Summary
Real-time kvantitativ polymerase kædereaktion analyse kombineret med reverse transkription (RT-qPCR) har været meget anvendt til at måle niveauet af RNA-virusinfektioner. Her præsenterer vi en direkte RT-qPCR assay, som ikke kræver en RNA oprensning skridt, udviklet til kvantificering af flere RNA-vira, herunder dengue virus.
Abstract
I øjeblikket, real-time polymerase kædereaktion (PCR) teknologi er et uundværligt redskab for påvisningen og kvantificeringen af viral genomer i forskningslaboratorier og for Molekylær diagnostik, på grund af dens følsomhed, specificitet, og bekvemmelighed. Men i de fleste tilfælde, kvantitativ PCR (qPCR) analysen generelt anvendes til påvisning af virusinfektion har påberåbt sig rensning af viral nukleinsyre før trinnet PCR. I denne undersøgelse, er fluorescens-baserede reverse transkription qPCR (RT-qPCR) analysen udviklet gennem en kombination af en behandling buffer og en et-trins RT-PCR reagens, således at hele processen, fra høsten af cellekultur supernatant for virus-inficeret celler indtil real-time opdagelse, kan udføres uden viral RNA oprensning. Den etablerede protokollen giver mulighed for kvantificering af en bred vifte af RNA koncentrationer af dengue virus (DENV) inden for 90 min. Derudover er tilpasningsevne af direkte RT-qPCR analysen til evaluering af et antiviralt middel påvist ved en in vitro- eksperiment ved hjælp af en tidligere rapporteret DENV hæmmer, mycophenolic syre (MPA). Desuden kan andre RNA-vira, herunder gul feber virus (YFV), Chikungunya virus (CHIKV) og mæslingevirus (MeV), kvantificeres ved direkte RT-qPCR med samme protokol. Derfor er direkte RT-qPCR analysen er beskrevet i denne rapport nyttig for overvågning RNA-virus replikering på en enkel og hurtig måde, som vil blive videreudviklet i en lovende platform for en høj overførselshastighed screening undersøgelse og klinisk diagnose.
Introduction
Slægten Flavivirus af Flaviviridae -familien omfatter mere end 70 indhyllet, positive-strenget RNA-vira, der overføres af myg og tæger. Vigtigere, fører flavivirus infektion hos mennesker ofte til alvorlig klinisk sygdom, såsom hæmoragisk feber og hjernebetændelse1. Faktisk, en seneste udbrud af Zika virus (ZIKV), en flavivirus, har spredt sig eksplosivt i hele Amerika og har vist sig at være forbundet med neurologiske komplikationer, herunder mikrocefali2,3. Flavivira, har derfor betydelig klinisk og økonomisk indvirkning på det moderne samfund.
En vigtig flavivirus er dengue virus (DENV), en myg-bårne virus vidt udbredt i de tropiske og subtropiske områder af verden. DENV overføres af Aedes myg, herunder Aedes albopictus og Aedes aegypti, hvilket resulterer i den globale spredning af dengue udbrud4. I øjeblikket, World Health Organization (WHO) klassificerer dengue sygdom som tre kategorier: dengue uden advarselstegn, dengue med advarselsskilte og svær dengue4. Selv om primær infektion med en af de fire serotyper af DENV (DENV-1-4) er ofte asymptomatisk eller selvbegrænsende, har epidemiologiske undersøgelser vist, at den sekundære infektion af forskellige serotyper øger risikoen for mere alvorlige former af dengue. Det er værd at bemærke, at antistof-afhængige forbedring af DENV infektion forårsaget af ikke - eller subneutralizing antistoffer produceres under den primære infektion er blevet foreslået som en potentiel mekanisme af svær dengue, som opstod som en sekundær infektion. Men ingen specifikke antivirale lægemiddel er tilgængelig for DENV infektion5.
For udviklingen af antivirale midler mod DENV er rutine og robust assays, som er indstillet til en høj overførselshastighed indstilling, afgørende for opdage virus replikering kvantitativt. Konventionelt, har biologiske assays (fx, plaque assay) til kvantificering af smitsomme virus og immunologiske assays (fxenzym-forbundet immunosorbent assay [ELISA]) til påvisning af virusantigen været brugt til at overvåge DENV replikering i in vitro og i vivo6,7. Men disse assays ofte besværlige og kræver flere dage at udføre, som hindrer håndtering af store mængder prøver. I denne henseende RT-qPCR er en pålidelig analyse til påvisning af DENV infektion: det er specifikke, følsomme og relativt hurtig7. Derudover har RT-qPCR teknik flere fordele i en høj overførselshastighed format. Ikke desto mindre, den typiske procedure af RT-PCR til RNA-vira kræver genvinding af viral nukleinsyrer fra indsamlede prøver. Selv om forskellige udvindingsmetoder kan være ansat for RT-qPCR, er flere trin stadig behov for at få renset viral RNA. Også, RT-qPCR assays normalt kræver dyre spin kolonner eller farlige organiske opløsningsmidler, hvorved præparationsprocessen mere besværligt. For at undgå forkert håndtering og/eller krydskontaminering mellem prøver er en kritisk faktor for succesfuld kvantificering af viral genomer, er en mindre besværlig og tidskrævende metode den foretrukne, især hvis RT-qPCR skal anvendes til høj overførselshastighed format.
Her rapporterer vi en simpel RT-qPCR procedure til måling af DENV RNA i en cellekultur supernatant af inficerede celler, der ikke involverer viral RNA oprensning. Denne optimerede RT-qPCR protokol er sammensat af to trin: i) Inkubationen af en supernatanten af DENV-inficerede cellekultur med en forarbejdning buffer, og ii) one-step RT-qPCR på en real-time PCR instrument. Derfor kan DENV RNA i en kultur supernatanten påvises inden for 90 min (figur 1). Vi beskriver også anvendelsen af den direkte RT-qPCR til andre RNA-virusinfektioner.
Protocol
1. forberedelse af skabelonen DNA RNA standard
- Forberede en PCR mix (samlede volumen af 50 μL, tabel 1) bruger en plasmid DNA vektor indeholdende DENV-2 New Guinea C (NGC, stammesamlingsnummer: AF038403.1) 3' utranslaterede region (3' UTR)8 og primere (T7-DENV 3 'UTR Fwd og DENV 3' UTR Rvs) i en 0,2 mL tube, som beskrevet i tabel 2.
Bemærk: Dette trin er skal gennemføres under en ren hætte (eller i et rent værelse) at undgå kontaminering af amplikon-relaterede produkter. - PCR-Forstærk cDNA af T7 sekvens-smeltet DENV 3' UTR i en thermocycler, ved hjælp af følgende betingelser: 30 cykler (98 ° c i 10 s, 55 ° C i 5 s og 72 ° C i 5 s).
- Bland PCR reaktionen med 10 μL af 6 x gel-loading farvestof og belastning på en 1% Agarosen gel med en DNA molekylære stige lige fra 0,1 til 10 kilobase par (kbp).
- Visualisere PCR produkt (479 basepar [bp]) i lang bølgelængde UV-lys ved hjælp af en DNA Visualisering metode og en gel imaging system. Skåret ud den DNA band ved hjælp af en ren skalpel.
- Uddrag DNA ved hjælp af en DNA rensning kit (Tabel af materialer).
Bemærk: Denne rensning trin kan udføres uden for den rene hood, men det er vigtigt at holde et rent miljø under processen med at undgå RNase forurening, som er et stort problem i de følgende DENV RNA standard syntese trin.- Gel skive og der tilsættes 100 μL af indfangning buffer pr 100 mg af gel skive i 1,5 mL microcentrifuge rør.
- Opløses gel ved inkubation ved 60 ° C i 5-15 min.
- Samle en DNA oprensning kolonne med en collection tube og 600 μL af opløste prøven overføres til kolonnen rensning.
- Der centrifugeres ved 16.000 x g for 30 s og kassér gennemstrømnings. Hvis prøven er større end 600 μl, gælder resten af prøven til kolonnen DNA oprensning efter den første omgang og Gentag dette trin.
- Anvende 500 μL vask buffer til kolonnen DNA oprensning.
- Der centrifugeres ved 16.000 x g i 30 s.
- Sæt kolonnen i en ny 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Tilsæt 50 μL af eluering buffer og inkuberes kolonnen ved stuetemperatur i 1 minut.
- Der centrifugeres ved den maksimale hastighed i 1 minut at eluere DNA.
- Måling af Ekstinktionen af DNA på 260 nm på et spektrofotometer ved hjælp af 3 μl af den eluted prøve. Brug den samme mængde af eluering buffer som en tomme.
Bemærk: Skabelonen DNA kan opbevares ved-20 ° C indtil brug.
2. Sammenfatning af DENV 3' UTR RNA Standard
Bemærk: Fastholde ribonuklease (RNase)-frit miljø så meget som muligt at udføre følgende trin. Set-up reagens skal udføres inde en ren hætten, ved hjælp af nukleasen-fri pipets, tips og rør.
- Bland i vitro transskription (IVT) reaktion (en samlede volumen af 20 μL) med 100 ng af T7 RNA promotor sekvens-smeltet DENV 3' UTR DNA skabelon (fra trin 1,6) i 0,2 mL PCR rør som beskrevet i tabel 3.
- Inkuber blanding ved 37 ° C i thermocycler for 2 h.
- Tilsæt 1 μL af DNase IVT reaktion og fortsætte inkubationen ved 37 ° C i 15 min.
- Rense in vitro- transskriberet RNA bruger et RNA oprensning kit (Tabel af materialer).
- Tilsættes 80 μl af RNase-fri H2O og 350 μL indfangning buffer, herunder 1% β-mercaptoethanol.
- Tilsæt 250 μL 100% ethanol til IVT reaktion og bland det godt af pipettering.
- Samle en RNA oprensning kolonne med en collection tube og overføre RNA prøven til kolonnen rensning.
- Det der centrifugeres ved 8.000 x g for 15 s og kassér gennemstrømnings-.
- Gælde RNA oprensning kolonnen 500 μL vask buffer og centrifugeres ved 8.000 x g i 2 min.
- Sæt kolonnen i en 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Tilsæt 50 μL af RNase-fri H2O og inkuberes kolonnen ved stuetemperatur i 1 minut.
- Der centrifugeres ved den maksimale hastighed i 1 minut at eluere RNA.
- Måling af Ekstinktionen af RNA på 260 nm på et spektrofotometer, ved hjælp af 3 μl af den eluted prøve. Brug den samme mængde af H2O som en tomme.
- Bestemme kopi antallet af syntetiserede DENV 3' UTR RNA. 1 ng af DENV 3' UTR RNA (462 baser, figur 2) kan sammenlignes med 4.05 x 109 eksemplarer.
- Gemme RNA standard ved-80 ° C indtil brug.
3. behandling af Virus prøver for RT-qPCR
Bemærk: Trin 3.1-3.3 er udføres inde i en biologisk sikkerhed kabinet. Håndtering af cellekultur supernatant indeholdende en smitsom virus skal især foretages under biosikkerhed niveau 2 (eller højere) miljø.
- Mix 199 μL af en behandling buffer og 1 μL nukleasen-fri proteinase K.
- Seriefremstillede fortyndes den syntetiserede DENV 3' UTR RNA (fra trin 2.6) 1:10 for at opnå 5 x 109 til 5 x 103 kopier/μL af RNA standard ved hjælp af cell næringssubstratet (f.eks.DMEM, suppleret med 10% føtal bovint serum og antibiotika [DMEM/10% FBS]) indeholdende 40 enheder/mL RNase inhibitor.
- Mix 5 μl af cellekultur supernatant af DENV-inficerede celler og DENV 3' UTR RNA standard med 5 μl forarbejdning buffer/proteinase K løsning (fra trin 3.1) ved hjælp af 8-tube PCR strimler eller en 96-brønd PCR plade. Som en ikke-template control (NTC), mix 5 μl af cellekulturmedium (dvs.ingen virus er inkluderet) med 5 μL af bufferen/proteinase K procesløsning.
- Efter en kort centrifugering, inkuberes prøver i en thermocycler ved hjælp af følgende betingelser: 1 cyklus (på 25 ° C i 10 min og 75 ° C i 5 min).
Bemærk: Forarbejdede prøver kan opbevares ved 4 ° C, hvis real-time PCR analysen er udført på den samme dag. Til langtidsopbevaring, skal prøverne opbevares ved-80 ° C.
4. real-time PCR analyse
Bemærk: Det anbefales stærkt at udføre trin 4.1-4.4 inde i en ren hood at minimere forurening af amplikon-relaterede produkter eller RNase.
- Forberede en RT-qPCR master mix med en et-trins RT-PCR reagens (Table of Materials) i en 1,5 mL microcentrifuge tube (RNase-fri) ved hjælp af DENV 3' UTR-specifikke primere og en fluorogenic sonde (tabel 1). Vinduesdiameter hver komponent (tabel 4) Ifølge 11% mere af det samlede antal prøver, herunder de standard RNA og NTC reaktioner.
- Alikvot 8 μL af master mix i brønden skal anvendes i en 96-brønd real-time PCR plade (Tabel af materialer).
- Kort centrifugeres de forarbejdede prøver, herunder de DENV 3' UTR RNA standard og NTC (fra trin 3.4) og tilsæt 2 μl af prøverne til hver brønd i 96-brønd real-time PCR-pladen.
- Forsegle PCR-plade med optisk klar selvklæbende film.
- Kort centrifugeres plade 200 x g ved at fjerne luftbobler.
- Pladen anbringes i en real-time PCR instrument og cykle pladen ved hjælp af følgende betingelser: 1 cyklus af RT fase (25 ° C i 10 min.), 1 cyklus af polymerase aktivering fase (95 ° C i 2 min.), 40 cyklusser af stadiet forstærkning (95 ° C til 10 s og 60 ° C i 30 s [enkelt data erhvervelse på dette trin]).
- Bestemme kopi antallet af DENV RNA i prøver ved hjælp af en real-time PCR-associerede software.
- I vinduet Opsætning af tildele godt af en reaktion, der skal analyseres som Ukendt prøve.
- Tildele godt af de seriefremstillede fortyndet DENV 3' UTR RNA som Standard og skrive det forventede kopi antal RNA standard i hver brønd (f.eks.hvis 5 x 103 kopier/μL af RNA standard løsning bruges, skal du skrive 5.000). Tildele brønden som Negativ kontrol for NTC.
- I vinduet analyse skal du klikke på analyser og sørg for at korrelationskoefficient (R2) af standardkurven genereres er lig med eller større end 0,98.
- Generelt bruger standardindstillingerne for Ct (tærskel: auto, Oprindelig startdato cyklus: auto, baseline ende cyklus: auto) til analyse.
Bemærk: Kopier række ukendte prøver automatisk beregnes ud fra cyklus (Ct) værdierne af de individuelle reaktioner. Beregnede kopi antallet af hver prøve er betragtes som RNA kopier pr. 10 μL RT-qPCR reaktion (f.eks.hvis 12.345 er angivet i en Ukendt prøve, dette betyder at 12,345 kopier af DENV RNA er til stede i reaktion).
Representative Results
Kvantificering af DENV RNA af RT-qPCR analyse, en standard for kendte kopi nummer, som kan påvises ved den samme primer angivet, er en forudsætning. I denne protokol, 462 nukleotid-lange RNA indeholdende den 3 'UTR sekvensen af DENV-2 NGC stamme var i vitro transskriberet fra T7-RNA promotor-smeltet DENV-2 3' UTR DNA-skabelon, som havde været forstærkes ved PCR og renset (figur 2A og 2B). Når en seriel 10-fold fortynding af standard DENV RNA (fra 5 x 109 til 5 x 102 eksemplarer i en 10 μL RT-qPCR reaktion) blev udsat for et direkte RT-qPCR analyse ved hjælp af 3' UTR-specifikke primere og en fluorogenic sonde9, en lineær kurve med en god korrelationskoefficient (R2 = 0.98726) blev opnået (figur 2 c).
Næste, denne direkte RT-qPCR analyse blev anvendt til at kvantificere DENV i cellekultur supernatant af virus-inficerede celler. DENV-2 (Singapore isoleres EDEN2 329510), som var blevet formeret i C6/36 myg celler og titreres ved plaque analyse ved hjælp af BHK-21 celler11, var seriefremstillede fortyndet (fra 8 x 106 til 80 plaque dannelse enheder [PFU] /mL). DENV prøver blev derefter behandlet med et lige saa stort volumen af forarbejdning buffer indeholdende proteinase K for at deproteinize virioner og udsat for et direkte RT-qPCR assay målretning DENV 3' UTR RNA sekvens. Igen, en god korrelation (R2 = 0.99981) mellem DENV smitsomme titer og Ct, en cyklus antallet, der anses for at være det punkt, hvor den fluorescerende signal stiger med eksponentiel vækst over baggrunden, blev opnået (figur 3A). Når Ct værdier dannet fra en seriel fortynding af DENV lager med kendte smitsomme titers blev afbildet på standardkurven lavet med transskriberet in vitro- 3' UTR RNA, alle de parceller, der er indhentet fra 8 x 106 til 80 PFU/mL (svarende til 8 x 10,3 8 x 10-2 PFU i en 10 μL RT-qPCR reaktion) var inden for rækkevidde af dem udsættes for standard RNA (5 x 109 til 5 x 103 eksemplarer i en 10 μL RT-qPCR reaktion, figur 3B), der angiver, at DENV prøver med en bred vifte af smitsomme titers kan analyseres samtidig, ved hjælp af denne direkte RT-qPCR. I parallel eksperimenter, blev effekten af behandling buffer eller proteinase K behandling på påvisning af viralt RNA RT-qPCR analyse undersøgt. Selv om behandling af en log fortynding af DENV prøve (8 x 106 til 8 x 102 PFU/mL) med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) alene før RT-qPCR (1:1 fortynding af virus prøven med PBS) og en inkubation af 25 ° C i 10 min og 75 ° C i 5 min fremkaldte en regression kurve (figur 3 c, sort streg), og de gennemsnitlige Ct værdier opnået ved PBS behandling blev forsinket 2.6-3.2 cyklusser i forhold til Ct følger af forarbejdningen af buffer/proteinase K behandling (figur 3 c, stiplede linje). Derudover kunne den højeste fortynding af virus (8 x 102 PFU/mL [8 x 10-1 PFU pr. 10 μL RT-qPCR reaktion]) ikke registreres med denne PBS behandling (figur 3 c). I mangel af proteinase K under forarbejdning buffer behandling (figur 3 c, grå linje), blev en lignende regression genereret; men forsinkelsen forstærkning (0.1-0.8 cykler) konstateredes stadig i forhold til forarbejdning reaktion indeholdende proteinase K (figur 3 c, stiplede linje). Disse data tyder på, at blandt de betingelser, der er testet, behandling af DENV prøven med forarbejdning buffer sammen med proteinase K forbedrer følsomheden af RT-qPCR assay.
Direkte RT-qPCR analysen blev yderligere vurderet for dens anvendelighed til validering af antivirale midler mod DENV. Mycophenolic syre (MPA), en nonnucleoside hæmmer af inosine monophosphate dehydrogenase, der bruges som en immunsupprimerende i transplantation, er blevet rapporteret til at hæmme DENV in vitro-12,13. Selv om de tidligere undersøgelser ansat en konventionel plaque assay eller en flow flowcytometri assay til påvisning virale antigener for at demonstrere den hæmmende effekt af MPA på DENV infektion12,13, i nuværende undersøgelse, direkte RT-qPCR var anvendes til at vurdere de MPA antiviral aktivitet. HeLa celler, som havde været seedet med en tæthed på 5 x 104 celler/brønd i en 24-godt plade 1 dag før infektionen, blev udsat for DENV-2 på et MOI af 1 til 1 time og efter vask, kulturperler med DMEM/10% FBS i overværelse af 50-0.016 μg/mL MPA ( eller 0,1% dimethylsulfoxid [DMSO]). Kultur supernatanten blev indsamlet 3 dage efter infektion og udsat for direkte RT-qPCR analysen ved hjælp af DENV 3' UTR specifikke primere og en fluorescerende sonde. Figur 4 viser DENV RNA eksemplarer (pr. reaktion) i kultur analysere af inficerede celler behandles med stigende koncentrationer af MPA, der blev fastslået ved en in vitro- transskriberet 3' UTR RNA standard. Med en behandling på 50 μg/mL (156 μM) MPA, en reduktion til 99.87 ± 0,02% af DMSO-behandlede kontrol kultur blev observeret (figur 4). Vigtigere, IC50 (50% hæmmende koncentration) værdi for MPA bestemmes af de data, der er vist i figur 4 var 0,79 μM, der svarer til værdierne rapporteret tidligere12,13. Dette resultat angiver derfor, at denne direkte RT-qPCR assay er en nyttig og pålidelig metode til at vurdere den hæmmende effekt af antiviral agenter på DENV infektion.
Endelig blev anvendelser af direkte RT-qPCR analysen til andre RNA-virus testet. Når en bestand af gul feber virus (YFV) 17D vaccinestammer (Flaviviridae), som havde blevet forstærket i Vero celler og titreres på BHK-21 celler, blev udsat for direkte RT-qPCR ved hjælp af sonde YFV-17 D-specifikke primere og en fluorogenic14, som beskrevet i tabel 1, en standardkurve med god direkte sammenhæng mellem virus titers og Ct værdier kunne være genereret med en 10-fold seriel fortynding af virus stock (3.2 x 105 til 3,2 PFU/mL, figur 5A). Ligeledes direkte RT-qPCR analyse af Chikungunya-virus (CHIKV, Togaviridae) Ross stamme stock, som havde blevet forstærket i Vero celler og titreres på BHK-21 celler, ved hjælp af CHIKV-specifikke primere og en fluorogenic sonde15 (tabel 1), gav en god regression mellem smitsomme titers (4,4 x 108 til 4,4 x 103 PFU/mL) og Ct værdier (figur 5B). Dette var også tilfældet for påvisning af en seriel fortynding (8 x 102 til 8 x 10-2 PFU/mL, figur 5 c) af mæslingevirus (MeV, Paramyxoviridae), der er blevet opformeret og titreres med Vero celler, ved hjælp af tidligere rapporterede primere og en fluorogenic sonde16 (tabel 1). Disse data viser tilpasningsevne af direkte RT-qPCR analysen til kvantitativ påvisning af forskellige RNA-vira.
Figur 1: arbejdsproces af direkte RT-qPCR analysen. Cellekultur supernatant af DENV-inficerede celler er behandlet med en forarbejdning buffer indeholdende proteinase K for at frigive viral RNA (prøve-behandlingstrin). Forarbejdede prøven er derefter blandet med en et-trins RT-PCR reagens og udsat for real-time PCR analysen ved hjælp af DENV 3' UTR-specifikke primere og en fluorogenic sonde. Niveauer af viral RNA registreres i de respektive prøver kan bestemmes ved en seriefremstillede fortyndet standard ved hjælp af in vitro- transskriberet DENV RNA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: en standardkurve genereret af DENV 3' UTR RNA. (A) Standard RNA indeholdende 3' UTR af DENV-2 NGC var transskriberede i vitro fra en T7-RNA promotor sekvens-smeltet PCR fragment. (B) renset DENV 3' UTR RNA (250 ng) blev visualiseret på en 1%-agarosegel (højre vognbane). Den venstre vognbane viser molekylvægt markør for RNA elektroforese. (C) en log fortynding af DENV 3 'UTR RNA standard behandlet med forarbejdning bufferen indeholder proteinase K og underkastes en real-time PCR analyse ved hjælp af en et-trins RT-qPCR reagens og DENV 3' UTR-specifikke primere og en fluorogenic sonde sæt. Ct middelværdier (n = 3) fremstillet i respektive fortyndinger blev sat ind mod den anslåede mængde af 3' UTR RNA (5 x 109 til 5 x 102 RNA kopierer i en 10 μL RT-qPCR reaktion). R2 er korrelationskoefficienten. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: kvantificering af DENV RNA i virus bestand af direkte RT-qPCR. (A) high-titer DENV-2 lager produceret i C6/36 celler var seriefremstillede fortyndet 10-fold (8 x 106 til 8 x 101 PFU/mL) med DMEM/10% FBS indeholdende en RNase hæmmer og udsat for direkte RT-qPCR analysen ved hjælp af DENV 3' UTR-specifikke primere /Probe. (B) Ct-værdier opnået ved RT-qPCR log-fortyndet DENV materiel (cirkler) blev afbildet på en standardkurve af 3' UTR RNA (trekanter) transskriberet in vitro-. Brug af 8 x 106 PFU/mL bestand i en direkte RT-qPCR assay svarer til 8 x 103 PFU virus i en 10 μL RT-qPCR reaktion. (C) dette panel viser effekten af behandling buffer og proteinase K behandlinger på påvisning af viralt RNA. DENV fortyndet stock (8 x 106 til 8 x 102 PFU/mL) var inkuberes med et lige saa stort volumen af forarbejdning buffer indeholdende proteinase K (hvide cirkler), forarbejdning buffer alene (grå cirkler) eller PBS (sorte cirkler) og derefter udsat for direkte RT-qPCR assay. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: evaluering af den hæmmende effekt af MPA ved direkte RT-qPCR. HeLa celler blev inficeret med DENV-2 på et MOI 1 og kulturperler i stigende koncentrationer af MPA, en tidligere rapporteret hæmmer af DENV (eller 0,1% DMSO). Tre dage efter infektion, blev kultur analysere af de inficerede celler indsamlet og udsat for direkte RT-qPCR analysen ved hjælp af DENV 3' UTR-specifikke primere/sonde. Kopi nummer af viral RNA blev bestemt ved DENV 3' UTR RNA standard transskriberede in vitro. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: anvendelse af direkte RT-qPCR til påvisning af andre RNA-vira. Seriefremstillede fortyndet virus bestande af (A) YFV, (B) CHIKV og (C) MeV blev udsat for direkte RT-qPCR analysen ved hjælp af PCR primere og fluorogenic sonder specifikke til deres respektive viral RNA sekvenser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Formål | Navn | Rækkefølge (5' - 3') | Bemærk |
| T7 promotor-smeltet DENV-2 3'UTR cDNA forstærkning | T7-DENV 3' UTR Fwd | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGc gaa tTA GAA GGC AAA ACT AAC ATG AAA | Kursiv, T7 promotor; små bogstaver, spacer; fed, DENV-2 NGC nukleotider 10,270-10,292 |
| DENV 3' UTR Rvs | AGA ACC TGT TGA TTC AAC AGC | DENV-2 NGC nukleotider 10,723-10,703 | |
| RT-qPCR analyse af DENV | DENV-2 3' UTR F | AAG GAC TAG AGG TTA GAG GAG ACC C | Reference 9 |
| DENV-2 3' UTR RASMUSSEN | GGC GTT CTG TGC CTG GAA TGA TG | ||
| Sonden 2 Den-2-4 | 6FAM-AAC AGC ATA TTG ACG CTG GGA AAG ACC-TAMRA | ||
| RT-qPCR analyse af YFV | YFV NS5 F | GAA CAG TGA TCA GGA ACC CTC TCT | Reference 14 |
| YFV NS5 RASMUSSEN | GGA TGT TTG GTT CAC AGT AAA TGT G | ||
| YFV NS5 sonde | 6FAM-CTA KBRT GTC TGG AGC CCG CAG CAA T-TAMRA | ||
| RT-qPCR analyse af CHIKV | CHIK E1 F | TCG ACG CGC FTT CTT TAA | Reference 15 |
| CHIK E1 RASMUSSEN | ATC GAA TGC ACC GCA CAC T | ||
| CHIK E1 PEDERSEN | 6FAM-ACC AGC CTG CAC CCA TTC CTC AGA C-TAMRA | ||
| RT-qPCR analyse af MeV | MeV N F | TGG KAT CTG AAC TCG GTA TCA C | Reference 16 |
| MeV N R | TGT FTT CAG TAG TAT GCA TTG CAA | ||
| MeV N P | 6FAM-CCG AGG ATG CAA GGC TTG TTT CAG A-TAMRA |
Tabel 1: Oligonukleotid primer og fluorogenic sonde sekvenser anvendes i denne undersøgelse.
| Komponenter | Stock koncentration | Volumen (μL) | Endelig koncentration |
| PrimeSTAR Max Premix | 2 x | 25 | 1 x |
| T7-DENV 3' UTR Fwd | 1 ΜM | 10 | 200 nM |
| DENV 3' UTR Rvs | 1 ΜM | 10 | 200 nM |
| pEU/DENV 3' UTR | 1 ng/μl | 1 | 20 pg/μL |
| Nukleasen-fri H2O | 4 | ||
| I alt | 50 |
Tabel 2: Komponenter af en PCR mix for udarbejdelsen af DENV 3' UTR skabelon DNA.
| Komponenter | Stock koncentration | Volumen (μL) | Endelig koncentration |
| T7 sekvens-smeltet DENV 3' UTR DNA-skabelon | (variabel) | x | 100 ng per reaktion |
| ATP løsning | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| CTP løsning | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| GTP løsning | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| UTP løsning | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| Reaktion Buffer | 10 x | 2 | 1 x |
| T7 Enzym Mix | 2 | ||
| Rekombinant RNase hæmmer | 40 enheder/μL | 1 | 2 enheder/μL |
| Nukleasen-fri H2O | 7 - x | ||
| I alt | 20 |
Tabel 3: Komponenter af en IVT mix for syntese DENV 3' UTR RNA standard.
| Komponenter | Stock koncentration | Volumen (μL) | Endelige koncentration i en RT-qPCR reaktion |
| iTaq universal sonder mastermix | 2 x | 5,00 | 1 x |
| iScript avanceret reverse transkriptase | 40 x | 0,25 | 100 ng per reaktion |
| Primer/sonden mix | DENV-2 3' UTR F: 3 ΜM | 1,00 | 300 nM |
| DENV-2 3' UTR R: 3 ΜM | 300 nM | ||
| Sonden 2 Den-2-4: 2 μM | 200 nM | ||
| Nukleasen-fri H2O | 1,75 | ||
| Subtotal | 8.00 |
Tabel 4: komponenter af en master mix for real-time RT-qPCR analyse af DENV RNA. Bemærk, at 2 μl af den forarbejdede DENV prøve (eller standard RNA) skal tilføjes til 8-μL master mix (ialt 10 μL per reaktion).
Discussion
I dag, viral nukleinsyre påvisning af fluorescerende-baseret real-time PCR er ved at blive en guld standard for den molekylære diagnose af patogene menneskelige vira, på grund af dens følsomhed og hurtighed,7. Dette er især vigtigt for bekræfter virusinfektion i den tidlige fase af akut smitsomme sygdomme som denguefeber17. Også, i feltet i DNEV grundforskning, RT-qPCR assay er et uundværligt redskab til overvågning virus replikering i in vitro- kultur, som vil føre til en forståelse af replikering af DENV biologi og opdagelsen af antivirale hæmmere. I denne undersøgelse, blev den fluorescerende-baseret real-time PCR assay yderligere udviklet af en kombination af en behandling buffer og en et-trins RT-PCR reagens så at DENV RNA i cellekultur supernatant af inficerede celler kunne kvantificeres ved RT-qPCR uden rensning viral RNA genom. Sammenlignet med rutinemæssig assays til at opdage virus replikation, som plaque assay, ELISA eller konventionelle RT-qPCR ansætte RNA oprensning6,7, en forenklet protokol af RT-qPCR analysen resulterede i en stor reduktion af tid og nødvendige skridt til at kvantificere DENV RNA. Dette er også et vigtigt element, som har fordele i at minimere kontaminering og tab af genetisk materiale. Dog skal det bemærkes, at brugen af en ren hætte er afgørende i opsætning af IVT (trin 2.1) og RT-qPCR (trin 4.1-4.4) reaktioner til at undgå krydskontaminering af amplikon-relaterede produkter eller RNase. Det er også afgørende at håndtere kultur supernatanten, herunder smitsomme virus inde en biosikkerhed kabinet (trin 3.3) at reducere laboratorium smittefare.
En anden betydning af direkte RT-qPCR analysen er, at en bred vifte af viral RNA kopier kan analyseres på samme tid uden fortynding eller koncentration af prøven. Når en seriefremstillede fortyndet DENV-3' UTR RNA standard blev brugt, direkte RT-qPCR protokollen produceret en lineær standardkurven over syv størrelsesordener, og den lavere kvantificeringsgrænse var 500 RNA eksemplarer (figur 2). Til påvisning af DENV i cellekultur supernatant af inficerede celler, 8 x 10,3 til 8 x 10-2 PFU vira i en 10 μL RT-qPCR var inden for rækkevidde af DENV 3' UTR RNA standard og lavere detektionsgrænse (8 x 10-2 PFU) blev beregnet til at indeholde 11 , 400 ± 7,077 RNA kopier (figur 3B). Af note, som rapporteret i flere flavivirus undersøgelser18,19,20, blev større forholdet mellem viral RNA kopier til virus smitsom titer (dvs., PFU) i DENV prøver også observeret i denne undersøgelse. Denne overvurdering antages for at være i vid udstrækning på grund af tilstedeværelsen af defekte (dvs.ikke-infektiøse) virus eller gratis viral RNA frigives fra inficerede og døde celler. Selv om forholdet mellem RNA kopier: PFU fås i denne undersøgelse (1,1 x 105 til 1,3 x 105 RNA kopier/PFU) var i strid med de data, der vises tidligere (nøgletal spænder fra 1 til 3 log)21,20, kan dette være tilskrives forskellen i virusstammer, celler eller kultur betingelser ansat. En anden sandsynlig forklaring på forskellen er, at da ingen RNA oprensning proces var involveret i den direkte RT-qPCR assay beskrevet heri, mere DENV RNA i cellekultur supernatant kunne påvises af real-time PCR analyse uden tab af viral genetiske materiale.
Enkelheden i den direkte RT-qPCR øger evnen til at håndtere et stort antal prøver i multi godt formater, såsom en 96-brønd plade. Derfor, denne ejendom vil bistå den fremtidige anvendelse af direkte RT-qPCR analysen til en høj overførselshastighed screening undersøgelse for opdagelsen af anti-DENV medicin. Faktisk i denne betænkning, anvendelse af direkte RT-qPCR analysen for validering af en anti-DENV hæmmer, MPA, blev undersøgt, og resultatet viste, at en50 værdien af MPA fremstillet ved direkte RT-qPCR analysen (figur 4) sammenlignes rapporteret i tidligere undersøgelser ved hjælp af plaque assay12,13. Dette viser at direkte RT-qPCR er en nyttig analyse for korrekt evaluering af de hæmmende effekt af antiviral agenter og kan vedtages i et stof screening undersøgelse i fremtiden.
I denne undersøgelse, blev der gjort forsøg på at anvende den direkte RT-qPCR til påvisning af andre RNA-vira. Som vist i figur 5, når 10-fold fortyndinger af tre andre RNA-vira (YFV, CHIKV og MeV) inddeles i forskellige slægter (Flaviviridae, Togaviridaeog Paramyxoviridae, henholdsvis) blev undersøgt ved hjælp af tidligere sonder rapporteret primere og fluorogenic specifikke for de respektive viral RNA sekvenser. God korrelationer mellem smitsomme titers og Ct værdier blev fremstillet ved direkte RT-qPCR assays, og sammenhænge var 4-6 lineære størrelsesordener. Dette tyder på, at den direkte RT-qPCR protokol er kan tilpasses til forskellige typer af RNA-vira ved blot at ændre virus-specifikke primere og fluorogenic sonder.
Ikke desto mindre følsomheden af påvisning varieret blandt virus testet i denne undersøgelse (figur 5). En ændring af den protokol, der kan forbedre påvisningen af target virus RNA bør være at bruge et nyt sæt af primer/sonden sekvenser. Desuden, menes et vigtigt skridt for den vellykkede direkte RT-qPCR assay at være effektiv udgivelsen af det virale genom under prøven behandling trin (trin 3.1 – 3.4). Det ville være af særlig betydning for kvantitativ påvisning af stabil vira som en ikke-kappebærende virus. Selvom som en indledende eksperiment, Coxsackievirus B3 (CVB3), en ikke-kappebærende RNA-virus, der hører til Picornaviridae, blev udsat for direkte RT-qPCR analysen bruge tidligere beskrevet CVB3-specifikke primere og fluorescerende sonde22, en positive amplikon signal kunne ikke blive opdaget selv med en høj titer (1 x 105 PFU/mL) virus bestand. Dette betragtes i vid udstrækning kan tilskrives ikke-kappebærende virus høje fysiske integritet. Hidtil har nogle RT-PCR assays, der ikke kræver rensning af nukleinsyre er blevet udviklet for at opdage flere RNA-vira, som bruger forskellige protokoller i RNA frigivelse trin23,24,25, 26. således, brugen af de alternative (eller yderligere) behandlinger, såsom en inkubation af en virus prøve ved en høj temperatur, potentielt øger følsomheden af påvisning.
I sammendrag var den direkte RT-qPCR protokol udviklet i denne undersøgelse en enkel og hurtig, men pålidelige metode til kvantificering af viral RNA i cellekultur supernatant af inficerede celler. På grund af denne enkelhed, kunne direkte RT-qPCR analysen behandle en række prøver på kort tid, som besidder løfte til høj overførselshastighed analyse af virus replikering. Desuden blev direkte RT-qPCR protokollens anvendelse til andre RNA-vira også demonstreret. Denne tilgang bør derfor være et nyttigt værktøj til effektiv overvågning af RNA-virusinfektioner i forskning laboratorium omgivelser og eventuelt i kliniske diagnoser.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke Subhash G. hans (hertug-NUS Graduate Medical School, Singapore) til DENV-2 isolere EDEN2 3295 og Shunro Imura (Kobe karantæne Station, Japan) i YFV 17D vaccinestammer. Forfatterne er også taknemmelig for, at medlemmerne af Institut for Mikrobiologi og bekæmpelse af infektioner for deres bistand. Dette arbejde støttes af MEXT KAKENHI Grant nummer JP16737900.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PrimeSTAR Max DNA Polymerase | Takara Bio. Inc | R045A | Comparable PCR reagent kit can be used. |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
| 6x Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7024S | Comparable gel loading dye can be used. |
| 2-Log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200 | 0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used. |
| Gel Scene Tablet | Astec | GST-33 | Comparable gel imaging system can be used. |
| illustra GFX PCR Purification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9034-70 | Comparable gel extraction kit can be used. |
| BioSpectrometer | Eppendorf | 6135000905 | Comparable spectrophotometer can be used. |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | |
| TURBO DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit. |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio. Inc | 2313A | 40 units/μL |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Comparable RNA purification kit can be used. |
| CellAmp Direct RNA Prep Kit | Takara Bio. Inc | 3733Q | |
| Proteinase K | Nacalai Tesque | 15679-06 | >600 units/mL. Comparable reagent can be used. |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad | 1725141 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube. |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | StepOnePlus-01 | Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
References
- Pastorino, B., Nougairede, A., Wurtz, N., Gould, E., de Lamballerie, X. Role of host cell factors in flavivirus infection: Implications for pathogenesis and development of antiviral drugs. Antiviral Research. 87 (3), 281-294 (2010).
- Fauci, A. S., Morens, D. M. Zika Virus in the Americas--Yet Another Arbovirus Threat. New England Journal of Medicine. 374 (7), 601-604 (2016).
- Wen, Z., Song, H., Ming, G. L. How does Zika virus cause microcephaly? Genes and Development. 31 (9), 849-861 (2017).
- Guzman, M. G., Harris, E. Dengue. Lancet. 385 (9966), 453-465 (2015).
- Low, J. G., Ooi, E. E., Vasudevan, S. G. Current Status of Dengue Therapeutics Research and Development. Journal of Infectious Diseases. 215 (suppl_2), S96-S102 (2017).
- Sukhavachana, P., Nisalak, A., Halstead, S. B. Tissue culture techniques for the study of dengue viruses. Bulletin of the World Health Organization. 35 (1), 65-66 (1966).
- Tang, K. F., Ooi, E. E. Diagnosis of dengue: an update. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 10 (8), 895-907 (2012).
- Suzuki, Y., et al. Characterization of RyDEN (C19orf66) as an Interferon-Stimulated Cellular Inhibitor against Dengue Virus Replication. PLoS Pathogens. 12 (1), e1005357 (2016).
- Callahan, J. D., et al. Development and evaluation of serotype- and group-specific fluorogenic reverse transcriptase PCR (TaqMan) assays for dengue virus. Journal of Clinical Microbiology. 39 (11), 4119-4124 (2001).
- Low, J. G., et al. Early Dengue infection and outcome study (EDEN) - study design and preliminary findings. Annals of the Academy of Medicine, Singapore. 35 (11), 783-789 (2006).
- Hishiki, T., et al. Interferon-mediated ISG15 conjugation restricts dengue virus 2 replication. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 95-100 (2014).
- Diamond, M. S., Zachariah, M., Harris, E. Mycophenolic acid inhibits dengue virus infection by preventing replication of viral RNA. Virology. 304 (2), 211-221 (2002).
- Takhampunya, R., Ubol, S., Houng, H. S., Cameron, C. E., Padmanabhan, R. Inhibition of dengue virus replication by mycophenolic acid and ribavirin. Journal of General Virology. 87 (Pt 7), 1947-1952 (2006).
- Akondy, R. S., et al. Initial viral load determines the magnitude of the human CD8 T cell response to yellow fever vaccination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 3050-3055 (2015).
- Edwards, C. J., et al. Molecular diagnosis and analysis of Chikungunya virus. Journal of Clinical Virology. 39 (4), 271-275 (2007).
- Hummel, K. B., Lowe, L., Bellini, W. J., Rota, P. A. Development of quantitative gene-specific real-time RT-PCR assays for the detection of measles virus in clinical specimens. Journal of Virological Methods. 132 (1-2), 166-173 (2006).
- Peeling, R. W., et al. Evaluation of diagnostic tests: dengue. Nature Reviews: Microbiology. 8 (12 Suppl), S30-S38 (2010).
- Bae, H. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
- Colton, L., Biggerstaff, B. J., Johnson, A., Nasci, R. S. Quantification of West Nile virus in vector mosquito saliva. Journal of the American Mosquito Control Association. 21 (1), 49-53 (2005).
- Richardson, J., Molina-Cruz, A., Salazar, M. I., Black, W. 4th Quantitative analysis of dengue-2 virus RNA during the extrinsic incubation period in individual Aedes aegypti. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 74 (1), 132-141 (2006).
- Wang, W. K., et al. Detection of dengue virus replication in peripheral blood mononuclear cells from dengue virus type 2-infected patients by a reverse transcription-real-time PCR assay. Journal of Clinical Microbiology. 40 (12), 4472-4478 (2002).
- Gnadig, N. F., et al. Coxsackievirus B3 mutator strains are attenuated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), E2294-E2303 (2012).
- Rudenko, N., Golovchenko, M., Cihlarova, V., Grubhoffer, L. Tick-borne encephalitis virus-specific RT-PCR--a rapid test for detection of the pathogen without viral RNA purification. Acta Virologica. 48 (3), 167-171 (2004).
- Pastorino, B., et al. Development of a TaqMan RT-PCR assay without RNA extraction step for the detection and quantification of African Chikungunya viruses. Journal of Virological Methods. 124 (1-2), 65-71 (2005).
- Nishimura, N., et al. Detection of noroviruses in fecal specimens by direct RT-PCR without RNA purification. Journal of Virological Methods. 163 (2), 282-286 (2010).
- Kang, K., et al. A direct real-time polymerase chain reaction assay for rapid high-throughput detection of highly pathogenic North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China without RNA purification. Journal of Animal Science and Biotechnology. 5 (1), 45 (2014).
