Summary
本文介绍了一种新的原发性爆炸创伤性脑损伤模型。压缩空气驱动的激波管被用来暴露在体外小鼠海马切片培养器的单个冲击波。这是一个简单而快速的协议, 产生可重复的脑组织损伤, 具有较高的吞吐量。
Abstract
创伤性脑损伤是军事和平民死亡和残疾的主要原因。爆炸创伤性脑损伤是爆炸装置爆炸造成的, 然而, 爆炸超压暴露造成的脑损伤背后的机制并不完全了解, 被认为是这种脑损伤所独有的。临床前模型是有助于更好地了解爆炸诱发脑损伤的关键工具。利用开放式激波管模拟了用弗里德曼波形模拟的现实生活中的露场冲击波, 建立了一种新的体外爆炸 tbi 模型。c57bl/6n 小鼠单型海马切片培养物暴露在单冲击波下, 使用碘化钠 (一种成熟的细胞损伤荧光标记) 对损伤的发展进行了活据, 该假体仅穿透细胞影响了细胞膜。在整个协议期间, 暴露在冲击波中的片中, 碘化丙酸的荧光比假片高得多。脑组织损伤是非常可重复的, 并与所应用的冲击波的峰值超压成正比。
Introduction
爆炸创伤性脑损伤 (tbi) 是一种复杂的脑损伤类型, 是由1,2爆炸装置爆炸引起的。在过去15年中, 随着伊拉克和阿富汗最近的军事冲突,爆炸 tbi 已成为一个主要的健康问题。总体而言, 据估计, 从伊拉克和阿富汗返回的士兵中, 有 4.4% 至 22.8% 的人遭受了轻微的 tbi, 其中很大一部分是与爆炸有关的, 据报道, 美军的爆炸 tbi 率高于英国军队 ,5。
使用简易爆炸装置造成了大多数与爆炸有关的创伤, 包括军队遭受的爆炸 tbi 6.炸药的引爆会导致压力的迅速--但短暂的--增加, 以毫秒为单位。由此产生的现实生活中自由场爆炸的超压波是由弗里德兰德函数模拟的, 突然上升到峰值超压, 然后是指数衰减7,8。在爆炸事件中看到的极端力的范围及其快速的时间过程通常在非爆炸创伤 1,9中没有经历过。峰值超压, 即波形的最大压力, 正弦波的持续时间被认为是造成爆炸脑损伤的重要因素, 而这些因素取决于爆炸装药和与爆炸10的距离, 11个。
爆炸爆炸造成的创伤被分为四个离散部件,分别为一级、二级、三级和四级爆炸伤害10、12、13、14。这些成分中的每一个都与具体的伤害机制有关。原发性爆炸损伤是由于超压波对器官和组织2,13的直接作用造成的。继发性爆炸损伤是由于弹丸碎片的撞击造成的, 造成穿透性和非穿透性伤口2,15.当受害者的身体被移位到地面或周围物体上, 并与加速减速力1、10、13 有关时, 就会发生三级爆炸伤害。第四纪爆炸伤害描述的是与爆炸直接相关的异质伤害群体, 前三种伤害机制未涵盖描述的 12,13.它包括 (但不限于) 热损伤、吸入烟雾、辐射、电磁波和不利的心理影响13,15。大多数与爆炸相关的 tbi 直接产生于前三种损伤机制, 而爆炸损伤的第四纪机制通常与全身损伤13有关。与其他类型的 tbi (如机动车撞车、坠落、弹道损伤) 有关的加速减速力 (如鞭子)、钝性和穿透性创伤性脑损伤的影响已得到广泛研究。然而, 原发爆压波是爆炸损伤所独有的, 其对脑组织的影响却远没有得到很好的理解。与超压波相关的主要爆炸损伤机制是与大脑相互作用的第一磁力。
在过去的几十年里, 开发了许多临床前 tbi 模型, 这些模型对于了解爆炸 tbi 损伤机制和病理生理学以及研究潜在的新治疗方法非常宝贵, 否则这些方法是不可能完全做到的在临床设置17,18,19。虽然没有一个单一的临床前模型可以重现临床爆炸脑外伤的复杂性, 典型的临床前 tbi 模型复制人类 tbi 的不同方面。与爆炸有关的力的破坏性作用可以在体外和体内爆炸 tbi 模型中孤立或结合研究。体外模型的优点是可以严格控制实验环境 (组织生理条件和损伤生物力学), 从而减少生物变异性并提高重现性, 从而允许研究没有动物模型20中存在的混淆物的特定分子级联。我们的目标是开发一个体外模型, 以研究原生爆炸对脑组织的影响。我们的目标是开发一个具有超声速冲击波的模型, 该冲击波代表了一个自由场爆炸, 例如简易爆炸装置 (ied) 产生的爆炸。
Protocol
本手稿中描述的实验是根据1986年《联合王国动物 (科学程序) 法》进行的, 并得到了伦敦帝国学院动物福利 & 伦理审查机构的批准。动物护理符合伦敦帝国学院的机构指导方针。
1. 海马有机切片的制备和培养
注: 该协议允许根据 stoppini 和同事描述的界面方法生产有机海马切片, 并稍作修改21,22, 23.理想情况下, 不应超过三种动物在一个会话中进行安乐死和解剖, 以确保每个步骤都能快速完成, 并避免影响切片的质量。在整个过程中使用无菌技术。
- 确保在启动解剖协议之前采取以下步骤。
- 使用0.22μm 滤清器提前准备和过滤所有溶液。
- 在储存过程中, 并在整个大脑解剖和海马切片准备过程中, 将溶液保持在 4°c, 方法是将储存容器和 petri 培养皿放在金属散热器上, 始终坐在湿冰上。
- 高压灭菌器所有金属仪器、环和纸组织。
- 确保协议每一步使用的所有仪器和材料都能随时使用, 提前布置, 并喷洒70% 的乙醇。确保允许它们冷却和干燥。
- 用颈椎脱位对5-7天龄的 c57bl/6n 小狗进行安乐死, 并用70% 乙醇浸泡的无菌纸质组织对整个皮肤表面进行短暂擦拭。用梅奥剪刀拍下皮肤干燥, 将小狗斩首。
- 用虹膜剪刀沿着头部中线切割头皮皮肤, 从枕部区域开始, 到鼻子附近结束, 并侧向收回。
- 将 vannas 剪刀的尖端插入孔状大口, 沿横向窦在骨头上做两个小的侧切, 然后沿中线切割头骨, 直到嗅球, 并在这个区域的中线垂直地做两个小切口。
- 使用细点弯曲钳, 将骨头的皮瓣侧向远离中线, 用一个小铲子小心地取出大脑, 并将其转移到含有 "解剖介质" 的90毫米硅胶涂层培养皿中。
注: 解剖介质是 gey 的平衡盐溶液 (5 mgml d-葡萄糖, 1% 抗生素-抗真菌溶液, 含有 10, 000 unitsl 青霉素、10 mgml 链霉素和25μgml 两性霉素 b)。 - 取出小脑, 用剃须刀片分离沿中线的大脑半球。使用铲子将大脑半球转移到一个新的90毫米硅胶涂层培养皿充满新鲜的冰凉解剖介质。如果要在一个会话中使用多个动物, 请重复步骤 1.2-1.6。
- 在立体显微镜下, 用剃须刀片切割嗅球和额叶皮层的尖端, 用细尖钳将大脑皮层与脑组织的其他部分分开。这一步使海马体暴露在皮质组织的内侧表面。从这一步开始, 使用层流组织培养罩 (紫外线消毒, 并使用70% 乙醇溶液清洗)。
- 将冰凉解剖介质涂在扁平的塑料切碎盘上, 并使用铲子将脑组织放置在圆盘上, 使皮层的内侧表面朝上, 海马的轴垂直于切碎刀片的轴线。
- 使用细尖巴斯德移液器从切碎盘中尽可能多地去除解剖介质。
- 使用组织切割机, 以50% 的切割速度和力量将大脑切割成400微米的切片。
注: 这是非常重要的, 这一步是尽快完成, 因为脑组织不淹没在解剖介质。 - 用新鲜的冰凉介质代替硅胶弹性体涂层培养皿中的解剖介质。
- 组织切碎器完成后, 将脑组织仔细浸入新鲜的解剖介质中, 并使用直刀将切割的组织转移回90毫米硅胶涂层的 petri 培养皿中。
- 在立体显微镜下, 使用细尖钳仔细分离皮质切片。对于每个切片, 检查海马体是否有形态和解剖或切片引起的潜在组织损伤。
- 使用细尖钳和小 vannas 剪刀将海马体与内皮皮层和漏斗分开。通常情况下, 每个半球生成大约6至8个海马切片。
- 将多达6种海马切片转移到组织培养中, 使用切割的巴斯德移液器插入, 并将其放置在一个35毫米的 petri 培养皿中。确保切片分开几毫米 (这将确保每个切片都可以单独成像)。
- 立即添加冰凉的 "生长介质" 到每个培养皿的底部, 在组织培养插入下, 就在组织培养的顶部插入边缘。
注: 生长介质含有50% 的最低必要的中鹰, 25% 的汉克斯的平衡盐溶液, 25% 的马血清, 5 mgml d-葡萄糖, 2 mmol l l l-谷氨酰胺, 1% 抗生素抗乙胺溶液, 和10莫莫尔 hepe, 滴定到 ph 7.2 与氢氧化钠。 - 在解剖后的第二天改变生长介质, 然后每隔2至3天改变一次 (使用37°c 的生长介质)。确保添加足够数量的生长培养基, 但不要过多溢出组织培养插入膜, 这可能会损害组织切片的可行性。
- 将组织切片保存在37°c 的加湿孵化器中, 空气中含有5% 的二氧化碳, 在实验中使用前12至14天。
2. 实验爆破 tbi 协议海马有机切片的制备
注: 除成像外, 本节的所有步骤都发生在层流组织培养罩中。
- 将定制的不锈钢环插入6孔板 (每口井 1个)。
注意: 环有一个有缺口的边缘 (应该坐在12点钟的位置), 并适合紧贴在井内, 而组织培养很容易插入在这个边缘。确保用杀菌消毒剂清洗戒指, 用纯净水彻底冲洗, 高压灭菌, 并允许提前冷却。 - 用预热 (37°c) 无血清的 "实验介质" 填充6井板的井, 并加入碘化物。
注: 碘化物的实验介质为: 75% 最低必要的中鹰, 25% 汉克斯的平衡盐溶液, 5 mgml d-葡萄糖, 2 mmoll l-谷氨酰胺, 1% 抗生素-抗真菌溶液, 10 mmoll hepes 和 4.5μmol-prodidide, 滴定 ph 值到7.2 与氢氧化钠。 - 确保介质的水平不会达到环的凹槽以上。将带环的6孔板转移到孵化器 1小时, 以确保培养基在组织培养插入物转移前立即处于37°c。
- 用35毫米培养皿中的有机切片将组织培养物插入到6孔板上, 用圆环和实验介质进行钳子。
- 用永久标记笔在3点钟位置的刀片边缘上做一个点。
注: 在实验过程中, 刀片将从6孔板中取出, 此步骤有助于在冲击波曝光后将刀片恢复到原来的位置, 并在整个协议过程中轻松跟踪每个切片。 - & 日期, 用唯一的名称标记每个6井板, 并绘制每个板材的井的地图, 命名每个井 (例如, a、b、c 等) 和每个井中的每个切片 (例如, 1, 2, 3 等), 以便每个切片都有一个唯一的标识符 (例如, a1、a2、a3等)。
- 将6孔板转移到孵化器 1小时, 以确保切片在成像前立即处于37°c。
注: 避免培养基溢出或组织培养插入膜下的任何气泡, 这可能会损害切片的可行性。 - 转移到实验介质1小时后, 使用荧光显微镜 (2x 目标, na 0.06) 单独图像每个切片, 并安装适当的激励 (bp 555/50 nm) 和发射 (lp 610 nm) 滤光片, 以评估损伤前的切片健康状况协议的执行。
注意: 在此阶段显示密集红色染色区域的切片应被视为存在的可行性, 并应排除在进一步分析之外 (这些切片通常不到生成切片总数的 10%)。确保成像以顺序的方式进行, 并尽可能迅速地将切片在孵化器外的时间降至最低 (通常6口井需要近30分钟的时间进行成像)。 - 任何时候都要把6孔板的盖子盖上。一些冷凝可能会在盖子的内部积聚。如果发生这种情况, 请在低设置上短暂使用吹风机。
- 确保所有成像条件在不同的日期和实验之间是相同的。
注: 成像的目的是量化组织荧光, 因此这一步骤对于确保结果的重现性并允许对所获得的数据进行比较非常重要。
3. 海马有机切片组织培养物的浸渍和运输
- 成像后, 立即在层流罩中, 用钳子将6孔板插入一个组织培养。
- 小心地将插入物转移到无菌聚乙烯袋 (3 "x 5"), 预先填充20毫升的温热 (37°c) 实验介质, 新鲜冒泡95% 的氧气和5% 的二氧化碳。
注: 使用德雷克尔瓶内的玻璃泡泡器, 使用共碎玻璃泡泡泡器, 确保氧气和二氧化碳浓缩实验介质在95% 的氧气和5% 的二氧化碳中冒泡至少 40分钟, 并将其转移到无菌聚乙烯袋内。层流组织培养罩使用20毫升注射器, 带有细菌过滤器和无菌填充管 (127 毫米) 连接。立即密封袋子, 并将其转移到37°c 的孵化器至少 1小时, 然后组织培养插入转移。 - 确保每个无菌袋都有正确的标签 (带有板材和良好的标识)。对每个组织培养插入重复此步骤。密封无菌袋时, 请小心排除气泡 (通过扭曲袋顶部和使用塑料夹具安全地完成)。
- 将带组织培养插入物的无菌袋和带实验介质的6孔板送回37°c 孵化器。
- 1小时后, 小心地将无菌袋与组织培养插入塑料盒中的一个热调节的盒子在 37°c, 充满去离子水, 以保持在生理温度下整个冲击波暴露协议。
4. 冲击管和海马有机切片冲击波曝光的制备
- 在准备激波和冲击波曝光过程中, 穿上钢脚趾防护靴、实验室外套和手套。
- 将无菌袋架框架固定在冲击管远端法兰上, 确保中心孔与冲击管出口对齐 (使用冲裁杆)。
- 径向安装两个压力传感器: 传感器 1, 在驱动部分的中间, 传感器2在冲击管的远端法兰 (图 1a)。通过电流源电源单元将压力传感器连接到示波器。
- 确保所有冲击管释放阀和流量控制都已关闭。
- 打开外部压缩空气管路, 并将电磁阀充电至 2.5 bar。
- 打开压缩空气气缸安全阀, 慢慢打开压力调节器, 将压力增加到约5巴。
注: 此调节器的压力设置应略高于最高的膜片爆裂压力。 - 将23μm 厚的聚酯薄片切割成 10 x10厘米2平方, 准备隔膜。使用高压灭菌器胶带准备手柄, 并将其粘附在每个隔膜的顶部和底部。
- 在胸围放置一个隔膜 (双胸罩的单槽-单膜片配置) 或两个膜片 (双胸罩-双膜片配置的两个插槽) (图 1 b)。
- 将隔膜居中, 并使用四个 m24 螺栓和螺母夹紧它们, 以对角对称的方式依次固定, 并确保隔膜无皱。
- 将每个无菌袋分别固定在支架框架的垂直位置, 确保组织培养物的表面与有机型海马片面向激流管出口, 组织培养插入物在无菌支架内居中包 (图 1c)。确保无菌袋被牢固地夹住在周围, 以确保牢固, 甚至固定。
- 在给冲击管加压时, 请佩戴耳罩和安全眼镜。打开电流源动力装置和示波器, 获取冲击波数据 (采集速率为50兆采样, 记录长度为20毫秒, 100万点), 并关闭电磁阀。
- 使用冲击管控制面板上的流量控制旋钮, 为单隔膜配置的冲击管的驱动器体积部分或双膜片冲击管的驱动体积部分和双膜片的双胸段缓慢加压配置。
注: 对于单隔膜配置, 爆裂压力将只取决于隔膜材料和厚度, 一旦达到材料爆裂压力, 隔膜将自发破裂。对于双隔膜配置, 爆裂压力还将取决于驾驶员和双胸腔的气体压差, 对于控制的隔膜, 双液压安全阀手动打开一次达到目标压力。 - 一旦隔膜破裂 (产生巨大的噪音), 使用流量旋钮快速关闭压缩气流, 打开电磁阀。
注: 可以通过插入冲裁段来修改驱动部分的总体积, 从而获得更广泛的冲击波峰值超压和持续时间。冲击波参数的理想组合应足以引起组织损伤, 但不会太高, 从而导致组织培养插入或无菌袋变形或破裂。 - 用一个组织培养物将每个无菌袋插入到一个冲击管波中, 并在从盒子中取出一个新的无菌袋并夹在支架框架上之前, 立即将其返回到热调节的盒子中。确保步骤 4.10-4.10 尽可能顺利和快速地执行 (在几分钟内), 以防止实验介质冷却, 因为低于37°c 的温度可能会干扰损伤的发展。
- 一旦所有的组织培养插入物都暴露在冲击波 (或假协议) 中, 将组织培养插入物返回到原来的6井板和各自的井 (层流组织培养罩内), 并返回到孵化器。
- 在37°c 的空气中, 将6井板保持在空气中5% 的二氧化碳中, 直到进一步成像。
- 包括每个实验的假控制, 以及切片冲击波曝光。
注: 表片的处理方式与暴露在冲击波中的切片相同 (用实验介质密封在无菌袋中, 运输到同一热调节箱中的冲击管实验室, 并悬浮在金属框架上的时间相当于:时间), 但冲击管没有发射。
5. 海马有机切片损伤的定量
- 在24小时、48小时和72小时时, 对步骤2.8 和2.9 中所述的切片进行图像成像。
- 在冲击波曝光72小时进行成像后, 按照当地的生物废物协议丢弃组织, 并对金属环进行消毒和高压灭菌。
Representative Results
这种方法中使用的激波管允许产生超压瞬变, 模拟由 friderander 函数7,8模拟的现实生活中的露天爆炸。得到了速度为 440 m2 (马赫 1.3) 的超音速冲击波 (图 2a)。报告的波形数据来自传感器 2, 径向定位在激波管驱动部分的末端。
使用上述协议, 暴露在单个冲击波中的有机型海马切片培养物 (图 2a) 使用碘化物 (一种高度极性的荧光染料) 进行了定量的重大损伤。会破坏细胞膜24、25 (图 2b, c)。
即使在最佳条件下, 并与其他 ohsc 公布的模型21,22一致, 有一个低水平的背景碘化物荧光, 部分原因是由于固有的组织操作造成的轻微损害 (例如培养过程中的介质变化或从孵化器中取出进行成像)。此爆炸 tbi 协议涉及大量操作, 包括将切片浸入介质内的无菌袋中, 以及在冲击波暴露协议期间的相当程度的处理 (例如, 将无菌袋夹紧到机架)。但是, 如果仔细执行所有步骤, 这种额外的操作不会对 ohsc 的基本运行状况产生影响, 因为在任何时候都没有发现保存在6井板中的控制组切片之间存在显著差异 (即,插入物未被淹没或处理) 和假组, 其中包括被淹没在夹在冲击管上的无菌袋内的切片 (图 2b)。
在50千帕和55千帕峰值超压下选择的两个冲击波, 与爆炸曝光后所有时间点的未受伤假片相比, 分别产生了显著的 (p & lt;0.05 和p & lt;0.0001) 和可重现性损伤协议 (图 2b), 而不会对组织培养插入物或无菌袋造成任何损害。为了确定模型对峰值超压微小差异的敏感性, 我们决定选择相差 ~ 10% 的值。这些结果还表明, 如预期的那样, 5 5千帕造成的伤害高于 5 0千帕冲击波后造成的伤害。
数据表示为均值的均值±标准误差。使用 holm-sidak 临时后测试, 采用双向重复方差测量分析对意义进行评估。因子1为组 (对照、假、爆炸) 和因子2为受伤后的时间 (-1小时、24小时、48小时和 72小时), 其中因子1是重复因子。使用了多个比较的p值调整。p值小于 0.05, 表明各组间差异显著。统计测试是使用图形和统计软件包进行的。
图 1: 带无菌袋架架的冲击管装置示意图.(a). 激波管是一个3.8 米长的不锈钢钢管, 由三个1.22 米长的截面组成, 由垫圈和法兰连接, 内径为59毫米. ( b)内联显示双胸装置。一个或两个 mylar 膜片可以夹紧在组件中, 密封由橡胶 o 形圈提供。(c) 无菌袋架架。框架的主体由两个金属板组成, 其中心圆孔 (直径59毫米) 与冲击管出口对齐。两个金属板之间安装了两片薄 (4 毫米) 的有机硅弹性体。这些板材的目的是提供一个均匀和不光滑的表面, 以夹紧无菌袋。袋子和激波管出口之间的距离是7厘米,请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 组织型海马切片培养中的典型冲击波和由此产生的损伤.(a) 使用23μm 厚的聚酯薄膜、2.16 bar 爆裂压力、55 kpa 峰值超压、0.4 ms 正波持续时间、10.1 kp· ms 脉冲获得的冲击波的代表性例子。从传感器2中获得了波形数据, 这些数据直接安装在激波管驱动段的远端法兰上。冲击波速度为440毫米 (马赫 1.3)。(b) 损伤的发展与冲击波的强度成正比。与假组相比, 50千帕和55千帕峰值超压冲击波都造成了严重的伤害, 在整个72小时协议中都有很大的伤害。55千帕峰值超压波照射造成的伤害明显高于48小时和 72小时50千帕后, 浅层切片的处理方式与爆炸片相同, 但没有发射激波管。控制切片在孵化器中的6个井板中保持不受任何操作。条形图表示平均值, 误差条是标准误差 (n = 7, 控制; n = 48, 假; n = 30, 爆炸50千帕; n = 51, 爆炸 55 kpa; n = 切片数, 来自6个单独的实验)。*p & lt;0.05, * **p & lt;0.0001 与假的比较。#p & lt;0.05, ## p & lt;0.01 与爆炸55千帕相比。(c) 具有代表性的碘化物荧光图像的有机切片从 (i) sham, (ii) 爆炸50kpa 和 (iii) 爆炸55千帕组在72小时后受伤。假片显示荧光水平较低,即损伤, 爆炸暴露切片显示高弥漫性损伤, 在55千帕峰值超压暴露切片 (刻度棒 = 500μm) 上更为明显。请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
在与爆炸 tbi (一级、二级和三级爆炸损伤机制) 相关的所有损伤机制中, 初级爆炸损伤是爆炸创伤所独有的, 在与爆炸相关的机制1、2 中, 这种损伤是最不了解的.本文所述的新协议是利用开放式激波管研究初级爆炸 tbi 的, 该方法利用简单而快速的协议将小鼠海马切片培养体暴露在单个冲击波中, 从而能够创建一种可重现性具有较高的吞吐量的主爆炸 tbi。
第一个体外原生爆炸 tbi 模型将静水压力波应用于细胞 26,27。然而, 压力输出并没有模拟弗里德曼函数, 因为静水压力脉冲的持续时间比机载爆炸超压波13要长得多。使用激波管 1,8,可以很容易地在实验室中模拟弗里德曼功能。激波可以产生冲击波, 在传统的实验室环境中模拟现实生活中的露天爆炸, 同时允许精确控制波参数, 如峰值超压、正波持续时间和脉冲, 方法是改变隔膜材料和厚度, 以及驱动器体积 8,28,29。
简单的体外模型, 如细胞培养, 通常缺乏异质性的细胞类型和突触连接30。近年来, 爆炸对不同细胞类型的体外脑细胞 "球体" 的影响进行了研究.对这些有趣的准备工作进行进一步调查是值得的;然而, 目前尚不清楚他们的细胞组织和连接是如何反映完整的大脑的。ohsc 是一个成熟的体外实验模型23,32, 易于培养, 其三维组织细胞结构, 细胞分化和突触连接保存良好, 非常类似于体内33,34, 35,36.ohsc 代表了细胞培养和体内模型 23,32之间的中间复杂性水平。ohsc 已被证明可以在体内模型中看到的体外病理神经退行性级联的繁殖, 并在筛选潜在的神经保护药物和了解其机制方面非常有用。行动17,21,22,37,38。最后, 所研究的解剖区域海马体在翻译 tbi 研究中具有高度的相关性, 因为在 tbi 患者39、40、41中经常受损。ohsc 已被用于模型爆炸 tbi28,42,43, 44, 但是, 我们的模型是相对简单的, 可以适应现有的水平或垂直的冲击管配置, 而无需复杂的调整。
ohsc 可以在培养中保存许多天, 这有助于随着时间的推移对生物过程的调查34。在该模型中, 在爆炸暴露后, 每天测量冲击波照射造成的组织损伤, 爆炸后使用碘化物, 这是细胞损伤的既定标记。碘化钠是一种无毒的高极性染料, 它能穿透细胞, 并与核酸结合, 并表现出典型的明亮的红色荧光 24,25,45。用 nisl 染色46, 47 检测出碘化丙酯的荧光与损伤细胞计数有很好的相关性。
鉴于该模型中产生的损伤是漫反射的 (图 2c), 在进行分析时测量了整个切片的荧光, 类似于以前在其他脑损伤范式21、22 中发表的工作, 而不是使用特定的区域, 就像在其他体外爆炸 tbi 模型28,43,44,48所做的那样。本文中描述的模型中使用的全局方法还消除了概述所定义的感兴趣区域时引入的潜在可变性, 并提供了与爆炸有关的伤害的更全面的情况。与假片相比, 50 kpa 和55千帕的冲击波峰值超压都产生了明显的 (p & lt;0.05 和lt;0.0001 ) 损伤 (图 2b)。不出所料, 峰值超压 5 5千帕的冲击波造成的伤害超过 5 0千帕波。在一个离体模型中, 分离的脑组织直接暴露在冲击波中, 如何准确地缩放到整个生物体或人类是不简单的。然而, 我们使用的冲击波在现场观测到的峰值超压范围内, 通常为 50–1000千 kpa8,49。
为了保持 ohsc 暴露在生理温度以及氧气和二氧化碳的水平下, 同时确保它们在整个冲击波暴露过程中不受污染, 组织培养插入物被密封成无菌聚乙烯袋采用无菌技术, 淹没在实验介质中加热至 37°c, 新鲜起泡95% 的氧气和5% 的二氧化碳, 类似于先前发表的作品28,43,44 ,48岁。与这些模型不同的是, 在冲击波照射过程中使用了复杂的装置来固定无菌袋, 在该协议中, 使用了一种简单而快速的方法将 ohsc 组织培养插入物挂在激流管出口前 (图 1a, c)).本文中描述的模型允许快速处理和高吞吐量, 同时最大限度地降低低温风险。这些方面与神经保护研究特别相关, 因为一些治疗干预措施在 tbi 之后可能有非常有限的潜在应用时间。这种新的冲击波暴露协议允许6至9个组织培养插入物 (通常为36至54海马组织切片) 在短时间内 (约 1小时) 暴露在冲击波中。
ohsc 在整个过程中都需要良好的无菌技术。重要的是要在整个培养过程中和转移到无菌袋爆炸时使用无菌层流罩。为了在无菌条件下进行切片成像, 并在6孔板的盖子上进行成像, 我们使用定制的金属环将细胞培养插入物提高到显微镜的焦平面上。我们协议的一个重要部分是, 我们在每个实验中都包括未受伤的假片。除了不发射冲击管的情况外, 对页片的处理方式与爆破片相同;另一个重要步骤是, 所有切片在受伤或假治疗前1小时进行成像, 以确保所使用的切片人群的健康状况相同 (图 2b)。
除了随着时间的推移对切片中的细胞损伤进行定量分析外, 在常规免疫组织化学 50的实验结束时, 还可以固定组织。我们开发并评估了使用小鼠海马切片的方法。然而, 我们的技术可以很容易地适应使用其他组织, 可以在培养中生长, 如脊髓, 视网膜, 肺或上皮组织。在本文和我们以前的工作与模型, 我们只研究了暴露在一个单一的爆炸的影响。然而, 该模型非常适合研究反复的低级爆炸对大脑或其他组织的影响。ohsc 可以在培养中保存数周甚至数月, 从而对慢性影响进行调查。
体外模型比体内模型简单, 吞吐量较高, 成本较低, 实验通常可以在较短的时间范围内完成.然而, 使用体外模型获得的结果需要在动物模型中得到验证, 因为体外培养的组织保存在人工环境中, 对损伤的反应可能与在体内17 不同。尽管如此,体外模型在提高我们对脑损伤级联的认识和在体内使用更复杂的模型 17、22 之前筛选神经保护药物方面具有极大的价值,51,52. 尽管该模型提供了许多优点, 但必须指出,体外模型缺乏动物体内存在的 tbi 的关键特征, 体内模型缺乏对血管系统的影响, 增加了颅内压力、全身免疫反应和功能行为障碍, 这突出表明需要验证在整个动物的体外模型中发现的结果。然而,体外模型, 如本文所描述的模型是非常有用的翻译相关的科学工具。
总之, 这项工作描述了一种简单而直接的新方法, 在这种方法中, 小鼠的器官型海马组织培养物暴露在严格控制和可重现的现实生活中相关冲击波中, 使用实验室的激波。由此产生的全球损伤, 是用碘化钠----一种成熟的细胞损伤标记----进行量化的, 它是非常可重复的, 并且与所施加的冲击波的峰值超压成正比。
Disclosures
作者没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
支助单位: 英国伯明翰皇家国防医学中心、英国伦敦皇家军团爆炸伤害研究中心、英国伦敦帝国学院。医学研究理事会, 联合王国伦敦 (MC_PC_13064;mrs来/n0277361)。天然气安全信托基金, 伦敦, 联合王国。rita campos-pires 获得了葡萄牙里斯本 cincia a 的 cincia 和 tecnologia 基金会颁发的博士培训奖。凯蒂·哈里斯是英国伦敦威斯敏斯特医学院研究信托基金博士生的获得者。
这种模式是在帝国学院英国皇家军团爆炸伤害研究中心 (rblcbis) 的支持下开发的。我们要感谢英国皇家军团的财政支持。对合作或更多细节感兴趣的研究人员可能会联系作者或 rblcbis。
我们感谢联合王国伯明翰皇家国防医学中心研究主任 amarjit samra 博士支持这项工作, 伦敦帝国学院外科 & 癌症系的 scott armstrong 为初步实验提供了协助, theofano eftaxiopolou, hari arora & luz ngoc nguyen, 伦敦生物工程帝国学院系, & 伦敦物理帝国学院系 william proud, 就冲击管 raquel yustos 提供咨询意见, raquel yustos, 研究技术员, 系伦敦帝国学院生命科学公司, 为寻求技术支持, paul brown mbe, 车间经理和史蒂夫·纳尔逊, 讲习班技术员, 物理系, 物理系, 物理系,伦敦帝国学院, 艺术品。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geys balanced salt solution | Sigma UK | G9779 | |
| D-glucose | Sigma UK | G8270 | |
| Antibiotic/antimycotic | Sigma UK | A5955 | |
| Minimum essential medium Eagle | Sigma UK | M4655 | |
| Hanks balanced salt solution | Sigma UK | H9269 | |
| Horse serum | Sigma UK | H1138 | |
| L-glutamine | Sigma UK | G7513 | |
| HEPES | VWR Prolabo, Belgium | 441476L | |
| Sodium hydroxide | Sigma UK | S-0945 | |
| Tissue culture inserts | Millicell CM 30 mm low height Millipore | PICM ORG 50 | |
| 6-well plates | NUNC, Denmark | 140675 | |
| Propidium iodide | Sigma UK | P4864 | |
| Sterile polyethylene bags - Twirl'em sterile sample bags | Fisherbrand | 01-002-30 | |
| Portex Avon Kwill Filling Tube 5" (127 mm) | Smiths Medical Supplies | E910 | |
| Epifluorescence microscope | NIKON Eclipse 80i, UK | ||
| Microscope objective | Nikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm | ||
| Microscope filter | Nikon G-2B (longpass emission) | ||
| Mylar electrical insulating film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm | RS Components UK | 785-0782 | |
| Pressure transducer | Dytran Instruments Inc. | 2300V1 | |
| Tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, United Kingdom. | Mcllwain tissue chopper | |
| Silicone elastomer | Dow Corning, USA | Sylgard 184 | |
| Graphing & statistics software | GraphPad Software, USA | Prism 7.0 |
References
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