Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

En roman In Vitro modell av Blast traumatisk hjärnskada

doi: 10.3791/58400 Published: December 21, 2018

Summary

Detta dokument beskriver en ny modell av primära blast traumatisk hjärnskada. En tryckluft driven signalledares används för att exponera in vitro- mus Hippocampus slice kulturer till en enda chockvåg. Detta är en enkel och snabb protokoll som genererar en reproducerbar hjärnskada vävnad med ett högt dataflöde.

Abstract

Traumatisk hjärnskada är en ledande orsak till död och funktionshinder i militära och civila befolkningar. Blast traumatisk hjärnan skada resultat från detonation av spränganordningar, men de mekanismer som ligger bakom de hjärnskador som följd av blast övertryck exponering inte är helt klarlagda och tros vara unikt för denna typ av hjärnskada. Prekliniska modeller är avgörande verktyg som bidrar till att bättre förstå blast-inducerad hjärnskada. En TBI romanen in vitro- blast modell har utvecklats med en förutsättningslös signalledares för att simulera verkliga öppna-fältet blast vågor modellerades av Friedlander vågformen. C57BL/6N mus organotypic Hippocampus slice kulturer utsattes för enda chockvågor och utvecklingen av skada präglades upp till 72 h använder propidium jodid, en väletablerad fluorescerande markör för cellskador som bara tränger celler med äventyras cellulära membran. Propidium jodid fluorescens var betydligt högre i de skivor som utsätts för en tryckvågor jämfört med sham skivor under hela protokollet. Hjärnans vävnadsskada är mycket reproducerbara och proportion till peak övertrycket av de tryckvågor som tillämpas.

Introduction

Blast traumatisk hjärnskada (TBI) är en komplex typ av hjärnskada som resulterar från detonation av spränganordningar1,2. Blast TBI har uppstått som ett stort hälsoproblem i de senaste 15 åren med de senaste militära konflikterna i Irak och Afghanistan2,3. Övergripande, det uppskattas att mellan 4,4% och 22,8% av soldater som återvänder från Irak och Afghanistan har lidit mild TBI, en stor del av dessa är blast-relaterade, med en högre frekvens av blast TBI i de amerikanska styrkorna jämfört med UK krafter4 ,5.

Användning av spränganordningar har varit ansvarig för de flesta av blast-associerade trauma, inklusive blast TBI, fick utstå den militära styrkor6. Detonation av en explosiv laddning resulterar i en mycket snabb — men övergående — ökning av tryck, som förekommer i millisekunder. Den resulterande övertryck våg från en verkliga livet gratis-fältet explosion är modellerad av funktionen Friedlander, med en plötslig ökning till peak övertrycket följt av en exponentiell förruttnelse7,8. Utbudet av extrema krafter och deras snabba tid kursen sett i en blast händelse upplevs vanligtvis inte i icke-blast trauman1,9. Topp övertrycket, vilket är det maximala trycket i vågformen, och varaktigheten av den positiva våg tros vara viktig bidragsgivare till blast hjärnskada och dessa beror på sprängladdning och avståndet från detonation10, 11.

Traumat att resultat från en explosiv blast klassificeras som fyra diskreta komponenter betecknas som primär, sekundär, tertiär och Kvartär blast skada10,12,13,14. Var och en av dessa komponenter är associerade med specifika mekanismer för skada. Primära blast skada resultat från den direkta åtgärden av övertryck vågen på organ och vävnader2,13. Sekundära blast skada resultat från inverkan av projektil fragment, orsakar genomträngande och icke-penetrerande sår2,15. Tertiär blast skadan uppstår när offrets kropp är förskjuten mot marken eller omgivande föremål och är associerad med acceleration/retardation krafter1,10,13. Kvartära blast skada beskriver en heterogen grupp av skador direkt relaterade till explosion inte omfattas av de första tre skada mekanismer beskrivna12,13. Det inkluderar (men begränsas inte till) termisk skada, rök inandning, strålning, elektromagnetiska vågor och psykologiska biverkningar13,15. De flesta blast-associerade TBI resultat direkt från de första tre mekanismerna för skada, medan de Kvartära mekanismerna för blast skada associeras vanligtvis med systemisk skada13. Effekterna av acceleration/retardation styrkor (t.ex., whiplash), trubbig och genomträngande traumatisk hjärnskada har studerats i förhållande till andra typer av TBI (t.ex.motorfordon kraschar, falls, ballistiska skada). Men den primära tryckvågor övertryck är unik för blast skada och dess effekter på hjärnvävnaden är mycket mindre förstådda16. De primära blast skada mekanismer, är associerad med ett övertryck vågen, är först av de mekaniska styrkorna att interagera med hjärnan.

Ett flertal prekliniska TBI modeller har utvecklats under de senaste årtiondena som har varit ovärderligt att förstå blast TBI mekanismer av skada och patofysiologi och utreda potentiella nya behandlingar, som annars skulle vara omöjligt att göra uteslutande i den kliniska inställningen17,18,19. Även om ingen enda preklinisk modell kan återge komplexiteten i kliniska blast hjärna trauma, vanligtvis replikera olika prekliniska TBI modeller olika aspekter av mänskliga TBI. Skadliga verkan av de krafter som är associerad med en blast explosion kan studeras isolerat eller i kombination i både in vitro- och in-vivo blast TBI modeller. In vitro -modeller har fördelen att en sträng kontroll av experimentella miljön (vävnad fysiologiska tillstånd och skada biomekanik), vilket minskar biologisk variabilitet och förbättrar reproducerbarhet, tillåter studier av specifika molekylära kaskader utan confounders som är närvarande i djur modeller20. Vårt mål var att utveckla ett in vitro- modell för att undersöka effekterna av primära blast på hjärnvävnad. Vi syftar till att utveckla en modell med en supersonic shockwave med Friedlander vågform representant för en gratis-fältet explosion som produceras av en improviserad sprängladdning (IED).

Protocol

De experiment som beskrivs i detta manuskript var gjort i enlighet med den Förenade kungariket djur (vetenskapliga förfaranden) Act från 1986 och har godkänts av the Animal Welfare & etisk granskning kroppen av Imperial College London. Djurvård var i enlighet med de institutionella riktlinjerna för Imperial College London.

1. Hippocampus Organotypic Slice förberedelse och kultur

Obs: Detta protokoll tillåter produktion av organotypic Hippocampus skivor enligt gränssnittsmetoden beskrivs av Stoppini och kollegor med mindre modifieringar21,22,23. Helst bör inte fler än tre djur vara euthanized och dissekeras i en session för varje steg sker snabbt och inte äventyra kvaliteten på skivor. Använd aseptisk teknik under hela.

  1. Säkerställa följande steg vidtas innan protokollet dissektion.
    1. Förbereda och filter sterilisera alla lösningar i förväg med ett 0,22 µm filter.
    2. Hålla lösningarna vid 4 ° C under lagringen och hela hjärnan dissektion och Hippocampus slice förberedelse genom att hålla de förvaringskärl och petriskålar på en metall kylflänsen sitter på våt is vid alla tidpunkter.
    3. Autoklav alla metall instrument, ringar och papper vävnader.
    4. Att alla instrument och material som ska användas för varje steg i protokollet är klar att använda, anges i förväg och besprutas med 70% etanol. Se till att de får svalna och torka.
  2. Avliva en 5 – 7 dagars-gamla C57BL/6N mus pup av cervikal dislokation och kort torka hela hudytan med steril papper indränkt i 70% etanol. Klappa huden torr och halshugga den pup med Mayo sax.
  3. Skär hårbotten huden med iris sax längs mittlinjen av huvudet börjar i occipital regionen och slutar nära nosen och återkalla det sido.
  4. Vännäs sax för in i foramen magnum och göra två laterala småsår på benet längs den tvärgående bihålor, sedan klippa skallen längs mittlinjen upp till luktbulben och göra två små nedskärningar vinkelrätt till mittlinjen i denna region.
  5. Med fina peka böjd pincett, återkalla viftar med av ben sidled från mittlinjen, noggrant ta bort hjärnan med en liten spatel och överföra den till en 90 mm silikon elastomer-belagd petriskål som innehåller ”dissektion medium”.
    Obs: Dissektion medium är Geys balanserad saltlösning (5 mg/mL D-glukos, 1% antibiotika-antimycotic lösning, med 10 000 enheter/mL penicillin, 10 mg/mL streptomycin och 25 µg/mL amfotericin B).
  6. Ta bort lillhjärnan och separata hjärnhalvorna längs mittlinjen med ett rakblad. Använd en spatel för att överföra hjärnhalvorna till en ny 90 mm silikon elastomer-belagd petriskål fylld med färsk iskall dissektion medium. Om mer än ett djur skall användas i en session, upprepa steg 1,2 – 1,6.
  7. Under ett stereomikroskop, skär luktbulben och spetsen på främre hjärnbarken med ett rakblad och separera hjärnbarken från resten av cerebral vävnad med fin spets pincett. Detta steg lämnar hippocampus exponeras på den mediala ytan av kortikal vävnad. Från detta steg framåt, Använd en vävnadskultur LAF (ultraviolett steriliseras och rengöras med 70% etanol lösning).
  8. Gälla en platt plast hugga disk iskall dissektion medium och, med hjälp av en spatel, placera hjärnvävnad på disken så att den mediala ytan av cortex är vänd uppåt och hippocampus axel är vinkelrät mot axeln av hugga bladet.
  9. Ta bort så mycket som möjligt av dissektion medium från hugga disken med hjälp av en fin spets Pasteur-pipett.
  10. Skär hjärnan i 400 µm skivor med en vävnad chopper med 50% hugga hastighet och kraft.
    Obs: Det är mycket viktigt att detta steg görs så snabbt som möjligt som hjärnvävnaden inte är nedsänkt i dissektion medium.
  11. Ersätta dissektion mediet i silikon elastomer-belagd petriskål med färska iskall medium.
  12. När vävnad helikoptern är klar, försiktigt dränka hjärnvävnaden i färska dissektion medium och överföra skära vävnaden tillbaka till 90 mm silikon elastomer-belagd petriskål med en rak klinga skalpell.
  13. Under ett stereomikroskop, noggrant separat kortikala skivor med fin spets pincett. För varje segment, inspektera hippocampus för morfologi och potentiella vävnadsskada som härrör från dissektion eller skivning.
  14. Separat i hippocampi från entorhinal cortex och från den fimbria med fin spets pincett och liten Vännäs sax. Normalt genereras cirka 6 till 8 Hippocampus segment per halvklotet.
  15. Överför upp till 6 Hippocampus skivor till en vävnadskultur infoga använder en cut Pasteur-pipett och placera den inuti en 35 mm Petri maträtt. Se till att skivor sprids några millimeter isär (detta kommer att säkerställa att varje skiva kan avbildas individuellt).
  16. Tillsätt omedelbart iskall ”odlingsmedium” längst ned på varje petriskål, under vävnadsodling skäret, strax under toppen av vävnadsodling infoga rim.
    Obs: Odlingsmedium innehåller 50% minst viktigt medium Eagle, 25% Hanks balanserad saltlösning, 25% häst serum, 5 mg/mL D-glukos, 2 mmol/L L-glutamin, 1% antibiotika-antimycotic lösning och 10 mmol/L HEPES, titreras till pH 7,2 med natriumhydroxid.
  17. Ändra odlingsmedium dagen efter dissektion och sedan varje 2 till 3 dagar därefter (Använd odlingsmedium vid 37 ° C). Säkerställa att odlingsmedium läggs i tillräcklig mängd, men inte så mycket att det svämmar över vävnadsodling infoga membranet, som skulle kunna äventyra livskraften hos vävnad skivor.
  18. Hålla vävnad skivor i en fuktad inkubator vid 37 ° C med 5% koldioxid i luften för 12 till 14 dagar före används i experiment.

2. beredning av hippocampus Organotypic skivor för experimentell Blast TBI protokollet

Obs: Alla stegen i detta avsnitt, förutom imaging, äga rum i en vävnadskultur LAF.

  1. Skräddarsydda rostfria ringar in en 6 väl platta (en per brunn).
    ANTECKNINGAR: Ringarna har en fälg med ett snäpp (som ska sitta i position klockan 12) och fit tätt inuti brunnar, medan vävnadsodling infogar passar enkelt i detta rim. Se till att ringarna är tvättas med en bakteriedödande desinfektionsmedel, noggrant sköljas med renat vatten, lättbetong och autoklaverad och kylas ner i förväg.
  2. Fyller väl av 6-väl plattan med pre värmde (37 ° C) serumfritt ”experimental medium” med propidium jodid.
    Obs: Experimental medium med propidium jodid är: 75% minst viktigt medium Eagle, 25% Hanks balanserad saltlösning, 5 mg/mL D-glukos, 2 mmol/L L-glutamin, 1% antibiotika-antimycotic lösning, 10 mmol/L HEPES och 4,5 µmol/L propidium jodid, titrerad pH till 7,2 med natriumhydroxid.
  3. Se till att nivån av medlet inte når ovanför skåran på ringen. Överföra 6-väl plattan med ringen tillbaka till inkubatorn för 1 h för att mediet är vid 37 ° C omedelbart innan vävnadsodling skären överförs.
  4. Överföra vävnadsodling skären med organotypic skivor från de 35 mm Petriskålarna i 6-väl plattan med ringar och det experimentella mediet med pincett.
  5. Gör en prick på Infoga rim i de 3 oclock ' positionen med en permanent tuschpenna.
    Obs: Skär kommer att tas bort från 6-väl plattan under experimentet och detta steg underlättar återvänder in till sin ursprungliga position efter chockvåg exponeringen och för att enkelt hålla koll på varje skiva i hela protokollet.
  6. Märk varje 6-well platta med ett unikt namn & datum och göra en karta över brunnarna av varje platta, namnge varje brunn (t.ex., A, B, C, etc.) och varje sektor i varje brunn (t.ex., 1, 2, 3, etc.), så att varje skiva har en unik identifierare ( e.g., A1, A2, A3, osv.).
  7. Överföra 6-väl plattan till inkubatorn för 1 h säkerställa skivor är vid 37 ° C omedelbart före imaging.
    Obs: Undvik spill av medium eller eventuella luftbubblor under vävnadsodling infoga membran, som skulle kunna äventyra livskraften i skivor.
  8. 1 h efter överföring till experimentella medium, bild varje skiva individuellt med fluorescens Mikroskop (2 X mål, NA 0,06) försedd med ett lämpligt excitation (BP 535/50 nm) och utsläpp (LP 610 nm) filter för att bedöma slice hälsa innan skadan protokoll utförs.
    ANTECKNINGAR: Skivor som uppvisar områden av tät röd färgning i detta skede bör anses uppvisa nedsatt livskraft och bör undantas från ytterligare analys (dessa representerar vanligtvis mindre än 10% av det totala antalet segment genereras). Säkerställa att imaging utförs på ett sekventiellt sätt och så snabbt som möjligt för att minimera tiden att skivor är utanför inkubatorn (vanligtvis 6 brunnar bör ta knappt 30 min till bild).
  9. Hålla locket på 6-väl plattan hela tiden. Vissa kondens kan byggas upp på insidan av locket. Om detta händer, kort använda hårtork på inställningen låg.
  10. Säkerställa att alla tänkbar villkor är identiska på olika dagar och mellan experiment.
    Obs: Imaging syftar till att kvantifiera den vävnad fluorescensen, därför detta steg är viktigt att säkerställa reproducerbarheten för resultaten och möjliggöra jämförelsen av uppgifterna.

3. nedsänkning och Transport av vävnad kulturen skär med Hippocampus Organotypic skivor

  1. Omedelbart efter imaging, i en LAF, ta en vävnadskultur infoga ur 6-väl plattan med hjälp av tången.
  2. Noggrant bubblade överföring skäret till en steril polyetenpåse (3 ”x 5”) förfylld med 20 mL varm (37 ° C) experimentella medium nymalen med 95% syre och 5% koldioxid.
    Obs: Se till att syre och koldioxid berikad experimentella mediet var bubblade för minst 40 min med 95% syre och 5% koldioxid med hjälp av ett scintered-glas bubbelflaskan inuti en Dreschler flaska och övergår i de sterila polyeten påsarna inuti en vävnadsodling LAF med en 20 mL spruta med en bakteriefiltret och en steril fyllning tub (127 mm) fäst. Seal väskor omedelbart och överföra dem till en 37 ° C inkubator för minst 1 h innan vävnadsodling infoga överföring.
  3. Se till att varje steril påse är korrekt märkta (med plattan och väl identifiering). Upprepa detta steg för varje vävnadsodling infoga. Utesluta luftbubblor noga på de sterila tätningsförband (gjort ordentligt genom att vrida toppen av påsar och genom att tillämpa en plast clamp).
  4. Returnera de sterila påsarna med vävnadsodling skären och 6-väl plattorna med experimentella medium till 37 ° C inkubatorn.
  5. Efter 1 h, noggrant packa de sterila påsarna med vävnadsodling skären i plastlådor inuti en thermo-reglerade låda fylld med avjoniserat vatten vid 37 ° C för att hålla organotypic skivor på fysiologiska temperatur under hela chockvåg exponeringen protokoll.

4. beredning av signalledares och Hippocampus Organotypic Slice chockvåg exponering

  1. Bär skyddande stål-tå stövlar, laboratorierock och handskar under utarbetandet av chocken röret och stötvåg exponering.
  2. Bult ramen steril påse innehavaren till shock tube distala flänsen, säkerställa att centrala hålet är i linje med shock tube utlopp (med en blanking rod).
  3. Montera två tryckgivare radiellt: sensor 1, i den mellersta delen av den drivna delen och sensor 2 i distala flänsen av chocken röret (figur 1A). Anslut tryckgivare till ett oscilloskop genom en aktuell källa kraftenhet.
  4. Se till att alla shock tube release ventiler och flöde kontroller är stängda.
  5. Öppna den externa tryckluftsledning och debitera magnetventilen till 2,5 bar.
  6. Öppna säkerhetsventilen tryckluft cylinder och öppna långsamt Tryckregulator för att öka trycket till ca 5 bar.
    Obs: Trycket för denna regulator bör vara något ovanför högsta membranet spricker trycket.
  7. Förbereda membranen av skärande 23 µm tjock polyester lakan i 10 x 10 cm2 rutor. Förbereda handtagen med autoklav tejp och sticka dem till toppen och botten av varje membran.
  8. Placera en membran (fack av den dubbla sätesbjudning - inre membran konfiguration) eller två membraner (båda spåren av den dubbla sätesbjudning - dubbelmembrandonets configuration) i sätesbjudning (figur 1B).
  9. Centrera membranen, och klämma dem med fyra M24 bultar och muttrar, fästa dem sekventiellt i ett diagonalt symmetriska sätt och säkerställa att membranen är skrynkelfri.
  10. Klämma varje steril påse individuellt i vertikalt läge på innehavaren ram, se till att ytan av vävnadsodling skären med organotypic Hippocampus skivor står inför shock tube utlopp och vävnadsodling Skäret är centrerad inuti den sterila väska (figur 1 c). Kontrollera att sterila påsen ordentligt spänns runt för att säkerställa fast och jämn immobilisering.
  11. Bära ear försvarare och säkerhet glasögon när pressa chocken röret. Slå på den nuvarande källan Nätdel med oscilloskop att förvärva chockvåg data (förvärv hastighet av 50 mega-prover/s, rekord längd 20 ms, 1 miljon poäng) och Stäng magnetventil.
  12. Använder flödesreglagevredet på shock tube Kontrollpanelen, långsamt trycksätta avsnittet drivrutinen volym av chocken röret för inre membran konfiguration eller både avsnittet drivrutinen volym och avsnittet dubbel sätesbjudning av chocken röret för membran konfiguration.
    Obs: För inre membran konfiguration, bristningstryck beror endast på det membran materialet och tjocklek och membranet kommer spontant brista när materialet spricker trycket nås. Dubbelmembrandonets konfiguration, sprängning trycket kommer också att bero på gas tryckskillnaden i både föraren och dubbel sätesbjudning kamrarna och, för membranen att brista på ett kontrollerat sätt, dubbel sätesbjudning säkerhetsventilen öppnas manuellt en gång målet trycket nås.
  13. Så snart membranet spricker (producera ett högt ljud), snabbt Stäng tryckluft flödet med hjälp av reglaget flöde och öppna magnetventilen.
    Obs: Den totala volymen av avsnittet drivrutinen kan ändras genom införandet av blanking segment, så att ett bredare spektrum av stötvåg peak övertryck och varaktigheter ska erhållas. En idealisk kombination av stötvåg parametrar bör vara tillräckligt för att orsaka vävnadsskada men inte så hög att det orsakar vävnadsodling infoga eller steril påse snedvridning eller bristning.
  14. Exponera varje steril påse med en vävnadskultur infoga till en enda chockvåg tube och det omedelbart återvända till rutan thermo-reglerade innan en ny steril påse tas från rutan och klämmas på innehavaren ram. Se till att stegen 4.10 – 4.14 utförs som smidigt och snabbt som möjligt (inom några minuter) för att förhindra experimentella medium kyla ner, eftersom temperaturer under 37 ° C kan störa skada utveckling.
  15. När alla vävnadsodling skär utsatts en stötvåg (eller sham protokoll), återvänder vävnadsodling skären till den ursprungliga 6-väl-plattan och till deras respektive väl (inuti en vävnadskultur LAF) och återgå till inkubatorn.
  16. Hålla 6-väl plattan i inkubatorn med 5% koldioxid i luften vid 37 ° C tills vidare imaging.
  17. Inkludera sham kontroller för varje experiment, tillsammans med slice chockvåg exponeringen.
    Obs: Sham skivor behandlas identiskt till de skivor som utsätts för en stötvåg (förseglade i de sterila påsarna med experimentella medium, transporteras till shock tube laboratoriet i rutan samma thermo-reglerade och upphängda på metallramen för motsvarande tid) men chocken röret avfyras inte.

5. Hippocampus Organotypic Slice skada kvantifiering

  1. Vid 24, 48 och 72 h, image skivor som beskrivs i steg 2.8 och 2.9.
  2. Efter imaging på 72 h post chockvåg exponering, kassera vävnad följande lokala biologiska avfall protokoll och desinficera och autoklav metall ringar.

Representative Results

Chocken röret används i denna metod möjliggör generering av övertryck transienter som simulerar verkliga livet öppna fältet explosioner modellerades av den Friedlander funktion7,8. Supersonic chockvågor med en hastighet av 440 m/s (Mach 1,3) erhölls (figur 2A). Vågformsdata rapporterade är från sensor 2, placerade radiellt i slutet av avsnittet driven av chocken röret.

Organotypic Hippocampus slice kulturer utsätts för en enda stötvåg (figur 2A) med hjälp av protokollet som beskrivs ovan, och utveckla betydande skada kvantifieras med hjälp av propidium jodid, ett starkt polar fluorescerande färgämne som endast penetrerar cellerna med äventyras cellulära membran24,25 (figur 2B, C).

Även under optimala förhållanden, och konsekvent till andra OHSC publicerade modeller21,22, det var en låg nivå av bakgrunden propidium jodid fluorescens berodde delvis mindre skador till följd av inneboende vävnad manipulationer ( till exempel media ändringar under den kultur eller avlägsnande från inkubatorn för imaging). Detta blast TBI-protokollet innebär betydande manipulation som innehåller nedsänkning i skivor i medium släpper sterila påsar och en betydande grad av hantering under protokollet chockvåg exponering (t.ex., fastspänning sterila påsar till den innehavaren ram). Dock om alla steg utförs omsorgsfullt, denna ytterligare manipulation har inte påverkar underliggande hälsa av OHSC som inga signifikanta skillnader sågs mellan en kontrollgrupp av skivor förvaras i 6-väl plattorna hela tiden (dvs., skären var inte nedsänkt eller hanteras) och gruppen sham, som ingår slices som var nersänkt i sterila påsar kläms till chock röret (figur 2B).

De två chockvågor valt, på 50 kPa och 55 kPa peak övertryck, producerat signifikant (p < 0,05 och p < 0,0001, respektive) och reproducerbara skada jämfört med oskadd simulerad skivor vid alla tidpunkter efter blast exponering protokoll (figur 2B) utan att orsaka skada på vävnadsodling skären eller sterila påsar. För att fastställa känsligheten för modellen till små skillnader i topp-övertryck, beslutade vi att välja värden som var annorlunda med ~ 10%. Dessa resultat visar också att, som förväntat, den skada som följd av 55 kPa är högre än efter en 50 kPa chockvåg.

Data är uttryckta som medelvärde ± standardavvikelsen för medelvärdet. Betydelse bedömdes med hjälp av en 2-vägs upprepade mätningar variansanalys med Holm-Sidak post hoc test. Faktor 1 var gruppen (kontroll, sham, blast) och faktorn 2 var tiden efter skadan (-1, 24 h, 48 och 72 h), där faktorn 1 var den upprepa faktorn. Justering av p -värde för multipla jämförelser användes. P -värden för mindre än 0,05 togs att indikera en signifikant skillnad mellan grupperna. Statistiska tester genomfördes med en grafritande och statistik programpaket.

Figure 1
Figur 1: Schematisk av shock tube enheten med steril påse innehavaren ram. (A). chocken röret är en 3,8 m långa rostfria rör, tillverkade av tre 1,22 m långa sektioner, packningar och flänsar, med en inre diameter på 59 mm. (B) infälld visar dubbel sätesbjudning församlingen. En eller två Mylar membraner kan spännas i församlingen med sigill som tillhandahålls av gummi o-ringar. (C) steril påse innehavaren ram. Kroppen av ramen består av två metallplattor med ett Centrerat cirkulärt hål (59 mm diameter) som justeras med shock tube utlopp. Två tunn (4 mm) ark av silikonelastomer monteras mellan två metallplattor. Syftet med dessa ark är att ge en jämn och halksäker yta för att klämma de sterila påsarna. Avståndet mellan påsen och uttaget av chocken röret är 7 cm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: typiska shockwave och skada i organotypic Hippocampus skiva kulturer. (A) representativa exempel på chockvåg som erhållits med 23 µm tjock Polyesterfilm, 2,16 bar bristningstryck, 55 kPa peak övertryck, 0.4 ms positiva våg varaktighet, 10,1 kPa·ms impuls. Vågformsdata erhölls från sensor 2 radiellt monterade på chocken röret driven avsnitt distala fläns. Chockvåg hastigheten var 440 m/s (Mach 1.3). (B) utveckling av skada är proportionell till intensiteten av stötvågen. Både 50 kPa och 55 kPa peak övertryck chockvågor vållat betydande skada som utvecklats i hela 72 h protokollet jämfört med sham-gruppen. Den skada som följd av en 55 kPa peak övertryck våg exponering var betydligt högre än efter 50 kPa vid 48 h och 72 h. Sham skivor behandlades identiskt till blast skivor men signalledares fick inte sparken. Kontroll skivor bibehölls 6 plattor i en inkubator utan någon manipulation. Staplarna representerar medelvärden och felstaplar är standardfel (n = 7, kontroller; n = 48, sham; n = 30, blast 50 kPa; n = 51, blast 55 kPa; n = antal skivor, från 6 separata experiment). * p < 0,05, *p < 0,0001 jämfört med sham. # p < 0,05, #p < 0,01 jämfört med blast 55 kPa. (C) representant propidium jodid fluorescens bilder av organotypic skivor från (jag) sham, (ii) blast 50 kPa och (iii) blast 55 kPa grupper på 72 h efter skada. Sham segmentet visar låga nivåer av fluorescens, dvs., skada och explosionen exponerade segment visar höga diffus skada, mer uttalade på 55 kPa peak övertryck utsatt skiva (skalstapeln = 500 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Bland alla mekanismer för skada som är associerad med blast TBI (primär, sekundär och tertiär blast skada mekanismer), primära blast skada är unika för blast trauma och det är den minst förstådda av blast-associerade mekanismer1,2 . Det nya protokollet som beskrivs här har utvecklats för att studera primära blast TBI använder en öppen signalledares för att exponera in vitro- mus Hippocampus slice kulturer till en enda chockvåg som med en enkel och snabb protokoll som möjliggör skapandet av en reproducerbar primära blast TBI med ett högt dataflöde.

De första in vitro- primära blast TBI modellerna tillämpas hydrostatiska tryckvågor celler26,27. Tryck utdata dock inte modell funktionen Friedlander som varaktigheten av en hydrostatiskt tryck puls var mycket längre än luftburna blast övertryck vågor13. Karakteristiskt Friedlander funktion kan modelleras enkelt i laboratoriet använder en shock tube1,8. Chocken röret kan producera chockvågor som simulerar verkliga livet öppna fältet explosioner i konventionella laboratoriemiljö, samtidigt som den exakt kontrollen av våg parametrar, såsom peak övertryck, positiva våg varaktighet och impuls, genom att variera den membran material och tjocklek, och de driver volym8,28,29.

Enkelt in vitro- modeller såsom cellkulturer saknar oftast heterogenitet celltyper och synaptic anslutning30. Effekten av blast på in vitro- hjärncell 'spheroids' införliva olika celltyper har nyligen varit undersökta31. Ytterligare utredning av dessa intressanta preparat är meriterade; men är det inte klart hur deras cellulära organisation och connectivity speglar intakt hjärnan. OHSC är en väletablerad i vitro experimental modell23,32, är lätt att kultur och deras tredimensionella vävnad cytoarchitecture, celldifferentiering och synaptic anslutning är väl bevarade och mycket liknar det i vivo33,34,35,36. OHSCs representerar en mellanliggande nivå av komplexitet mellan cellkultur och en i vivo modell23,32. OHSCs har visat att reproducera i vitro patologiska neurodegenerativa cascades sett i i vivo modeller och har varit mycket användbar i screening av potentiella neuroprotektiva droger och förstå deras verkningsmekanismer åtgärd17,21,22,37,38. Slutligen det anatomiska området studeras, hippocampus, är mycket relevant i translationell TBI studier, denna region är ofta skadad i TBI patienter39,40,41. OHSC har använts till modell blast TBI28,42,43,44, men vår modell är relativt enkel och kan anpassas till befintliga chock-rör i antingen horisontell eller vertikal konfigurationer utan komplexa anpassningar.

OHSC kan hållas i kultur i många dagar, vilket underlättar utredningen av biologiska processer över tid34. I denna modell var den vävnadsskada som resulterade från chockvåg exponering mätas dagligen under tre dagar, efter den blast exponeringen med hjälp av propidium jodid, en väletablerad markör för cellskador. Propidium jodid är ett giftfritt mycket polar färgämne som penetrerar cellerna med komprometterad cellulära membran, där det binds till nukleinsyror och uppvisar en karakteristisk ljusa röd fluorescens24,25,45. Fluorescensen mätt med propidium jodid har visat sig ha en god korrelation med skadade celler använder Nissl färgning46,47.

Med tanke på att den skada som produceras i denna modell var diffus (figur 2 c), mättes fluorescensen i den hela sektionens när du utför analysen liknar tidigare publicerade arbete i andra hjärnan skada paradigm21,22 , istället för att använda särskilda regioner, som har gjorts i andra in vitro- modeller blast TBI28,43,44,48. Den övergripande strategin som används i den modell som beskrivs i den här artikeln eliminerar också det potentiella variabilitet som införs när beskriver definierade regioner av intresse och ger en mer heltäckande bild av den blast-relaterad skadan. Både chockvåg peak overpressures, 50 kPa och 55 kPa, producerat signifikant (p < 0,05 och p < 0,0001, respektive) skada jämfört med sham skivor (figur 2B). Som väntat, stötvågen med högsta topp övertrycket, produceras 55 kPa, mer skada än 50 kPa vågen. I in vitro- modell med isolerade hjärnans utsatta vävnad direkt för en shockwave, hur man korrekt skala till hela organismen eller en människa är inte okomplicerad. Ändå är de chockvågor som vi använt inom spänna av peak overpressures observerats i området, normalt 50-1000 kPa8,49.

För att upprätthålla den OHSC utsätts för fysiologisk temperatur och nivåer av syre och koldioxid, samtidigt som man säkerställer att de var fria från föroreningar i hela chockvåg exponering protokollet, beseglades vävnadsodling skären till steril polyetylenpåsar efter en aseptisk teknik, nedsänkt i experimentell medium värmas till 37 ° C och nymalen bubblade med 95% syre och 5% koldioxid, på samma sätt som tidigare publicerade arbete28,43,44 ,48. Tvärtemot dessa modeller där komplexa enheter användes för att hålla de sterila påsarna under chockvåg exponering, i detta protokoll, användes en enkel och snabb metod att avbryta OHSC vävnadsodling skären framför utloppet shock tube (figur 1A, C ). Den modell som beskrivs i detta dokument tillåter snabb behandling och hög genomströmning, samtidigt som du minimerar risken för hypotermi. Dessa aspekter är särskilt relevanta för neuroprotektion studier med tanke på att några terapeutiska interventioner kan ha en mycket begränsad tidsfönstret för potentiella program efter TBI. Denna roman chockvåg exponering protokoll tillåter 6 till 9 vävnadsodling skär (normalt 36 till 54 Hippocampus organotypic vävnad skivor) för att utsättas för en chockvåg i ett kort tidsintervall (ca 1 h).

OHSCs kräver bra aseptisk teknik i hela. Det är viktigt att använda en aseptisk LAF i hela odling och vid överföring till sterila påsar för blast. För att genomföra slice bildtagning under aseptiska förhållanden med locken av 6-väl plattorna på plats, använder vi skräddarsydda metallringar för att höja cell kultur skären till fokalplanet av mikroskopet. En viktig del av vårt protokoll är att vi inkluderar oskadd sham skivor i varje experiment. Sham skivor behandlas identiskt till blast skivor med undantaget att inte avfyras chock-röret; ett annat viktigt steg är att alla skivor är avbildade 1 h innan skada eller simulerad behandling, så att hälsan hos befolkningen i skivor som används är identiska (figur 2B).

Förutom att kvantifiera cell skada i skivor över tid, kan vävnaden vara fast i slutet av experimentet för konventionella immunohistokemi50. Vi utvecklade och utvärderade metoden som använder mus Hippocampus skivor. Vår teknik kan dock enkelt anpassas till använda annan vävnad som kan odlas i kultur, såsom ryggmärgen, näthinnan, lunga eller epitelvävnad. I detta papper och vårt tidigare arbete med modellen undersökte vi bara effekten av exponering för en enda signal. Modellen skulle dock väl lämpad att undersöka effekterna av upprepad lågaktivt Blaster på hjärnan eller annan vävnad. OHSCs kan hållas i kultur i flera veckor eller t.o.m. månader, vilket gör att kroniska effekter ska undersökas.

In vitro modeller, att vara enklare än i vivo modeller, har en högre genomströmning, är billigare och experiment kan oftast utföras på en kortare tid skala17. De resultat som erhålls med hjälp av in vitro- modeller behöver dock valideras i djurmodeller som i vitro odlade vävnader hålls i en artificiell miljö och kan svara på skada annorlunda från vad de skulle i vivo17. Ändå, in vitro- modeller har varit oerhört värdefullt för att öka vår förståelse av hjärnan skada kaskader och screening neuroprotektiva droger innan användningen av mer komplexa i vivo modeller17,22 , 51 , 52. Trots de många fördelarna som erbjuds av denna modell, är det viktigt att notera att in vitro- modeller saknar nyckeln dragen av TBI presentera i djur och i vivo modeller, såsom effekter på kärlsystemet, ökat intrakraniellt Tryck, systemisk immunsvar och beteendemässiga funktionsnedsättningar, som belyser behovet av att validera resultaten i in vitro- modeller i hela djuret. In vitro- modeller såsom den modell som beskrivs i detta dokument är dock mycket användbara translationally relevanta vetenskapliga verktyg.

Avslutningsvis beskriver detta arbete en enkel och okomplicerad roman metod där mus organotypic Hippocampus vävnadskulturer utsätts för hårt kontrollerade och reproducerbara verkliga relevanta chockvågor använder ett laboratorium signalledares. Resulterande globala skadan, som kvantifierades använder propidium jodid, en väletablerad markör för cellskador, är mycket reproducerbara och är proportionell mot peak övertrycket av den chock som tillämpas.

Disclosures

Författarna har ingen konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Stöds av: Royal Centre för försvar medicin, Birmingham, Storbritannien, Royal British Legion centrum för Blast skada studier, Imperial College London, Storbritannien. Medicinska forskningsrådet, London, Storbritannien (MC_PC_13064; MR/N027736/1). Gassäkerhet Trust, London, Storbritannien. Rita Campos-Pires var mottagare av en forskarutbildning award från den Fundação para en Ciência e en Tecnologia, Lissabon, Portugal. Katie Harris var mottagare av doktorand från Westminster medicinska skolan forskning Trust, London, Storbritannien.

Denna modell har utvecklats med stöd av Royal British Legion centrum för Blast skada studier (RBLCBIS) vid Imperial College. Vi vill erkänna det finansiella stödet från de Royal British Legion. Forskare intresserade av samarbeten eller ytterligare information kan kontakta upphovsmännen eller RBLCBIS.

Vi tackar Dr Amarjit Samra, forskningschef, Royal Centre för försvar medicin, Birmingham, Storbritannien, för att stödja detta arbete, Scott Armstrong, Avd för kirurgi & Cancer, Imperial College London, för hjälp med preliminära experiment , Theofano Eftaxiopolou, Hari Arora & Luz Ngoc Nguyen, Institutionen för bioteknik Imperial College London, och William Proud, Institutionen för fysik Imperial College London, för råd om chock-röret, Raquel Yustos, forskning tekniker, Institutionen Biovetenskap, Imperial College London, för teknisk support, Paul Brown MBE, verkstadschefen och Steve Nelson, workshop tekniker, ringar Institutionen för fysik, Imperial College London, för att göra metallen, Neal Powell av Institutionen för fysik, Imperial College London, för konstverk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Geys balanced salt solution Sigma UK G9779
D-glucose Sigma UK G8270
Antibiotic/antimycotic Sigma UK A5955
Minimum essential medium Eagle Sigma UK M4655
Hanks balanced salt solution Sigma UK H9269
Horse serum Sigma UK H1138
L-glutamine Sigma UK G7513
HEPES VWR Prolabo, Belgium 441476L
Sodium hydroxide Sigma UK S-0945
Tissue culture inserts Millicell CM 30 mm low height Millipore PICM ORG 50
6-well plates NUNC, Denmark 140675
Propidium iodide Sigma UK P4864
Sterile polyethylene bags - Twirl'em sterile sample bags Fisherbrand 01-002-30
Portex Avon Kwill Filling Tube 5" (127 mm) Smiths Medical Supplies E910
Epifluorescence microscope NIKON Eclipse 80i, UK
Microscope objective Nikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm
Microscope filter Nikon G-2B (longpass emission)
Mylar electrical insulating film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm RS Components UK 785-0782
Pressure transducer Dytran Instruments Inc. 2300V1
Tissue chopper Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, United Kingdom. Mcllwain tissue chopper
Silicone elastomer Dow Corning, USA Sylgard 184
Graphing & statistics software GraphPad Software, USA Prism 7.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Risling, M., Davidsson, J. Experimental animal models for studies on the mechanisms of blast-induced neurotrauma. Frontiers in Neurology. 3, 30 (2012).
  2. Nakagawa, A., et al. Mechanisms of primary blast-induced traumatic brain injury: insights from shock-wave research. Journal of Neurotrauma. 28, (6), 1101-1119 (2011).
  3. Goldstein, L. E., McKee, A. C., Stanton, P. K. Considerations for animal models of blast-related traumatic brain injury and chronic traumatic encephalopathy. Alzheimer's Research & Therapy. 6, (5), 64 (2014).
  4. Rona, R. J., et al. Mild traumatic brain injury in UK military personnel returning from Afghanistan and Iraq: cohort and cross-sectional analyses. Journal of Head Trauma and Rehabilitation. 27, (1), 33-44 (2012).
  5. Terrio, H., et al. Traumatic brain injury screening: preliminary findings in a US Army Brigade Combat Team. Journal of Head Trauma and Rehabilitation. 24, (1), 14-23 (2009).
  6. Elder, G. A., Stone, J. R., Ahlers, S. T. Effects of low-level blast exposure on the nervous system: is there really a controversy. Frontiers in Neurology. 5, 269 (2014).
  7. Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. Explosive blast neurotrauma. Journal of Neurotrauma. 26, (6), 815-825 (2009).
  8. Bass, C. R., et al. Brain injuries from blast. Annals of Biomedical Engineering. 40, (1), 185-202 (2012).
  9. Young, L. A., Rule, G. T., Bocchieri, R. T., Burns, J. M. Biophysical mechanisms of traumatic brain injuries. Seminars in Neurology. 35, (1), 5-11 (2015).
  10. Wolf, S. J., Bebarta, V. S., Bonnett, C. J., Pons, P. T., Cantrill, S. V. Blast injuries. Lancet. 374, (9687), 405-415 (2009).
  11. Kluger, Y., Nimrod, A., Biderman, P., Mayo, A., Sorkin, P. The quinary pattern of blast injury. American Journal of Disaster Medicine. 2, (1), 21-25 (2007).
  12. Champion, H. R., Holcomb, J. B., Young, L. A. Injuries from explosions: physics, biophysics, pathology, and required research focus. Journal of Trauma: Injury, Infection, and Critical. 66, (5), 1468-1477 (2009).
  13. Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, D. F. In-vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 26, (6), 861-876 (2009).
  14. Edwards, D. S., Clasper, J. Blast Injury Science and Engineering: A Guide for Clinicians and Researchers. Bull, A. M. J., Clasper, J., Mahoney, P. F. Springer International Publishing. 87-104 (2016).
  15. Kirkman, E., Watts, S., Cooper, G. Blast injury research models. Philosophical Translations of the Royal Society B: Biological Sciences. 366, (1562), 144-159 (2011).
  16. Hicks, R. R., Fertig, S. J., Desrocher, R. E., Koroshetz, W. J., Pancrazio, J. J. Neurological effects of blast injury. J Trauma. 68, (5), 1257-1263 (2010).
  17. Morrison, B., Elkin, B. S. 3rd, Dolle, J. P., Yarmush, M. L. In vitro models of traumatic brain injury. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 13, 91-126 (2011).
  18. Johnson, V. E., Meaney, D. F., Cullen, D. K., Smith, D. H. Animal models of traumatic brain injury. Handbook of Clinical Neurology. 115-128 (2015).
  19. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nature Reviews Neuroscience. 14, (2), 128-142 (2013).
  20. Morganti-Kossmann, M. C., Yan, E., Bye, N. Animal models of traumatic brain injury: is there an optimal model to reproduce human brain injury in the laboratory? Injury. 41, Suppl 1. S10-S13 (2010).
  21. Banks, P., Franks, N. P., Dickinson, R. Competitive inhibition at the glycine site of the N-methyl-D-aspartate receptor mediates xenon neuroprotection against hypoxia-ischemia. Anesthesiology. 112, (3), 614-622 (2010).
  22. Harris, K., et al. Neuroprotection against traumatic brain injury by xenon, but not argon, is mediated by inhibition at the N-methyl-D-aspartate receptor glycine site. Anesthesiology. 119, (5), 1137-1148 (2013).
  23. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37, (2), 173-182 (1991).
  24. Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Research Protocols. 3, (3), 278-290 (1999).
  25. Macklis, J. D., Madison, R. D. Progressive incorporation of propidium iodide in cultured mouse neurons correlates with declining electrophysiological status: a fluorescence scale of membrane integrity. Journal of Neuroscience Methods. 31, (1), 43-46 (1990).
  26. Salvador-Silva, M., et al. Responses and signaling pathways in human optic nerve head astrocytes exposed to hydrostatic pressure in vitro. Glia. 45, (4), 364-377 (2004).
  27. Howard, D., Sturtevant, B. In vitro study of the mechanical effects of shock-wave lithotripsy. Ultrasound Medical Biology. 23, (7), 1107-1122 (1997).
  28. Effgen, G. B., et al. A Multiscale Approach to Blast Neurotrauma Modeling: Part II: Methodology for Inducing Blast Injury to in vitro Models. Front Neurol. 3, 23 (2012).
  29. Nguyen, T. T. The characterisation of a shock tube system for blast injury studies. Imperial College London. PhD Thesis (2016).
  30. Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets CNS and Neurological Disorders. 4, (4), 435-452 (2005).
  31. Sawyer, T. W., et al. Investigations of primary blast-induced traumatic brain injury. Shock Waves. 28, (1), 85-99 (2017).
  32. Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4, (4), 329-342 (1981).
  33. Gahwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neuroscience. 20, (10), 471-477 (1997).
  34. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nature Protocols. 1, (3), 1439-1445 (2006).
  35. Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term live imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nature Protocols. 1, (3), 1223-1226 (2006).
  36. De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550, (Pt 1), 135-147 (2003).
  37. Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M. 3rd, Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS). Drug Discovery Today. 10, (14), 993-1000 (2005).
  38. Cater, H. L., et al. Stretch-induced injury in organotypic hippocampal slice cultures reproduces in vivo post-traumatic neurodegeneration: role of glutamate receptors and voltage-dependent calcium channels. Journal of Neurochemistry. 101, (2), 434-447 (2007).
  39. Atkins, C. M. Decoding hippocampal signaling deficits after traumatic brain injury. Translational Stroke Research. 2, (4), 546-555 (2011).
  40. Bigler, E. D., et al. Hippocampal volume in normal aging and traumatic brain injury. American Journal of Neuroradiology. 18, (1), 11-23 (1997).
  41. Umile, E. M., Sandel, M. E., Alavi, A., Terry, C. M., Plotkin, R. C. Dynamic imaging in mild traumatic brain injury: support for the theory of medial temporal vulnerability. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 83, (11), 1506-1513 (2002).
  42. Effgen, G. B., et al. Primary Blast Exposure Increases Hippocampal Vulnerability to Subsequent Exposure: Reducing Long-Term Potentiation. Journal of Neurotrauma. 33, (20), 1901-1912 (2016).
  43. Effgen, G. B., et al. Isolated primary blast alters neuronal function with minimal cell death in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neurotrauma. 31, (13), 1202-1210 (2014).
  44. Vogel Iii, E. W., et al. Isolated Primary Blast Inhibits Long-Term Potentiation in Organotypic Hippocampal Slice Cultures. Journal of Neurotrauma. (2015).
  45. Vornov, J. J., Tasker, R. C., Coyle, J. T. Direct observation of the agonist-specific regional vulnerability to glutamate, NMDA, and kainate neurotoxicity in organotypic hippocampal cultures. Experimental Neurology. 114, (1), 11-22 (1991).
  46. Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45, (1), 117-127 (2004).
  47. Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V., Malouf, A. T. Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures. The Journal of Neuroscience. 15, (11), 7702-7711 (1995).
  48. Miller, A. P., et al. Effects of blast overpressure on neurons and glial cells in rat organotypic hippocampal slice cultures. Frontiers in Neurology. 6, 20 (2015).
  49. Panzer, M. B., Wood, G. W., Bass, C. R. Scaling in neurotrauma: how do we apply animal experiments to people. Experimental Neurology. 120-126 (2014).
  50. Campos-Pires, R., et al. Xenon Protects against Blast-Induced Traumatic Brain Injury in an In Vitro Model. Journal of Neurotrauma. 35, (8), 1037-1044 (2018).
  51. Coburn, M., Maze, M., Franks, N. P. The neuroprotective effects of xenon and helium in an in vitro model of traumatic brain injury. Critical Care Medicine. 36, (2), 588-595 (2008).
  52. Campos-Pires, R., et al. Xenon improves neurologic outcome and reduces secondary injury following trauma in an in vivo model of traumatic brain injury. Critical Care Medicine. 43, (1), 149-158 (2015).
En roman <em>In Vitro</em> modell av Blast traumatisk hjärnskada
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Campos-Pires, R., Yonis, A., Macdonald, W., Harris, K., Edge, C. J., Mahoney, P. F., Dickinson, R. A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (142), e58400, doi:10.3791/58400 (2018).More

Campos-Pires, R., Yonis, A., Macdonald, W., Harris, K., Edge, C. J., Mahoney, P. F., Dickinson, R. A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (142), e58400, doi:10.3791/58400 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter