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Neuroscience

대규모 병렬 단일 핵 RNA 시퀀싱에 대 한 성인 척수 핵의 절연

doi: 10.3791/58413 Published: October 12, 2018

ERRATUM NOTICE

Summary

여기, 선물이 빠르게 다운스트림 대규모 병렬 RNA 시퀀싱 신선 또는 냉동 조직에서 높은-품질 핵을 분리 하는 프로토콜. 우리는 세제-기계 및 소형 기계 조직 장애 및 셀 세포 옵션을 둘 다 핵의 격리에 대 한 사용할 수 있습니다를 포함 합니다.

Abstract

개별 셀의 유전자 발현 프로 빙 셀 유형과 셀 상태 식별 수 있습니다. 단일 셀 RNA 시퀀싱 transcriptional 프로필 셀, 특히 중추 신 경계와 같은 다른 유형의 조직에서에서의 공부에 대 한 강력한 도구로 떠오르고 있다. 그러나, 분리 방법 단일 셀 시퀀싱에 필요한 실험 변경 유전자 표현과 세포 죽음에 발생할 수 있습니다. 또한, 이러한 방법을 따라서 보관에 대 한 연구 및 바이오-은행 소재를 제한 하는 신선한 조직에 일반적으로 제한 됩니다. 단일 핵 RNA 시퀀싱 (snRNA-Seq)는 그것은 정확 하 게 세포 유형 식별, 냉동 또는 해리, 어려운 조직의 연구 주어진 transcriptional 연구에 대 한 매력적인 대안 이다 분리 유발 감소 전사입니다. 여기, 선물이 다운스트림 snRNA-이 대 한 핵의 신속한 격리에 대 한 높은 처리 프로토콜 이 메서드는 신선 또는 냉동 척수 샘플에서 핵의 분리를 가능 하 게 하 고 두 대규모 병렬 드롭릿 캡슐화 플랫폼 결합 될 수 있다.

Introduction

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신 경계는 다양 한 형태학, 생화학, 및 electrophysiological 속성을 표시 하는 셀의 이기종 그룹의 구성 됩니다. 대량 RNA 시퀀싱은 다른 조건 하에서 유전자 발현에서 조직 전체의 변화를 결정 하는 데 유용한 동안, 단일 세포 수준에서 transcriptional 변화의 감지를 걸로 하겠습니다. 단일 셀 transcriptional 분석의 최근 발전 기능적인 그룹 분자 그들의 레 퍼 토리를 기반으로 이기종 세포의 분류를 가능 하 게 하 고 했다 최근에 활성화 된 뉴런의 집합을 검색 하는 데도 수 있습니다. 1 , 2 , 3 , 4 지난 10 년 동안, 단일 셀 RNA 시퀀싱 (scRNA-Seq)의 개발은 개별 셀, 셀 형 다양성으로 볼의 유전자 발현의 연구 활성화. 5

대규모 병렬 scRNA-Seq, 같은 확장 가능한 접근의 출현 순서 이질적인 조직, 중앙 신경 시스템의 많은 영역을 포함 한 플랫폼을 제공 하고있다. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 그러나 15 , 단일 세포 분리 방법 세포 죽음 뿐만 아니라 유전자 발현 실험 변경 발생할 수 있습니다. 16 최근 작품 내 생 transcriptional 프로필의 보존 수 있도록 단일 셀 시퀀싱 방법 적응 했다. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 이러한 전략 즉시 이른 유전자 (IEG) 식 다음 감각 자극 또는 동작을 감지 하는 데 특히 적합 했습니다. 3 , 4 미래에,이 전략 또한 사용 될 수 조직 질병 상태 또는 스트레스에 대 한 응답에서 동적인 변화를 공부 하. 이러한 메서드의 단일 핵 RNA 시퀀싱 (snRNA-Seq) 스트레스 유도 세포 분리를 포함 하지 않는 및 (척수), 같은 조직 분리 하기 어려운 뿐만 아니라 냉동에 사용할 수 있습니다 유망 접근은 조직. 4 , 17 , 18 , 19 이전 핵 격리 방법에서 적응,20,,2122,23,25 snRNA-Seq 일반적으로 활용 하 여 신속한 조직 장애 및 셀 차가운 조건, 원심 분리, 및 세포에서 핵의 분리에서 세포. 4 핵 여러 미세 물방울 캡슐화 플랫폼에서 다운스트림 차세대 시퀀싱에 대 한 격리 수 있습니다. 4 , 7 , 24 , 25 이 메서드는 시간에 순간에 세포의 수천의 transcriptional 활동 현황에 대 한 수 있습니다.

절연 및 시퀀싱, 각각 그들의 자신의 이점 및 불리 하기 전에 세포에서 핵을 방출 하기 위한 여러 전략을 확인 하 고 있습니다. 여기, 우리가 설명 및 다운스트림 대규모 병렬 snRNA-Seq에 대 한 성인 척수에서 핵의 격리 수 있도록 두 개의 프로토콜 비교: 세제 기계 세포 및 소형 기계 세포. 세제-기계 세포 완전 한 조직 장애 및 핵의 높은 최종 수익률을 제공합니다. 소형 기계-세포 조직 장애, 수량 및 최종 핵 수확량의 순도 사이의 균형을 선택 하기 위한 기회를 제공의 제어도 포함 되어 있습니다. 이러한 접근 비교 RNA 수확량, 핵, 그리고 셀 형 프로 파일링 당 유전자의 감지 된 숫자를 제공 하 고 또한 둘 다에 사용할 수 있습니다 성공적으로 snRNA-이

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Protocol

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모든 동물 일 신경 성 질환의 국가 학회 및 치기 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 수행 되었다. 샘플은 남성과 여성의 ICR/CD-1 야생-타입 마우스, 8 사이 균형 그리고 12 주 오래 된, 모든 실험을 위해 사용 되었다. 마우스 로컬 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 따라 처리 되어야 합니다.

1입니다. 준비 재료 및 버퍼의

  1. 모든 버퍼 사용의 날을 준비 하 고 미리 얼음에 진정 ( 표 1참조).
    1. 세제-기계 세포를 사용 하 여 세제 세포의 용 해 버퍼 (샘플 당 > 500 μ), 낮은 자당 버퍼 (> 6 mL 샘플 당), 자당 밀도 버퍼 (> 견본 당 12.5 mL), 및 물의 resuspension 솔루션 (> 1 mL)을 준비.
    2. 소형 기계 세포를 사용 하는 경우 준비 침투성 세포의 용 해 버퍼 (> 5 mL 샘플 당), 히 매체 (> 5 mL 샘플 당), 낮은 자당 버퍼 (> 3 mL 샘플 당), 자당 밀도 버퍼 (> 견본 당 12.5 mL), 및 물의 resuspension 솔루션 (> 1 mL).
    3. 그냥 프로토콜을 시작 하기 전에 dithiothreitol (DTT)의 25 μ 자당 밀도 그라데이션 버퍼의 25 ml DTT의 또 다른 25 μ 낮은 자당 버퍼의 25 mL를 추가 합니다.
  2. 종이 타 올 또는 단일 핵을 캡처하는 데 사용 되는 미세 채널을 방해할 수 있습니다 벤치 프로텍터에서 섬유 샘플의 오염을 최소화 하기 위해 알루미늄 호 일 해 표면 커버.
  3. 스프레이 해 도구 및 벤치 공간 RNase 오염 솔루션. 또한, RNase 오염 솔루션 Dounce 균질 화기 튜브 (세제 기계 세포 세포의 용 해를 사용 하 여) 하는 경우와 오크 리 지 튜브의 내부를 스프레이. Dounce 및 오크 리 지 튜브 초순, RNase 무료 물으로 씻어.
  4. 미리 모든 컬렉션 튜브 (50 mL 원뿔, 오크 릿지)과 Dounce 균질 화기 튜브 얼음에 침착 해.
  5. 화재 폴란드어 파스퇴르 펫의 시리즈 (소형 기계 세포 세포의 용 해를 사용 하 여) 하는 경우.

2입니다. 척수의 준비

  1. 신선한 조직에 사용 하 여, CO2 흡입에 의해 마우스를 안락사. 안락사를 다음 샘플에서 머리 오염을 최소화 하기 위해 70% 에탄올과 마우스의 코트 스프레이.
  2. 날카로운 RNase 무료 수술가 위 마우스를 목을 벨. 다음, 부드럽게 복 부 리프팅 집게와 피부와 내부 장기를 노출 하는 신체의 길이 따라 절 개.
  3. 집게를 사용 하 여 신체 구멍에서 내부 장기를 당겨서 마우스 내장을 들어낸. 영역을 청소 하거나이 오염 물질을 소개 수 있습니다 장기 제거 종이 타 올을 사용 하지 마십시오. L2 및 L3 척추 척추 사이의 척추 열을 잘라가 위를 사용 하 여.
    참고: 연습,이 단계는 30 초 미만에서 얻을 수 있습니다.
    1. 척수를 추출 하려면 3 mL 주사기 25 G ¼ 인치 바늘으로 얼음 처럼 차가운 PBS를 포함 적합. 척추 칼럼의 성 례의 끝에 바늘의 끝을 놓습니다. 손가락 두 개를 사용 하 여 바늘의 팁 주위 단단한 물개를 만들고 rostrally 척수를 추출 하는 플런저에 눌러 척추를 꼬집어. 얼음 처럼 차가운 PBS와 페 트리 접시에 척수를 놓습니다.
    2. 이 시점에서 조직 동결-80 ° C에서 저장 하거나 세제-기계 (3 단계) 또는 소형 기계 (4 단계) 세포에 대 한 즉시 사용.
  4. 냉동된 조직를 사용 하 여 드라이 아이스에 조직 유지, 세제-기계 (3 단계) 또는 소형 기계 (4 단계) 세포를 진행 합니다.

3. 세제-기계 세포 세포의 용 해

  1. 미리 냉장된 Dounce 균질 화기에서 요 추 척수를 놓고 500 mL 미리 냉장 세제 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다.
    참고: 마우스 요 추 척수는 뜻의 325.5 mg ± 63.9 mg 표준 오차 (SEM, N = 4). 50 mg-1.5 g 조직의 성공적으로 사용할 수 있습니다.
  2. 5 선 유 봉 ('느슨한' 유 봉)의 다음 5-10 스트로크 유 봉 B의 ('꽉' 유 봉) Dounce. 뇌졸중 사이 세포 솔루션에서 균질 화기 해제 방지 하 고 거품을 소개 하지 마십시오.
  3. 미리 냉장된 50 mL 원뿔 튜브와 낮은 자당 버퍼의 1 mL와 함께 prewet 40 m m 여과기를 놓습니다.
  4. 세포의 용 해 버퍼에서 원유 핵을 포함 하는 Dounce 균질 화기에 낮은 자당 버퍼의 1 mL을 추가 하 고 2-3 번 pipetting으로 부드럽게 혼합.
  5. 미리 냉장된 50 mL 원뿔 튜브에 40 m m 스 트레이너를 통해 원유 핵 준비를 전달 합니다.
  6. 3 mL 낮은 자당 버퍼 및 세포의 용 해 버퍼의 500 mL를 최종 볼륨을 데리고 40 m m 스 트레이너를 통해 추가로 1 mL 낮은 자당 버퍼를 전달 합니다.
  7. 풀링 같은 원뿔 튜브에 여러 코드를 결합 하는 경우 3.1-3.6 단계를 반복 합니다.
  8. 4 ° c.에서 10 분 동안 3200 x g에서 샘플을 원심 원심 분리는 완료 되 면는 상쾌한을 가만히 따르다. 5 단계로 진행 합니다.

4. 소형 기계 세포 세포의 용 해

  1. 조직 문화 접시에 침투성 세포의 용 해 버퍼의 5 mL에 요 추 척수를 놓습니다. 척수, 이등분 다음 봄이 위를 사용 하 여 코드 3-4 m m 조각으로 잘라 봄이 위의 무뚝뚝한 끝을 사용 하지만 말하다 하지 마십시오.
    참고: 조직의 50mg-1.5 g 수 성공적으로 사용.
  2. 소용돌이 치는 2-3 시간 15 분 동안 얼음에 품 어.
  3. 침투성 세포의 용 해 버퍼 희석 히 매체의 5 mL를 추가 합니다.
  4. 10 시간 5 mL 혈 청 학적인 피 펫, 또는 직물의 조각을 모두는 피 펫의 개방을 통해 원활 하 게 이동 될 때까지 조직 triturate
  5. 3 화재 광택 파스퇴르 펫 점차적으로 좁은 직경의 시리즈와 triturate (~ 900-600 m m).
    1. 각 피 펫에 대 한 triturate, 5-15 시간 허용 정착, 상쾌한 천연된 핵 포함의 1-2 mL을 제거 하 고 미리 냉장된 50 mL 원뿔 튜브 40 m m 스 트레이너를 통해 전달 하는 조직.
    2. 작은 크기의 파스퇴르 피 펫으로 분쇄, 후에 homogenate 피 펫 팁을 통해 원활 하 게 흐르는 확인 하십시오. 50 mL 원뿔 튜브에 40 m m 스 트레이너를 통해 나머지 솔루션을 전달 합니다.
      주: triturations의 총 수를 조정할 수 있습니다 원하는대로. 마우스 척수의 meninges, 유지 되지만 척수의 모든 보이는 덩어리를 triturate 하는 것이 중요 하다. 40 m 스 트레이너를 통해 나머지 homogenate를 전달 합니다. 분쇄 하는 동안 거품을 소개 하지 마십시오.
  6. 4 ° c.에서 10 분 1000 x g에서 필터링 된 샘플을 원심 원심 분리는 완료 되 면 가만히 따르다 고는 상쾌한 삭제. 5 단계로 진행 합니다.

5. 균질 및 자당 밀도 그라데이션

  1. 3 단계 또는 4 후 낮은 자당 버퍼의 3 mL를 사용 하 여 펠 릿 resuspend. 부드럽게 펠 릿은 물의 resuspension 촉진 하기 위하여 벽에서 제거 하는 소용돌이 친다. 2 분 동안 얼음에 앉아서는 오크 리 지 튜브에 정지를 전송 샘플을 보자.
  2. 균질 화기를 사용 하 여 15-30 s, 유지 하는 얼음에 샘플에 대 한 낮은 자당 버퍼에 핵을 균질 1 설정.
    참고: 사용 15 s 한 요 추 척수 또는 30을 사용 하는 경우 사용 하는 경우 s 풀링된 샘플 또는 전체 척수.
  3. 혈 청 학적인 피 펫, 레이어 밀도 레이어를 방해 하는 거품을 만드는 것이 아니라 돌 낮은 자당 버퍼 homogenate 아래 밀도 자당 버퍼의 12.5 mL를 사용 하 여.
  4. 3200 x g 4 ° c.에 20 분에 관을 원심
  5. 원심 분리는 완료 되 면 즉시 터치 모션에 상쾌한을 가만히 따르다.
    참고: 낮은 볼륨 및 최종 샘플 청소기를 원하는 경우 삭제 될 수 있습니다 자당 버퍼의 잔여 볼륨 (400 mL 미만)만이 잔여 핵을 포함 하는 볼륨과 핵 수확량을 최대화 하기 위해 보존 될 수 있습니다.
  6. 100 mL-1 mL의 물의 resuspension 솔루션을 사용 하 여 벽에 남은 핵 resuspend. 수 초 '싫은' 세제 기반 준비 남아 하지 마십시오.
  7. 30-35 m m 기 공 크기 스 트레이너를 통해 핵을 필터링 하 고 미리 냉장된 튜브에 수집 합니다.
  8. 핵 핵 10 X 목표 아래 계산 하는 hemocytometer를 사용 하 여 항복을 결정 합니다.
    참고: Trypan 블루 핵, 파란색 표시는 시각화를 추가할 수 있습니다. 세포질 파편의 양을 note합니다
  9. 단계 6 또는 7로 이동 합니다.

6. 대규모 병렬 snRNA 시퀀싱: 학술 플랫폼7

  1. (예를 들어, 드롭-Seq) 대규모 병렬 snRNA 시퀀싱을 수행 방법은 앞에서 설명한 다음 수정7 :4
    1. ML 당 225 핵의 최종 농도에 핵을 조정 합니다.
    2. ML 당 250 구슬의 농도에 바코드 비즈를 준비 합니다.
    3. 0.7 %sarkosyl 세포의 용 해 버퍼를 준비 합니다.
    4. 구슬, 핵를 위한 분 당 35 mL 및 석유에 대 한 분 당 200 mL에 대 한 분 당 35 ml의 유량을 조정 합니다.

7. 대규모 병렬 snRNA 시퀀싱: 상용 플랫폼26

  1. (예를 들어, 크롬 단일 세포 유전자 식 솔루션) 상용 플랫폼을 사용 하 여 대규모 병렬 snRNA-연속 수행 제품 제조 업체의 지침26 다음과 같은 수정:
    1. 리버스-전사, 다음 추가 PCR 주기 주기에서 핵 세포에 비해 감소 cDNA에 대 한 보상 대상된 셀 복구에 기반 하는 cDNA 증폭에 대 한 계산된 수를 추가 합니다.

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Representative Results

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여기, 우리는 다운스트림 대규모 병렬 RNA 시퀀싱 성인 마우스 요 추 척수에서 핵의 격리를 수행합니다. 프로토콜 관련 세 가지 주요 구성 요소: 조직 장애 및 세포 세포의 용 해, 균질, 고 자당 밀도 원심 분리 (그림 1). 초 이내에, 세제 기계 세포 세포와 조직 파편 (그림 2A표 2) 핵의 많은 수와 원유 핵 준비 나왔고. 15 분 후, 소형 기계 세포 적은 파편, 하지만 또한 적은 핵 (그림 2B표 2) 원유 핵 준비 나왔고. 두 준비는 균질을 받았다 (그림 2C D) 및 자당 농도 0.04 %BSA PBS에서 물의 resuspension 전에 그라데이션 원심 분리 (그림 2E F). 평균에, 마우스 요 추 척수 (325.5 mg ± 63.9 mg 표준 오차의 의미, SEM, N = 4) 나왔고 105 핵 x 5.1 (6.3 x 10 ±4 SEM, N = 3) 세제 기계 세포 및 105 핵 (± 5.9 x 104 x 2.0 SEM, N = 3) 소형 기계 세포에 따라. 요 추 척수 핵의 수 세제 기계 세포의 용 해 프로토콜에서 Dounce 균질 후 초기 원유 준비에서 견적 되었다 (2.6 x 106 핵 ± 4.0 x 105 SEM, N = 3, 표 2). 세제-기계 세포의 용 해 프로토콜에서 최종 샘플 구성 초기 핵의 20% (± 2 %SEM, N = 3, 표 2). 분쇄 다음 소형 기계 세포에서 원유 핵 준비 포함 초기 핵의 62% (± 2 %SEM, N = 3, 표 2). 마지막 소형 기계 세포 샘플 포함 초기 핵의 단지 8% (± 1 %SEM, N = 3, 표 2). 우리 두 준비 방법 사이의 총 RNA 수확량 또는 내부 관리 유전자 (Gapdh)에 대 한 cDNA 수익률에 어떤 차이 검색 하지 못했습니다. 정량 Pcr를 사용 하 여 세제 메서드 나왔고 463.7 ng (± 98.9 SEM, N = 6) 총 RNA와는 평균 검출 임계값의 주기 25.2 (± 1.3 SEM) Gapdh cDNA에 대 한 정량 및 소형 방법으로 나왔고 419.2 ng (± 85.3 SEM, N = 6) 총 RNA의 평균 검출 임계값 Gapdh cDNA (± 0.8 SEM)에 대 한 26.1의 주기. 두 세포 옵션 모두 해리 하기 어려운 조직에서 핵을 분리 하 고 다운스트림 단일 핵 RNA 시퀀싱에 대 한 높은-품질 자료 제공.

다운스트림 대규모 병렬 단일 핵 시퀀싱 플랫폼에 대 한 미세 채널의 크기를 감안할 때, 그것은 큰 입자의 막힘을 방지 하기 위해 세포 파편 무료 핵 정지 입력 중요. 여기에 제시 된 프로토콜에 따라 했다 Macosko 그 외 여러분 에서 적응 플랫폼에서 막힘 없는 인스턴스 2015 (N = 17)와 상용 플랫폼에 한 부분 덩어리 (N = 16).

세제-기계 및 소형 기계 절차 성공적으로 2 개의 대규모 병렬 드롭릿 캡슐화 플랫폼에 대 한 핵을 분리 하는 데 사용 했다 하 고 대표적인 결과 그림 3에 표시 됩니다. 이러한 접근의 둘 다 핵, 수천 및 성인 마우스 요 추 척수 (그림 3)에서 세포 유형의 분류의 transcriptional 프로 파일링을 사용할 수 있습니다. 4 이러한 접근 귀착되 었 다 핵 각 세포 유형에 대 한 당 대 등 한 유전자 (그림 3C D). 두 플랫폼 간의 입력된 핵의 복구의 속도 다. Sathyamurthy 그 외 여러분 에서 수정 Macosko 외. 2015에서에서 적응 하는 플랫폼 2018 복구 핵의 약된 0.59% (± 0.05 %SEM, N = 17) 상용 플랫폼 예상된 53.7% 핵을 복구 하는 동안, (N = 2).

이 프로토콜은 약간 최종 준비에 신경 핵에 대 한 풍요롭게. 요 추 척수 조직 섹션에서 우리는 27% 핵의 신경 마커 NeuN 긍정 했다 발견 (N = 2 동물에서 7,368 핵), 요 추 척수의 세제 기계 핵 준비 결과 NeuN, 표현 총 핵의 31.9% 형광 활성화 된 세포 분류에 의해 결정 (FACS, ± 2.0 %SEM, N = 13 독립적인 핵 준비 여러 동물에서 풀링된 샘플을 사용 하 여 각 준비, 그림 4). 이것은 무슨 관찰 되었습니다 이전 (20% ~ 24% 나이 따라), 전체 척수에 NeuN 긍정적인 핵의27 자 궁 경부 및 흉부 영역을 더 백색 질 및 oligodendrocytes를 포함 하 여 비슷합니다. 메모의 NeuN/Rbfox3 모든 신경 세포에 표현 되지 고, 따라서 이러한 숫자 가능성이 겸손 underestimates. 작은 비 신경 세포 자당 그라데이션 정화 동안 고갈 약간은 가능 하다.입니다. 또한, 시퀀싱 다음 다운스트림 필터링 및 분석 매개 변수 신경 핵 당 더 많은 유전자를가지고 있기 때문에 마지막 셀 유형 배급 변경할 수 있습니다 (그림 3C D) 그리고, 따라서, 제거 하는 동안 필터링 프로세스.

치료를 필요로 하는이 프로토콜에 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 과도 한 douncing 또는 분쇄 (에서 단계 3 또는 4, 각각) 세포질 파편 및 입자 형성 증가 발생할 수 있습니다. 작은 입자는 세포 세포의 용 해 동안 생성 한 여과 및 자당 밀도 원심 큰 입자를 분리할 수 있습니다, 하지만 그들은 제거 하기가 어렵습니다. 둘째, 균질, 동안 놓지 마십시오 오크 릿지 튜브의 하단에 직접 균질 화기. 대신, 튜브의 바닥을 건드리지 않고 resuspended 핵을 포함 하는 낮은 자당 솔루션에는 균질 화기의 끝 잠수함. 균질 세포 파편을 제거 하 고 수 풀 및 multiplets (그림 5) 여 핵 격리를 향상 시킵니다. 자당 밀도 원심 분리에 따라 그것은 중요 하는 원심 분리기에서 오크 리 지 튜브를 즉시 제거 하 고 신속 하 게 급속 한 '터치' 모션에 상쾌한을 가만히 따르다. 오크 릿지 튜브의 벽에서 핵 resuspending 때 resuspend myelin 밴드와 튜브의 바닥 사이에서 '짠' 펠 릿. 참고는 펠 릿 표시 되지 않을 수 있습니다. Resuspending 튜브를 따라 더 높은 핵 핵 준비에서 myelin 오염 될 수 있습니다. 세포 세포의 용 해 및 자당 밀도 원심 분리 단계는 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 미세 채널을 방해할 수 있습니다 미 립 자 감소에 가장 중요 합니다.

재료의 이름 / 장비 사진 농도 최종 농도 볼륨 / 금액
세제 세포의 용 해 버퍼
낮은 자당 버퍼 - - 600 Μ
트리톤-X 20% 0.10% 3 Μ
침투성 세포의 용 해 버퍼
Tris HCl (pH = 7.4) 1 M 10 m m 100 Μ
NaCl 5 M 10 m m 20 Μ
MgCl2 1 M 3 m m 30 Μ
Nonidet P40 - 0.01% 1 Μ
Nuclease 무료 물 최대 10 mL
히 매체
최대 절전 모드-A - - 10 mL
Glutamax - - 100 Μ
B27 - - 200 Μ
낮은 자당 버퍼
자당 - 0.32 M 2.75 g
HEPES (pH = 8.0) 1 M 10 m m 250 Μ
CaCl2 1 M 5 mM 125 Μ
MgAc 1 M 3 m m 75 Μ
EDTA 0.5 M 0.1 m m 5 Μ
DTT 1 M 1mm 25 Μ
Nuclease 무료 물 최대 25 mL
자당 밀도 버퍼
자당 - 1 M 8.6 g
HEPES (pH = 8.0) 1 M 10 m m 250 Μ
MgAc 1 M 3 m m 75 Μ
DTT 1 M 1mm 25 Μ
Nuclease 무료 물 최대 25 mL
물의 Resuspension 솔루션
1 X PBS - - 1 mL
BSA 20 mg/mL 0.4 mg/mL 20 Μ
RNAse 억제제 40 U/Μ 0.2 U/Μ 5 Μ

표 1: 솔루션의 테이블입니다.

원유 무 균 최종
세제-기계 100 ± 15% 87 ± 9% 20 ± 2%
소형 기계 62 ± 12% 35 ± 4% 8 ± 1%

표 2: 프로토콜의 각 단계에서 핵의 항복. 세제-기계 세포의 용 해 프로토콜에서 dounce 균질 후 초기 원유 준비에서 핵의 수 요 추 척수 핵의 수를 견적 하기 위하여 사용 되었다. 초기 핵 생성 (2.6 x 106 핵 ± 4.0 x 105 SEM, N = 3) 핵 두 세제 당뇨-기계 세포의 용 해 프로토콜에 대 한 각 다운스트림 단계에서 수익률을 계산 하는 데 사용 되었다. 소형 기계 준비에 의해 고립 된 핵의 수 예상된 초기 핵을 정상화 했다. 테이블의 값은 평균 ± SEM, N = 3.

Figure 1
그림 1: 핵 격리의 도식. 성인 척수에서 핵 세제 기계 또는 소형 기계 세포 세포의 용 해, 균질, 및 자당 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용 하 여 격리 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 대표 명시와 키에 DAPI 스테인드 핵 단계 프로토콜에.  (A, B) 원유 핵 다음 세제 기계 또는 소형 기계 세포. (C, D) 다음과 같은 균질 핵. (E, F) 핵 자당 밀도 원심 분리에 따라 0.04 %BSA PBS에서 resuspended. 핵 2 %paraformaldehyde 고정 하 고 이후에 Trypan 파랑 또는 DAPI를 사용 하 여 스테인드. 이미지 10 배에서 찍은 (눈금 막대 = 100 µ m) 명시 및 피 형광을 사용 하 여. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 시퀀스 된 핵의 대표 tSNE 줄거리: 세제-기계 및 소형 기계 세포를 사용 하 여. 17000 핵 해 부 성인 마우스 요 추 척수를 세제 기계 세포를 다음에서 Macosko 외. 2015 수정 Sathyamurthy 그 외 여러분 에서 따라 시퀀싱에서 얻은 결과 (A) 2018. Sathyamurthy 외. 허가이 그림 수정 되었습니다. 2018.4 (B) 꺼낸된 성인 요 추 척수 소형 기계 세포 및 상업 미세 단일 셀 캡슐화 플랫폼에서에서 시퀀싱 5000 핵에서 얻은 결과. 26  성인 마우스 척수 ± SEM.에서에서 주요 세포 유형의 클러스터링 다음 핵 결과 당 평균 유전자 (C, D) 메모, Macosko 뒤 세제 기계 세포 절차의 2015 플랫폼 해 부 요 추 척수를 사용 하 여 수행 되었다, 상용 플랫폼 이어서 소형 기계 세포 수행 하는 동안 사용 하 여 배출 요 추 척수 (로이 프로토콜에서 설명). 주어진 코드를 꺼내기 경질 및 지 루트 신경 제거, meningeal/Schwann 세포 클러스터는 결 석 그림 3B 에서 D. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: NeuN+ 핵 다음 세제 기계 세포의 FACS 줄거리. FACS 플롯 고정된 핵을 보여주는 NeuN 대 한 스테인드 (평균 31.9%의 총 핵 ± 2.0 %SEM, N = 13), 세제 기계 세포의 용 해 프로토콜을 사용 하 여 절연. 즉각적인 고정, FACS 유효성 검사, 핵을 위한 원유 핵 준비 1%와 함께 즉시 고정 이어서 세제 기계 준비를 사용 하 여 척수의 dounce 균질에 의해 얻은 5 분 잠복기와 PFA. 고정 250mm 글리신, 함께 침묵 했다 그리고 핵 수집 했다. 안티 NeuN 항 체와 얼룩이 솔루션에서 수행 되었다. FACS는 고정, 셀 정렬을 사용 하 여 스테인드 NeuN 핵에서 수행 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 균질 하지 않고 핵 준비. 핵 자당 밀도 원심 다음 A 세제 기계 또는 균질 하지 않고 B 소형 기계 세포 이전 resuspended 했다. * 세포질 파편을 핵 (A) 및 세포질 파편 (B)에 의해 연결 된 핵의 multiplet에 연결을 나타냅니다. 핵 자당 밀도 원심 분리에 따라 0.04 %BSA PBS에서 resuspended. 핵 2 %paraformaldehyde 고정 하 고 이후에 Trypan 파랑 또는 DAPI를 사용 하 여 스테인드. 이미지 명시 및 피 형광을 사용 하 여 (규모 바 100 µ m) X 10에서 찍은 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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이 프로토콜의 궁극적인 목표는 다운스트림 transcriptional 분석에 대 한 높은-품질 RNA를 포함 하는 핵을 분리 하는. 우리는 모든 척수에서 세포 유형의 프로필 위해 snRNA-Seq 방법 적응. 처음에, 우리는 전형적인 세포 분리 방법 효과 없었다 단일 셀 RNA 시퀀싱, 척수 신경은 세포 죽음에 특히 취약 발견. 또한, 세포 분리 방법 hundred-fold 몇몇까지 여 다양 한 활동 및 스트레스 반응 유전자의 표정을 유도. 3 , 4 , 16 단일 셀 준비와 관련 된 단점을 감안할 때, 우리와 다른 사용 핵 대안입니다. 16 , 17 , 18 , 24 이 방법 또한 냉동된 척수 조직을 포함 하 여 인간의 조직에 사용할 수 있습니다. 4 , 19 , 24 여기, 우리가 설명 합니다 및이 방법의 한계.

이 방법의 장점에는 신선 하 고 냉동 조직을 사용 하는 기능 뿐만 아니라 실험적으로 유도 된 IEGs 회피 포함 됩니다. 4 따라서,이 방법은 수 생 IEGs 동작이 나 자극에 따라 검색 하는 데 유용. 1 , 3 , 4 이 방법의 장점 중 하나는 그것은 대규모 병렬 단일 핵 시퀀싱, 핵의 활용에 대 한 특수 장치를 필요 하지 않습니다 하지만 Macosko 외. 2015 년 사소한 조정의 개발 플랫폼을 사용할 수 있습니다. 세포의 용 해 버퍼 및 흐름 속도, 또는 상업적으로 사용할 수 있는 시스템을 사용. 또한, 단일 핵 시퀀싱은이 접근의 강도에 대출 세포 유형의 식별에 대 한 단일 셀 시퀀싱의 유사한 방법 입증 됩니다. 28 , 그러나 29 , 거기이 방법의 몇 가지 중요 한 제한이 있습니다. 핵 세포 mRNA의 약 20-50% 포함,29 그리고이 단일 셀 시퀀싱에 비해 핵 당 성적표의 낮은 수에 반영 됩니다. 18 , 29 검색 된 유전자의 수를 증가 하는 한 가지 방법은 snRNA-Seq intronic 읽기를 포함 하 여.

조직에서 핵의 격리 수 있도록 여러 가지 사용 가능한 프로토콜을 확인 하 고 있습니다. 2 , 16 , 17 , 18 , 24 , 30 대부분 다른 방법에 비해 여기에 제시 된 프로토콜 필요 하지 않습니다 수 초 제거, ultracentrifugation, 또는 많은 원심 분리 단계 또는 핵의 마지막 숫자를 낮출으로 이어질 수 있는 세척. 또한,이 프로토콜은 45 분 (세제-기계) 또는 1 시간 (소형-기계)를 완료 합니다. 미세 플랫폼에서 지원 되는 상업 프로토콜 시간 더 보다는 두 배, 그리고 핵 손실의 위험을 증가 많은 더 원심 분리 단계가 필요. 만 세포 및 필터링을 포함 하는 핵 격리 프로토콜와 여기에 제시 된 방법 마지막 핵의 순도 높이기 위해 자당 기온 변화도 포함 합니다. 이 단계는 백색 질 및 결과 myelin 파편의 큰 비율로 인해 성인 척수 조직이 필요 합니다.

세제-기계 세포의 용 해 프로토콜 사용할 수 있습니다 완벽 한 조직 분리 및 세포, 그리고 조직 분리 및 세포 잔해 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 수의 양을 조절 하 소형 기계 세포의 용 해 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 이러한 프로토콜 사용할 수 있는 바이오-은행 소재, 조직 분리 하기 어려운 고 핵의 격리를 통해 활동-종속 transcriptional 변경의 조사에 대 한 다운스트림 대규모 병렬 snRNA-이 대 한 대규모 병렬 단일 핵 RNA 시퀀싱, 뿐만 아니라이 프로토콜, 면역 형광 검사, DNA 메 틸 화 연구 및 칩 Seq (그림 4와 같은 후 성적인 분석 및 FACS 등 다른 응용 프로그램에 대 한 핵을 사용할 수 있습니다. ). 23

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Disclosures

우리는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

Acknowledgments

이 작품은 NINDS 교내 프로그램에 의해 지원 되었다 (1 지아 NS003153 02) 및 NIDCD (1 지아 DC000059 18). 우리는 L. 리 및 그들의 기술 지원 및 유용한 토론, C.I. Dobrott C. Kathe 원고를 검토 하기 위한 감사 합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Invitrogen 15503-022
1 M HEPES (pH = 8.0) Gibco 15630-080
CaCl2 Sigma Aldrich C1016-100G
MgAc Sigma Aldrich M5661-50G
0.5 M EDTA (pH = 8.0) Corning MT-46034CI
Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 10197777001 Add DTT just prior to use
Triton-X Sigma Aldrich T8787
Nuclease-free water Crystalgen 221-238-10
1 M Tris-HCl (pH = 7.4) Sigma Aldrich T2194
5 M NaCl Sigma Aldrich 59222C
1 M MgCl2 Sigma Aldrich M1028
Nonidet P40 Sigma Aldrich 74385
Hibernate-A Gibco A12475-01
Glutamax (100x) Gibco 35050-061
B27 (50x) Gibco 17504-044
1x PBS Crystalgen 221-133-10
0.04% BSA New England Biolabs B9000S
0.2 U/μL RNAse Inhibitor Lucigen 30281-1
Oak Ridge Centrifuge Tube Thermo Scientific 3118-0050
Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-8B
Glass Tissue Dounce (2 mL) Kimble 885303-002
Glass large clearance pestle Kimble 885301-0002
Glass small clearance pestle Kimble 885302-002
T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer IKA 3737001
Dispersing tool (S 10 N – 5G) IKA 3304000
Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher Scientific T10282
40 μm cell strainer Falcon 352340
MACS SmartStrainers, 30 μm Miltenyi Biotec 130-098-458
Conical tubes Denville Scientific 1000799
Sorvall Legend XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004505
Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor Thermo Fisher Scientific 75003698
Sterological Pipettes: 5 mL, 10 mL Denville Scientific P7127
Hemocytometer Daigger Scientific EF16034F
Chemgenes Barcoding Beads Chemgenes Macosko-2011-10
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) Corning 352235
MoFlo Astrios Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns 10X Genomics 120262
Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns 10X Genomics 120267
Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns 10X Genomics
Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm) Corning 353002

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.

Step 3.1 was updated from:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.

to:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.

Step 3.6 was updated from:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.

to:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.

Step 5.5 was updated from:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

to:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

Step 5.6 was updated from:

Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

to:

Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.

to:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
대규모 병렬 단일 핵 RNA 시퀀싱에 대 한 성인 척수 핵의 절연
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Matson, K. J. E., Sathyamurthy, A., Johnson, K. R., Kelly, M. C., Kelley, M. W., Levine, A. J. Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58413, doi:10.3791/58413 (2018).More

Matson, K. J. E., Sathyamurthy, A., Johnson, K. R., Kelly, M. C., Kelley, M. W., Levine, A. J. Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58413, doi:10.3791/58413 (2018).

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