Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Änderung des Angst von Nagetier Tiermodellen untersucht. Die erhöhten plus Labyrinth (EPM) Test, zusammen mit einem Video tracking-Software bietet eine zuverlässige Methode, um die Wirkung der verschiedenen möglichen anxiolytische Behandlungen in präklinischen Labor Szenarien zu dokumentieren.
Abstract
Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, die Methodik der erhöhten beschreiben plus Labyrinth (EPM) Test in Kombination mit einem Video tracking-Software. Die Methode soll die Wirkung verschiedener potenzieller anxiolytische Behandlungen auf Labor-Nager-Modelle zu dokumentieren. Die EPM-Test basiert auf der Nagetiere Neigung in Richtung geschützte, geschlossene dunkle Räume und unbedingte Angst vor offenen Räumen und Höhen und ihre angeborenen intensive Motivation, neue Umgebungen zu erkunden. Die EPM-Test ist ein weit verbreiteten Verhaltens Test zur Untersuchung der angstlösende oder furchtauslösende Antworten von Nagetieren, die Medikamente, die bekannt sind, um Verhalten zu beeinflussen. Beobachtungen zeigen einen verminderten Anteil der Zeitaufwand für die geschlossene Arme, ein erhöhter Anteil der Zeitaufwand für die offenen Armen, eine reduzierte Anzahl von Einträgen, geschlossene Arme und eine erhöhte Anzahl von Einträgen, die offenen Arms gemessen an der EPM-Test kann reduzierte widerspiegeln. Angstniveaus. Mit dieser Methode wird die Wirkung von exogenen Keton Ergänzungen auf Verhalten im Zusammenhang mit der Angst in Sprague-Dawley (SPD) Ratten getestet. Exogene Keton Ergänzungen werden chronisch die Ratten für 83 Tage oder subchronically zugeführt und akut oral gavaged, täglich für 7 Tage vor der Durchführung der EPM testen. Verhaltensdaten Sammlung erfolgt über die SMART Video tracking-System durch eine verblendete Beobachter am Ende der Behandlungen. Die wichtigsten Ergebnisse zeigen, dass der EPM-Test eine wirksame Methode ist um die Keton Ergänzung-induzierte angstlösende Wirkung zu erkennen und eine sensible Maßnahme als kann, um Änderungen in Angst Verhalten zugeordnet oder metabolische-medikamentöse Therapien zu beurteilen.
Introduction
Das Ziel dieses Artikels ist es, die Methodik der EPM-Test in Kombination mit einem Video tracking-Software zur Überwachung der Veränderungen im Verhalten im Zusammenhang mit Angst und neuartige Behandlungen im Labor Nager-Modelle zu beschreiben. Die EPM-Test ist eine relativ einfache Verhaltens Bewertungsmethode, die für die Untersuchung zur Quantifizierung der Angstniveaus Verhalten und Angst-Reaktionen von Ratten nach der Anwendung des Medikaments Behandlungen1entwickelt wurde. In der Tat wurde nachgewiesen, dass der EPM-Test eine verbreitete und wirksame Verhaltens-Assay für die Untersuchung von Veränderungen in der Angstniveaus der Nagetiere1,2 ist. Die Anwendbarkeit des EPM-Tests bei Nagetieren (vor allem Ratten und Mäuse) basiert auf ihre Neigung in Richtung geschlossenen, dunklen Räumen (Ansatz), eine unbedingte Höhenangst offene Räume / (Vermeidung) und ihre hohe angeborene Motivation Roman erkunden Umgebungen. Die EPM-Test ist eine etablierte Methode basiert auf einem Annäherungs-Vermeidungs-Konflikt2,3.
EPM ist eine Plus-förmige Vorrichtung, bestehend aus vier erhöhten Arme, die wurde von Handley und Mithani4 (Abbildung 1) beschrieben, und besteht aus zwei gegenüberliegenden Armen, die offen in die Umgebung (offenen Armen), während die beiden gegenüberliegenden Arme geschlossen (geschlossene Arme) sind mit Wänden ausgestattet. Nach der Behandlung wenn erhöhte auf den offenen Armen Verweildauer und/oder eine erhöhte Anzahl von offenen Arm Einträge im Vergleich zur Kontrolle (unbehandelt) Tiere ist auf der EPM erkannt bedeutet dies eine angstlösende Wirkung2,3. Die robusteste Vermeidung Antwort wurde in den ersten 5 min nach dem Start (Platzierung der Ratten im Schnittpunkt von vier Arme des EPM) der EPM-Assay5nachgewiesen; Deshalb wird jedes Verhalten nach einer Behandlung häufig für 5 min auf der EPM aufgezeichnet. Als zusätzliche Maßnahmen einer Angst-Ebene, die Anzahl der Kopf Dips, Hinterreifen (vertikal stehend der Nager auf beiden Hinterbeinen), fäkale Boli sowie total Arm Einträge (spontane Motorik) und verschiedenen Körperhaltungen (Dehnung oder Einfrieren), können auch erfasst werden auf der EPM-2. Somit können mehrere verhaltensbezogene Parameter kompiliert werden, um eine umfassende Bewertung von Verhalten im Zusammenhang mit der Angst zu stellen.
Um die Gültigkeit der Ergebnisse zu erhöhen, zwei bis drei Verhaltens Assays sind gebräuchlich zusammen, wie die hell-dunkel-Choice-Test, die soziale Interaktion-Test und der EPM-Test Angstniveaus der verschiedenen Tier messen Modelle6. Die EPM-Assay durchgeführt allein auf Nagetiere ist auch eine geeignete Methode zur Untersuchung der angstlösende oder furchtauslösende Wirkung von verschiedenen Medikamenten7. Die EPM-Test reagiert nicht nur auf Benzodiazepin-Typ Anxiolytika (z.B. Diazepam)8, sondern auch unter anderem zu amino Acid, Monoamin, Peptidergic und Nucleosidergic Verbindungen (z.B., N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-antagonist AP7, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Säure (AMPA) Antagonist CNQX, µ-Opioid-Rezeptor Agonist Morphin, NPY1 Antagonist BIBP3226, Substanz P, Ghrelin, Oxytocin, Serotonin-Rezeptor-Agonisten und Antagonisten wie 8-OH-DPAT und Way-100635 und β1-adrenergen Antagonisten Betaxolol)9,10,11,12. Infolgedessen ist die EPM-Assay auf Nagetiere eine geeignete und empfindliche Methode, den Einfluss der verschiedenen Behandlungen zu untersuchen, die Hirnareale beteiligt die angstlösende Wirkung (z.B., die Amygdala, Hippocampus und limbischen Regionen) zu beeinflussen und Wirkmechanismen (z.B. die serotonergen GABAergen und Adenosinergic System) in Angst2verwickelt. Die Agenten in diesen EPM-Studien getestet sind exogene Keton Ergänzungen, die verändern Gehirn signalisieren auf subtile Weise, die eine empfindliche Methode zur Erkennung von Verhaltensänderungen erfordern.
In diesem Artikel beschreiben wir die EPM-Test in Kombination mit einem Video tracking-Software, die hilft, um experimentelle Verzerrungen zu beseitigen und erleichtert die Sammlung und Analyse des Verhaltens Veränderungen in Reaktion auf neuartige anxiolytische Behandlungen verwendet.
Protocol
Die Behandlung von Tieren und Messverfahren wurden im Einklang mit der University of South Florida Tier Pflege und Nutzung Committee (IACUC) Richtlinien (Protocol #0006R) durchgeführt. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um die Zahl der Versuchstiere zu reduzieren.
1. Vorbereitungen
Hinweis: Das Protokoll erfordert in der Regel Labor gezüchtete Ratten oder Maus zu Testzwecken EPM. Allerdings wurden auch andere Tiere, wie Meerschweinchen, EPMs13getestet. Es ist wichtig, den Farbkontrast zwischen den Tieren in den Irrgarten und Labyrinth-Farbe zu berücksichtigen, wenn Sie video-Tracking zu verwenden. Der Kontrast ist weniger wichtig für Forscher, die Tiere live oder per video ansehen. Die Einstellungen des Video-tracking-Software müssen konfiguriert werden, um zu dokumentieren, dass die Tiere sind schwarz oder weiß auf einem schwarzen oder weißen Labyrinth. Probleme mit Konfigurationseinstellungen können auftreten, mit einem klaren Acryl Labyrinth kann, ein mattes grau Labyrinth jedoch für beide Nagetieren Farben optimal.
- Wählen Sie Tiere für das Experiment, wenn man bedenkt das Potenzial Einflussfaktoren, wie z. B. Stamm, Geschlecht, Brunst-Zyklus, sowie Alter und Body Gewicht2.
- Basierend auf den individuellen Experiment, bestimmen Sie die Anzahl der Tiere pro Gruppe für den Test.
Hinweis: Die Größe der Gruppe die Effektgröße abhängig werden, die mit der Testbehandlung erwartet wird. Machtanalysen sind in der Regel erfolgen, bevor das Experiment bestimmen die minimale Anzahl von Themen aufgenommen werden angesichts die Variabilität des Tieres Antworten in jede Aufgabe sowie die Anzahl der Gruppen/Versuchsbedingungen initiiert wird. - Design-das Experiment (in dem eine Reihe von unterschiedlichen Verhaltens Tests, wie Open-Feldtest, EPM-Test, Loch-Board Test und gezwungen Schwimmtest genutzt werden) sorgfältig.
Hinweis: Vor der Exposition von den Nagetieren auf eine neuartige Testumgebung (z. B. ein offener Feldversuch) unmittelbar vor der EPM-Tests kann das Verhalten der Tiere auf der EPM1,2ändern. - Behandeln Sie alle Tiere in ähnlicher Weise vor dem EPM-Test.
Hinweis: Es wurde nachgewiesen, dass verschiedene Stressfaktoren, Anwendung von Medikamenten (z.B. Injektionen), Versand Stress und Handhabung das Verhalten und die Verhaltensreaktionen von Nagetieren auf der EPM-16ändern können. Gewöhnung der Tiere (z. B.nach Versand, für 1-2 Wochen vor dem Test EPM) ein Tierhaus, experimentellen Bedingungen und Behandlungsverfahren (z.B. Gavaging) sind daher notwendig. Es ist auch wichtig, dass der Umgang mit den Nagetieren und keine Erfahrung mit vorheriger Stressoren, besonders unmittelbar vor der Prüfung, Tiere und Behandlungsgruppen konsistent sind. - Führen Sie die Verhaltensstudien in nachtaktive Tiere wie Ratten und Mäuse, mit eine umgekehrte Lichtzyklus, so dass die Behaviorale Beurteilung durchgeführt werden kann, wenn die Tiere in ihren dunklen, aktive Phase sind.
Hinweis: Die Auswirkungen der verschiedenen Haltungsbedingungen und Licht Zyklus/Circadiane Rhythmen auf Verhalten und deren Einfluss auf EPM Ergebnisse gezeigt wurden bisher17, da die Tiere Hormone durch die Licht-Zyklus reguliert werden. - Verwenden Sie die gleichen Experimentatoren im Verlauf der Verfahren und bitten sie, Parfüm oder Seifen mit starkem Geruch zu vermeiden.
- Fragen Sie die Experimentatoren nicht zu sprechen, in der Nähe des Tieres während des Experiments oder Verschieben von Objekten in der Nähe der EPM-Umgebung.
Hinweis: Es ist von entscheidender Bedeutung, dass der Beobachter nur minimale Bewegungen und keinen Lärm macht, wenn Verhaltensdaten sammeln. - Reinigen Sie die gesamte EPM nach jeden Versuch, Gerüche von vorherigen Tieren, die mit der Erforschung von Versuchstieres stören könnten zu löschen.
- (Empfohlen) Behandeln die Tiere tagelang vor dem EPM-Test (durch den Oberkörper vorsichtig abnehmen und halten es für ein oder zwei Minuten) zu ihnen, der Experimentator akklimatisieren.
- Wenn die Tiere auf der EPM platzieren, stellen Sie sicher, alle Tiere in konsistenter Weise zu behandeln und jedes Nagetier in der EPM in der gleichen Position mit Blick auf den gleichen Arm (z. B.in der Mitte mit Blick auf den offenen Arm Weg von der Experimentator).
2. Anwendung der exogenen Keton Ergänzungen
- Messen Sie das Körpergewicht der Tiere vor Beginn der Behandlungen um die Berechnung der Dosierung für die Behandlung (z.B. eines-Magensonde) zu bestimmen.
- Vertraut machen Sie, die Tiere, die eines-Magensonde Methode (Anpassungslehrgang) mit Wasser durch die Magensonde für 5D vor Keton-Supplementierung (standard Nagetier Chow/Standard-Diät [SD] + Wasser Magensonde; z.B.2,5 g/kg Körpergewicht/Tag des Wassers). Schließen Sie aus, die Verwendung von Tieren, die nicht an der Methode eines-Magensonde anpasst.
- Nach Ablauf der Anpassung, füttern Sie die Tiere chronisch für 83 d und subchronically für die 7D mit SD und Magensonde täglich mit entweder Wasser (z.B., 5 g/kg Körpergewicht/Tag; Kontrollgruppe: n = 8), Keton Ergänzungen wie Keton Ester (KE; 1,3 - Butandiol-Acetate Diester; z.B., 5 g/kg Körpergewicht/Tag; n = 8), Keton Salz (KS; Na+/k+\u2012beta-hydroxybutyrate [βHB] Mineralsalz; z.B., 5 g/kg Körpergewicht/Tag; n = 8), oder KS + mittelkettige Triglyceride (Verhältnis 1:1, KSMCT; n = 8)18,19,20.
Hinweis: Die Tiere, die eines-Magensonde empfangen wurden auf der EPM 1 h nach der Behandlung getestet. Ratten gefüttert mit standard Nagetier Chow und gavaged mit Wasser (ausgenommen Keton-Supplementierung) diente als Kontrollgruppe.
3. Angst Assay
- EPM-Apparat
- Verwenden Sie denselben Geräten über eine Studie Ergebnisse zu standardisieren. EPM ist ein Plus-förmigen Apparat, bestehend aus vier Arme (z. B.die Arme möglicherweise 10 cm breit und 50 cm lang): zwei gegenüberliegende Arme geöffnet sind, und die beiden geschlossen gegenüber Armen sind mit hohen (z.B. 30 cm) Wänden ausgestattet. Der Apparat ist erhöht über dem Boden (z. B.um 55 cm)2.
Hinweis: Die am häufigsten verwendeten Parameter sind die angesammelten Zeit in die offenen Arme und die Anzahl der Einträge in die offenen Arme; jedoch die Zeit der geschlossenen Arme und Zentrum, und die Anzahl der Einträge in die geschlossene Arme und Zentrum gemessen werden, sowie die Entfernung reiste in den einzelnen Bereichen. - Die EPM durch indirekte Beleuchtung leuchten (d.h.direkt die Lichtquelle auf die Decke statt direkt beleuchtet die EPM-Apparat) und stellen Sie sicher, alle vier Arme sind ebenso beleuchtet (ohne Schatten, siehe Abbildung 2).
Hinweis: Änderungen in der Ebene des Lichts verändern das Verhalten der Nager auf der EPM. Daher braucht man ähnliche Beleuchtung in aufeinander folgenden Versuchstiere und Tage (z.B. 2.800 Lumen im Zimmer)2.
- Verwenden Sie denselben Geräten über eine Studie Ergebnisse zu standardisieren. EPM ist ein Plus-förmigen Apparat, bestehend aus vier Arme (z. B.die Arme möglicherweise 10 cm breit und 50 cm lang): zwei gegenüberliegende Arme geöffnet sind, und die beiden geschlossen gegenüber Armen sind mit hohen (z.B. 30 cm) Wänden ausgestattet. Der Apparat ist erhöht über dem Boden (z. B.um 55 cm)2.
- Video-Trackingsystem
Hinweis: Verwenden Sie eine Video-Tracking-System mit einem Computer-Interface und eine Videokamera für die Datensammlung, die Verhaltensdaten in Ratten (automatisch sammelnAbbildung 3). Für das tracking-System, eine Vielzahl von standard-analog-Kameras oder benutzerdefinierte Bildquellen (Infrarot-Kameras, Camcorder, WIA-konforme USB-Kamera, Webcams, videoetc.) kann verwendet werden. Bei der Analyse der aufgezeichneten Videos unterstützt die Bewegung-Tracking-Software alle gängigen video Formate wie AVI, VOB, .wmv, .asf, .mov, .qt, .mpg, .mpeg,. MP4, .3 GP und .mkv. Wenn das Video nicht abspielen richtig tut, könnte es einen bestimmten Codec erfordern; Weitere video-Formate werden unterstützt, wenn der entsprechende Codec auf dem System installiert ist. Bewegung-Tracking-Software kann auch verwendet werden, um zuvor erworbenen Videos analysieren und verarbeiten die Bilder aus verschiedenen Quellen wie DVD/HD Recorder, digitale Videodateien (.avi, .divx, .mpeg,etc.), Webcams, DV-Kameras, und WIA-kompatiblen imaging-Geräte.-
System-setup
- Stecken Sie einen USB 2.0 Anschluss Installationsschlüssel von der Bewegung-Tracking-Software und starten Sie das Installations-Tool.
- Befestigen Sie die Kamera über dem experimentellen Bereich und stellen Sie sicher, dass es für die Dauer des Experiments unbeweglich bleibt.
- Richten Sie ein neues Experiment in der Bewegung-Tracking Softwaresystem mithilfe der Bedienungsanleitung. Wählen Sie Neues Experiment. Doppelklicken Sie auf das Symbol des Protokolls, dass das neue Experiment (Abbildung 3, ergänzende Datei 1) folgen sollte.
- Geben Sie Details zu Label/beschreiben das Experiment im Dialogfeld " Info zu experimentieren ".
- Geben Sie die Quelle der Videosequenzen zu verarbeiten.
- Definieren der Transformationsregel für eine korrekte Distanz-Messung. Die Kalibrierung ermöglicht die Bewegung-Tracking-Software über die tatsächlichen Maße des experimentellen Bereich informiert werden, um zuverlässige Werte für Distanzen und Geschwindigkeiten zu erhalten.
- Die Regionen von Interesse (Zonen) im Arbeitsbereich zu bestimmen.
- Passen Sie die Parameter für die Erkennung.
- Damit für die Bewegung-Tracking-Software, genau die Position des Tieres im Bild erkennen kann müssen einige Anpassungen Erkennung eingestellt werden.
- Das Tracking-Verfahren erfordert eine klare und gut kontrastierende Bild mithilfe eine Feineinstellung der allgemeine Helligkeit und Kontrast Parameter im Abschnitt Helligkeit und Kontrast der Erkennung Einstellungsleiste. Passen Sie gegebenenfalls die Einstellungen für das gesamte Bild oder benutzerdefinierte Zonen.
- Legen Sie eine Ratte in jeder Arena um den Erkennungsprozess zu testen.
- Drücken Sie auf Test starten , zu überprüfen, ob die Erkennung das Thema richtig identifizieren kann. Bestätigen Sie, dass die Erkennung durch das Auftreten von einem Punkt auf dem Bildschirm aktiviert ist. Die Kalibrierung muss vor Beginn der Prüfung erfolgen.
- Nachweis gilt als bestätigt, wenn der einzige schwarze Punkt im Player angezeigt wird das Tier verfolgt. Die rote Linie verfolgen muss das Tier Verschiebungen verfolgen. Ordnungsgemäße Verfolgung bestätigt auch mit einem weißen Aufkleber die tierische Anzahl auflisten und entsprechende Koordinaten basiert auf Verdrängung. Wenn diese Erkennung nicht erreicht wird, passen Sie die Schwelle und Erosionen Parameter zur Optimierung der Erkennung und Verfolgung Prozess.
- Passen Sie die Schwelle und Erosion Parameter um ein schärferes und rauschfreie Testbild zu erhalten.
- Wenn der Tracking-Pfad korrekt erkannt wird, drücken Sie Stop Test (Abbildung 4). Wenn diese Anpassungen für jede neue experimentelle Datei verwendet werden sollen, drücken Sie die Schaltfläche als Standard speichern . Drücken Sie die Schaltfläche " annehmen " zum Speichern der neuen Einstellungen Erkennung.
- Festlegen Sie die Zeitbedingungen, der Prüfungen.
- Wenn das experimentelle Protokoll Track Akquisitionsprozess gleichzeitig starten, die das Thema in den experimentellen Bereich gelegt wird erfordert, ist es möglich zum Einrichten der remote-Einheit, die mit der Software kommt oder eine schnurlose Maus verwenden.
Hinweis: Diese Option bietet die Möglichkeit der Fernsteuerung starten und stoppen.
-
Setup der Fächer im system
- Verwalten Sie die Experimente Thema Datenbank. Um eine Datenbank von Versuchspersonen zu erstellen, geben Sie Themen Database Manager durch drücken die Schaltfläche " Themen " in der Experimente Assistant Bar.
- + Die Taste der Datenbank neue Themen hinzu.
- Ein Thema Option bereits ausgewählt ist geben Sie das Thema Code.
- Füllen Sie den Rest des Subjekts Informationen im Abschnitt Thema Eigenschaften .
- Drücken Sie die Schaltfläche " Erstellen ", um den neuen Betreff hinzufügen.
- Definieren Sie die Experimente-Plan. Der Planer verwenden, um die verschiedenen Phasen definieren, Sitzungen, Studien und Themen innerhalb der experimentellen Projekt ausgeführt werden sollen. Der Prozess wird automatisch als "die nächste Trial" ausgewählt, die ausgeführt werden. Diese Eigenschaft wird als ein grünes Häkchen auf der linken Seite des Studie namens angezeigt.
-
Datenerfassung durch die gleichzeitige Aufzeichnung und Verfolgung
Hinweis: Wenn eine live-Bild-Quelle ausgewählt ist, bietet das Playerfenster eine eingebettete Erfassungsmodul für leicht die Videoaufnahme von der ausgewählten Kamera kommen.- Bereiten Sie die Bewegung-Tracking-Software für die Datenerfassung (Kalibrierung, Zonendefinition, Erkennung Einstellungen, Zeiteinstellungen, Scheduler).
- Öffnen Sie die Datenerfassung .
- Starten Sie die Videoaufnahme des Experiments ohne das Tier durch Drücken der Taste starten Sie die Aufnahme in die Software zur Verfügung.
- Fügen Sie das Tier in den experimentellen Bereich.
- Starten Sie die Datenerfassung durch Drücken der Start -Taste auf dem Zeit -Bedienfeld. Das Tracking-Verfahren wird gleichzeitig mit der Aufnahmeprozess durchgeführt werden. Je nach Bedarf Fragen den Experimentator notieren die behavioralen Variablen manuell, wie Hinterreifen, Kopf, Dips und Wasserfälle (Abbildung 5).
- Die EPM-Daten sammeln sowohl manuell als auch durch eine verblendete Beobachter (der Beobachter von der EPM durch einen Vorhang getrennt) in den Prüfraum.
- Bis zum Ende der Tracking-Prozess Aufnahme warten Sie oder drücken Sie die Stop -Taste auf dem Bedienfeld der Zeit .
- Entfernen Sie das Tier aus dem experimentellen Bereich. Stoppen Sie die Video-Aufzeichnung durch Drücken der stop -Taste zur Verfügung auf der Bewegung-Tracking-Software-Player.
- Bereiten Sie das Versuchsfeld für das nächste Tier durch Waschen und trocknen. Wiederholen Sie den Zyklus erneut.
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Datenanalyse
- Um das Tool zu gelangen, drücken Sie Analyse in der Experimente Assistant Bar.
- Um Analyseberichte der fertigen Studien zu generieren, wählen Sie die Testversionen zu analysieren. Konfigurieren Sie und wählen Sie den Analysebericht. Legen Sie die Zeitintervalle analysiert werden. Generieren Sie und überprüfen Sie die Berichte. Exportieren Sie die Ergebnisse in einer Tabelle oder Bild Formate (Abbildung 6).
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System-setup
- EPM zur Messung des Angstniveaus
- Durchführen Sie die EPM-Experimente unter Nonstress Bedingungen (in einem schwach beleuchteten und ruhigen Raum) nach oralen Magensonde.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Experimente in einem engen Zeitintervall (z.B.zwischen 1200 und 1400) ausgeführt werden, weil der zirkadiane Rhythmus die Nagetiere Verhalten auf der EPM-15,-17beeinflussen kann. Vermeiden Sie unnötige Bewegungen und Geräusche während des Experiments. - Sicherstellen Sie vor Beginn des Tests, dass die EPM wird gereinigt und getrocknet und das Video tracking-System ist einsatzbereit.
- Übertragen Sie die Ratten in ihrem Hause Käfig auf Versuchsraum 30 min vor Beginn des Experiments.
- Legen Sie eine Ratte an der Kreuzung der vier Arme des EPM, mit Blick auf den offenen Arm gegenüber von der Experimentator.
- Das Video tracking-Software laufen, als auch das Verhalten des Tieres, für 5 min manuell zu erfassen.
- Fällt das Tier aus der EPM, abzuholen Sie ihn, und legen Sie sie wieder an der gleichen Stelle der EPM wo fiel es aus. Verhaltensdaten dieses Tieres von der Analyse auszuschließen.
Hinweis: Ein lautes Geräusch oder Bewegung kann zu immobilisieren/Tiere auf offenen Armen einfrieren. Wenn während des Versuchs ein lautes Geräusch zu hören ist, schließen Sie die Verhaltensdaten des Tieres das Experiment in diesem Moment aus der Analyse unterzogen aus. - Am Ende der 5 Minuten-Test stoppen Sie das Video tracking-Software und entfernen Sie das Tier aus der EPM. Legen Sie es zurück in seine Heimat Käfig.
- Reinigen Sie vor dem nächsten Experiment/Tier die EPM mit einem desinfizierenden Reinigungsmittel (z.B.Quatricide), gefolgt von Leitungswasser. Trocknen Sie das Gerät mit einem Papiertuch.
- Durchführen Sie die EPM-Experimente unter Nonstress Bedingungen (in einem schwach beleuchteten und ruhigen Raum) nach oralen Magensonde.
4. Analyse der erhobenen Daten durch das Video Tracking-System
- Anhand der aufgezeichneten Daten, analysieren Sie die Höhe der Zeitaufwand in die offenen Arme und in den geschlossenen Armen; die Anzahl der Einträge, um die offenen Arme, Arme geschlossen, und der Center-Zone; die Wartezeit für den Eintritt in die geschlossene Arme; die zurückgelegte Strecke in die offenen Arme, Arme geschlossen, und in der Mitte-Zone.
Hinweis: Das Tier gilt in einem Gebiet als das Zentrum des Körpers Masse ist in diesem Bereich. - Bestimmen Sie den Auswirkungen der Behandlungen auf Verhalten mithilfe einer Varianzanalyse (ANOVA) mit Fisher es wenigsten signifikanten Unterschied (LSD) multiple Vergleiche-Test/Tukey-Test.
Representative Results
Das aktuelle Experiment untersucht die Hypothese, dass exogene Keton Ergänzung verabreicht entweder chronisch (83 Tage gefüttert) oder subchronically (mündlich gavaged für 7 Tage) hat eine angstlösende Wirkung auf zwei Monate alten männlichen Sprague-Dawley (SPD) Ratten ( 250-350 g). Chronische Verabreichung bestand aus den folgenden Keton Ergänzungen: niedrig dosierte Keton Ester (LKE; 1,3-Butandiol-Acetate Diester, ~ 10 g/kg/Tag, LKE), Hochdosis-Keton Ester (HKE; ~ 25 g/kg/Tag, HKE), Beta-Hydroxybutyrat-Mineral-Salz (bHB-S; ~ 25 g / kg/Tag, KS), und bHB-S + mittlere Kette Triglyceride (MCT; ~ 25 g/kg/Tag, KSMCT). Für subchronische Experimente dienten die folgenden Behandlungsgruppen: KE, KS, und KSMCT (5 g/kg/Tag). Die Kontrollgruppen enthalten SD- oder SD mit Wasser Magensonde (Kontrolle). Alle Daten wurden dargestellt als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Die Ergebnisse wurden als bedeutende wenn p < 0,05. Die Bedeutung wurde durch einfache ANOVA mit Fisher LSD-Test ermittelt.
Nach der chronischen Fütterung, verbrachte Ratten in der KSMCT-Gruppe deutlich mehr Zeit in die offenen Arme (p = 0.0094) im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Verweildauer in den geschlossenen Armen war deutlich weniger in die LKE, KS und KSMCT Gruppen (p = 0.0389, 0.0077 und 0.0019, beziehungsweise), während die KS-Gruppe deutlich mehr in der Mitte Zeit (p = 0.0239) im Vergleich zu der Kontrolle (SD) Gruppe ( Abbildung 7A) 18.
Ratten in den KS und KSMCT Gruppen reisten deutlich längere Strecken in die offenen Arme (p = 0,036 und 0.0165), während die Ratten in die LKE, KS und KSMCT Gruppen zeigten deutlich weniger Abstand in den geschlossenen Armen reiste (p = 0.0252, 0.00041, und 0.0032, beziehungsweise), verglichen mit der Kontrollgruppe (SD) (Abb. 7 b). Im Vergleich zur Kontrollgruppe, die KS und KSMCT Gruppen hatten größere zurückgelegte Strecke im Mittelbereich (p = 0.0206 und 0.0482, beziehungsweise), während in der KSMCT-Gruppe, die Wartezeit bis zur ersten Einfahrt in die geschlossene Arme war deutlich größer nach chronische Fütterung (p = 0.0038)18 (Abbildung 7).
Die Zeit in die offenen Arme war größer in der KE-Gruppe (p = 0.0281) nach 7 Tagen oralen Magensonde, während in den KE, KS und KSMCT Gruppen, die Zeit in der Mitte reduziert (p = 0,0005, < 0,0001, und = 0,023, bzw.), im Vergleich zu den Contro l-Gruppe (Abb. 8A)18. In den Gruppen KE und KS, die Anzahl der Einträge in die geschlossene Arme war signifikant niedriger (p = 0.0436 und 0.0234, beziehungsweise) nach 7 Tagen nach der Gabe (Abbildung 8 b), während die Ratten in der KS auch gruppieren die Mitte weniger häufig eingegeben (p = 0.0193), verglichen mit der Kontrollgruppe (SD).
Abbildung 1: erhöhte plus Labyrinth (EPM) Ratten zu Testzwecken verwendet. Jeder Arm ist 10 cm breit und 50 cm lang, mit zwei gegenüberliegenden Arme geöffnet mit einem erhöhten Rand. Die beiden geschlossen gegenüber Armen sind mit 30 cm hohen Wänden ausgestattet. Die Start-und Landebahn-Höhe vom Boden ist 55 cm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Beispiele für direkte und indirekte Beleuchtung. Stellen Sie sicher, dass die Lichtquelle gegen die Decke gerichtet ist, während das direkte Licht über dem experimentellen Bereich blockiert wird. Es ist wichtig, indirektes Licht während der EPM Experimente zu verwenden, um alle vier Arme ohne Schatten in ähnlicher Weise zu beleuchten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: die Experimente Assistent Bar von der Bewegung-Tracking-Software. Es soll Zugriff auf die wichtigsten Operationen zu ermöglichen. Die Tasten entsprechen die Aufgabe im Rahmen des typischen experimentieren während nur die derzeit zulässigen Aufgaben aktiv sind. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: die Thema Spur zeichnet sich durch eine rote Linie, die das Tier Bewegung folgen. Durch die Anpassung der Schwellenwerts, kann Hintergrund verringert werden, bis nur das Tier erkannt und durch die rote Linie verfolgt. Die Strecke folgt der Mitte der Masse des Subjekts und die aktuelle Positionskoordinaten sind angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: erhöhte plus Labyrinth (EPM) mit einer Ratte Sprague-Dawley (SPD) in der offenen bestückt Ein Beispiel für den Versuchsaufbau zeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: kumulierte Bewegungsspur des Tieres während eines Prozesses. Im Rahmen der Datenanalyse kann die gesammelten Flugbahn Spur des Themas in das Fährtengelände angezeigt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: Verhaltensreaktionen von SPD Ratten in der EPM nach 83 Tagen der chronischen Fütterung von exogenen Keton Supplementierung. Diese Tafeln zeigen repräsentative Ergebnisse von EPM und Bewegung-Tracking System18gesammelt. (A) der KSMCT-Gruppe verbrachte einen größeren Prozentsatz der Zeit in die offenen Arme, während die LKE, KS, und KSMCT Gruppen verbrachten weniger Zeit in geschlossenen Armen, im Vergleich zu der Kontrollgruppe (SD). (B) die KS und KSMCT Gruppen reisten mehr Distanz in die offenen Arme, während die LKE, KS, und KSMCT Gruppen weniger Strecke automatisch in den geschlossenen Armen zeigen im Vergleich zu der Kontrolle Angst reduziert (SD) Gruppe. (C) die KSMCT Gruppe eingegeben die geschlossene Arme später reduzierte Angst gegenüber der Kontrolle (SD) Gruppe angibt. Abkürzungen: SD = standard Nagetier Chow + Wasser (25 g/kg Körpergewicht (b.w.) von Wasser/Tag); LKE = SD + LKE (1,3-Butandiol-Acetate Diester, 10 g/kg b.w./day); HKE = SD + HKE (25 g/kg b.w./day); KS = SD + Beta-Hydroxybutyrat-Mineral-Salz (bHB-S 25 g/kg b.w./day); KSMCT = SD + bHB-S + mittlere Kette Triglyceride (MCT 25 g/kg b.w./day); SPD = Sprague-Dawley Ratten; EPM = erhöhte plus maze (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; *** p < 0,0001). Diese Zahl wurde von Ari Et al.modifiziert. 18. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8: Verhaltensreaktionen von SPD Ratten nach 7 Tagen von oralen Magensonde von exogenen Keton Supplementierung. Repräsentative Ergebnisse wurden durch die EPM gesammelt zu testen, mit einer Bewegung-Tracking-Software System18. (A) die KE-Gruppe verbrachte einen größeren Prozentsatz der Zeit in die offenen Arme, während die KE, KS, und KSMCT Gruppen verbrachten weniger Zeit in der Mitte (im Vergleich zu der Kontrollgruppe [SD]), was darauf hindeutet, reduziert Angst. (B) im Vergleich zu der Kontrolle (SD) Gruppe, weniger Einträge wurden in den geschlossenen Armen von Ratten in der KE und KS Gruppen erkannt. Abkürzungen: SD = standard Nagetier Chow + Wasser (5 g/kg b.w. von Wasser/Tag); KE = SD + Keton Ester (1,3-Butandiol-Acetate Diester, 5 g/kg b.w./day); KS = SD + Beta-Hydroxybutyrat-Mineral-Salz (bHB-S 5 g/kg b.w./day); KSMCT = SD + bHB-S + MCT (5 g/kg b.w./day); SPD = Sprague-Dawley Ratten; EPM = erhöhte plus maze (* p < 0,05; *** p < 0,001; *** p < 0,0001). Diese Zahl wurde von Ari Et al.modifiziert. 18. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
In der Regel verwendete mehrere häufig Tests, wie z. B. die hell-dunkel-Choice-Test, die soziale Interaktion-Test und der EPM-Test verwendet werden, um die Angst in verschiedenen Tiermodellen zu messen. Aber der EPM-Test allein ist eine geeignete Methode, um zu untersuchen, zum Beispiel die Wirkung von exogenen Keton Ergänzungen auf Nagetiere Angst Ebenen18,20.
Der Hauptvorteil der EPM-Methode ist, dass es stützt sich auf die Nagetiere instinktive Neigung in Richtung dunkle, geschlossene Räume, neben der unbedingten Höhenangst und Vermeidung von Freiflächen. Auf der anderen Seite basieren die Verhaltensreaktionen auf bestimmte schädliche Reize, z. B. Essen/Wasserentzug, Stromschlag, laute Geräusche und Exposition gegenüber Raubtier Geruch3andere Methoden verwendet, um Angst-ähnliches Verhalten zu studieren. Diese Tests führen in der Regel eine konditionierte Reaktion während der EPM auch eine humanere Alternative darstellt. Darüber hinaus kann die EPM ein nützliches Werkzeug, um die Beteiligung der verschiedenen Hirnregionen (z. B.limbischen Regionen, Hippocampus) und die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen (z.B.GABA, Glutamat, Serotonin, Adenosin) Angst Verhalten2.
Bei Behandlungen, die sind ziemlich stressig für die Tiere (z.B.orale Magensonde), ist es wichtig, alle Tiere die gleiche Weise behandelt werden und von der gleichen Person, vor allem, wenn potenzielle, subtile anxiolytische Effekte zu beurteilen. Wenn möglich, können Einführung der Droge/Verbindung im Trinkwasser oder über eine schmackhaft "behandeln" eine bevorzugte Methode sein. Um sicherzustellen, dass die gleiche Menge jedes Tier verabreicht wird, kann eine orale Magensonde verwendet werden. Basierend auf die pharmakokinetischen Eigenschaften der Verbindung, ist es meist ratsam, die Tiere auf der EPM innerhalb 1 Stunde nach der Gavaging zu testen. Bei der Auswahl der Versuchspersonen ist es wichtig zu prüfen ihren Stamm, Geschlecht, Brunst-Zyklus, und Alter sowie Körpergewicht, nach den Zielen und Stoffe2zu testen. In Bezug auf Alter beim Entwerfen EPM Studien und Interpretation der Daten es wichtig ist zu berücksichtigen, dass der Anteil der offenen Arm Einträge linear steigt mit Alter21 und die altersbedingte Veränderungen im EPM Verhalten sind Stamm-spezifische22.
Wenn Sie einen EPM-Test durchführen, gibt es potenzielle Probleme, die behoben werden müssen. Manchmal müssen Tiere aus der Analyse durch Ausreißer Tendenzen ausgeschlossen werden (z.B., das Tier nie verlässt den Bereich, wo es platziert wurde, fast fällt das Gerät wird durch ein Geräusch oder eine Veranstaltung außerhalb der Apparat abgelenkt). Weitere Komplikationen mit EPM testen können Behandlungen umfassen die Sedierung oder Hyperaktivität verursachen, da diese Arten von Effekten bewerteten über EPM-Parameter sein müssen.
Es ist wichtig, die Tiere auf der EPM-Test nur einmal aussetzen, weil Aktivität auf den offenen Armen verringert und eine verminderte Gesamtzeit auf der zentralen Plattform wurden auf der zweiten (wiederholter) von Nagetieren, die im Vergleich zu der ersten Exposition auf die EPM demonstriert 14,15. Einmaliger Exposition von Nagetieren, die EPM-Test wird daher dringend empfohlen. Jedoch wenn gibt es ein Minimum von drei Wochen zwischen dem ersten und zweiten Exposition gegenüber EPM und das EPM-Setup in ein anderes Zimmer (andere Umgebung) verschoben wird, können die Tiere durch die EPM untersucht werden mehrmals testen Sie2.
Die EPM gibt es in verschiedenen Materialien, Größen (z. B.Maus oder Ratte) und Fächer lernen Farben, die bei der Auswahl berücksichtigt werden muss. Es ist wichtig zu beachten, dass die Gerüche, die durch das vorherige Tier auf das Gerät verlassen das Verhalten des nachfolgenden Tieres ändern können. Deshalb empfehlen wir, dass mit einer EPM aus einem Material hergestellt, die leicht zu reinigen, wie Acrylglas (nicht transparent), die nicht die Gerüche nach dem Waschen beibehält. Vermeiden Sie EPM Apparat aus Holz gemacht. Verwenden Sie vorzugsweise eine Matte Farbe, die unterscheidet sich von der Farbe der Tiere auf die EPM (z.B.schwarz, wenn weiße Tiere getestet werden) getestet. Je besser erhalten den Kontrast zwischen dem Tier und das Gehäuse, desto besser die Erkennung des Tieres und desto höher die Zuverlässigkeit und Präzision der Ergebnisse (zurückgelegte Strecke, Geschwindigkeit, Verfolgung). EPM-Apparat aus mattem grau Material hergestellt sind mit weiß, schwarz, und weiße und schwarze Tiere nützlich.
Ein weiterer Vorteil des video-Trackingsystems ist, dass neben EPM, es eine flexible und einfache Möglichkeit bietet, es mit einer Vielzahl von Verhaltensstörungen Tests, wie zum Beispiel Wasser-Irrgarten, Open-Field, Plus/Radial Arm/T-Y Labyrinthe, Ort bevorzugt, gezwungen schwimmen eingerichtet , und tail Aussetzung Tests.
Zusammenfassend ist das Ziel dieses Artikels beschreiben die EPM-Test in Kombination mit einem Video tracking-Software zum sammeln und analysieren Verhaltens-Veränderungen in Reaktion auf neuartige anxiolytische Behandlungen verwendet. Die Anwendungsmöglichkeiten der EPM gehören die prescreening neuentwickelten pharmakologischer Substanzen für die Behandlung von Angst-Erkrankungen. Neben der angstlösende und furchtauslösende Agenten können auch die Verhaltensstörungen Wirkung von verschiedenen Hormonen und Drogenmissbrauch untersucht werden. Der Einfluss des Alterns und der Exposition gegenüber verschiedenen Stressoren kann auch bewertet werden. Diese Studie kam zu dem Schluss, dass beim richtigen Schritte unternommen werden, die Verwendung von EPM eine empfindliche Methode erwiesen hat zu Verhaltensänderungen Keton Ergänzung18,20zugeordnete beurteilen.
Disclosures
D ' Agostino, D.P., Kesl, S., Arnold, p. Kompositionen und Verfahren zur Herstellung von erhöht und nachhaltig Ketose. Internationalen Patent # PCT/US2014/031237. University of South Florida.
Ari, C., d ' Agostino, D.P., exogene Keton Ergänzungen zur Verringerung der Angst-Verhalten. Vorläufige patent #62289749. University of South Florida.
Dominic P. D'Agostino und Csilla Ari sind Miteigentümer des Unternehmens Keton Technologies LLC.
Diese Interessen wurden überprüft und von der Universität gemäß seiner institutionellen und individuellen Interessenkonflikt Richtlinien verwaltet. Alle Autoren erklären, dass es keine zusätzlichen Interessenkonflikte gibt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von einem ONR Grant N000141310062 und ein GLUT1D Foundation Grant #6143113500 (zu Dominic P. D'Agostino), der nationalen Entwicklung Agentur von Ungarn (unter Grant Nr. unterstützt. TIOP-1.3.1.-07/2-2F-2009-2008; an Zsolt Kovács) und des Department of Veterans Affairs (um Kindy markieren). Die Autoren möchten Quest Ernährung LLC danken für die Unterstützung der laufenden Forschung zu diesem Thema (um Csilla Ari).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elevated Plus Maze for mice and rats | Coulbourn Instruments | H10-35-EPM | |
| SMART Video Tracking Software | Harvard Apparatus | SMART 3.0 |
References
- Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open : closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 14 (3), 149-167 (1985).
- Walf, A., Frye, C. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2 (2), 322-328 (2007).
- Barnett, S. A. The rat: A study in behavior. , University of Chicago Press. Chicago, IL. (1975).
- Handley, S. L., Mithani, S. Effects of alpha-adrenoceptor agonists and antagonists in a maze-exploration model of 'fear'-motivated behaviour. Naunyn Schmiedebergs Archives. In Pharmacology. 327 (1), 1-5 (1984).
- Montgomery, K. C. The relation between fear induced by novel stimulation and exploratory behavior. Journal of Comparative Physiology and Psychology. 48 (4), 254-260 (1955).
- Sarkisova, K. Y., Midzianovskaia, I. S., Kulikov, M. A. Depressive-like behavioral alterations and c-fos expression in the dopaminergic brain regions in WAG/Rij rats with genetic absence epilepsy. Behavioral Brain Research. 144 (1-2), 211-226 (2003).
- Jain, N., Kemp, N., Adeyemo, O., Buchanan, P., Stone, T. W. Anxiolytic activity of adenosine receptor activation in mice. British Journal of Pharmacology. 1116 (3), 2127-2133 (1995).
- Paslawski, T., Treit, D., Baker, G. B., George, M., Coutts, R. T. The antidepressant drug phenelzine produces antianxiety effects in the plus-maze and increases in rat brain GABA. Psychopharmacology (Berlin). 127 (1), 19-24 (1996).
- Florio, C., Prezioso, A., Papaioannou, A., Vertua, R. Adenosine A1 receptors modulate anxiety in CD1 mice. Psychopharmacology (Berlin). 136 (4), 311-319 (1998).
- Engin, E., Treit, D. The effects of intra-cerebral drug infusions on animals' unconditioned fear reactions: a systematic review. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 32 (6), 1399-1419 (2008).
- Botton, P. H., et al. Aged mice receiving caffeine since adulthood show distinct patterns of anxiety-related behavior. Physiology and Behavior. 170, 47-53 (2017).
- Hughes, R. N., Hancock, N. J., Henwood, G. A., Rapley, S. A. Evidence for anxiolytic effects of acute caffeine on anxiety-related behavior in male and female rats tested with and without bright light. Behavioural Brain Research. 271, 7-15 (2014).
- Rex, A., Marsden, C. A., Fink, H. Effect of diazepam on cortical 5-HT release and behaviour in the guinea-pig on exposure to the elevated plus maze. Psychopharmacology (Berlin). 110 (4), 490-496 (1993).
- Almeida, S. S., Garcia, R. A., de Oliveira, L. M. Effects of early protein malnutrition and repeated testing upon locomotor and exploratory behaviors in the elevated plus-maze. Physiology of Behaviour. 54 (4), 749-752 (1993).
- Bertoglio, L. J., Carobrez, A. P. Behavioral profile of rats submitted to session 1-session 2 in the elevated plus-maze during diurnal/nocturnal phases and under different illumination conditions. Behavioural Brain Research. 132 (2), 135-143 (2002).
- Korte, S. M., De Boer, S. F. A robust animal model of state anxiety: fear-potentiated behaviour in the elevated plus-maze. European Journal of Pharmacology. 463 (1-3), 163-175 (2003).
- Carobrez, A. P., Bertoglio, L. J. Ethological and temporal analyses of anxiety-like behavior: the elevated plus-maze model 20 years on. Neuroscience & Biobehavioural Reviews. 29 (8), 1193-1205 (2005).
- Ari, C., et al. Exogenous ketone supplements reduce anxiety-related behavior in Sprague-Dawley and Wistar Albino Glaxo/Rijswijk rats. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 137 (2016).
- D'Agostino, D. P., et al. Therapeutic ketosis with ketone ester delays central nervous system oxygen toxicity seizures in rats. American Journal of Physiology: Regulation Integration and Comparative Physiology. 304 (10), R829-R836 (2013).
- Kovács, Z., D'Agostino, D. P., Ari, C. Anxiolytic effect of exogenous ketone supplementation is abolished by adenosine A1 receptor inhibition in Wistar Albino Glaxo/Rijswijk rats. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, 29 (2018).
- Lynn, D. A., Brown, G. R. The ontogeny of anxiety-like behavior in rats from adolescence to adulthood. Developmental Psychobiology. 52 (8), 731-739 (2010).
- Ferguson, S. A., Gray, E. P. Aging effects on elevated plus maze behavior in spontaneously hypertensive, Wistar-Kyoto and Sprague-Dawley male and female rats. Physiology of Behavior. 85 (5), 621-628 (2005).
