Summary
ここでは、齧歯類の動物モデルの不安レベルの変化を調査するためのプロトコルを提案する.高架式十字迷路 (EPM) テスト、追跡ソフトウェア、ビデオと併用は前臨床研究所では様々 な潜在的な抗不安薬治療の効果を文書化する信頼性の高い方法を提供します。
Abstract
本研究の全体的な目標は、高架式の方法論を説明するビデオのトラッキング ソフトウェアとの組み合わせで迷路 (EPM) 試験プラス。このメソッドの目的は研究室齧歯動物モデルのさまざまな潜在的な抗不安薬治療の効果を文書化します。EPM テストは、保護されている、囲まれた暗い空間・ オープン スペース ・ ハイツ、新しい環境を探索する彼らの生得的な強烈な動機の無条件の恐怖の齧歯動物の性癖に基づいています。EPM テストは動作に影響を与えると知られている薬を与えられた齧歯動物の抗不安薬または不安惹起の応答を調査するため広く使用されている行動のテスト。閉じた腕、開いた腕、クローズドの腕にエントリの数が減少、EPM テストによって測定された腕を開くエントリの上昇数に費やされる時間の割合が増加するに費やされる時間の割合が減少を示す観察可能性があります削減反映不安レベル。このメソッドを使用して、不安関連行動に外因性ケトン サプリメントの効果は、スプレイグ ドーリー (SPD) ラットでテストします。外因性ケトン サプリメントが、83 日間または subchronically のラットに与え慢性と急性経口 gavaged EPM を行う前に、7 日間毎日テストします。行動データ収集は治療の終わりに盲目オブザーバーによってスマート ビデオ追跡システムを使用して実行されます。主な結果を示し EPM テスト ケトン サプリメントによる抗不安薬の効果を検出する効果的な方法です、薬物または代謝ベースの治療に関連付けられている不安行動の変化を評価するために敏感な尺度と見なすことができます。
Introduction
この記事の目的は、不安関連行動の変化と研究室齧歯動物モデルで新しい治療法を監視するためにトラッキング ソフトウェア ビデオとの組み合わせで EPM テストの方法論を説明します。EPM テストは、薬物治療1の適用後不安行動レベルとラットの不安反応の定量化の調査のために開発された比較的単純な行動評価方法です。確かに、EPM テストが齧歯動物1,2の不安レベルの変化の調査のために広く使用され、効果的な行動アッセイであることが実証されています。齧歯動物 (主にラット、マウス) で EPM 試験の適用性は、囲まれた、暗いスペース (アプローチ) に向かって自分の性癖、オープン スペース/ハイツ (回避) の無条件恐怖と小説を探索する生得的なモチベーションの高レベルに基づいてください。環境。その結果、EPM テストは接近回避葛藤2,3に基づいて確立された手法です。
EPM がプラスの形をした装置 4 高架の腕から成るハンドリーと Mithani4 (図 1) が記載されていると、2 つの反対側のアームを閉じたに対し (両手) の周囲に開いている 2 つの反対側のアームで構成されています壁 (閉じた腕) が備わっています。治療後、増加時間は開いた腕および/または制御 (未処理) 動物に比べて腕が開いてエントリ数の増加が、EPM で検出された場合抗不安薬の効果2,3を示します。最も堅牢な回避反応は、EPM アッセイ5; (EPM の 4 本の腕の交差点でラットの配置) 開始後最初の 5 分で実証されています。したがって、治療後の動作は、EPM 上で 5 分間よく記録されます。不安レベルの追加措置、頭のディップ、後部 (2 つの後ろ足で齧歯動物の垂直立ち) 糞便ボリ、合計の腕の数として (自発運動) のエントリと異なる姿勢ストレッチ (凍結)、記録することもEPM2。したがって、複数の行動パラメタは、不安関連行動の包括的な評価を提供するためにコンパイルできます。
、結果の妥当性を高めるために 2 ~ 3 行動アッセイ一般的など使用される一緒に、社会的相互作用試験明暗選択テストと EPM のテストは、別の動物の不安レベルを測定するモデル6。齧歯動物を一人で演じる EPM アッセイも異なる薬7の抗不安薬や不安惹起効果を調べるための適切な方法です。EPM テストは敏感なとりわけ、ベンゾジアゼピン系抗不安薬 (例えばジアゼパム)8、しかしまた、するだけではなくアミノ酸、モノアミン、ペプチド、nucleosidergic 化合物 (例えばN-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA) 拮抗薬AP7、α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic 酸 (AMPA) 拮抗薬 CNQX、μ-オピオイド受容体アゴニスト モルヒネ、NPY1 拮抗薬 BIBP3226、サブスタンス P、グレリン、オキシトシン、セロトニン受容体アゴニストと拮抗薬 8 ああ DPAT などとWAY-100635 と β 1 アドレナリン拮抗薬ベタキソ ロール)9,10、11,12。その結果、齧歯動物の EPM アッセイは (例えば扁桃体、海馬、大脳辺縁系) 抗不安薬の作用に関与する脳の領域に影響を与えるさまざまな治療の影響を調査するための適切な高感度法と不安2に関係するアクション (例えば、セロトニン、Gaba、および adenosinergic システム) のメカニズム。これらの EPM の研究でテスト エージェントには、微妙な方法で行動の変化を検出する高感度法が必要となるシグナル伝達の脳を変更する外因性ケトン サプリメントが含まれます。
この記事では EPM テストのトラッキング ソフトウェア、実験的バイアスを排除するのに役立ちますし、コレクションと新規抗不安薬治療への応答における行動変化の解析を容易にビデオと組み合わせて使用をについて説明します。
Protocol
南フロリダの大学機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ガイドラインに従って (プロトコル #0006R) は動物の処理および測定プロシージャを行った。すべての努力は、使用される動物の数を減らすために行われました。
1. 準備
注: プロトコル通常必要があります研究所飼育ラットまたはマウス EPM をテストするため。ただし、モルモットなどの動物は、交通13でテストされています。ビデオのトラッキングを使用するときは、迷路の中で動物と迷路の色の色のコントラストを考慮することが重要です。コントラストがライブの動物または経由でビデオを見ている研究者には重要です。追跡ソフトウェアを文書化するように構成しなければ動物ビデオの設定には、黒または黒または白のいずれかの迷路に白がいます。透明なアクリルの迷路の設定で問題が発生するが、マット グレー迷路は両方の齧歯動物の色を最適にすることができます。
- 本体重量2と同様、ひずみ、セックス、発情サイクルと、年齢などの要因に影響を与える可能性を考慮した実験のために動物を選択します。
- 個々 の実験に基づいて、テストのグループごとのペット数を決定します。
注: グループ サイズは試験治療の予想される効果のサイズに依存になります。電力解析は実験グループの数と同様に、任意のタスク、動物の応答の可変性を与え含まれる科目の最小数を決定するのに実験が開始される前に一般的に行われます。 - デザイン実験 (、オープン フィールド テスト、EPM テスト、穴板テスト、および強制水泳テストなど、別の行動テスト バッテリー使用されます) 慎重に。
注意: 齧歯動物の EPM テストの直前に (オープン フィールド テスト) など新たなテスト環境への曝露前は、EPM1,2の動物の動作を変更できます。 - EPM のテスト前に同様の方法ですべての動物を扱います。
注: それが実証されて別のストレス要因、薬 (例えば注射)、送料の応力、および処理のアプリケーションが動作と EPM16齧歯動物の行動応答を変更できます。したがって、動物の家 (例えば出荷、EPM テストの前に 1-2 週間後)、実験的条件および処置 (例えばgavaging) を動物の慣れが必要です。また、齧歯動物、特にすぐに、テスト前に事前のストレッサーの経験の処理、動物および試験治療グループ間で一貫性のあることが重要です。 - ラットおよびマウスの動物は、彼らの暗い、アクティブな段階と行動評価を実行できますように逆のライト サイクルを使用してなどの夜行性動物の行動の研究を行います。
注: 別の住宅条件と光の効果に及ぼすサイクル/概日リズムと EPM の結果に与える影響を示した以前17動物のホルモンは、光のサイクルによって規制されているので。 - 手続き中に同じ実験者を使用し、臭気の強い石鹸や香水を避けるためにそれらを求めます。
- 実験中に話を動物の近くまたは EPM 環境近くのオブジェクトを移動しないこと実験者を求めます。
注: それが行動データを収集するときに、オブザーバーで最小限の動きとノイズを作ることが重要です。 - 探査試験動物に干渉する可能性が以前の動物のあらゆる臭いを消去する各試行後全体の EPM をきれい。
- (推奨)EPM テスト (1 〜 2 分押し続けると上体をそっと拾い) の前に数日間、動物を扱う実験者にそれらに適応します。
- 一貫した方法ですべての動物を処理し、各齧歯動物が、(例えば、実験者から開かれた腕に直面している中心部で) 同じ腕に直面する同じ位置で EPM は、EPM に動物を配置するときを確認します。
2. 外因性ケトン サプリメントの適用
- (例えば、胃内強制経口投与) の治療のための投与量の計算を決定するための任意の治療を開始する前に、動物の体重を測定します。
- ケトン補充 (標準的な齧歯動物の食事/スタンダード ダイエット [SD] + 水強制経口投与の前に 5 d の水を強制経口投与による胃内強制経口投与法 (適応期間) に動物を理解します。例えば水/日の 2.5 g/kg 体重)。胃内強制経口投与法に適応しない任意の動物の使用を除外します。
- 83 d の慢性的なため、SD と 7 d のどちらかの水で毎日強制経口投与 subchronically 動物をフィード次の適応期間 (例えば、5 g/kg 体重/日; コントロール グループ: n = 8)、ケトン エステルなどのサプリメントはケトン (柯; 1, 3-ブタンジ オール アセト酢酸ジエステル;例えば、5 g/kg 体重/日;n = 8)、ケトン塩 (KS。Na+/K+\u2012beta-hydroxybutyrate [βHB] ミネラル塩。例えば、5 g/kg 体重/日;n = 8)、または KS + 中鎖トリグリセリド (1:1 の比率、KSMCT;n = 8)18,19,20。
注: 胃内強制経口投与を受けた動物は、治療後 EPM 1 h でテストされました。ラットが標準の齧歯動物の食事と gavaged 水 (ケトン補充を除く) 制御グループとして提供しています。
3. 不安アッセイ
- EPM 装置
- 研究間で同じ装置を使用して、結果を標準化します。EPM は十字型の装置で、4 本の腕で構成されています (例えば、幅 10 cm、長さ 50 cm、腕があります): 2 つの反対側のアームが開かれ、2 つの反対の腕を閉じる高 (例えば、30 cm) の壁が備わっています。装置は (例えば、55 cm) 床の上高架2。
注: 最も一般的に使用されるパラメーターは、開いた腕とオープン腕の中; にエントリの数の累積時間ただし、クローズド アームとセンターに時間し、距離だけでなく、クローズド アームとセンターにエントリの数を測定各地域で旅しました。 - 間接照明を使用して EPM を光 (すなわち、直接光源が直接 EPM 装置を照明代わりに天井の方) すべての 4 本の腕同様に点灯していることを確認し、(影なしは図 2を参照)。
注: 光のレベルの変化は、EPM の齧歯動物の動作を変更します。したがって、連続した実験動物の日 (例えば部屋で 2,800 ルーメン)2と同様の照明が必要です。
- 研究間で同じ装置を使用して、結果を標準化します。EPM は十字型の装置で、4 本の腕で構成されています (例えば、幅 10 cm、長さ 50 cm、腕があります): 2 つの反対側のアームが開かれ、2 つの反対の腕を閉じる高 (例えば、30 cm) の壁が備わっています。装置は (例えば、55 cm) 床の上高架2。
- ビデオ追跡システム
注: は、コンピューターのインターフェイスと自動的に (ラットの行動データを収集するデータ収集用ビデオカメラ システムを追跡ビデオを使用します。図 3).追跡システム、さまざまな標準アナログ カメラまたはユーザー定義のイメージ ソース (赤外線カメラ、ビデオカメラ、WIA に準拠した USB カメラ、ウェブカメラ、ビデオetc.) 使用することができます。録画したビデオを分析、運動追跡ソフトウェアは、.avi、.vob、.wmv、.asf、.mov、.qt、.mpg、.mpeg、.mp4、.3gp、.mkv など、すべての一般的なビデオ フォーマットをサポートします。特定のコーデックを必要とする可能性がありますビデオが正しく再生されない場合その他のビデオ形式は、対応するコーデックがシステムにインストールされている場合にサポートされます。運動追跡ソフトウェアは、以前に取得した動画を分析し、DVD ・ HD レコーダー、デジタル ビデオ ファイル (.avi、.divx、.mpeg などの異なるソースから画像処理にも使用できます。etc.)、DV カメラ、ウェブカメラと WIA と互換性のあるイメージング デバイス。-
システムのセットアップ
- 動き追跡ソフトウェアのインストール キーを USB 2.0 ポートに差し込み、インストール ツールを起動します。
- 実験的領域の上カメラを修正し、それ実験の期間の間不動が保たれることを確認します。
- 取扱説明書を使用して運動追跡ソフトウェア システムに新しい実験を設定します。新しい実験を選択します。プロトコルのアイコンをダブルクリックして、新しい実験する必要があります (図 3、補助ファイル 1) に従うこと。
- ラベル/実験情報ダイアログで実験を説明する詳細を入力します。
- ビデオ シーケンスを処理するためのソースを指定します。
- 正しい距離測定の変換規則を定義します。校正プロセスには、距離と速度の信頼性の高い値を得るために実験の領域の実際の寸法を通知する運動追跡ソフトウェアができます。
- 作業領域への関心 (ゾーン) の領域を決定します。
- 検出プロセスのパラメーターを調整します。
- 動き追跡ソフトウェア イメージの動物の位置を正確に検出するため、いくつかの検出調整を設定する必要があります。
- 追跡プロセスでは、検出の設定パネルの明るさとコントラストのセクションで一般的な明るさとコントラストのパラメーターの微調整を使用してはっきりとよく対照的なイメージが必要です。必要に応じて、画像全体またはユーザー定義のゾーンにこれらの設定を調整します。
- 検出プロセスをテストする各アリーナにネズミを入れてください。
- 検出プロセスが正しく対象を識別できるかどうかを確認するテストの開始ボタンを押します。検出をアクティブに画面上のドットの外観を確認します。校正プロセスは、テストを開始する前に行う必要があります。
- 検出は、プレーヤーで表示される唯一の黒いドットが追跡されている動物を確認とみなされます。トラッキング線赤は密接にすべての動物の変位に従う必要があります。適切な追跡はまた座標の変位に基づく動物番号のリストと対応するホワイト ラベル確認します。そのような検出が得られない場合は、検出の最適化およびプロセスを追跡するためのしきい値とびらんのパラメーターを調整します。
- シャープとノイズのないテスト画像を得るためのしきい値と侵食のパラメーターを調整します。
- トラッキング パスは正しく表示されない場合は、テストの停止ボタン (図 4) を押します。これらの調整は、実験の新しいファイルすべてに使用する場合は、[既定値として保存] ボタンを押します。新しい検出設定を保存に同意ボタンを押します。
- 試験の時の条件を設定します。
- 実験プロトコルは、実験エリアに配置された対象は同じ時間に開始するトラックの取得プロセスを必要とする場合ソフトウェアに付属しているリモート ユニットを設定するか、ワイヤレス マウスを使用することが可能です。
注: このオプションは、リモート開始と停止を制御する可能性を提供します。
-
システムでは、被験者のセットアップ
- 実験対象のデータベースを管理します。実験科目のデータベースを作成するには、実験アシスタントのバーの科目のボタンを押すと被験者データベースマネージャーを入力します。
- データベースに新しい科目を追加するボタンを押して+ 。
- 1 つの対象オプションを既に選択、対象のコードを入力します。
- 件名プロパティ] セクションの件名の情報の残りの部分を入力します。
- 新しいテーマを追加するのに [作成] ボタンを押します。
- 実験計画を定義します。スケジューラを使用してさまざまなフェーズを定義します、セッション、試験、および被験者実験プロジェクト内で実行される予定です。裁判が「次の試行」として自動的に選択されます。このプロパティは、試用版の名前の左側にある緑色のチェック マークで表示されます。
-
同時録音と追跡によるデータ収集
注意: ライブ イメージ ソースが選択されているときは、プレーヤーパネルは簡単に選択したカメラからビデオをキャプチャするため埋め込み録音モジュールを提供します。- データ集録 (校正、ゾーン定義、検出設定、時間設定、スケジューラ) の運動追跡ソフトウェアを準備します。
- データ集録のパネルを開きます。
- せず、動物実験のソフトウェアで利用可能な記録を開始] ボタンを押して録画を開始します。
- 動物を実験のエリアに配置します。
- 時間コントロールパネルの開始ボタンを押すとデータ取得プロセスを開始します。追跡プロセスが実施される記録プロセスと同時。必要に応じて、行動の変数を手動で書き留めること実験者を求める後部など頭ディップと滝 (図 5)。
- EPM データを収集手動でと同様、実験室で盲目のオブザーバー (カーテンで EPM からオブザーバーは別)。
- 追跡処理記録の終わりまで待つか時間制御パネルの停止ボタンを押します。
- 実験区域から動物を削除します。動き追跡ソフトウェア プレーヤーで使用可能な停止ボタンを押すとビデオ録画プロセスを停止します。
- 洗浄、乾燥させると次の動物の実験エリアを準備します。再び同じサイクルを繰り返します。
-
データ分析
- 分析ツールにアクセスするには、実験アシスタントのバーの分析ボタンを押します。
- 終了試験の分析レポートを生成するため、分析試験を選択します。構成、分析レポートを選択します。分析する時間間隔を設定します。生成し、レポートを確認します。結果をスプレッドシートまたはイメージ形式 (図 6) にエクスポートします。
-
システムのセットアップ
- 不安レベルの測定のための EPM
- 経口後 (ぼんやり点灯と静かな部屋) でノンストレス条件下で EPM 実験を実行します。
注: 概日リズムは EPM15,17の齧歯動物の行動に影響を及ぼすために、実験がクローズ時間間隔 (例えば1200 と 1400 との間) で実行されることを確認します。実験中に不必要な動きやノイズを避けるため。 - テストの開始前に、EPM を洗浄して乾燥し、追跡システム ビデオを使用する準備を確認します。
- 自分のホームのケージでラットを実験室の実験を開始する前に 30 分に転送します。
- EPM は、実験者の反対の腕が開いてに直面しての 4 つの腕の交差にラットを配置します。
- トラッキング ソフトウェア、ビデオの実行だけでなく、5 分のための動物の動作を手動で記録。
- 動物 EPM が落ちる場合は、それを拾うし、それが落ちた、EPM の同じポイントに戻る場所します。この動物の行動データを分析から除外します。
注: 大きな音や動きが固定/凍結開いて腕上の動物。実験中に大きな音は聞いたことが場合、は、分析からその時点で実験動物の行動データを除外します。 - 5 分テストの終わりに、トラッキング ソフトウェア ビデオを停止し、EPM から動物を削除します。その家のケージに戻ってそれを配置します。
- 次の実験/動物前に水道水に続いて消毒洗剤 (例えばQuatricide) で EPM をクリーンアップします。ペーパー タオルで器具を乾燥させます。
- 経口後 (ぼんやり点灯と静かな部屋) でノンストレス条件下で EPM 実験を実行します。
4. ビデオ追跡システムによって収集されたデータの解析
- 開いて腕の中で、閉鎖の腕の中に費やされた時間数を分析記録されたデータに基づいて、腕にオープン、クローズドの腕と、センター ゾーンに作成されたエントリの数遅延; 閉じた腕の中にエントリを腕にオープン、クローズドの腕およびセンター ゾーンで進む距離。
注: 動物である区域にあるとき中心体の質量は、その地域では。 - テスト/テューキーの多重比較検定、フィッシャーの最小有意差 (LSD) 分散分析 (ANOVA) を用いた処理動作に及ぼす影響を決定します。
Representative Results
現在の実験調査は、外因性ケトン補充投与か慢性的仮説 (83 日間供給) または subchronically (7 日間経口投与 gavaged) が 2 ヶ月歳男性 (SPD) Sprague-dawley ラット (抗不安薬の効果250-350 g)。慢性的な管理から成っていた次のケトン サプリメント: 低用量ケトン エステル (LKE; アセト酢酸 1, 3-ブタンジ オール ジエステル、~ 10 g/kg/日、LKE)、高用量ケトン エステル (長城; 〜 25 g/kg/日、長城)、β-ヒドロキシ酪酸・ ミネラル塩 (bHB S; 〜 25 g/kg/日、KS)、および bHB S + 中鎖トリグリセリド (MCT; 〜 25 g/kg/日、KSMCT)。亜慢性実験、次の試験治療グループは使用された: 柯、KS と KSMCT (5 g/kg/日)。コントロール グループには、水強制経口投与 (コントロール) に SD または SD が含まれています。すべてのデータは、平均値として表された ± (SEM) 平均値の標準誤差。結果が重要と見なされるときp < 0.05。意義は、フィッシャーの LSD テストに一方向の分散分析によって決定されました。
KSMCT 群ラットが開いて腕の中で大幅に時間を過ごした慢性授乳後 (p = 0.0094) 制御グループと比較して。閉じられた腕の中で過ごした時間は小さかった LKE、カンザス、および KSMCT のグループで (p = 0.0389、0.0077、および 0.0019、それぞれ)、KS グループが中心で大幅により多くの時間を過ごした (p = 0.0239) コントロール (SD) グループ (と比較して図 7 a)18。
KS と KSMCT グループのラットが開いて腕の中で大幅に長い距離を旅して (p = 0.036 と 0.0165) 以下の距離を有意 LKE、KS と KSMCT グループのラットを閉じられた腕の中で旅している間、(p = 0.0252 0.00041 と0.0032、それぞれ)、対照群 (SD) (図 7 b) と比較して。センター地区に大きい距離制御グループと比較して、KS と KSMCT のグループがあった (p = 0.0206 0.0482、それぞれ)、KSMCT グループで閉じた腕の最初の入り口に待ち時間だった後有意慢性的な餌 (p = 0.0038)18 (図 7)。
KE グループで開いて腕の中で費やされた時間が大きかった (p = 0.0281) 経口の 7 日後 KE、KS、KSMCT のグループで時間で減少した中心 (p = < 0.0001、0.0005、0.023 をそれぞれ =)、コントロールと比較してl グループ (図 8 a)18。柯と KS グループで閉じた腕にエントリ数が低く (p = 0.0436 0.0234、それぞれ) 政権 (図 8 b)、KS のラットはまたグループの 7 日入力センター少ない頻繁 (p= 0.0193) コントロール (SD) グループに比べると。
図 1: 高架式十字迷路 (EPM) ラットのテストに使用します。各アームは 10 センチ、50 センチで、2 つの反対側のアームで開く縁が発生。2 つの反対の腕を閉じる 30 cm 高の壁が備わっています。床から滑走路の高さは 55 cm ですこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 2: 例の直接の間接照明します。光源は天井に向かって指摘されて実験的領域の上直接光がブロックされてを確認します。同様に影がないすべての 4 本の腕を照らすために EPM 実験中に間接光を使用することが重要です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 運動追跡ソフトウェアの実験助手バー 。それは主要な操作へのアクセスを提供するために設計されています。ボタンは、現在許可されているタスクだけがアクティブな間、典型的な実験プロセス内のタスクに対応しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 対象トラックが動物の動きに続く赤い線でマークされています。しきい値を調整して、背景は動物だけが検出され、赤い線で追跡まで減らすことができます。トラックは以下の通り、対象の質量の中心と現在の位置座標が示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 高架式十字迷路 (EPM) オープンの腕にスプレイグ ドーリー (SPD) ラット実験のセットアップの例が示されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 試用期間中動物の蓄積された運動トラック。データ分析の一部として、[追跡] の件名の収集した軌跡のトレースを表示できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 外因性ケトン補充の慢性的な供給の 83 日後 EPM で SPD ラットの行動応答します。これらのパネルは、EPM および運動追跡システム18によって収集された代表的な結果を示します。(A) KSMCT グループ LKE、KS 中、開いて腕の中での時間の大きな割合を費やしてし、KSMCT グループは、(SD) を対照群と比較して閉じられた腕の中で短い時間を過ごした。(B) の KS および KSMCT グループ LKE、KS 中、開いて腕の中でより多くの距離を旅して、KSMCT グループ旅閉じられた腕の中で距離コントロールと比較して不安の減少を示す (SD) グループ。(C)、KSMCT グループ入力後、閉鎖の腕 (SD) グループのコントロールと比較して不安を示します。略語: SD = 標準の齧歯動物の食事 + 水 (25 g/kg 体重 (帯域幅) 水/日);LKE = SD + LKE (アセト酢酸 1, 3-ブタンジ オール ジエステル、10 g/kg b.w./day);長城 = SD + 長城 (25 g/kg b.w./day);KS = SD + β-ヒドロキシ酪酸・ ミネラル塩 (bHB S; 25 g/kg b.w./day);KSMCT = SD + bHB S + 中鎖トリグリセリド (MCT; 25 g/kg b.w./day);SPD = Sprague-dawley ラット;EPM = 高架プラス迷路 (* p < 0.05; * * p < 0.01; * * * p < 0.001; * * * p < 0.0001)。この図は、Ariらから変更されています。18.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: 外因性ケトン補充の経口 7 日後 SPD ラットの行動応答します。代表的な結果は、EPM を介して収集された運動追跡ソフトウェア システム18を使用してテストします。KE グループ (A) 柯、KS 中、開いて腕の中での時間の大きな割合を費やして、KSMCT グループを示すため、不安を減少させた (コントロール [SD] グループに比較して) 中心部に短い時間を過ごした。(SD) グループのコントロールと比較して (B)、柯と KS グループのラットから閉じられた腕の中で少ないエントリが検出されました。略語: SD = 標準の齧歯動物の食事 + 水 (水/日 5 g/kg マリンスイーツ);KE = SD + ケトン エステル (アセト酢酸 1, 3-ブタンジ オール ジエステル、5 g/kg b.w./day);KS = SD + β-ヒドロキシ酪酸・ ミネラル塩 (bHB S; 5 g/kg b.w./day);KSMCT = SD + bHB S + MCT (5 g/kg b.w./day);SPD = Sprague-dawley ラット;EPM = 高架プラス迷路 (* p < 0.05; * * * p < 0.001; * * * p < 0.0001)。この図は、Ariらから変更されています。18.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
一般に、いくつかはよくテストを使用される明暗選択テスト、社会的相互作用のテストや EPM テストは異なる動物の不安レベルを測定する使用されるなど。しかし、単独で EPM アッセイは調査する適切な方法、たとえば、外因性ケトンの効果サプリメント齧歯動物の不安レベル18,20。
EPM 方法の主な利点は齧歯動物の本能的な性癖への無条件の恐怖とオープン スペースの回避だけでなく、暗い、囲まれたスペースを利用しています。その一方で、不安様行動を研究するために使用する他の方法は、電気ショック、食品/水剥奪、騒音、プレデター臭気3への露出など、ある特定の有害な刺激への行動応答に基づいています。EPM もより人の代替を表す間、これらのテストは通常エアコン応答になります。さらに、EPM は、異なる脳領域 (例えば辺縁系、海馬) と根本的なメカニズムの関与を検討する有用なツールをすることができます (例えばGABA、グルタミン酸、セロトニン、アデノシン) 不安行動2の。
ときに潜在的な微妙な抗不安作用を評価する場合は特に動物 (例えば経口)、すべての動物が同じ方法で処理することが重要だと、同じ人によってはかなりストレスが治療法を適用します。可能な場合は、飲料水または経由で口当たりの薬/化合物の導入 '治療' の好まれる方法可能性があります。同じ量はそれぞれの動物に投与されることを確保するため、経口を使用できます。化合物の薬物動態学的性質に基づいて、それは通常 gavaging 後 1 時間以内、EPM に動物をテストすることをお勧めします。実験科目を選択すると、目的に応じてそのひずみセックス、発情周期と年齢と同様、体重を考慮し、物質2をテストすることが重要です。年齢、点で EPM 研究の設計、データの解釈、それはそれを考慮することが重要腕が開いてエントリの割合は直線的年齢21増加し、EPM 動作の加齢関連の変更、株特異22。
EPM テストを実施する際に対処する必要がある潜在的な問題があります。動物が外れ値の傾向のため解析から除外する必要がある (例えば動物はそれが配置された領域から離れた、装置にほとんど落ちるがノイズや装置外イベントに気を取ら)。EPM のテストをさらに合併症治療効果のこれらのタイプは EPM パラメーター評価を経由する必要があるため、鎮静剤や多動性を引き起こす可能性があります。
開いて腕の活動を低下するため一度だけ EPM テストに動物を公開することが重要だし、中央のプラットフォーム上減少した総時間行い、EPM上の最初の露出と比較しての齧歯動物の 2 番目 (繰り返された) 露出14,15。したがって、EPM テストに齧歯動物の単一の露出することをお勧めします。ただし、EPM に最初と 2 番目の露出の間の 3 週間の最小値があると EPM セットアップは別の部屋 (異なる環境) に移動、EPM が動物を調査することがある場合は2でテスト複数回。
EPM は (例えば、マウスまたはラットの)、サイズの異なった材料で利用できる、色を選択するときに考慮する必要がある科目を勉強します。装置左側の前の動物臭が後続の動物の動作を変更可能性があります注意してくださいすることが重要です。したがって、アクリル ガラス (透明ではない)、洗浄後匂いが維持されませんなどきれい、やすい材料から作られる、EPM を使用をお勧めします。木製の EPM 装置を避けてください。好ましくは、EPM を (例えば、黒の場合は白い動物をテスト) でテスト動物の色とは異なるマットの色を使用します。動物とエンクロージャより良いコントラスト動物とより高い信頼性の検出と結果の精度を取得 (走行距離、速度、追跡)。EPM 装置マット グレー素材から作られた、白、黒と白と黒の動物と便利です。
ビデオ追跡システムのさらなる利点は、EPM に加えてそれは多種多様な水迷路、オープン フィールド プラス/ラジアル アーム/T ・ Y 迷路などの行動テストの場所選好、スイミングを強制設定する柔軟かつ簡単な方法を提供、と尾のサスペンション テスト。
要約すると、この資料の目的は、ビデオのトラッキング ソフトウェアと組み合わせて使用を収集し、新しい抗不安薬治療への応答での行動の変化を分析する EPM テストを記述するためです。EPM の可能なアプリケーションは、不安関連障害の治療のため新たに開発した薬理学的エージェントの細胞診を含まれます。抗不安薬、不安惹起剤に加えて、乱用薬物とさまざまなホルモンの行動の影響も調査することができます。高齢化と様々 なストレス要因への露出の影響も評価することができます。本研究は、適切な手順が取られるとき、EPM の使用をケトン補充18,20に伴う行動の変化を評価するために敏感な方法であると証明されて ことを締結しています。
Disclosures
ダゴスティーノ、d. p. Kesl、s. アーノルド、P. 組成物及びその製造方法高架・ ケトーシスを持続します。国際特許 # PCT/US2014/031237。南フロリダの大学。
アリ、c.、ダゴスティーノ、d. p.、外因性ケトンは、不安関連行動を減らすためサプリメントします。仮特許 # 62289749。南フロリダの大学。
ドミニク P. ダゴスティーノと Csilla Ari 会社ケトンの技術 LLC の共同所有者であります。
これらの利益が検討されており、その制度と個人の利害の対立の方針に従って大学によって管理されます。すべての著者は、その他の利害の対立がないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、(グラント号の下でハンガリーの国家開発庁によって、ONR グラント N000141310062 と (ドミニク P. ダゴスティーノ) に GLUT1D 財団補助金 #6143113500 によって支持されました。TIOP-1.3.1.-07/2-2F-2009-2008;ジョルト ・ Kovács) に、(幼稚園マーク) に退役省。著者 (Csilla アリ) このトピックに関する継続的な研究を支援するための探求栄養 LLC を感謝したいです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elevated Plus Maze for mice and rats | Coulbourn Instruments | H10-35-EPM | |
| SMART Video Tracking Software | Harvard Apparatus | SMART 3.0 |
References
- Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open : closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 14 (3), 149-167 (1985).
- Walf, A., Frye, C. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2 (2), 322-328 (2007).
- Barnett, S. A. The rat: A study in behavior. , University of Chicago Press. Chicago, IL. (1975).
- Handley, S. L., Mithani, S. Effects of alpha-adrenoceptor agonists and antagonists in a maze-exploration model of 'fear'-motivated behaviour. Naunyn Schmiedebergs Archives. In Pharmacology. 327 (1), 1-5 (1984).
- Montgomery, K. C. The relation between fear induced by novel stimulation and exploratory behavior. Journal of Comparative Physiology and Psychology. 48 (4), 254-260 (1955).
- Sarkisova, K. Y., Midzianovskaia, I. S., Kulikov, M. A. Depressive-like behavioral alterations and c-fos expression in the dopaminergic brain regions in WAG/Rij rats with genetic absence epilepsy. Behavioral Brain Research. 144 (1-2), 211-226 (2003).
- Jain, N., Kemp, N., Adeyemo, O., Buchanan, P., Stone, T. W. Anxiolytic activity of adenosine receptor activation in mice. British Journal of Pharmacology. 1116 (3), 2127-2133 (1995).
- Paslawski, T., Treit, D., Baker, G. B., George, M., Coutts, R. T. The antidepressant drug phenelzine produces antianxiety effects in the plus-maze and increases in rat brain GABA. Psychopharmacology (Berlin). 127 (1), 19-24 (1996).
- Florio, C., Prezioso, A., Papaioannou, A., Vertua, R. Adenosine A1 receptors modulate anxiety in CD1 mice. Psychopharmacology (Berlin). 136 (4), 311-319 (1998).
- Engin, E., Treit, D. The effects of intra-cerebral drug infusions on animals' unconditioned fear reactions: a systematic review. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 32 (6), 1399-1419 (2008).
- Botton, P. H., et al. Aged mice receiving caffeine since adulthood show distinct patterns of anxiety-related behavior. Physiology and Behavior. 170, 47-53 (2017).
- Hughes, R. N., Hancock, N. J., Henwood, G. A., Rapley, S. A. Evidence for anxiolytic effects of acute caffeine on anxiety-related behavior in male and female rats tested with and without bright light. Behavioural Brain Research. 271, 7-15 (2014).
- Rex, A., Marsden, C. A., Fink, H. Effect of diazepam on cortical 5-HT release and behaviour in the guinea-pig on exposure to the elevated plus maze. Psychopharmacology (Berlin). 110 (4), 490-496 (1993).
- Almeida, S. S., Garcia, R. A., de Oliveira, L. M. Effects of early protein malnutrition and repeated testing upon locomotor and exploratory behaviors in the elevated plus-maze. Physiology of Behaviour. 54 (4), 749-752 (1993).
- Bertoglio, L. J., Carobrez, A. P. Behavioral profile of rats submitted to session 1-session 2 in the elevated plus-maze during diurnal/nocturnal phases and under different illumination conditions. Behavioural Brain Research. 132 (2), 135-143 (2002).
- Korte, S. M., De Boer, S. F. A robust animal model of state anxiety: fear-potentiated behaviour in the elevated plus-maze. European Journal of Pharmacology. 463 (1-3), 163-175 (2003).
- Carobrez, A. P., Bertoglio, L. J. Ethological and temporal analyses of anxiety-like behavior: the elevated plus-maze model 20 years on. Neuroscience & Biobehavioural Reviews. 29 (8), 1193-1205 (2005).
- Ari, C., et al. Exogenous ketone supplements reduce anxiety-related behavior in Sprague-Dawley and Wistar Albino Glaxo/Rijswijk rats. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 137 (2016).
- D'Agostino, D. P., et al. Therapeutic ketosis with ketone ester delays central nervous system oxygen toxicity seizures in rats. American Journal of Physiology: Regulation Integration and Comparative Physiology. 304 (10), R829-R836 (2013).
- Kovács, Z., D'Agostino, D. P., Ari, C. Anxiolytic effect of exogenous ketone supplementation is abolished by adenosine A1 receptor inhibition in Wistar Albino Glaxo/Rijswijk rats. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, 29 (2018).
- Lynn, D. A., Brown, G. R. The ontogeny of anxiety-like behavior in rats from adolescence to adulthood. Developmental Psychobiology. 52 (8), 731-739 (2010).
- Ferguson, S. A., Gray, E. P. Aging effects on elevated plus maze behavior in spontaneously hypertensive, Wistar-Kyoto and Sprague-Dawley male and female rats. Physiology of Behavior. 85 (5), 621-628 (2005).
