra oral gavaj gerçekleştirin.
Not: sirkadiyen ritim kemirgenler davranış EPM15,17etkileyebilir çünkü deneyler yakın zaman aralığında (Örneğin, 1200 ve 1400 arasında) çalıştırılan emin olun. Gereksiz hareketler ve gürültü deneme sırasında kaçının. - Test başlamadan önce EPM temizlenmiş ve kurutulmuş ve video izleme sistemi kullanıma hazır olduğundan emin olun.
- Deneysel Oda deneme başlamadan önce 30 dk ev onların kafeste fareler aktarın.
- Bir sıçan deneyci karşısında açık ve kol karşı karşıya EPM, dört kol kesiştiği yer.
- Video izleme yazılımı çalıştırmak gibi el ile kaydetme 5 min için hayvan davranış.
- Hayvan EPM düşerse, onu al ve nereye düştü EPM aynı noktaya geri yerleştirin. Bu bir hayvan davranış veri çözümleme dışı bırakmak.
Not: Bir gürültü veya hareket hareketsiz/hayvanlar üzerinde kollarını açarak donma. Bir gürültü deneme sırasında duyduysan, o anda analiz deneme geçiren hayvan davranış veri hariç. - 5 dk test sonunda, izleme yazılımı videoyu durdurun ve hayvan EPM kaldırın. Geri ev onun kafes yerleştirin.
- Bir sonraki deneme/hayvan önce musluk suyu tarafından takip EPM (Örneğin, Quatricide) dezenfeksiyon bir deterjan ile temizleyin. Aparatı kağıt havlu ile kuru.
- EPM deneyler (bir odada loş aydınlatılmış ve sessiz) nonstress koşullarda sonra oral gavaj gerçekleştirin.
4. Video izleme sistemi tarafından toplanan verilerin analizleri
- Kaydedilen verileri temel alan, kollarını açarak ve kapalı silah harcanan süreyi analiz; kollarını açarak, kapalı silah ve orta bölge için yaptığınız girişleri sayısı; gecikme süresi kapalı silah girmesinden; mesafe kollarını açarak, kapalı silah ve merkez alan gitti.
Not: Hayvan bir alanda olarak kabul edilir ne zaman merkezi kitle o bölgede organıdır. - Tedavilerinin davranışı üzerinde etkileri Fisher'ın en az önemli farkla (LSD) bir varyans analizi (ANOVA) kullanarak test/Tukey'nın birden fazla karşılaştırma testi belirleyin.
Representative Results
O eksojen keton takviyesi ya da kronik olarak yönetilen hipotez geçerli deney inceler (83 gündür beslenen) veya subchronically (7 gün için sözlü olarak gavaged) iki aylık erkek Sprague-Dawley (SPD) fareler (anksiyolitik etkisi yoktur 250-350 g). Kronik yönetim oluşuyordu aşağıdaki keton takviyeleri: düşük doz keton ester (LKE; 1,3-butanediol-phyiscally diester, ~ 10 g/kg/gün, LKE), yüksek doz keton ester (HKE; ~ 25 g/kg/gün, HKE), beta-hidroksibütrat-mineral tuz (bHB-S; ~ 25 g / kg/gün, KS) ve bHB-S + Orta zincir trigliserid (MCT; ~ 25 g/kg/gün, KSMCT). Subkronik deneyler için aşağıdaki tedavi grupları kullanılmıştır: KE, KS ve KSMCT (5 g/kg/gün). Kontrol grubu dahil SD ya da SD ile su sonda ile besleme (kontrol). Tüm veriler ortalama temsil edildi ± standart hata ortalamaya (SEM). Sonuçları ne zaman önemli kabul edildi p < 0,05. Önemini tarafından tek yönlü ANOVA Fisher'in LSD testi ile tespit edilmiştir.
Kronik beslenme sonra fareler KSMCT grubunda açık silah önemli ölçüde daha fazla zaman geçirdim (p 0.0094 =) kontrol grubu ile karşılaştırıldığında. Kapalı kollarında harcanan zamanı önemli ölçüde daha az LKE, KS ve KSMCT gruplar halinde (p = 0.0389, 0.0077 ve 0.0019, sırasıyla), KS grup merkezinde önemli ölçüde daha fazla zaman harcarken (p 0.0239 =) göre denetim (SD) grubu (için) Şekil 7A) 18.
Fareler KS ve KSMCT gruplar halinde seyahat kollarını açarak önemli ölçüde uzun mesafeler (p = 0.036 ve 0.0165), önemli ölçüde daha az mesafe gösterdi LKE, KS ve KSMCT gruplar halinde fareler kapalı kollarında seyahat ederken (p = 0.0252, 0.00041, ve 0.0032, sırasıyla), (SD) (Şekil 7B) kontrol grubu ile karşılaştırıldığında. Kontrol grubuna kıyasla KS ve KSMCT gruplarının daha büyük mesafe merkezi bölgede seyahat vardı (p = 0.0206 ve 0.0482, sırasıyla), ilk girişinde kapalı silah için gecikme süresi önemli ölçüde daha fazla sonra KSMCT grubunda ise, Kronik beslenme (p = 0.0038)18 (Şekil 7C).
Kollarını açarak harcanan zaman KE grubunda büyük (p 0.0281 =) oral gavaj 7 gün sonra KE, KS ve KSMCT gruplar halinde iken, zaman harcanan azalmıştır Center'da (p 0.0005, < 0,0001, = ve = 0.023, sırasıyla), contro ile karşılaştırıldığında l grubu (Şekil 8A)18. KE ve KS grupları, girişlerin kapalı silah için önemli ölçüde daha düşük (p = 0.0436 ve 0.0234, sırasıyla) Yönetim (KS fareler de grup iseresim 8B), 7 gün merkezi daha az sık girdikten sonra (p 0.0193 =), (SD) kontrol grubu ile karşılaştırıldığında.
Şekil 1: artı labirent (EPM) fareler sınamak için kullanılan yüksek. Her kol 10 cm genişliğinde ve 50 cm uzunluğunda iki ters kolu ile yükseltilmiş bir kenar ile açtı. Silah kapalı iki 30 cm-yüksek duvarlar ile donatılmıştır. Yerden pist Yükseklik 55 cm. olan Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: örnek olarak doğrudan ve dolaylı ışık. Deneysel alanı üzerindeki doğrudan güneş ışığı bloke ederken ışık kaynağı tavana doğru sivri olduğundan emin olun. Benzer şekilde tüm dört kol gölgeler olmadan aydınlatmak için EPM deneyler sırasında dolaylı ışık kullanmak önemlidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: deneme Yardımcısı çubuğu hareket izleme yazılım. Bu ana işlemlerine erişim sağlamak için tasarlanmıştır. Yalnızca şu anda izin verilen görevleri etkin olmakla birlikte düğmeleri tipik deneme süreci içinde görev karşılık gelir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: konu parça hayvanın hareketini takip kırmızı bir çizgiyle işaretlenir. Kadar sadece hayvan tespit ve kırmızı çizgi tarafından izlenen eşik ayarlayarak, arka plan Azaltılabilecek. Parça konu kitle ortasına takip ediyor ve geçerli konum koordinatları gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: artı labirent (EPM) açık kol Sprague Dawley (SPD) köstebeğiyle ile yüksek Deneysel set-up bir örnek gösterilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: birikmiş hareket parça bir deneme sırasında hayvan. Veri Analizi kapsamında toplanan yörünge izleme konu izleme alanında görüntülenebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: kronik eksojen keton takviyesi beslenme 83 gün sonra EPM SPD Rats'in davranışsal yanıt. Bu paneller EPM ve hareket izleme sistemi18tarafından toplanan temsilcisi sonuçları göster. (A) KSMCT grup harcanan süre LKE, KS, kollarını açarak zamanında büyük bir yüzdesi ve KSMCT gruplar kapalı kollar, denetim (SD) grubuna kıyasla daha kısa sürede geçirdi. (B) KS ve KSMCT gruplarının LKE, KS, süre açık silah daha fazla mesafe seyahat ve KSMCT gruplar daha az mesafe kapalı kollarında denetime göre anksiyete azaltılmış gösterilen (SD) Grup gitti. (C) KSMCT grup daha sonra kapalı silah azaltılmış anksiyete denetime (SD) Grup karşılaştırıldığında gösteren girdi. Kısaltmalar: SD = standart kemirgen chow + su (25 g/kg vücut ağırlığı (BW) su/gün); LKE = SD + LKE (1,3-butanediol-phyiscally diester, 10 g/kg b.w./day); HKE = SD + HKE (25 g/kg b.w./day); KS = SD + beta-hidroksibütrat-mineral tuz (bHB-S; 25 g/kg b.w./day); KSMCT = SD + bHB-S + Orta zincir trigliserid (MCT; 25 g/kg b.w./day); SPD Sprague-Dawley rat; = EPM yükseltilmiş = artı labirent (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; *** p < 0.0001). Bu rakam Ari ve arkdeğiştirildi. 18. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: SPD sıçan eksojen keton takviyesi oral gavaj 7 gün sonra davranışsal yanıt. Temsilcisi sonuçları EPM toplanan test, hareket izleme yazılım sistemi18kullanarak. (A) KE grubu harcanan süre KE, KS, kollarını açarak zamanında büyük bir yüzdesi ve KSMCT gruplar böylece azaltılmış anksiyete gösteren (denetim [SD] grubuna göre) ortasında daha az zaman geçirdim. (B) denetime (SD) grubu karşılaştırıldığında, daha az girişleri fareler KE ve KS gruplar kapalı kollarından tespit edildi. Kısaltmalar: SD = standart kemirgen chow + su (5 g/kg c.a. su/gün); KE = SD + keton ester (1,3-butanediol-phyiscally diester, 5 g/kg b.w./day); KS = SD + beta-hidroksibütrat-mineral tuz (bHB-S; 5 g/kg b.w./day); KSMCT = SD + bHB-S + MCT (5 g/kg b.w./day); SPD Sprague-Dawley rat; = EPM yükseltilmiş = artı labirent (* p < 0,05; *** p < 0,001; *** p < 0.0001). Bu rakam Ari ve arkdeğiştirildi. 18. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Koyu seçim testi, sosyal etkileşim testi ve EPM test kaygı düzeyi farklı hayvan modellerinde ölçmek için kullanılan gibi genel olarak, çeşitli testler, çok kullanılan. Ancak, EPM tahlil yalnız araştırmak için uygun bir yöntemdir, örneğin, kemirgenler anksiyete düzeyleri18,20tarihinde eksojen keton etkisi takviyeleri.
EPM yöntemi büyük avantajı kemirgenler içgüdüsel meyil koşulsuz yükseklik korkusu ve kaçınma açık alanlarda ek olarak karanlık ve kapalı alanlarda doğru yapılmasını gerektirecek ayarlamalardan olduğunu. Öte yandan, anksiyete gibi davranış çalışma için kullanılan bir diğer yöntem davranışsal yanıt elektrik çarpması, gıda/su yoksunluğu, gürültü ve predator koku3maruz gibi belirli zararlı uyaranlara için temel alır. EPM da daha insancıl bir alternatif temsil ederken bu testler genellikle bir şartına yanıt neden. Ayrıca, EPM farklı beyin bölgelerini (Örneğin, limbik bölgelere, hipokampus) ve temel mekanizmaları katılımı eğitim için yararlı bir araç olabilir (Örneğin, GABA, glutamat, serotonin, adenozin) anksiyete davranış2.
Özellikle potansiyel, ince Anksiyolitik etkileri değerlendirilirken (tüm hayvanlar aynı şekilde ele alınır önemlidirÖrneğin, oral gavaj), hayvanlar için ve aynı kişi tarafından oldukça stresli tedaviler uygulanırken. Mümkünse, uyuşturucu/bileşik içme suyu veya üzerinden bir kabul edilebilir hale getirilmesi 'tedavi' tercih edilen bir yöntem olabilir. Aynı miktarda her hayvan için yönetilen emin olmak için bir oral gavaj kullanılabilir. Bahçedeki farmakokinetik özelliklerine göre hayvanlar üzerinde EPM gavaging sonra 1 saat içinde test etmek için genellikle tavsiye edilir. Deneysel konuları seçerken, onların zorlanma, seks, estrus döngüsü, yaş, ve vücut ağırlığı, amaçlarına göre göz önünde bulundurun ve maddeler2test etmek önemlidir. Konuda yaş için EPM çalışmaları tasarlama ve veri yorumlama, bu dikkate almak önemlidir açık kol girişleri yüzdesi doğrusal olarak yaş21 ile artar ve zorlanma özgü22EPM davranış yaşlanma ile ilgili değişiklikler vardır.
Ne zaman bir EPM test iletken, ele alınması gereken potansiyel sorunlar var. Bazen hayvanlar nedeniyle aykırı eğilimleri analiz dışlanması gerekir (Örneğin, hayvan nerede yerleştirildi, alan bırakmaz neredeyse falls aparatı, kapalı bir gürültü veya olay aparatı dışında deli). EPM test ile daha fazla komplikasyonlar etkileri bu tip EPM parametreleri biçilen yoluyla gerektiğinden hangi sedasyon veya hiperaktivite neden tedavileri içerebilir.
Hayvanlar EPM test etmek için yalnızca bir kez kollarını açarak faaliyete düşmüştür çünkü ortaya çıkarmak önemlidir ve merkezi platformu üzerinde harcanan azalan toplam zaman gösterdi bu kemirgenler EPM tarihinde ilk poz göre ikinci (yinelenen) pozlama üzerinde 14,15. Bu nedenle, kemirgenler tek bir pozlama EPM test etmek için kesinlikle önerilir. Ancak, en az üç hafta EPM birinci ve ikinci maruz arasında olduğunu ve EPM Kurulum başka bir odaya (farklı ortam) taşınır, hayvanlar tarafından EPM soruşturma olması birden çok kez2test.
EPM farklı malzeme, (Örneğin, fare ya da sıçan için) boyutları mevcuttur ve renkleri seçerken dikkate alınması gereken ders. Önceki hayvan tarafından cihaz üzerinde yaptı kokuları izleyen hayvan davranışı değişebilir akılda tutmak önemlidir. Bu nedenle, hangi kokuları yıkandıktan sonra korumaz temiz, akrilik cam gibi (saydam), kolay bir malzemeden yapılmış bir EPM kullanarak önerilir. EPM aparatı ağaçtan kaçının. Tercihen, EPM üzerinde (Örneğin, siyah beyaz hayvanlar test) test hayvanları rengini farklıdır mat bir renk kullanın. Daha iyi hayvan ve muhafaza, daha iyi arasındaki kontrast hayvan ve yüksek güvenilirlik tespiti ve sonuçları duyarlığını elde (kaplı mesafe, hız, izleme). EPM aparatı mat gri malzemeden yapılmış beyaz, siyah ve beyaz ve siyah hayvanlarla yararlıdır.
EPM yanı sıra yüzme zorla çok çeşitli su labirent, açık alan, artı/Radyal Kol/T-Y labirentine, gibi davranış testleri ile yer tercih, kurmak için esnek ve kolay bir yol sunar video izleme sistemi başka bir avantajı olduğunu ve kuyruk süspansiyon testleri.
Özet olarak, bu makalenin amacı toplamak ve davranış değişiklikleri yanıt roman anksiyolitik tedaviler olarak çözümlemek için bir video izleme yazılımı ile birlikte kullanılan EPM testi tarif etmektir. EPM olası uygulamaları bozuklukları anksiyete ile ilgili tedavisinde yeni geliştirilmiş farmakolojik ajanlar prescreening içerir. Anksiyolitik ve anxiogenic ajanlar yanı sıra, farklı hormonlar davranış etkisi ve Uyuşturucu istismarı da soruşturma. Yaşlanma ve çeşitli stresler maruz etkisi de değerlendirilebilir. Bu çalışmada uygun adımlar alındığında, EPM kullanımı davranış değişiklikleri keton takviyesi18,20ile ilişkili değerlendirmek için hassas bir yöntem olmaya kanıtlamıştır imzalamıştır.
Disclosures
D'Agostino, DP, Kesl, S., Arnold, P. besteleri ve yöntemleri üretmek için yüksek ve sürekli ketozis. Uluslararası Patent # PCT/US2014/031237. Güney Florida Üniversitesi.
Ari, C., D'Agostino, D.P., eksojen keton takviyeleri anksiyete ile ilgili davranış azaltmak için. Geçici patent #62289749. Güney Florida Üniversitesi.
Dominic P. D'Agostino ve Csilla Ari keton Technologies LLC şirketi iş sahipleri.
Bu ilgi gözden geçirilmiş ve kendi kurumsal ve bireysel çıkar çatışması politikası doğrultusunda üniversite tarafından yönetilen. Tüm yazarlar hiçbir ek çıkar çatışması vardır bildirin.
Acknowledgments
Bu eser bir ONR Grant N000141310062 ve GLUT1D Vakfı Hibe #6143113500 (için Dominic P. D'Agostino), Ulusal Kalkınma Ajansı Macaristan (altında Grant No tarafından desteklenen bir durumdu TIOP-1.3.1.-07/2-2F-2009-2008; Zsolt Kovács için) ve (Kindy işaretlenecek) Gaziler Bakanlığı Bakanlığı tarafından. Yazarlar Quest beslenme LLC (için Csilla Ari) bu konuda devam eden araştırma destek için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elevated Plus Maze for mice and rats | Coulbourn Instruments | H10-35-EPM | |
| SMART Video Tracking Software | Harvard Apparatus | SMART 3.0 |
References
- Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open : closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 14 (3), 149-167 (1985).
- Walf, A., Frye, C. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2 (2), 322-328 (2007).
- Barnett, S. A. The rat: A study in behavior. , University of Chicago Press. Chicago, IL. (1975).
- Handley, S. L., Mithani, S. Effects of alpha-adrenoceptor agonists and antagonists in a maze-exploration model of 'fear'-motivated behaviour. Naunyn Schmiedebergs Archives. In Pharmacology. 327 (1), 1-5 (1984).
- Montgomery, K. C. The relation between fear induced by novel stimulation and exploratory behavior. Journal of Comparative Physiology and Psychology. 48 (4), 254-260 (1955).
- Sarkisova, K. Y., Midzianovskaia, I. S., Kulikov, M. A. Depressive-like behavioral alterations and c-fos expression in the dopaminergic brain regions in WAG/Rij rats with genetic absence epilepsy. Behavioral Brain Research. 144 (1-2), 211-226 (2003).
- Jain, N., Kemp, N., Adeyemo, O., Buchanan, P., Stone, T. W. Anxiolytic activity of adenosine receptor activation in mice. British Journal of Pharmacology. 1116 (3), 2127-2133 (1995).
- Paslawski, T., Treit, D., Baker, G. B., George, M., Coutts, R. T. The antidepressant drug phenelzine produces antianxiety effects in the plus-maze and increases in rat brain GABA. Psychopharmacology (Berlin). 127 (1), 19-24 (1996).
- Florio, C., Prezioso, A., Papaioannou, A., Vertua, R. Adenosine A1 receptors modulate anxiety in CD1 mice. Psychopharmacology (Berlin). 136 (4), 311-319 (1998).
- Engin, E., Treit, D. The effects of intra-cerebral drug infusions on animals' unconditioned fear reactions: a systematic review. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 32 (6), 1399-1419 (2008).
- Botton, P. H., et al. Aged mice receiving caffeine since adulthood show distinct patterns of anxiety-related behavior. Physiology and Behavior. 170, 47-53 (2017).
- Hughes, R. N., Hancock, N. J., Henwood, G. A., Rapley, S. A. Evidence for anxiolytic effects of acute caffeine on anxiety-related behavior in male and female rats tested with and without bright light. Behavioural Brain Research. 271, 7-15 (2014).
- Rex, A., Marsden, C. A., Fink, H. Effect of diazepam on cortical 5-HT release and behaviour in the guinea-pig on exposure to the elevated plus maze. Psychopharmacology (Berlin). 110 (4), 490-496 (1993).
- Almeida, S. S., Garcia, R. A., de Oliveira, L. M. Effects of early protein malnutrition and repeated testing upon locomotor and exploratory behaviors in the elevated plus-maze. Physiology of Behaviour. 54 (4), 749-752 (1993).
- Bertoglio, L. J., Carobrez, A. P. Behavioral profile of rats submitted to session 1-session 2 in the elevated plus-maze during diurnal/nocturnal phases and under different illumination conditions. Behavioural Brain Research. 132 (2), 135-143 (2002).
- Korte, S. M., De Boer, S. F. A robust animal model of state anxiety: fear-potentiated behaviour in the elevated plus-maze. European Journal of Pharmacology. 463 (1-3), 163-175 (2003).
- Carobrez, A. P., Bertoglio, L. J. Ethological and temporal analyses of anxiety-like behavior: the elevated plus-maze model 20 years on. Neuroscience & Biobehavioural Reviews. 29 (8), 1193-1205 (2005).
- Ari, C., et al. Exogenous ketone supplements reduce anxiety-related behavior in Sprague-Dawley and Wistar Albino Glaxo/Rijswijk rats. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 137 (2016).
- D'Agostino, D. P., et al. Therapeutic ketosis with ketone ester delays central nervous system oxygen toxicity seizures in rats. American Journal of Physiology: Regulation Integration and Comparative Physiology. 304 (10), R829-R836 (2013).
- Kovács, Z., D'Agostino, D. P., Ari, C. Anxiolytic effect of exogenous ketone supplementation is abolished by adenosine A1 receptor inhibition in Wistar Albino Glaxo/Rijswijk rats. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, 29 (2018).
- Lynn, D. A., Brown, G. R. The ontogeny of anxiety-like behavior in rats from adolescence to adulthood. Developmental Psychobiology. 52 (8), 731-739 (2010).
- Ferguson, S. A., Gray, E. P. Aging effects on elevated plus maze behavior in spontaneously hypertensive, Wistar-Kyoto and Sprague-Dawley male and female rats. Physiology of Behavior. 85 (5), 621-628 (2005).
