Summary
Здесь мы представляем протокол для изучения изменений в уровень тревожности грызунов животных моделей. Повышенные плюс лабиринт (EPM) тест, используемый вместе с видео, отслеживания программного обеспечения, обеспечивает надежный метод для документирования эффект различных потенциальных анксиолитическое лечения в сценариях доклинических лаборатории.
Abstract
Общая цель этого исследования заключается в том, для описания методологии повышенный плюс тест лабиринт (EPM) в сочетании с видео отслеживания программного обеспечения. Метод предназначен для документирования эффект различных потенциальных анксиолитическое лечения на лабораторных грызунов модели. EPM тест основан на грызунов склонность к защищенных, закрытых темного пространства и безусловный страх открытых пространств и высот и их врожденной интенсивной мотивации для изучения новых сред. EPM тест — это широко используемый поведенческих тест для расследования анксиолитическое или anxiogenic реакции грызунов, учитывая препаратов, которые влияют на поведение. Наблюдения, демонстрируя снизилась доля времени, затраченного на закрытых оружия, увеличение доли времени, затраченного на распростертыми объятиями, сокращение числа записей для закрытых оружия и повышенных количество записей с распростертыми объятиями, измеряется EPM тест может отражать сокращение уровень тревоги. С помощью этого метода, влияние экзогенных кетон добавки на связанные тревоги поведение испытывается в крысах Sprague-Dawley (СДПГ). Экзогенные кетон добавки хронически кормили крыс в течение 83 дней или subchronically и остро устно gavaged, ежедневно в течение 7 дней, прежде чем проводить EPM теста. Поведенческих данных коллекции осуществляется с помощью смарт-видео системы отслеживания ослепленный наблюдателя в конце лечения. Основные выводы показывают, что тест EPM является эффективным методом для обнаружения кетон дополнения индуцированной Анксиолитический эффект и может считаться чувствительных мер для оценки изменений в поведении тревоги, связанные с наркотиками или метаболических основе терапии.
Introduction
Цель этой статьи заключается в том, для описания методологии тестирования EPM в сочетании с видео отслеживания программного обеспечения для мониторинга изменений в поведении, связанных с тревоги и Роман лечения в лабораторных грызунов модели. EPM тест является относительно простой поведенческие оценки метод, который был разработан для изучения количественного поведение уровень тревоги и беспокойства ответы крыс после применения препарата лечения1. Действительно было продемонстрировано, что тест EPM является широко используемым и эффективным поведенческих assay для изучение изменений в уровень тревоги грызунов1,2. Применимость EPM теста в грызунов (главным образом, крыс и мышей) основана на их склонность к закрытый, темного пространства (подход), безусловный страх открытого пространства/высот (предотвращение) и их высокий уровень врожденное желание исследовать Роман среды. Следовательно тест EPM является устоявшейся методологии, основанной на2,подход недопущение конфликта3.
EPM является плюс образный аппарат, состоящий из четырех повышенной оружия, который был описан Хэндли и Mithani4 (рис. 1) и состоит из двух противоположных оружия, которые являются открытыми для окрестности (распростертыми объятиями), тогда как две закрытые противоположной руки (закрытой оружия) оснащены стены. После лечения если увеличение времени тратится на распростертыми объятиями и/или увеличение количества открытых руку записей, по сравнению с управления (необработанных) животных обнаруживается на EPM, это указывает Анксиолитический эффект2,3. Наиболее надежный ответ избежания была продемонстрирована в первые 5 минут после начала (размещение крыс на пересечении четырех оружия EPM) EPM пробирного5; Таким образом любое поведение после лечения обычно записывается на 5 мин на EPM. Как дополнительные меры уровень тревожности, количество головы провалы, тылы (вертикальные стоя грызунов на двух задних ногах), фекальные боли, а также общая руку записи (спонтанной двигательной активности) и различные позы (растяжения или замораживания), также могут быть записаны на EPM2. Таким образом несколько поведенческих параметров может быть скомпилирован предоставлять всестороннюю оценку поведения, связанные с тревогой.
Для повышения достоверности результатов, два или три поведенческих анализов часто используются совместно, например выбор свето тени, тест социального взаимодействия, и EPM тест, чтобы измерить уровень тревоги различных животных моделей6. Assay EPM, выполняются только на грызунов также является подходящим методом для расследования анксиолитическое или anxiogenic эффект различных препаратов7. EPM тест чувствительны не только к бензодиазепин тип анксиолитиков (например, диазепам)8, но и, среди прочего, амино кислоты, моноаминов, peptidergic и nucleosidergic соединений (например, N-метил D-аспартат (NMDA) антагонист AP7, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic кислоты (АМПА) антагонист CNQX, морфин агонистом μ опиоидных рецепторов, NPY1 антагонист BIBP3226, вещества P, грелина, окситоцин, серотонин рецепторов агонистов и антагонистов например 8-OH-DPAT и Way-100635 и Бетаксолол β1-адренергических антагонист)9,10,,1112. Следовательно, EPM пробу на грызунов является подходящим и чувствительных метод для изучения влияния различных методов лечения, которые влияют на зоны мозга, участвующие в Анксиолитический эффект (например, миндалины, гиппокампа и лимбической области) и механизмы действия (например, серотонинергические, ГАМК и adenosinergic системы) причастных тревоги2. Агенты, в этих исследованиях EPM включают экзогенных кетон добавки, которые изменяют мозг сигнализации в тонкие способы, которые могут потребовать чувствительным методом для выявления поведенческих изменений.
В этой статье мы опишем EPM теста используется в сочетании с видео отслеживания программного обеспечения, которое помогает устранить экспериментальной предвзятости и облегчает сбор и анализ поведенческих изменений в ответ на роман анксиолитическое лечения.
Protocol
Животных лечения и процедур измерения проводились в соответствии с университета Южной Флориды институциональных животных ухода и использования Комитет (IACUC) (протокол #0006R). Чтобы уменьшить количество животных, используемых были предприняты все усилия.
1. Подготовка
Примечание: Протокол обычно требует разводят лабораторных крыс или мышь для тестирования EPM. Однако другие животные, такие как морские свинки, также были протестированы на Геролерный13. Важно учитывать цветовой контраст между животными в лабиринте и лабиринт цвета при использовании видео-слежения. Контрастность является менее важным для исследователей, наблюдая животных жить или через видео. Параметры видео, отслеживания программного обеспечения необходимо настроить документ который животных, черный или белый на черный или белый лабиринт. Могут возникнуть проблемы с параметрами конфигурации с акриловой лабиринт, но матовый серый лабиринт может быть оптимальным для обоих грызунов цветов.
- Выберите животных для эксперимента, учитывая потенциал, воздействующие на нее факторы, такие как штамм, секс, цикл эструса и возраст, а также тела вес2.
- Основываясь на индивидуальный эксперимент, определите количество животных на группы для теста.
Примечание: Размер группы будет зависеть Размер эффекта, который ожидается с испытаний лечения. Анализ питания обычно сделаны до начала эксперимента является определить минимальное количество субъектов включить ввиду изменчивости в ответах животного в любой конкретной задачи, а также количество экспериментальных групп/условий. - Дизайн (в котором будет использоваться батарея различные поведенческие тесты, такие как полевых испытаний, EPM тест, тест отверстие Совет и заставили плавательный тест) эксперимент внимательно.
Примечание: Перед воздействием грызунов Роман тестовой среде (например, открытое поле тест) непосредственно перед проведением испытаний EPM могут изменить поведение животных на EPM1,2. - Обработка всех животных аналогичным образом перед испытанием EPM.
Примечание: Показал, что различные факторы стресса, применение препаратов (например, инъекции), доставку стресс и обработки можно изменить поведение и поведенческие реакции грызунов на EPM16. Таким образом необходимы привыкания животных животных дом (например, после отгрузки, для 1-2 недели до начала испытания EPM), экспериментальных условий и процедур (например, gavaging). Также важно, грызунов и любой опыт с предварительного раздражители, особенно непосредственно перед тестированием, должно быть согласовано между животных и лечения групп. - Проводить поведенческие исследования в ночных животных, таких как крыс и мышей, используя обратный свет цикла, так, что поведенческие оценки могут быть выполнены, когда животные находятся на этапе их темные, активный.
Примечание: Последствия различных жилищных условий и свет цикла/циркадного ритма на поведение и их влияние на результаты EPM были продемонстрированы ранее17, поскольку животных гормонов регулируется свет цикла. - Использование же экспериментаторов во время процедур и попросите их, чтобы избежать духи или мыло с сильным запахом.
- Попросите экспериментаторов не к говорить у животного во время эксперимента или переместить объекты вблизи EPM окружающей среды.
Примечание: Крайне важно, что наблюдатель делает минимальные движения и отсутствие шума при сборе поведенческих данных. - Очистите весь EPM после каждого судебного разбирательства, чтобы стереть любые запахи предыдущих животных, которые могут помешать исследованию животных испытаний.
- (Рекомендуется) Обрабатывать животных за несколько дней до испытания EPM (поднять его плавно, туловище и держа его на минуту или две) чтобы акклиматизироваться их экспериментатора.
- При размещении животных на EPM, убедитесь, что для обработки всех животных и последовательным образом и место каждой грызунов в EPM в том же положении, сталкиваются с той же руке (например, в центре, перед открытой руки от экспериментатора).
2. Применение экзогенных кетон добавки
- Мера веса тела животных перед началом любого лечения, чтобы определить дозировка расчет для лечения (например, внутрижелудочного затравки).
- Ознакомить животных в метод внутрижелудочного затравки (период адаптации) с использованием воды путем затравки для 5 d до кетон добавки (стандарт грызунов Чоу/стандарт диета [SD] + вода кормления; например, 2,5 г/кг веса тела/день воды). Исключить использование любого животного, которое не адаптироваться к методу внутрижелудочного затравки.
- После периода адаптации, кормить животных, хронически 83 d и subchronically для 7 d с SD и кормления ежедневно либо водой (например, 5 г/кг веса тела/день; контрольной группы: n = 8), кетон добавки например кетон Эстер (ке; 1,3 - бутандиол ацетоуксусный диэфира; например, 5 г/кг веса тела в сутки; n = 8), кетоны соль (KS; Минеральные соли Na+/k+\u2012beta-hydroxybutyrate [βHB]; например, 5 г/кг веса тела в сутки; n = 8), или KS + средний цепи триглицеридов (соотношение 1:1, KSMCT; n = 8)18,19,20.
Примечание: Животных, которые получили внутрижелудочного калийную были протестированы на EPM 1 ч после лечения. Крыс кормили с стандартным грызунов Чоу и gavaged с водой (за исключением кетон добавки) служил в качестве контрольных групп.
3. тревога Assay
- EPM аппарат
- Используйте же аппарат через исследование для стандартизации результатов. EPM это плюс образный аппарат, который состоит из четырех оружия (например, оружие может быть шириной 10 см и длиной 50 см): два противоположных вооружений открываются, и двумя закрытыми напротив оружия оснащены стены высокой (например, 30 см). Аппарат поднимается выше уровня пола (например, 55 см)2.
Примечание: Наиболее часто используемые параметры являются накопленный время, проведенное в объятия и количество записей в объятия; Однако, время, проведенное в закрытых оружия и центр, и количество записей в закрытых оружия и центр измеряются, а также расстояние ездил в каждой области. - Осветите вверх EPM с помощью непрямого освещения (т.е., прямой источник света к потолку вместо непосредственно осветительные приборы EPM) и обеспечить также светятся все четыре руки (без тени, см. Рисунок 2).
Примечание: Изменения в уровень света влияет на поведение грызунов на EPM. Таким образом подобные освещения необходима в последовательных подопытных животных и дней (например, 2800 лм в комнате)2.
- Используйте же аппарат через исследование для стандартизации результатов. EPM это плюс образный аппарат, который состоит из четырех оружия (например, оружие может быть шириной 10 см и длиной 50 см): два противоположных вооружений открываются, и двумя закрытыми напротив оружия оснащены стены высокой (например, 30 см). Аппарат поднимается выше уровня пола (например, 55 см)2.
- Видео системы
Примечание: Используйте видео система с интерфейсом компьютера и видео-камеры для сбора данных, который будет автоматически собирать поведенческих данных в крыс (отслеживанияРисунок 3). Для отслеживания системы, широкий спектр стандартных аналоговых камер или определяемые пользователем изображения источников (инфракрасные камеры, видеокамеры, WIA-совместимых USB-камеры, веб-камеры, видеоetc.) могут быть использованы. При анализе записанное видео, движение отслеживания программного обеспечения поддерживает все распространенные видео форматы, такие как .avi, .vob, .wmv, .asf, .mov, .qt, .mpg, .mpeg, .mp4, .3gp и .mkv. Если видео не воспроизведения правильно, она может потребовать определенного кодека; Дополнительные видео форматы поддерживаются, если в системе установлен соответствующий кодек. Движение отслеживания программного обеспечения может также использоваться для анализа ранее приобретенные видео и обработки изображений из различных источников, таких как DVD/HD диктофоны, цифровые видео файлы (.avi, .divx, .mpeg,etc.), веб-камеры, видеокамеры, и изображений WIA-совместимых устройств.-
Настройка системы
- Подключите ключ установки программного обеспечения отслеживания движения к порту USB 2.0 и запустите средство установки.
- Исправить камеру выше области экспериментальной и убедитесь, что он будет оставаться неподвижным в течение всего эксперимента.
- Настроить новый эксперимент в системе отслеживания движения с помощью инструкции по эксплуатации. Выберите Новый эксперимент. Дважды щелкните на значке протокола, что новый эксперимент должен следовать (рис. 3, 1 дополнительный файл).
- Введите данные метки/описать эксперимент в диалоговом окне Информация эксперимент .
- Укажите источник видео последовательностей для обработки.
- Определите правила преобразования для измерения правильного расстояния. Процесс калибровки позволяет движение отслеживания программного обеспечения быть информированным о фактические размеры области экспериментальной с целью получения надежных значений расстояния и скорости.
- Определите регионы интереса (зоны) в рабочей области.
- Отрегулируйте значения параметров процесса обнаружения.
- Чтобы движение отслеживания программного обеспечения точно определить положение животного в изображении необходимо задать некоторые обнаружения изменения.
- Процесс отслеживания требует образ четкий и хорошо контрастирует с помощью тонкой регулировки общая яркость и контраст параметров в разделе панели Настроек обнаружения яркость и контраст . При необходимости, настройте эти параметры для всего изображения или для пользовательских зон.
- Положите крысу в каждой арене для тестирования процесса обнаружения.
- Нажмите кнопку Начать тест для проверки, если процесс обнаружения может правильно определить тему. Убедитесь, что обнаружение активируется появление точки на экране. Процесс калибровки должно быть сделано перед запуском теста.
- Обнаружение считается подтвердил, когда только черная точка, показано в игрока это животное отслеживается. Красный, отслеживание линии необходимо внимательно следить за перемещениями животных. Надлежащего отслеживания также подтверждено white label листинг животных номер и соответствующих координат на основе перемещения. Если такое определение не получается, настройте порог и эрозий параметры для оптимизации обнаружения и отслеживания процесса.
- Отрегулируйте параметры порог и эрозии , чтобы получить изображение резче и шум бесплатный тест.
- Если путь отслеживания правильно обнаружено, нажмите кнопку Остановить тест (Рисунок 4). Если эти коррективы будут использоваться для каждого нового экспериментального файла, нажмите кнопку Сохранить как значение по умолчанию . Нажмите кнопку Accept , чтобы сохранить новые параметры обнаружения.
- Задайте время условия испытаний.
- Если экспериментальный протокол требует процесса приобретения трек, чтобы начать в то же время, что предметом помещается в области экспериментальной, то можно настроить пульт, который поставляется с программным обеспечением или использовать беспроводную мышь.
Примечание: Эта опция обеспечивает возможность удаленно контролировать start и stop.
-
Установка субъектов в системе
- Управление базой данных экспериментов субъекта. Для создания базы данных экспериментальных субъектов, введите диспетчер Баз данных субъектов , нажав на кнопку темы в строке Экспериментов помощник .
- Нажмите + кнопку Добавить новые темы в базу данных.
- Уже выбран вариант один предмет введите код субъекта.
- Заполните остальную информацию субъекта в разделе Свойства субъекта .
- Нажмите кнопку создать , чтобы добавить новую тему.
- Определение плана эксперимента. Использовать планировщик для определения различных фаз, сессий, испытания и темы планируется выполняться в рамках экспериментального проекта. Судебный процесс будет выбран автоматически, как «следующий процесс» должен быть выполнен. Это свойство отображается зеленая галочка слева от имени суда.
-
Сбор данных от одновременной записи и отслеживания
Примечание: При выборе источника живой образ, игрок группа обеспечивает встроенный записывающий модуль для легко захвата видео, поступающего из выбранной камеры.- Подготовьте движение отслеживания программного обеспечения для сбора данных (калибровка, определение зоны, обнаружение параметров, настройки времени, планировщик).
- Открытие панели сбора данных .
- Начните запись видео эксперимента без животного, нажав кнопку начать запись , имеющихся в программном обеспечении.
- Поместите животное в области экспериментальной.
- Начните процесс сбора данных, нажав кнопку Пуск на панели управления времени . Процесс отслеживания будет осуществляться одновременно с процессом записи. По мере необходимости попросите экспериментатор записать поведенческие переменные вручную, например тылы, голова провалы и водопад (рис. 5).
- Сбор данных EPM вручную, а также ослепленный наблюдателя (отдельный наблюдатель от EPM занавес) в зале испытаний.
- Дождитесь окончания процесса отслеживания записи или нажмите кнопку остановить на панели управления времени .
- Удаление животное из области экспериментальной. Остановите процесс записи видео, нажав кнопку остановить доступны на плеере движение отслеживания программного обеспечения.
- Подготовьте экспериментальные области для следующего животных путем промывки и сушки. Повторите цикл снова.
-
Анализ данных
- Для доступа к средство анализа , нажмите кнопку анализ на панели Помощник экспериментов .
- Чтобы создать отчеты анализа готовой испытаний, выберите испытаний для анализа. Настройка и выберите отчет анализ. Задайте интервалы времени для анализа. Выпускать и анализировать отчеты. Экспорт результатов в электронную таблицу или изображения форматов (рис. 6).
-
Настройка системы
- EPM для измерения уровней тревожности
- После пероральная затравка выполните EPM экспериментов в nonstress условиях (в тускло освещенной и тихой комнате).
Примечание: Убедитесь в том, что эксперименты выполняются в тесном временной интервал (например, между 1200 и 1400), потому что суточный ритм может повлиять на поведение грызунов EPM15,17. Избегайте ненужных движений и шум во время эксперимента. - Перед началом тестирования убедитесь, что EPM очищается и высушивается и видео, системы отслеживания готова к использованию.
- Передать в их дома клетки крыс экспериментальный номер 30 мин до начала эксперимента.
- Место Крыса на пересечении четырех оружия EPM, стоящих перед открытым руку напротив экспериментатора.
- Запустить видео, отслеживания программного обеспечения, а также запись вручную поведение животного, за 5 мин.
- Если животное падает EPM, забрать его и снова поместите ее на той же точке EPM, где он упал. Исключить из анализа поведенческих данных этого животного.
Примечание: Громкий шум или движение может парализовать/заморозить животных на распростертыми объятиями. Если во время эксперимента слышен громкий шум, исключите поведенческих данных животное проходит эксперимент в тот момент из анализа. - В конце теста 5 мин остановить видео, отслеживания программного обеспечения и удалите животное из EPM. Поместите его обратно в свои дома клетке.
- До следующего эксперимента/животное очистите EPM с дезинфицирующих моющих средств (например, Quatricide) следуют водопроводной воды. Сухие аппарат с бумажными полотенцами.
- После пероральная затравка выполните EPM экспериментов в nonstress условиях (в тускло освещенной и тихой комнате).
4. анализ данных, собранных на видео, системы слежения
- На основе зарегистрированных данных, проанализируйте количество времени, проведенное в объятия и в закрытой оружия; количество записей, с распростертыми объятиями, закрытые оружия, и к зоне центра; Задержка до вступления в закрытой оружия; Расстояние ездил в объятия, закрытые оружия и в зоне центра.
Примечание: Животное считается в районе когда центр тела масса в этой области. - Определите эффекты лечения на поведение с помощью дисперсионный анализ (ANOVA) с наименее значимого различия Фишера (ЛСД) тест/Тьюки множественные сравнения теста.
Representative Results
Текущего эксперимента расследует гипотеза, что экзогенные кетон добавки осуществляется либо хронически (кормили в течение 83 дней) или subchronically (устно gavaged за 7 дней) имеет Анксиолитический эффект на двух месячного мужской Sprague-Dawley (СДПГ) крысы ( 250-350 г). Хронический администрации состоял из следующих кетон добавки: низкие дозы кетон Эстер (LKE; 1,3-бутандиола ацетоуксусный диэфира, ~ 10 г/кг/день, LKE), Эстер высок дозы кетон (HKE; ~ 25 г/кг/день, HKE), бета гидроксибутирата минеральные соли (bHB-S; ~ 25 g / кг/день, KS) и bHB-S + средний цепи триглицеридов (MCT; ~ 25 г/кг/день, KSMCT). Для подострой экспериментов, были использованы следующие группы лечения: KE, KS и KSMCT (5 г/кг/день). Группы управления включены SD или SD с затравки воды (контроль). Все данные были представлены как среднее ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM). Результаты были значительными при p < 0,05. Значение определяется односторонний дисперсионный анализ с ЛСД тест Фишера.
После хронической кормления, крысы в группе KSMCT значительно больше времени в объятия (p = 0.0094) по сравнению с контрольной группой. Время, проведенное в закрытых оружия было значительно меньше в группах LKE, KS и KSMCT (p = 0.0389, 0.0077 и 0.0019, соответственно), в то время как группа KS значительно больше времени в центре (p = 0.0239) по сравнению с (Группа управления (SD) Рисунок 7а) 18.
Крысы в группах KS и KSMCT путешествовал значительно больше расстояния в объятия (p = 0,036 и 0.0165), в то время как крысы в LKE, KS и KSMCT групп, показали значительно меньше расстояния путешествовал в закрытой оружия (p = 0.0252, 0.00041, и 0,0032, соответственно), по сравнению с контрольной группой (SD) (рис. 7B). По сравнению с контрольной группой, KS и KSMCT группы имели большее расстояние в центре района (p = 0.0206 и 0.0482, соответственно), в то время как в группе KSMCT, задержка до первого входа закрытой оружия было значительно больше, после хронический кормления (p = 0.0038)18 (рис. 7 c).
Время, проведенное в распростертыми объятиями было больше в группе KE (p = 0.0281) после 7 дней пероральная затравка, в то время как в группах KE, KS и KSMCT, время, проведенное в центре сократилось (p = 0.0005, < 0.0001, а = 0,023, соответственно), по сравнению с contro l группы (рис. 8A)18. В группах KE и KS, количество записей в закрытых вооружений была значительно ниже (p = 0.0436 и 0.0234, соответственно) после того, как 7 дней администрации (Рисунок 8B), в то время как крысы в KS группа также вошел в центре менее часто (p = 0.0193), по сравнению с группой контроля (SD).
Рисунок 1: повышенные плюс лабиринт (EPM) используется для тестирования крысы. Каждая рука шириной 10 см и 50 см длиной, с двух противоположных оружия открыт с приподнятой кромки. Две закрытые напротив оружия оснащены стены 30 см высотой. Взлетно-посадочная полоса высота от пола составляет 55 см. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: примеры прямого и непрямого освещения. Убедитесь, что источник света указал к потолку, в то время как прямой свет выше области экспериментальной заблокирован. Важно использовать непрямой свет во время экспериментов EPM чтобы аналогичным образом осветить все четыре руки без тени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: бар помощник экспериментов движения отслеживания программного обеспечения. Он предназначен для обеспечения доступа к основным операциям. Кнопки соответствуют задачи в рамках процесса типичный экспериментов, хотя активны только в настоящее время разрешенных задач. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: тема трек, отмеченные красной линией после движения животного. Регулируя порог, фон может быть уменьшено до тех пор, пока только животного обнаруживается и отслеживается красной линией. Трек следит центр массы предмета, и указаны текущие координаты позиции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: повышенные плюс лабиринт (EPM) с крыса Sprague-Dawley (СДПГ) в открытом arm. Продемонстрировал пример экспериментальной установки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: трек накопленные движения животного во время судебного процесса. В рамках анализа данных собранных траектории след субъекта в области отслеживания могут быть отображены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: поведенческих реакций крыс SPD в EPM после 83 дней хронических кормления экзогенных кетон добавки. Эти панели показывают представитель результаты, собранные EPM и систему отслеживания движения18. (A) Группа KSMCT провел больший процент времени в объятия, а LKE, KS, и KSMCT групп провели меньше времени в закрытых оружие, по сравнению с группой контроля (SD). KS (B) и KSMCT групп путешествовал больше расстояние в объятия, а LKE, KS, и KSMCT групп путешествовал меньше расстояния в закрытой оружия, показаны сокращен тревожности, по сравнению с контролем (SD) группы. (C) KSMCT группа вошла закрытой оружия позднее, указывающее снижение тревоги по сравнению с контролем (SD) группа. Сокращения: SD = Стандартный грызунов Чоу + вода (25 г/кг веса тела (b.w.) день воды); LKE = SD + LKE (1,3-бутандиола ацетоуксусный диэфира, b.w./day 10 г/кг); HKE = SD + HKE (25 г/кг b.w./day); KS = SD + бета гидроксибутирата минеральные соли (bHB-S b.w./day 25 г/кг); KSMCT = SD + bHB-S + средний цепи триглицеридов (MCT b.w./day 25 г/кг); SPD = крыса Sprague-Dawley; EPM = повышенные плюс лабиринт (* p < 0,05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; *** p < 0.0001). Эта цифра была изменена от ОРВИ и др. 18. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: поведенческие реакции СПД крыс после 7 дней устных сцеженным экзогенных кетон добавки. Представитель результаты были собраны через EPM тест, с помощью программного обеспечения системы отслеживания движения18. (A) Группа KE провел больший процент времени в объятия, а KE, KS, и KSMCT групп провели меньше времени в центре (по сравнению с группой контроля [SD]), показывая тем самым, уменьшить тревогу. (B) по сравнению с контролем (SD) группа, менее записи были обнаружены в закрытых оружия от крыс в группах KE и KS. Сокращения: SD = Стандартный грызунов Чоу + вода (5 г/кг веса тела воды/день); КЕ = SD + кетон Эстер (1,3-бутандиола ацетоуксусный диэфира, b.w./day 5 г/кг); KS = SD + бета гидроксибутирата минеральные соли (bHB-S b.w./day 5 г/кг); KSMCT = SD + bHB-S + MCT (5 г/кг b.w./day); SPD = крыса Sprague-Dawley; EPM = повышенные плюс лабиринт (* p < 0,05; *** p < 0,001; *** p < 0.0001). Эта цифра была изменена от ОРВИ и др. 18. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
В целом несколько часто используемые тесты, такие как свето тени выбор испытания, социального взаимодействия и EPM тест, используются для измерения уровня тревоги в различных моделях животных. Однако только assay EPM является подходящим методом для расследования, например, влияние экзогенных кетон добавки на грызунов беспокойство уровней18,20.
Основным преимуществом метода EPM является, что она опирается на грызунов инстинктивное склонность к темной, закрытых помещениях, помимо безусловный страх высот и избежания открытых пространств. С другой стороны другие методы, используемые для изучения тревоги подобное поведение основаны на поведенческие реакции некоторых вредных раздражителей, как электрическим током, лишение пищи и воды, громких звуков и подверженности хищник запах3. Эти тесты обычно приводят в условный рефлекс, в то время как EPM также представляет собой более гуманную альтернативу. Кроме того, EPM может быть полезным инструментом для изучения участия различных мозга регионов (например, лимбической регионов, гиппокамп) и основных механизмов (например, ГАМК, глутамат, серотонин, аденозин) поведение тревоги2.
При применении процедур, которые являются довольно напряженный для животных (например, пероральная затравка), важно, что все животные, обрабатываются таким же образом и тем же лицом, особенно при оценке потенциальных, тонкие анксиолитический эффекты. Если возможно введение наркотиков/соединения в питьевой воде или через приятный «лечения» может быть предпочтительным методом. Для обеспечения же сумму для каждого животного, могут использоваться пероральная затравка. Основываясь на фармакокинетические свойства соединения, обычно рекомендуется проверить животных на EPM в течение 1 часа после gavaging. При выборе экспериментальной предметов, важно рассмотреть их деформации, секс, цикл эструса и возраст, а также веса тела, согласно целям и испытания веществ2. В связи с возрастом при проектировании EPM исследования и интерпретации данных, важно учитывать, что процент записей открытых руку линейно увеличивается с возрастом21 и связанных со старением изменений в поведении EPM штаммоспецифических22.
При проведении теста EPM, существуют потенциальные проблемы, которые необходимо решить. Иногда животных должны быть исключены из анализа из-за тенденции выбросов (например, животное никогда не покидает область, где он был помещен, почти падает покинуть аппарат, отвлекается на шум или событие вне аппарата). Дальнейшие осложнения с EPM тестирование может включать процедуры, которые вызывают седации или гиперактивность, потому что эти виды воздействия должны быть параметры начисленных через EPM.
Важно, подвергать животных EPM тест только один раз, потому что снижение активности на распростертыми объятиями и снижение общее время, затраченное на основе центральной платформы были продемонстрированы на второй (повторные) воздействию грызунов, по сравнению с первой экспозиции на EPM 14,15. Поэтому настоятельно рекомендуется одного контакта грызунов на тест EPM. Однако если есть как минимум трех недель между первым и вторым подверженности EPM и EPM set-up перемещается в другую комнату (различные среды), животные могут быть расследованы EPM тест более одного раза2.
EPM доступен в различных материалов, размеров (например, мыши или крысы), и цвета, которые необходимо учитывать при выборе изучать предметы. Важно иметь в виду, что запахи оставленные предыдущих животных на аппарат может изменить поведение последующих животного. Поэтому мы рекомендуем использование EPM изготовлены из материала, который легко очистить, например акриловое стекло (не прозрачный), который не сохраняет запахи после стирки. Избегайте EPM аппарат из дерева. Предпочтительно используйте матовый цвет, отличающийся от цвета животных, протестировано на EPM (например, черный, если тестируются белых животных). Чем лучше контраст между животным и корпуса, тем лучше обнаружения животных и тем выше надежность и точность результатов получены (покрынное расстояние, скорость, отслеживание). EPM аппарат из матовой серой материала являются полезными с животными белый, черный и белый и черный.
Еще одно преимущество системы видео-слежения, что помимо EPM, он предлагает гибкий и простой способ установить его вверх с широкий спектр поведенческие тесты, такие как вода лабиринт, открытое поле, плюс/радиальная руку/T-Y лабиринты, место предпочтений, заставили плавательный и хвост испытания подвески.
Таким образом цель этой статьи-изложить EPM теста используется в сочетании с видео отслеживания программного обеспечения для сбора и анализа поведенческих изменений в ответ на роман анксиолитическое лечения. Возможные применения EPM включают, подавшим недавно разработанных фармакологических агентов для лечения расстройств, связанных с тревогой. В дополнение к анксиолитическим и anxiogenic агенты также могут расследоваться поведенческих эффект различных гормонов и наркотиков. Можно также оценить влияние старения и воздействия на различные раздражители. Это исследование показало, что когда будут предприняты надлежащие шаги, использование EPM оказался чувствительным методом для оценки поведенческих изменений, связанных с кетон добавки18,20.
Disclosures
Д ' Агостино, д.п., Kesl, S., Арнольд, P. композиции и методы для производства повышенных и устойчивый кетоза. Международный патент # PCT/US2014/031237. Университет Южной Флориды.
Ари, C., Агостино, д.п., экзогенных кетон добавки для снижения тревоги, связанные с поведением. Предварительный патент #62289749. Университет Южной Флориды.
Доминик P. D'Agostino и Чилла ОРВИ являются совладельцами компании кетон Technologies LLC.
Эти интересы были рассмотрены и управляется университета в соответствии с его политикой институционального и индивидуального конфликт интересов. Все авторы заявляют, что не существует никаких дополнительных конфликты интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана ОНР Грант N000141310062 и GLUT1D Foundation грант #6143113500 (для Доминик P. д ' Агостино), национального агентства развития Венгрии (под № Грант TIOP-1.3.1.-07/2-2F-2009-2008; для Жолта Kovács) и Департамент по делам ветеранов (в ознаменование Кинди). Авторы хотели бы поблагодарить Quest питания ООО для поддержки текущих исследований по этой теме (чтобы Чилла Ari).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elevated Plus Maze for mice and rats | Coulbourn Instruments | H10-35-EPM | |
| SMART Video Tracking Software | Harvard Apparatus | SMART 3.0 |
References
- Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open : closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 14 (3), 149-167 (1985).
- Walf, A., Frye, C. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2 (2), 322-328 (2007).
- Barnett, S. A. The rat: A study in behavior. , University of Chicago Press. Chicago, IL. (1975).
- Handley, S. L., Mithani, S. Effects of alpha-adrenoceptor agonists and antagonists in a maze-exploration model of 'fear'-motivated behaviour. Naunyn Schmiedebergs Archives. In Pharmacology. 327 (1), 1-5 (1984).
- Montgomery, K. C. The relation between fear induced by novel stimulation and exploratory behavior. Journal of Comparative Physiology and Psychology. 48 (4), 254-260 (1955).
- Sarkisova, K. Y., Midzianovskaia, I. S., Kulikov, M. A. Depressive-like behavioral alterations and c-fos expression in the dopaminergic brain regions in WAG/Rij rats with genetic absence epilepsy. Behavioral Brain Research. 144 (1-2), 211-226 (2003).
- Jain, N., Kemp, N., Adeyemo, O., Buchanan, P., Stone, T. W. Anxiolytic activity of adenosine receptor activation in mice. British Journal of Pharmacology. 1116 (3), 2127-2133 (1995).
- Paslawski, T., Treit, D., Baker, G. B., George, M., Coutts, R. T. The antidepressant drug phenelzine produces antianxiety effects in the plus-maze and increases in rat brain GABA. Psychopharmacology (Berlin). 127 (1), 19-24 (1996).
- Florio, C., Prezioso, A., Papaioannou, A., Vertua, R. Adenosine A1 receptors modulate anxiety in CD1 mice. Psychopharmacology (Berlin). 136 (4), 311-319 (1998).
- Engin, E., Treit, D. The effects of intra-cerebral drug infusions on animals' unconditioned fear reactions: a systematic review. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 32 (6), 1399-1419 (2008).
- Botton, P. H., et al. Aged mice receiving caffeine since adulthood show distinct patterns of anxiety-related behavior. Physiology and Behavior. 170, 47-53 (2017).
- Hughes, R. N., Hancock, N. J., Henwood, G. A., Rapley, S. A. Evidence for anxiolytic effects of acute caffeine on anxiety-related behavior in male and female rats tested with and without bright light. Behavioural Brain Research. 271, 7-15 (2014).
- Rex, A., Marsden, C. A., Fink, H. Effect of diazepam on cortical 5-HT release and behaviour in the guinea-pig on exposure to the elevated plus maze. Psychopharmacology (Berlin). 110 (4), 490-496 (1993).
- Almeida, S. S., Garcia, R. A., de Oliveira, L. M. Effects of early protein malnutrition and repeated testing upon locomotor and exploratory behaviors in the elevated plus-maze. Physiology of Behaviour. 54 (4), 749-752 (1993).
- Bertoglio, L. J., Carobrez, A. P. Behavioral profile of rats submitted to session 1-session 2 in the elevated plus-maze during diurnal/nocturnal phases and under different illumination conditions. Behavioural Brain Research. 132 (2), 135-143 (2002).
- Korte, S. M., De Boer, S. F. A robust animal model of state anxiety: fear-potentiated behaviour in the elevated plus-maze. European Journal of Pharmacology. 463 (1-3), 163-175 (2003).
- Carobrez, A. P., Bertoglio, L. J. Ethological and temporal analyses of anxiety-like behavior: the elevated plus-maze model 20 years on. Neuroscience & Biobehavioural Reviews. 29 (8), 1193-1205 (2005).
- Ari, C., et al. Exogenous ketone supplements reduce anxiety-related behavior in Sprague-Dawley and Wistar Albino Glaxo/Rijswijk rats. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 137 (2016).
- D'Agostino, D. P., et al. Therapeutic ketosis with ketone ester delays central nervous system oxygen toxicity seizures in rats. American Journal of Physiology: Regulation Integration and Comparative Physiology. 304 (10), R829-R836 (2013).
- Kovács, Z., D'Agostino, D. P., Ari, C. Anxiolytic effect of exogenous ketone supplementation is abolished by adenosine A1 receptor inhibition in Wistar Albino Glaxo/Rijswijk rats. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, 29 (2018).
- Lynn, D. A., Brown, G. R. The ontogeny of anxiety-like behavior in rats from adolescence to adulthood. Developmental Psychobiology. 52 (8), 731-739 (2010).
- Ferguson, S. A., Gray, E. P. Aging effects on elevated plus maze behavior in spontaneously hypertensive, Wistar-Kyoto and Sprague-Dawley male and female rats. Physiology of Behavior. 85 (5), 621-628 (2005).
