Summary
本稿では、プライマリ爆発外傷性脳損傷の新たなモデルについて説明します。圧縮空気駆動型衝撃波管を使用して、単一の衝撃波にマウス海馬スライス培養体外を公開します。高スループットで再現可能な脳組織の損傷を生成する簡単かつ迅速なプロトコルです。
Abstract
外傷性脳損傷は、軍と民間人の集団における死亡や障害の主要な原因です。爆発装置の爆発からの爆風外傷性脳傷害の結果しかし、爆発圧力の露出に起因する脳損傷の根底にあるメカニズムに完全に理解されない、脳損傷のこのタイプに固有であると考えられています。前臨床モデルは、ブラストによる脳損傷を理解に寄与する重要なツールです。フリードランダー波形をモデル化した現実野外爆発波をシミュレートするために、自由回答式衝撃波管を用いた新規体外ブラストの TBI モデルが開発されました。C57BL/6 n マウス脊髄海馬スライス培養された単一衝撃波にさらされ、損傷の開発は最大 72 時間細胞に浸透し、細胞の損傷だけの老舗蛍光マーカーによる特徴づけられました。細胞膜が損なわれます。Propidium ヨウ化蛍光プロトコルの全期間にわたって偽スライスと比較すると爆風にさらされるスライスで有意に高値だった。脳組織の損傷は非常に再現性のある適用衝撃波のピーク過圧に比例です。
Introduction
爆発外傷性脳損傷 (TBI) は、爆発装置1,2の爆発に起因する脳損傷の複合型です。ブラスト TBI は、健康問題にイラクとアフガニスタンの2,3の最近の軍事衝突の最後の 15 年間で、主要なとして登場しました。全体的にみて、推定されている 4.4% とイラクとアフガニスタンからの帰還兵の 22.8% の穏やかな TBI、ブラスト関連英国軍4 と比較して米軍にブラスト TBI の報告された率が高いとされているこれらの大きい割合に苦しんでいます。 ,5。
即席爆発装置の使用は、ブラスト TBI、軍隊6耐えを含む、ブラスト関連の外傷のほとんどを担当しています。爆薬の爆轟により非常に急速な-しかし、過渡-ミリ秒単位で発生する圧力の増加します。現実自由場爆発から結果の重圧の波がフリードランダー関数、指数関数的減衰7、8に続いてピーク過圧に急激な増加をモデル化しました。極端な力と爆発イベントで彼らの急速な時間経過の範囲通常経験のない非爆発のトラウマ1,9。波形の最大圧力と肯定的な波の期間であるピーク過圧ブラスト脳損傷への重要な貢献者と考えられているし、これらは、爆薬と起爆10からの距離に依存 11。
爆破の結果を一次、二次、第三紀と第四紀の爆発負傷10,12,13,14として指定された 4 つの個別のコンポーネントとして分類するトラウマ。これらの各コンポーネントは、傷害の特定のメカニズムに関連付けられます。プライマリ爆発損傷臓器や組織の2,13重圧の波の直接行動からの結果します。投射物のフラグメントの影響から二次爆発傷害の結果、傷を2,15貫通と非貫通を引き起こします。第三爆発損傷は、犠牲者の体は地面や周囲のオブジェクトに対して変位、加速/減速力1,10,13と関連付けられる場合に発生します。第四紀の爆発の損傷では、最初の 3 つの傷害メカニズム説明12,13でカバーされない爆発に直接関連傷害の異種グループについて説明します。それは (しかしに限定されていません) が含まれています熱損傷、煙の吸入、放射線、電磁波、心理的悪影響13,15。爆風損傷の第四紀のメカニズムは通常全身負傷13に関連付けられてほとんどのブラスト関連 TBI は傷害の最初の 3 つの機構から直接結果します。効果 (例えばむち打ち症) 加速/減速力を鈍らせるし、外傷性脳損傷の浸透が盛ん TBI (例えば、自動車クラッシュ、滝、弾道傷害) の他のタイプに関連して。ただし、爆風損傷にユニークなプライマリ爆風過圧、脳組織への影響はあまりよく理解されて16。重圧の波に関連付けられているプライマリ爆発傷害メカニズムは、脳を操作する機械の力の最初です。
多くの前臨床 TBI モデル ブラスト TBI 機構傷害の病態生理を理解し、それ以外の場合、排他的に行うことが可能となるだろう潜在的な新しい治療法を調査する貴重なされている最後の十年にわたって開発されています。臨床設定の17,18,19を実行します。単一の前臨床モデルで臨床ブラスト脳外傷の複雑さを再現しないが通常異なる臨床 TBI モデルは人間 TBI の異なる側面をレプリケートします。爆発爆発に関連付けられている力の有害な作用は、単独で、あるいは両方生体外でそして生体内のブラスト TBI モデルでの組み合わせで学ぶことができます。In vitroモデル生物学的変動が減少し、向上の研究を許可する再現性実験環境 (組織の生理学的な条件および傷害バイオメカニクス) の厳格な制御を許可する利点があります。特定の分子は、動物の存在の交絡因子モデル20なしに重ねて表示します。私たちの目標は、脳組織に及ぼす主な爆発を調査するための in vitroモデルを開発することでした。即席爆発装置 (IED) によって生成されるよう自由場爆発フリードランダー波形代表と超音速衝撃波とモデルの開発を目指しました。
Protocol
本稿に記載されている実験イギリス動物 (科学的なプロシージャ) の行為 1986 年に準拠して行われた、動物福祉・倫理的レビュー体のインペリアル カレッジ ロンドンによって承認されています。動物の世話は、ロンドン大学インペリアル カレッジの制度のガイドラインに準拠してだった。
1. 海馬切片スライス標本と文化
注: このプロトコル Stoppini とマイナーな修正21,22,23の同僚によって記述されるインターフェイス メソッドによると海馬スライス標本切片の製造が可能します。理想的には、3 つ以上の動物を安楽死させ、各ステップを迅速に行うようにして、スライスの品質を損なうことを避けるために 1 つのセッションで解剖する必要があります。全体の無菌技術を使用します。
- 解剖のプロトコルを開始する前に次の手順が実行されますを確認します。
- 準備およびフィルター殺菌 0.22 μ m フィルターを使用して、事前にすべてのソリューション。
- 貯蔵の間に、脳、海馬スライス標本は 4 ° C で、ソリューションをすべての回で濡れている氷の上に座って、金属ヒートシンクに貯蔵容器とペトリ皿を保つことによって維持します。
- オートクレーブすべての金属の楽器、リングおよびペーパーティッシュ。
- すべての機器やプロトコルの各ステップに使用する材料は、事前に広げて置かれ、70% エタノールを噴霧を使用して、準備ができていることを確認します。冷めるし、乾燥を許可することを確認します。
- 5-7 日を安楽死させる-古い C57BL/6 n 頚部転位によって子犬をマウスし、簡単に 70% エタノールに浸漬滅菌紙ペーパーで全体の皮膚の表面を拭いてください。乾燥肌をなでるし、マヨはさみを使用して子犬の首をはねます。
- アイリス頭後頭部の開始と終了、鼻付近の正中線に沿ってはさみで頭皮の皮膚を切り取って横にそれを撤回します。
- 後頭に Vannas はさみの先端を挿入、横静脈洞に沿って骨に 2 つの小さな水平カットして嗅球まで正中線に沿って頭蓋骨をカットし、この地域で正中線に垂直に 2 つの小さい切り傷を作る。
- 罰金を使用してポイント カーブタイプ鉗子、正中線から横方向に骨のフラップ、慎重に小さいヘラを使って脳を削除し、90 mm シリコーン エラストマー コーティング シャーレに「解剖中」を含む転送します。
注: 郭清培地は Gey の平衡塩溶液 (5 mg/mL D-グルコース、1% 抗生物質抗真菌薬溶液、10,000 単位/ml ペニシリン、ストレプトマイシン 10 mg/mL、25 μ g/mL アムホテリシン B)。 - 小脳を取り外し、かみそりの刃を使用して正中線に沿って大脳半球。ヘラを使用すると、90 mm の新しいシリコーン エラストマー コーティング シャーレいっぱい新鮮な冷たい解剖中に大脳半球を転送します。1 つ以上の動物を 1 つのセッションで使用する場合は、手順 1.2-1.6.
- 、顕微鏡下で嗅球とかみそりの刃で前頭葉の先端をカットし、ファインチップ鉗子を用いた脳組織の残りの部分から別の大脳皮質。この手順は、海馬皮質組織の内側表面に露出を残します。、このステップから層流ティッシュ文化フード (紫外線殺菌し、70% エタノールで洗浄) を使用します。
- 平らなプラスチック製チョッピング ディスクに冷たい解剖中を適用し、皮質の内側面を向いている、海馬の軸はチョッピング刃の軸に垂直になるようにディスク上の脳組織の位置へらを使用して。
- ファインチップ Pasteur のピペットを使用してチョッピング ディスクから解剖中の可能な限り削除します。
- 50% のチョッピング速度で組織のチョッパーを使用して 400 μ m スライスに脳をカットし、強制的に。
注: この手順ができるだけ早く脳組織が解剖中に浸漬されないと実行は非常に重要です。 - シリコーン エラストマー コーティング ペトリ皿中郭清を新鮮な冷たい媒体に置き換えます。
- 組織のチョッパーが完了すると、慎重に新鮮な解剖中、脳組織が水没し、切断組織を 90 mm シリコーン エラストマー コーティング ペトリ皿ストレート刃メスに転送します。
- 、顕微鏡の下で慎重に微細先端の鉗子を用いた皮質のスライスを区切ります。各スライスに対して、解離に起因またはスライスの形態と潜在的な組織の損傷の海馬を検査します。
- 内嗅野采ファインチップ鉗子と Vannas のハサミを使用してから、なったを区切ります。通常、大脳半球海馬スライス標本約 6 に 8 が生成されます。
- カットを使用してティッシュ文化の挿入にまで 6 海馬スライスを転送パスツール ピペットと場所 35 mm ペトリ中皿します。スライスが数ミリ離れて (各スライスは個別に視覚化されるようにするが) に広がっていることを確認します。
- すぐに冷えた追加「培」各シャーレの底にティッシュ文化挿入下組織文化の最上部のすぐ下が縁を挿入します。
注: 成長培地を含む 50% 最小値必要な媒体イーグル、25% ハンクス平衡塩溶液、25% 馬血清、D-グルコースの 5 mg/mL、2 ミリ モル/L L グルタミン、1% 抗生物質抗真菌薬ソリューション、および 10 ミリ モル/L HEPES、水酸化ナトリウムで pH 7.2 に滴定します。 - 郭清後の日とし、すべて 2 〜 3 日その後 (使用培 37 ° C で) 成長媒体を変更します。成長培地が追加されるように十分な量が、それほど培養挿入膜組織スライスの生存を危険にさらす可能性にオーバーフローします。
- 12 〜 14 日の実験で使用されている前に加湿のインキュベーターで空気中の炭酸ガスの 5% と 37 ° C での組織スライスを維持します。
2. 実験的爆発 TBI プロトコルの海馬切片スライスの準備
注: 画像を除く、このセクションのすべての手順で行われる流ティッシュ文化フード。
- (まあ 1) 6 ウェル プレートにオーダーメイドのステンレス製リングを挿入します。
ノート: リング (12 の位置に座る必要があります)、ノッチとリム、組織培養を挿入しながら、井戸中ぴったりフィットはこのリムに容易に合います。リングが殺菌消毒剤で洗浄し、徹底的に精製水、オートクレーブですすぎ、事前に冷却を確認します。 - 無血清に予め温めておいた (37 ° C) で 6 ウェル プレートの井戸を埋める propidium ヨウ化「実験中」。
注: propidium ヨウ化実験中です: 75% 最小値必要な媒体イーグル、25% ハンクス平衡塩溶液、D-グルコースの 5 mg/mL、2 ミリ モル/L L-グルタミン, 1% 抗生物質抗真菌薬ソリューション 10 ミリ モル/L HEPES、滴定された pH 4.5 µmol/L propidium ヨウ化水酸化ナトリウムで 7.2。 - リングの切り込みの上媒体のレベルが到達しないことを確認します。リングを持つ 6 ウェル プレートを培養挿入が転送される前にすぐにメディアが 37 ° C であることを確認する 1 h のためのインキュベーターに転送します。
- リングを持つ 6 ウェル プレート、鉗子で実験中に 35 mm のシャーレから脊髄スライス培養インサートを転送します。
- 3 位挿入縁に恒久的なマーカー ペンでドットを作る。
注: 挿入実験中に 6 ウェル プレートから削除していると衝撃波暴露後プロトコルを通して各スライスを容易に追跡する元の位置に挿入を戻ってこの手順が容易になります。 - ラベルの一意の名前と日付の各 6 ウェル プレート、各プレートの各ウェルを名前付けの井戸の地図を作る (e.g、B、C、等。) と各ウェルでの各セグメント (e.g。、1、2、3、など。)、各スライスが一意の識別子 ( 。例えば.、A1、A2、A3、 etc.)。
- 6 ウェル プレートをイメージングする直前に 37 ° C でスライスを確実にする 1 h のためのインキュベーターに転送します。
注: 媒体のオーバーフローを回避または任意の気泡組織培養下に空気の膜は、スライスの生存を脅かす可能性を挿入します。 - 実験中に転送した後 1 時間は、イメージの各スライス損傷前に、スライス健康を評価するために適切な励起 (BP 535/50 nm) と発光 (LP 610 nm) フィルター装備蛍光顕微鏡 (2 × 対物、NA 0.06) を使用して個別にプロトコルは実行されます。
メモ: この段階で染色濃い赤のエリアを示すスライスは侵害された可能性を提示すると見なされ (これらは通常生成されたスライスの合計数の 10% 未満を表します) 以降の解析から除外する必要があります。順次、スライス、インキュベーター外時間を最小限に抑えるために可能な限り迅速に、イメージングを実行ことを確認 (通常 6 井戸だけで 30 分にしなければ画像)。 - すべての回で 6 ウェル プレートの蓋をしてください。いくつかの凝縮は、蓋の内側に蓄積されます。このような場合簡単に低設定にヘアドライヤーを使用します。
- 実験と別の日にすべての撮影条件が同一であることを確認します。
注: イメージングの目的組織蛍光を定量化することです、それゆえこの手順が結果の再現性を確保し、取得したデータの比較を許可することが重要。
3. 水没と組織文化の輸送を海馬切片スライスを挿入します。
- 画像の直後に層流フードの鉗子を用いた 6 ウェル プレートの 1 つのティッシュ文化挿入を取る。
- 慎重に滅菌ポリ袋 (3"× 5") に挿入は前たて暖かい (37 ° C) 実験中の 20 mL でいっぱい転送は 95% の酸素および 5% の炭酸ガスで泡立った。
メモ: は、酸素と二酸化炭素の濃縮実験媒体が Dreschel 瓶の内部 scintered ガラス バブラーを使用して 95% 酸素および 5% 二酸化炭素を少なくとも 40 分放置され、内部滅菌のポリエチレン袋に転送を確認します。細菌フィルターと接続されている無菌充填チューブ (127 mm) 20 mL の注射器を使用して層流ティッシュ文化フード。すぐに袋を密封し、組織文化は、転送を挿入する前に少なくとも 1 時間 37 ° C の定温器に転送します。 - それぞれ滅菌バッグは正しく付け (プレートとよく同定) を確認します。組織培養挿入するたびにこの手順を繰り返します。(袋の上部をねじることによって、プラスチック製のクランプを適用することで安全に行われます) 滅菌袋のシールに慎重に空気の泡を除外します。
- 培養インサート付き滅菌バッグと実験培地で 6 ウェル プレートを 37 ° C の定温器に返します。
- 1 時間後慎重に満ちている 37 ° C で脱イオン水中衝撃波の露出を通して生理学的温切片スライスを保つために温度調節箱の中のプラスチックの箱で組織培養インサート付き滅菌バッグをパックします。プロトコル。
4. 衝撃波管と海馬切片スライス衝撃波露出の準備
- 衝撃波管と衝撃波の露出の準備の間に保護の鋼鉄つま先のブーツ、実験室のコートと手袋を着用します。
- 滅菌バッグ ホルダー フレームをボルト ショック チューブの遠位部フランジ、(ブランクのロッドを使用して) 衝撃管出口と中央の穴が揃っていることを確認します。
- 2 つの圧力トランスデューサーをラジアル マウント: センサー 1、駆動セクションと衝撃波管 (図 1 a) の遠位端のフランジのセンサー 2 の中央部に。圧力トランスデューサーを現在ソースの電源をオシロ スコープに接続します。
- すべてのショック チューブ リリース バルブ、フロー コントロールが閉じていることを確認します。
- 外部圧縮空気ラインを開き、2.5 バーにソレノイド バルブを充電します。
- 圧縮空気シリンダーの安全弁を開き、ゆっくりと約 5 バーへの圧力を増加する圧力調整器を開きます。
注: このレギュレータのため設定圧力は、破裂圧力最高のダイヤフラムの上少しする必要があります。 - 10 × 10 cm2の正方形に切断 23 μ m 厚のポリエステル シートでダイヤフラムを準備します。オートクレーブ テープを使用し、横隔膜の上下に貼ってハンドルを準備します。
- 1 ダイヤフラム (ダブル砲尾 - 単一のダイヤフラムの構成の単一スロット) の位置または 2 つのダイヤフラム (ダブル砲尾 - の両方のスロット二重ダイヤフラム構成) (図 1 b) 骨盤位で。
- 4 M24 ボルトとナットを使用して、対角的に対称の方法でそれらを順次締結、ダイヤフラムは、ことを確認、それらをクランプしてセンターのダイヤフラム、しわ。
- クランプ ホルダー フレームの垂直位置で個別に各滅菌バッグ、衝撃管出口に直面している組織文化の表面を切片海馬スライスを挿入することを確認、内部、無菌培養挿入を中心バッグ (図 1)。滅菌バッグがしっかりと均等の固定を確実に安全にすべての周りクランプされていることを確認します。
- 無隔膜ショック ・ チューブを加圧する際耳擁護と安全眼鏡を着用します。衝撃波データ (50 メガ-サンプル/秒、レコード長さ 20 ms のアクイジション ・ レート、100 万点) を取得し、電磁弁を閉じる現在のソース電源ユニットとオシロ スコープに切り替えます。
- 一構成の衝撃波管のドライバー音量] セクションまたは両方ドライバーの音量] セクションおよび二重ダイヤフラムの衝撃波管の二重尾セクション衝撃管コントロール パネルの流量調節ノブを使用して、ゆっくりと加圧し構成。
注: 1 つのダイヤフラムの構成、破裂圧力だけになりますダイアフラム材質と厚さと横隔膜破裂自発的に達すると破裂圧力の材料。二重ダイヤフラム構成の破裂圧力はまた差動ドライバーで二重尾室のガス圧に依存し、制御された方法で破裂するダイヤフラム、ダブル逆子安全弁は一度手動で開かターゲットの圧力に達する。 - 横隔膜破裂 (騒音の生産)、すぐに流れのつまみを使用して圧縮空気の流れを閉じ、電磁弁を開きます。
注: ドライバーのセクションの容量は、セグメント、広範囲衝撃波ピーク過圧の得られる期間をブランクの挿入によって変更できます。衝撃波パラメーターの理想的な組み合わせは組織の損傷を引き起こすのに十分になりますが、組織培養の挿入または滅菌バッグ歪みや破断を引き起こすそう高くはないです。 - 組織培養インサート単一衝撃波管をそれぞれ滅菌バッグを公開し、新しい滅菌バッグをボックスから取られ、ホルダーのフレームにクランプする前に温度調節・ ボックスにすぐに戻ります。4.10-4.14 の手順実行されるよう円滑かつ可能な限り速やか (数分以内)、実験中の冷却を防ぐために 37 ° C 以下の低温傷害の開発を妨げる可能性があります。
- すべての組織培養挿入がさらされている一度衝撃波 (または偽プロトコル)、組織培養挿入に戻り元 6 ウェル プレート、(内流ティッシュ文化フード) それぞれ、インキュベーターに戻ります。
- さらに画像まで 5% 空気中の二酸化炭素とインキュベーターで 37 ° C で 6 ウェル プレートを保ちます。
- スライス衝撃波と共に、各実験のための偽のコントロールが含まれます。
注: 偽スライス同一に扱われます (実験中で滅菌袋に封印、同じ温度調節箱に衝撃管研究室に運ばれ、金属製のフレームの相当期間中断衝撃波にさらされるスライスする時間) ショックが、チューブは発生しません。
5. 海馬切片スライス損傷の定量化
- 24 時間、48 時間、72 時間で前述の手順 2.8、2.9 のスライスをイメージします。
- 72 h ポスト衝撃波でイメージング後、破棄組織次のローカル生物プロトコルを無駄にし、消毒やオートクレーブ金属リング。
Representative Results
このメソッドで使用される衝撃波管には、フリードランダー関数7、8をモデル化した現実オープン フィールド爆発をシミュレート圧力トランジェントの生成が可能です。440 m/s (マッハ 1.3) の速度で超音速衝撃波 (図 2 a) が得られました。報告された波形データは、センサー 2、衝撃波管駆動部の終わりに放射状に配置されているからです。
上記プロトコルを使用して (図 2 a) 単一衝撃波にさらされる切片海馬スライス培養開発定量化、だけで細胞を浸透水性蛍光色素による重大な傷害細胞膜24,25 (図 2 b, C) を侵害されました。
最適な条件下でも、その他一部は、OHSC に一貫性モデル21,22、ある propidium ヨウ化蛍光バック グラウンドのレベルが低いため、一部では、固有の組織操作 (から生じる軽微な損傷にメディアの変更など培養期間またはイメージングのためのインキュベーターから除去中)。TBI のプロトコルは、この爆発を含む培地滅菌バッグと衝撃波露出プロトコル間処理のかなりの程度の中でスライスの水没を含む相当な操作 (例えば.、滅菌袋をクランプ、ホルダー フレーム)。ただし、慎重に、すべての手順を行う場合この追加操作がない影響の一部は、OHSC の基になる健康に 6 ウェル プレートに常時保管スライスのコントロール グループ間の有意差は見られなかったので (すなわち、。挿入を水没または処理されなかった) とクランプ滅菌袋内衝撃波管 (図 2 b) に水中に沈められたスライスが含まれて偽のグループ。
55 kPa ピーク過圧 50 kPa で選ばれた 2 つの衝撃波を重要な生産 (p < 0.05、 p < 0.0001、それぞれ) と無傷のシャムと比較して再現性のある傷害スライス爆発の露出の後の時点ですべての組織培養の挿入または滅菌バッグに損傷を与えずにプロトコル (図 2 b)。ピーク過圧のわずかな違いに対するモデルの感度を決定するために 〜 10% によって異なる値を選択することにしました。これらの結果は、予想通り、55 kPa から生じる損傷は 50 kPa の衝撃波後も表示します。
データは、平均の平均 ± 標準誤差として表されます。意義は、ホルム Sidakホックを投稿テストを使用しての分散の 2 ウェイ反復測定分析を使用して評価されました。因子 1 グループ (コントロール、シャム、爆発)、要因 2 だった (-1 h、24 時間、48 時間、72 時間) 傷害の後に繰り返し要因の要因 1 のところ。多重比較のp値の調整が使用されました。P値が 0.05 未満は、グループ間に有意差を示すために撮影されました。統計的検定は、グラフや統計ソフトウェア パッケージを用いて実装されていました。
図 1: 滅菌バッグ ホルダー フレーム ショック チューブ デバイスの模式。(A). 衝撃波管は 3.8 m 長いステンレス鋼チューブ、ガスケットとフランジで接続された 3 つの 1.22 メートル長いセクション、内部の直径 59 mm. の(B)インセットは、ダブル逆子アセンブリを示しています。1 つまたは 2 つのマイラー振動板は、ゴム o リングによるシールとアセンブリにクランプすることができます。(C) 滅菌バッグ ホルダーのフレーム。フレームのボディは衝撃管出口揃う中心円形穴 (直径 59 mm) を 2 つの金属板から成っています。シリコーン ・ エラストマーの 2 つの薄い (4 mm) シートは、金属平板間取り付けられています。これらのシートの目的は、滅菌袋をクランプにも禁煙滑りやすい表面を提供することです。バッグと衝撃波管の出口との間の距離は 7 cmこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 2: 典型的な衝撃波と海馬切片で傷害結果スライス文化。(A) 23 μ m 厚ポリエステル フィルム、バーの破裂圧力、55 kPa ピーク過圧、肯定的な波の持続時間を 0.4 ms、10.1 kPa·ms インパルス 2.16 を用いて衝撃波の代表的な例です。波形データは、放射状にセクションを駆動型衝撃波管の遠位部のフランジに装着したセンサー 2 から得られました。衝撃波速度は 440 m/s (マッハ 1.3) だった。(B) 傷害の開発は衝撃波の強さに比例します。50 kPa と 55 kPa ピーク過圧衝撃波シャム群と比較して 72 時間プロトコルを通して開発された重大な傷害を引き起こした。55 kPa ピーク過圧波曝露に起因する傷害だった 50 kPa で 48 時間後より有意に高いと 72 h 偽スライスは同じブラスト スライスに扱われたが、衝撃波管が発生しませんでした。コントロールのスライスは、操作することがなくインキュベーターで 6 ウェル プレートで維持されました。バーは、平均値を表し、エラーバーは標準誤差 (n = 7、コントロール; n = 48、シャム; n = 30、爆風 50 kPa; n = 51、ブラスト 55 kPa; n = 6 の個別の実験からのスライスの数)。*p < 0.05、 *p < 0.0001 がシャムと比較して。#p < 0.05、 #p < ブラスト 55 kPa に比べ 0.01。(C) 代表 propidium ヨウ化蛍光画像 (私) シャムから切片スライス、(ii) ブラスト 50 kPa と (iii) ブラスト 55 kPa グループ負傷後 72 時間で。偽スライス蛍光、すなわちの低レベルを示しています。、傷害と露出したスライスが 55 kPa ピーク過圧公開スライスでより顕著、びまん性の損傷の高レベルを示す爆発 (スケールバー = 500 μ m)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
ブラスト TBI (プライマリ、セカンダリ、三次爆発損傷機構)、プライマリ爆発損傷は爆風トラウマにユニークなブラスト関連メカニズム1,2 の理解に関連する傷害のすべてのメカニズムの間で.ここで説明する新しいプロトコルのプライマリ爆発 TBI により、再現を作成簡易かつ迅速なプロトコルを使用して単一の衝撃波にマウス海馬スライス培養体外を公開するオープン エンドのショック チューブを使用して開発スループットの高いプライマリ爆発 TBI。
最初の in vitroプライマリ爆発 TBI モデルは細胞26,27に静水圧波を適用しました。ただし、圧力出力はモデル フリードランダー関数静水圧パルスの持続時間は空中爆発重圧の波13よりもはるかに長かった。フリードランダー関数の特性は、ショック チューブ1,8を使用して実験室で簡単に組み立てることも可能します。衝撃波管を変えることによってピーク過圧、正波継続時間、衝動的などの波パラメーターの正確な制御を可能にしながら従来の研究室では、実際生活露地爆発をシミュレートする衝撃波を作り出すことができる、ダイアフラム材質と厚みドライバー ボリューム8,28,29
モデル シンプルな体外培養細胞などは通常種類の細胞とシナプス接続30の不均一性を欠いています。最近では、'楕円' 異なる種類の細胞を組み込んだ脳細胞の in vitroでの爆発の効果は調査31をされています。これらの興味深い準備の更なる調査が報われます。しかし、わかりにくい細胞組織との接続がそのまま脳にミラー化。一部は、OHSC が定評の in vitroの実験モデル23,32, 文化しやすく、自分の三次元組織細胞構築、細胞分化とシナプス結合がよく維持され、非常にその体内33,34,35,36.のようOHSCs は、細胞培養との間、体内モデル23,32複雑さの中間レベルを表します。OHSCs は体内のモデルに見られるin vitro病理学的変性カスケードを再現し、潜在的な神経保護薬のスクリーニングとそのメカニズムを理解する上で非常に有用されているが示されています。アクション17,21,22,37,38。最後に、解剖学的領域は、海馬を調査した、この地域は頻繁に TBI 患者39,40,41で破損して、トランスレーショ TBI で関連性の高い。一部は、OHSC モデル ブラスト TBI28,42,43,44に使用されている、しかし、我々 のモデルは比較的簡単、または垂直か水平に既存衝撃波管に適応することができます。複雑な適応なしの構成。
時間34以上の生物学的プロセスの調査を容易にする多くの日のための文化の一部は、OHSC で保管できます。このモデルで衝撃波に起因する組織の損傷を毎日測定した、細胞の損傷の確立されたマーカーによる爆発の露出に続く 3 日間。Propidium ヨウ化は危険にさらされた細胞膜、それが核酸に結合し、独特の明るい赤の蛍光24,25,45の展示と細胞に浸透し無毒水性染料です。Propidium ヨウ化で測定した蛍光は、ニッスル染色46,47を使用して負傷した細胞数と良好な相関を持っている示されています。
その他脳損傷パラダイム21,22で以前出版された仕事と同様の解析を実行するとき、全体のスライスの蛍光を測定したこのモデルで生成された傷害がびまん性 (図 2)、、他の in vitroで行われている特定の領域を使用する代わりにブラスト TBI モデル28,43,44,48。この資料に記載されているモデルで使用されているグローバルなアプローチが導入されたとき、関心領域を定義されたアウトラインとブラスト関連の傷害のより包括的な画像を提供する潜在的な変動もなくなります。衝撃波ピーク加圧、50 kPa と 55 kPa の両方重要な生産 (p < 0.05、 p < 0.0001、それぞれ) 損傷偽スライス (図 2B) と比較した場合。予想通り、最も高いピーク過圧と衝撃波 55 kPa は 50 kPa 波よりより多くの損傷を作り出した。分離脳の in vitroモデルで組織に直接公開、衝撃波や人間の全体の有機体に正確にサイズ変更する方法は簡単ではありません。それにもかかわらず、我々 が使用される衝撃波が、野外、通常 50-1,000 kPa8,49で観察されたピーク加圧の範囲内。
滅菌に密封された培養挿入衝撃波露出プロトコル全体の汚染から解放されたことを確保しながら生理学的温度と酸素と二酸化炭素のレベルにさらされて、一部は、OHSC を維持するために37 ° C に加温し、たて同様に過去に発表された28,43,44 95% 酸素、5% 炭酸ガスのバブルの実験中に浸漬、無菌ポリエチレン袋、48。これらのモデルは、複雑なデバイスは、このプロトコルでは、衝撃波の露光中に滅菌バッグを保持するために使用されていた場所に反して簡易迅速法は衝撃管出口 (図 1 a、C の前に一部は、OHSC 培養挿入を中断する使用されました。).本稿で説明するモデルでは、低体温症のリスクを最小限に抑えながら高速処理と高スループットをことができます。これらの側面は、いくつかの治療上の介在は TBI 後潜在的なアプリケーションの非常に限られた時間ウィンドウを必要があることを考える神経保護研究のため特に関連しています。露出にあるこの小説の衝撃波のプロトコルにより 6 に 9 組織培養時間 (約 1 時間) の短い間隔で衝撃波にさらされる (通常 36 に 54 海馬切片組織スライス) を挿入します。
OHSCs は、全体の良い無菌技術を必要とします。培養中とブラストの滅菌袋に転送するとき無菌層流フードを使用することが重要です。場所 6 ウェルプレートの蓋無菌条件下でのスライス画像を遂行するために顕微鏡の焦点面に細胞文化挿入を高めるために特注の金属リングを使用します。プロトコルの重要な部分は、すべての実験で無傷の偽スライスが含まれてです。偽のスライスは、衝撃波管は発生しません; 例外とブラスト スライスを同一に扱われますもう一つの重要なステップは、すべてのスライスが 1 h をイメージ化けがや偽治療、確実に同じ (図 2 b) 使用されるスライスの人口の健康にする前に、です。
スライスで時間をかけての細胞損傷の定量化、に加えて、従来免疫組織化学50の実験の終わりに組織を固定できます。開発し、マウス海馬スライスを用いた評価.ただし、本手法は他の組織文化、脊髄、網膜、肺上皮性のティッシュなどで栽培することができますを使用する簡単に合わせることができます。本稿およびモデルと私たちの以前の仕事は、のみ 1 つの爆発への露出の効果を調べた。ただし、モデルは、脳やその他の組織に及ぼす繰り返し低レベルの爆発を調査するためよく適しているでしょう。多くの週のための文化 OHSCs を保つことができるあるいは 3カ月間で、慢性的な影響を検討します。
In vitroモデル、体内モデルよりも簡単高スループット、安価と実験は、短い時間スケール17で通常完了ことができます。ただし、体外モデルを使用して得られた結果体外培養組織の人工環境で保たれます、何から異なる傷害に応答可能性があります動物モデルで検証する必要があります彼らは生体内で17。それにもかかわらず、生体外モデルと脳損傷カスケードの私達の理解を高めることで非常に貴重なされているより複雑な生体内での使用前に神経保護薬のスクリーニング モデル17,22,51,52の in vitroモデルに動物と体内のモデルでは、血管系に及ぼす影響などに存在する TBI の機能キーがないことに注意することが重要だ、このモデルによって提供される多くの利点にもかかわらず増加頭蓋内。圧力、全身の免疫反応の in vitroモデル全体の動物では、結果を検証する必要性を強調機能の行動障害。それにもかかわらず、このペーパーで説明されているモデルなどの in vitroモデルは、非常に便利な並進関連する科学的なツールです。
結論としては、この作業はマウス海馬切片培養組織がしっかりと管理して再現性のある実際の生活関連衝撃波研究所衝撃波管を用いたにさらされているシンプルで簡単な手法を説明します。による、細胞の損傷の確立されたマーカーの定量化を行った結果の世界的な傷害、非常に再現性のある適用衝撃波のピーク過圧に比例しています。
Disclosures
著者は競合する金融興味を持ってないです。
Acknowledgments
サポートされている: イギリスの防衛医学、バーミンガム、イギリス、爆発損傷研究、インペリアル カレッジ ロンドン、ロイヤル ブリティッシュ軍団センター ロイヤル センター。医療研究評議会、ロンドン、イギリス (MC_PC_13064;MR/N027736/1)。ガスの安全性の信頼、ロンドン、イギリス。リタ カンポス ピレスだったカルースト パラから博士課程賞を受賞 Ciência e、技術、リスボン、ポルトガル。ケイティ ・ ハリスは、ウェストミン スター医療学校研究の信頼、ロンドン、イギリスから思い立ったの受信者だった。
このモデルは、インペリアル ・ カレッジでの爆発損傷研究 (RBLCBIS) のロイヤル英国リージョン センターの支援を受けて開発されました。我々 は、ロイヤル英国在郷軍人会の助成を受けたいと思います。著者または RBLCBIS、研究者のコラボレーションやさらなる詳細に興味がお問い合わせください。
ありがとう Dr Amarjit Samra、調査担当ディレクター、ロイヤル センター防衛医学、バーミンガム、イギリス、この作業を支援するスコット ・ アームスト ロング、外科・がん、インペリアル カレッジ ロンドン、予備実験について、ウィリアム誇りに思う, 部の物理ロンドン大学インペリアル カレッジ、ラケル Yustos 衝撃波管についてのアドバイスを、部門の技術者を研究・ ルス ゴック グエン、部の生物工学ロンドン大学インペリアル カレッジ、ハリ アローラ Theofano Eftaxiopolou生命科学、ロンドン大学インペリアル カレッジ、テクニカル サポート、ポール ・ ブラウン MBE ワーク ショップ マネージャーのスティーブ · ネルソン、工場の技術者、金属を作るためのインペリアル カレッジ ロンドン物理学、リング、物理学教室のニール ・ パウエルインペリアル ・ カレッジ ・ ロンドン、アートワークの。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geys balanced salt solution | Sigma UK | G9779 | |
| D-glucose | Sigma UK | G8270 | |
| Antibiotic/antimycotic | Sigma UK | A5955 | |
| Minimum essential medium Eagle | Sigma UK | M4655 | |
| Hanks balanced salt solution | Sigma UK | H9269 | |
| Horse serum | Sigma UK | H1138 | |
| L-glutamine | Sigma UK | G7513 | |
| HEPES | VWR Prolabo, Belgium | 441476L | |
| Sodium hydroxide | Sigma UK | S-0945 | |
| Tissue culture inserts | Millicell CM 30 mm low height Millipore | PICM ORG 50 | |
| 6-well plates | NUNC, Denmark | 140675 | |
| Propidium iodide | Sigma UK | P4864 | |
| Sterile polyethylene bags - Twirl'em sterile sample bags | Fisherbrand | 01-002-30 | |
| Portex Avon Kwill Filling Tube 5" (127 mm) | Smiths Medical Supplies | E910 | |
| Epifluorescence microscope | NIKON Eclipse 80i, UK | ||
| Microscope objective | Nikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm | ||
| Microscope filter | Nikon G-2B (longpass emission) | ||
| Mylar electrical insulating film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm | RS Components UK | 785-0782 | |
| Pressure transducer | Dytran Instruments Inc. | 2300V1 | |
| Tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, United Kingdom. | Mcllwain tissue chopper | |
| Silicone elastomer | Dow Corning, USA | Sylgard 184 | |
| Graphing & statistics software | GraphPad Software, USA | Prism 7.0 |
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