Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Изоляция взрослых спинной ядра для массивно параллельной сингл ядро РНК последовательности

Published: October 12, 2018 doi: 10.3791/58413
Automatic Translation
1, 1, 2, 3,4, 3, 1
1Spinal Circuits and Plasticity Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 2Bioinformatics Section, Information Technology Program, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 3Laboratory of Cochlear Development, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, 4Single Cell Analysis Facility, Frederick National Laboratory

ERRATUM NOTICE

Summary

Здесь мы представляем протокол быстро изолировать высокого качества ядер из свежих или замороженных ткани для вниз по течению массивно параллельной последовательности РНК. Мы включать моющих средств механические и гипотонической механические ткани нарушения и ячейки лизис вариантов, оба из которых могут быть использованы для изоляции ядер.

Abstract

Зондирование экспрессии генов отдельной ячейки позволяет идентифицировать тип ячейки и ячейки состояния. Одноместный клеточной РНК последовательности стала мощным инструментом для изучения транскрипционный анализ профиля клеток, особенно в разнородных тканей, таких как центральной нервной системы. Однако диссоциация методы, необходимые для отдельной ячейки виртуализации может привести к экспериментальные изменения в ген выражение и клеток смерть. Кроме того эти методы обычно ограничены свежие ткани, тем самым ограничивая исследования архивных и био банк материала. Последовательности одного ядра РНК (мяРНК Seq) является привлекательной альтернативой для транскрипционный анализ исследований, учитывая, что он точно идентифицирует типы клеток, позволяет исследование ткани, замороженные или трудно отделить, и уменьшает диссоциации индуцированной транскрипция. Здесь мы представляем высок объём протокол для быстрой изоляции ядер для вниз по течению мяРНК Seq. Этот метод позволяет изоляции ядер из свежих или замороженных спинного образцов и могут быть объединены с двумя платформами инкапсуляции массивно параллельной капелька.

Introduction

Нервная система состоит из гетерогенных групп клеток, которые отображают разнообразные морфологических, биохимических и электрофизиологических свойств. В то время как основная РНК последовательности был полезным для определения ткани-изменения в экспрессии генов в различных условиях, он исключает обнаружения transcriptional изменений на уровне одной ячейки. Последние достижения в одну ячейку транскрипционный анализ анализ позволили классификации разнородные клеток в функциональные группы на основании их молекулярные репертуар и даже могут быть использованы для обнаружения наборы нейронов, которые были недавно активных. 1 , 2 , 3 , 4 за последние десять лет, развитие одноклеточного РНК последовательности (scRNA-Seq) позволило изучение экспрессии генов в отдельных клетках, обеспечивая представление в разнообразии типа клеток. 5

Появление масштабируемых подходов, таких как массивно параллельной scRNA-Seq, предоставил платформ для последовательности разнородных тканей, включая многие регионы центральной нервной системы. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 однако, методы диссоциации одной ячейке может привести к гибели клеток, а также экспериментальные изменения в экспрессии генов. 16 последние работы адаптировала одну ячейку последовательности методов включения сохранения эндогенного транскрипционный анализ профиля. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 эти стратегии были особенно подходит для обнаружения немедленно ранних экспрессии генов (IEG) после сенсорные стимулы или поведение. 3 , 4 в будущем, эта стратегия могла бы также использоваться для изучения динамических изменений в тканях в болезненном состоянии или в ответ на стресс. Из этих методов, последовательности одного ядра РНК (мяРНК Seq) является многообещающим подходом, который не предполагает стресса заставить диссоциации клеток и могут быть использованы на трудно отделить ткани (например, спинной мозг), а также замороженные ткани. 4 , 17 , 18 , 19 адаптировано из предыдущих методов изоляции ядер,20,21,22,,2325 мяРНК Seq обычно использует нарушения быстрого ткани и клетки Лизис в холодных условиях, центрифугирования и разделение ядер от сотовой мусора. 4 ядра могут быть изолированы для вниз по течению виртуализации следующего поколения на нескольких платформах инкапсуляции microfluidic капли. 4 , 7 , 24 , 25 этот метод позволяет для моментального снимка транскрипционный анализ деятельности тысяч клеток в момент времени.

Существует несколько стратегий для выпускать ядра от клеток до изоляции и последовательности, каждый имеет свои собственные преимущества и недостатки. Здесь мы описываем и сравнить два протокола для включения изоляции ядра от взрослых спинного мозга для вниз по течению массивно параллельной мяРНК Seq: лизис моющих средств механические и гипотонической механические lysis. Моющее механические лизис обеспечивает полный тканей срыв и более высокую доходность окончательный ядер. Гипотонический механические лизис включает управляемые степень разрушения тканей, обеспечивая возможность для выбора баланса между количеством и чистоты доходности окончательного ядерного. Эти подходы обеспечивают сопоставимых РНК урожайности, обнаруженных числа генов в ядро и профилирование типа клеток и также может использоваться успешно для мяРНК Seq.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все животные работа была выполнена в соответствии с протоколом, утвержденным Национальный институт неврологических нарушений и инсульта животных уход и использования Комитетом. Сбалансированный образцы мужские и женские мышей дикого типа МГП/CD-1, между 8 и 12 недель старые, были использованы для всех экспериментов. Мышей должны обрабатываться местных институциональных животное уход и использование Комитетом руководящим принципам.

1. Подготовка материалов и буферы

  1. Подготовить все буферы в день использования и предварительно охладить на льду (см. таблицу 1).
    1. При использовании стирального порошка механические лизис, подготовьте стиральный порошок литического буфера (> 500 мкл на сэмпл), низкая сахарозы буфера (> 6 мл на сэмпл), буфер плотность сахарозы (> 12,5 мл на сэмпл) и ресуспендирования раствор (> 1 мл).
    2. При использовании лизис гипотонический механические, подготовить гипотонический литического буфера (> 5 мл на сэмпл), ЕВР среднего (> 5 мл на сэмпл), низкая сахарозы буфера (> 3 мл на сэмпл), буфер плотность сахарозы (> 12,5 мл на сэмпл) и ресуспендирования раствор (> 1 мл).
    3. Добавьте 25 мкл Дитиотреитол (DTT) 25 мл буфера низкой сахарозы и еще 25 мкл DTT до 25 мл буфера градиента плотности сахарозы непосредственно перед запуском протокола.
  2. Покрыть поверхность рассечения с алюминиевой фольгой, чтобы свести к минимуму загрязнение образца с волокна от бумажных полотенец или скамейке защитников, которые могут засорить microfluidic каналы, используемые для захвата одного ядра.
  3. Спрей рассечения инструменты и скамейка пространства с решением РНКазы обеззараживания. Кроме того спрей внутри трубки гомогенизатор Dounce (при использовании моющих средств механические клетки лизис) и трубки Oak Ridge раствором РНКазы обеззараживания. Промойте Dounce и ОК-Ридже трубка с сверхчистого, RNase свободной воды.
  4. Предварительно охладите все коллекции трубок (50 мл конические, дуб хребет) и Dounce гомогенизатор трубы на льду.
  5. Огонь польской серии пипетки Пастера (при использовании лизис клеток гипотонический механические).

2. Подготовка спинного мозга

  1. При использовании свежих ткани, усыпить мыши вдыханием CO2 . После эвтаназии спрей пальто мыши с 70% этанола для сведения к минимуму загрязнения волос в образце.
  2. Обезглавить мышь с острыми, RNase бесплатные хирургические ножницы. Далее аккуратно подъема брюшной кожи пинцетом и надрезают вдоль длины тела подвергать внутренние органы.
  3. Потрошение мыши, потянув внутренние органы от полости тела, используя пинцет. Не используйте бумажные полотенца для очистки области или для удаления органов, как это может ввести загрязняющих веществ. Использование ножницами, вырезать позвоночник между L2 и L3 позвонка позвоночника.
    Примечание: С практикой, этот шаг может быть достигнуто в менее чем 30 секунд.
    1. Чтобы извлечь спинного мозга, подходят 3 мл шприц, содержащие ледяной PBS с помощью иглы 25 G ¼ дюйма. Место кончике иглы в сакральной конец позвоночного столба. Используйте два пальца для щепотка позвонков для создания герметичности вокруг кончика иглы и нажмите на поршень, чтобы извлечь спинного рострально. Место спинного мозга в чашке Петри с ледяной PBS.
    2. На данный момент замораживания тканей и хранить при температуре-80 ° C или немедленно использовать для моющих средств механические (шаг 3) или гипотонические механические лизис (шаг 4).
  4. Если с использованием замороженных ткани, сохранить ткани на сухой лед, перейти к моющим средством механические (шаг 3) или лизис гипотонический механические (шаг 4).

3. моющее средство механические клетки Lysis

  1. Поясничного отдела спинного мозга в предварительно охлажденные гомогенизатор Dounce и добавить что 500 мл предварительно охлажденные стиральный порошок литического буфера.
    Примечание: Мыши поясничного отдела спинного мозга — 325.5 мг ± 63.9 мг Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM, N = 4). 50 мг – 1,5 г ткани может быть успешно использован.
  2. Dounce с 5 ударов пестика («свободный» пестик), затем 5-10 ударов пестика B («жесткой» пестик). Избегайте подъема гомогенизатор из лизис раствора между штрихами и избежать пузырей.
  3. Поместите стрейнер 40 мм предварительно охлажденные 50 мл Конические трубки и prewet с 1 мл раствора низкой сахарозы буфера.
  4. Добавить 1 мл буфера низкой сахарозы в гомогенизатор Dounce, содержащие сырой ядер литического буфера и смешайте нежно закупорить 2 – 3 раза.
  5. Передайте prep сырой ядер над 40 мм сито в предварительно охлажденные 50 мл Конические трубки.
  6. Передайте буфером низкой сахарозы еще 1 мл 40 мм сито, чего окончательный объем до 3 мл буфера низкой сахарозы и 500 мл буфера lysis.
  7. Повторите шаги 3.1 – 3,6, если объединение нескольких шнуров, объединения в том же конической трубки.
  8. Центрифугуйте образцы на 3200 x g 10 мин при 4 ° C. После центрифугирования, сцеживаться супернатант. Перейдите к шагу 5.

4. гипотонический механические клетки Lysis

  1. Место поясничного отдела спинного мозга в 5 мл гипотонический литического буфера в тканевой культуры блюдо. Использовать тупой конец весны ножницы пополам спинного мозга, а затем использовать ножницы весной шнур нарезать 3 – 4 мм, но не жалел.
    Примечание: 50 мг – 1,5 г ткани может успешно использоваться.
  2. Инкубируйте на льду за 15 мин, закрученной 2 – 3 раза.
  3. Добавьте 5 мл HEB среды для разбавления гипотонический литического буфера.
  4. Нарезанных ткани 10 раз с 5 мл Серологические Пипетки, или до тех пор, пока все куски ткани плавно путем открытия пипеткой.
  5. Нарезанных с серии три огонь полированные пипетки Пастера постепенно узкой диаметром (~ 900 – 600 мм).
    1. Для каждого пипетку, нарезанных 5 - 15 раз, позволяют ткани урегулировать, удалить 1 – 2 мл супернатанта, содержащих диссоциированных ядер и пройти через стрейнер 40 мм в предварительно охлажденные 50 мл Конические трубки.
    2. После Тритурация с пипетка Пастера наименьшего размера убедитесь, что огневки плавно перетекает через наконечник пипетки. Пройти оставшийся раствор над 40 мм сито в 50 мл Конические трубки.
      Примечание: Общее количество порошки могут быть скорректированы как пожелано. Мозговые оболочки спинного мозга мыши останется, но это важно для нарезанных любых видимых куски спинного мозга. Передайте оставшихся огневки 40 m ситечко. Избегайте введения пузырей во время Тритурация.
  6. Центрифуга для отфильтрованных выборки в 1000 g x 10 мин при 4 ° C. После центрифугирования, декантируют и удалить супернатант. Перейдите к шагу 5.

5. гомогенизации и градиент плотности сахарозы

  1. После шага 3 или 4 Ресуспензируйте Пелле, используя 3 мл буфера низкой сахарозы. Аккуратно водоворот удалить гранулы от стены для облегчения ресуспендирования. Пусть пример сидеть на льду на 2 мин и передать трубки Oak Ridge подвеска.
  2. С использованием гомогенизатора в настройке 1, гомогенизировать ядер в буфере низкой сахарозы для 15-30 сек, сохраняя образца на льду.
    Примечание: Используйте 15 s при использовании одного поясничного отдела спинного мозга или 30 s при использовании пула образцы или весь спинной мозг.
  3. С помощью Серологические Пипетки, слой 12,5 мл плотности сахарозы буфера под низким сахарозы буфера огневки, заботиться, чтобы не создавать пузырь, который разрушает слои плотности.
  4. Центрифуга для трубы на 3200 x g 20 мин при 4 ° C.
  5. После центрифугирования, немедленно сцеживаться супернатант в flicking движения.
    Примечание: Остаточный объем (менее чем 400 мл) сахарозы буфера может быть удален при необходимости производить низкой громкости и чистого последний пример, но этот остаточный объем содержат ядра и могут быть сохранены для максимизации доходности ядер.
  6. С помощью 100 мл - 1 мл раствора ресуспендирования Ресуспензируйте ядер, оставаясь на стене. Избегайте миелина «хмуриться» остается с подготовкой на основе моющих средств.
  7. Фильтр ядра через сито 30 – 35 мм, размер поры и собирать в предварительно охлажденные трубы.
  8. Определите ядер урожайности с использованием Горяева для подсчета ядер под объектив 10 X.
    Примечание: Трипановый синий могут добавляться визуализировать ядер, которые должны появиться синий. Обратите внимание на количество сотовой мусора.
  9. Перейдите к шагу 6 или 7.

6. массивно параллельной мяРНК последовательности: академический платформы7

  1. Выполните массивно параллельной мяРНК последовательности (например, падение-Seq) метод как описано7 со следующими изменениями:4
    1. Настройка ядра до конечной концентрации ядер 225 мл.
    2. Подготовьте перепутываются бусины в концентрации бусины 250 мл.
    3. Подготовьте литического буфера с 0,7% sarkosyl.
    4. Отрегулируйте скорость потока до 35 мл / мин для бусины, 35 мл / мин для ядер и 200 мл / мин для нефти.

7. массивно параллельной мяРНК последовательности: коммерческая платформа26

  1. Выполнение расширенной параллельной мяРНК последовательности с использованием коммерческой платформы (например, хрома ячейки ген выражение решения) продукты согласно инструкции производителя26 со следующим изменением:
    1. После обратного транскрипция добавьте дополнительный цикл PCR расчетное количество циклов для амплификации кДНК на основе восстановления целевой ячейки компенсировать снижение cDNA от ядра, по сравнению с клетками.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Здесь мы провели изоляции ядер от поясничного отдела спинного мозга взрослого мыши по течению массивно параллельной последовательности РНК. Протокол участвуют три основных компонента: тканей срыв и сотовых лизиса, гомогенизации и сахароза плотность центрифугирования (рис. 1). В течение нескольких секунд моющее средство механические lysis принесли подготовки сырой ядер с большим числом ядер, а также клеточные и тканевые мусора (рисунок 2AТаблица 2). После пятнадцати минут гипотонические механические lysis принесли подготовки сырой ядер, которые имели меньше мусора, но также меньше ядер (Рисунок 2БТаблица 2). Обе препараты прошли гомогенизации (рис. 2 c и D) и сахароза плотность градиентного центрифугирования до ресуспендирования в PBS с 0,04% BSA (Рисунок 2E и F). В среднем, мыши поясничного отдела спинного мозга (325.5 мг ± 63.9 мг Среднеквадратичная ошибка среднего значения, SEM, N = 4) принесли 5.1 x 105 ядер (± 6,3 x 104 SEM, N = 3) после лизиса моющих средств механические и 2.0 x 105 ядер (± 5.9 x 104 SEM, N = 3) после гипотонический механические lysis. Количество ядер в поясничного отдела спинного мозга оценивался от начальной подготовки нефти после гомогенизации Dounce в протоколе моющих средств механические лизис (2.6 x 106 ядер ± 4,0 x 105 SEM, N = 3, Таблица 2). Окончательный пример из моющих средств механические лизис протокола состоит из 20% первоначального ядра (± 2% SEM, N = 3, Таблица 2). Подготовка сырой ядер от lysis гипотонический механические, после Тритурация содержит 62% первоначального ядра (± 2% SEM, N = 3, Таблица 2). Окончательный гипотонический механические лизис образец содержит только 8% от первоначального ядра (± 1% SEM, N = 3, Таблица 2). Мы не обнаружить любые различия в общей доходности РНК или cDNA доходность для уборки гена (Gapdh) между двумя подготовка методами. С помощью ПЦР, метод моющего средства принесли 463.7 нг (± 98,9 SEM, N = 6) всего РНК и средняя обнаружения порога цикла 25,2 (± 1,3 SEM) для Gapdh cDNA ПЦР и гипотонической метод принесли 419.2 нг (± 85,3 SEM, N = 6) всего РНК и порог средняя обнаружения цикл 26.1 для Gapdh cDNA (± 0,8 SEM). Два варианта лизис изолировать ядра от трудно отделить тканей и обеспечивают высокое качество материала для вниз по течению сингл ядро РНК последовательности.

Учитывая размер microfluidic каналов для вниз по течению массивно параллельной одно ядро виртуализации платформ, критически важно для ввода ядер подвеска, без крупных частиц или сотовой мусора для предотвращения засорения. После протокола, представленные здесь не было случаев засорения на платформе адаптировано из Macosko и др. 2015 (N = 17) и одно частичное забивают на платформе коммерческого (N = 16).

Моющее механические и гипотонической механические процедуры были использованы для изоляции ядра успешно для двух платформ инкапсуляции массивно параллельной капелька и представитель результаты показаны на рисунке 3. Оба эти подхода позволило транскрипционный анализ профиля тысяч ядер, и классификации типов клеток взрослых мыши поясничного отдела спинного мозга (рис. 3). 4 эти подходы привели к сопоставимым генов в ядро для каждого типа клеток (рис. 3 c и D). Отличаются темпов восстановления ввода ядер между этими двумя платформами. Платформа, взято из Macosko et al. 2015 года с изменениями от Sathyamurthy и др. 2018 восстановлены оценкам 0,59% ядер (± 0,05% SEM, N = 17), в то время как коммерческие платформы восстановлены оценкам 53,7% ядер (N = 2).

Этот протокол слегка обогащает для нейронов ядер в окончательной подготовки. В разделах ткани поясничного отдела спинного мозга, мы обнаружили, что 27% ядер были положительными для нейронов маркер NeuN (N = 7,368 ядра от 2 животных), в то время как моющее средство механические ядер подготовка поясничного отдела спинного привели к 31,9% всего ядер, выражая NeuN, как определяется сортировки активирован флуоресценции клеток (СУИМ, ± 2,0% SEM, N = 13 независимых ядра препаратов с использованием пула образцов из нескольких животных в каждом подготовки, рис. 4). Это похоже на то, что наблюдалось ранее для процент ядер NeuN позитивных всего спинного мозга (20% до 24% в зависимости от возраста),27 включая шейки матки и грудной области, которые имеют больше белого вещества и олигодендроциты. Следует отметить NeuN/Rbfox3 выражается не в всех нейронов, и, соответственно, эти цифры являются скорее всего скромный недооценивает. Вполне возможно, что меньше номера нейрональные клетки слегка истощены во время очистки градиента сахарозы. Кроме того, вниз по течению параметров фильтрации и анализа, после виртуализации может изменить распределение окончательный тип ячейки, потому что нейроны имеют больше генов в ядро (рис. 3 c и D) и, следовательно, менее вероятно быть удалены в процессе фильтрации.

Есть несколько ключевых шагов в настоящем Протоколе, которые требуют ухода. Во-первых, чрезмерно douncing или Тритурация (в шаги 3 и 4, соответственно) может привести к увеличению сотовой мусора и частицы формирования. Хотя фильтрации и центрифугирования плотность сахарозы может отделить крупные частицы, после мелких частиц создаются во время лизис клеточных, они трудно удалить. Во-вторых во время гомогенизации, не ставьте гомогенизатор, непосредственно на нижней части трубки Oak Ridge. Вместо этого погружаться в конце гомогенизатор в низкой сахарозы раствор, содержащий ресуспензированы ядер, не прикасаясь к нижней части трубки. Гомогенизация улучшает ядерной изоляции путем удаления сотовой мусора и уменьшения сгустки и мультплеты (рис. 5). После центрифугирования плотность сахарозы важно немедленно удалить трубки Oak Ridge из центрифуги, и быстро декантируют супернатант в быстрое движение «flicking». Когда resuspending ядер от стенки трубки Oak Ridge, Ресуспензируйте «соленый» гранулы от на полпути между полосами миелина и в нижней части трубки. Обратите внимание, что гранулы могут быть не видны. Resuspending ядер выше вдоль трубки может привести к миелина загрязнения в порядке подготовки ядер. Лизис клеточных и сахароза плотность центрифугирования шаги являются наиболее важными для снижения твердых частиц, которые могут засорить microfluidic каналы для вниз по течению приложения.

Имя материала / оборудование Складе концентрация Конечная концентрация Объем / количество
Стиральный порошок литического буфера
Низкая сахарозы буфера - - 600 МКЛ
Тритон X 20% 0,10% 3 МКЛ
Гипотонический литического буфера
Трис HCl (рН = 7,4) 1 M 10 мм 100 МКЛ
NaCl 5 M 10 мм 20 МКЛ
2 MgCl 1 M 3 мм 30 МКЛ
Nonidet P40 - 0,01% 1 МКЛ
Нуклеаза свободной воды до 10 мл
HEB среднего
Спящий режим A - - 10 мл
Glutamax - - 100 МКЛ
B27 - - 200 МКЛ
Низкая сахарозы буфера
Сахароза - 0,32 М 2.75 g
HEPES (рН = 8.0) 1 M 10 мм 250 МКЛ
CaCl2 1 M 5 мм 125 МКЛ
MgAc 1 M 3 мм 75 МКЛ
ЭДТА 0.5 М 0,1 мм 5 МКЛ
DTT 1 M 1 мм 25 МКЛ
Нуклеаза свободной воды до 25 мл
Буфер плотность сахарозы
Сахароза - 1 M 8.6 g
HEPES (рН = 8.0) 1 M 10 мм 250 МКЛ
MgAc 1 M 3 мм 75 МКЛ
DTT 1 M 1 мм 25 МКЛ
Нуклеаза свободной воды до 25 мл
Ресуспендирования решение
ПБС - - 1 мл
BSA 20 мг/мл 0,4 мг/мл 20 МКЛ
АБС битор РНКазы 40 U/МКЛ 0.2 U/МКЛ 5 МКЛ

Таблица 1: Таблица решений.

Сырой Гомогенизированные Окончательное
Моющее механические 100 ± 15% 87 ± 9% 20 ± 2%
Гипотонический механические 62 ± 12% 35 ± 4% 8 ± 1%

Таблица 2: доходность ядер на каждом шаге в протоколе. Количество ядер в начальной подготовки нефти после гомогенизации dounce в протоколе моющих средств механические лизис использовалась для оценки числа ядер в поясничного отдела спинного мозга. Доходность первоначального ядра (2.6 x 106 ядер ± 4,0 x 105 SEM, N = 3) использовалась для расчета ядра выход на каждом шагу вниз по течению для обоих протоколы lysis моющих средств - и гипотонических механический. Количество ядер изолированных гипотонический Механическая подготовка нормализована оценкам первоначального ядра. В таблице значения являются среднее ± SEM, N = 3.

Figure 1
Рисунок 1: схема ядерной изоляции. Ядра от спинного мозга взрослого могут быть изолированы с помощью моющих средств механические или гипотонические механические клетки лизиса, следуют гомогенизации и сахароза плотность градиентного центрифугирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Представитель brightfield и DAPI-окрашенных ядер в ключевые шаги в протоколе.  (A, B) сырой ядра, после моющих средств механические или гипотонические механические lysis. (C, D) Ядра, после гомогенизации. (E, F) Ядер высокомобильна в PBS с 0,04% BSA после центрифугирования плотность сахарозы. Ядра были исправлены с 2% параформальдегида и впоследствии окрашенных с помощью Трипановый синий или DAPI. Изображения были взяты в 10 X (шкала бар = 100 мкм) с использованием brightfield и epi флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: представитель tSNE участок виртуализированного ядер: Использование моющих средств механические и гипотонической механические лизис. (A) результаты, полученные из последовательности более 17,000 ядер из расчлененных взрослых мыши поясничного отдела спинного мозга после лизиса моющих средств механические и согласно Macosko соавт. 2015 года с изменениями от Sathyamurthy et al. 2018. Этот показатель был изменен с разрешения Sathyamurthy и др. 2018.4 (B) результаты, полученные от 5000 ядра виртуализации от выбрасывается взрослых поясничного отдела спинного мозга после лизиса гипотонический механические и коммерческих microfluidic одноклеточного инкапсуляции платформы. 26  (C, D) средняя генов в ядро результаты кластеризации типов основных клеток в ± спинного мозга взрослого мыши SEM. Следует отметить, моющее средство механические лизис процедура Macosko и др. платформы 2015 года проводилось с использованием расчлененных поясничного отдела спинного мозга, в то время как гипотонический механические lysis следуют коммерческая платформа была выполнена с использованием выбрасывается поясничного отдела спинного мозга (как описано в настоящем протоколе). Учитывая, что изгнание шнур удаляет Дура и спинной корень ганглиев, менингеальные/Шванновские клетки кластер отсутствует от рисунок 3B и D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: участок СУИМ NeuN+ ядер после моющих средств механические лизис. Участок СУИМ, показаны фиксированной ядер витражи для NeuN (средняя 31,9% общего ядра ± 2,0% SEM, N = 13), изолированное с помощью моющих средств механические лизис протокола. Для немедленной фиксации, ядра для проверки СУИМ, подготовка сырой ядер был получен путем усреднения dounce связок позвоночника с использованием моющих средств Механическая подготовка, следуют немедленной фиксации с 1% PFA с инкубационный период 5 мин. Фиксация был закаленных с 250 мм глицин, и были собраны ядер. Пятнать антитела анти NeuN была исполнена в растворе. СУИМ была исполнена на фиксированной, NeuN окрашенных ядер с помощью сортировщика ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Подготовка ядра без гомогенизации. Ядра были высокомобильна перед центрифугированием плотность сахарозы после A моющих средств механические или B лизис гипотонический механически, без гомогенизации. * Обозначает сотовой мусора, придает ядер (A) и multiplet ядер, придает сотовой мусора (B). Ядер высокомобильна в PBS с 0,04% BSA после центрифугирования плотность сахарозы. Ядра были исправлены с 2% параформальдегида и впоследствии окрашенных с помощью Трипановый синий или DAPI. Изображения были взяты в 10 X (шкалы бар 100 мкм) с использованием brightfield и epi флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Конечная цель настоящего Протокола заключается в изоляции ядер, содержащие РНК высокого качества для вниз по течению transcriptional анализа. Мы адаптировали мяРНК Seq методы для того, чтобы профиль, все типы клеток спинного мозга. Первоначально мы обнаружили, что типичных клеток диссоциации методы были неэффективными для одной ячейки РНК последовательности, как нейроны спинного мозга являются особенно уязвимыми к смерти клетки. Кроме того методы диссоциации клеток вызывают экспрессии различных генов деятельности - и стресс реакция, до нескольких перспективнее. 3 , 4 , 16 Учитывая недостатки, связанные с подготовкой одну ячейку, мы и другие использовали ядер в качестве альтернативы. 16 , 17 , 18 , 24 этот метод также может использоваться на человеческой ткани, включая замороженные спинного тканей. 4 , 19 , 24 здесь, мы будем описывать преимущества и недостатки этого подхода.

Преимущества этого метода включают в себя недопущение экспериментально индуцированной IEGs, а также возможность использовать свежие и замороженные ткани. 4 таким образом, этот подход может быть полезным для зондирования эндогенного IEGs после поведения или стимул. 1 , 3 , 4 , одним из преимуществ данного метода является, что она не требует специализированных устройств для использования ядер для секвенирования массивно параллельной одного ядра, но можно использовать платформа, разработанная Macosko et al. 2015, с незначительными изменениями в Лизис буфера и потока скорость, или использование коммерчески доступных систем. Кроме того одно ядро виртуализации оказалась сопоставимой метод в одну ячейку последовательности для идентификации типов клеток, кредитование в силу этого подхода. 28 , 29 однако, существует несколько важных ограничений этого подхода. Ядра содержат примерно 20-50% клеточных мРНК,29 и это отражается в меньшее количество стенограммы на ядро, по сравнению с одной ячейке последовательности. 18 , 29 включая intronic читает из мяРНК Seq является одним из подходов к увеличению числа выявленных генов.

Существует несколько доступных протоколов, позволяющих изоляции ядер из ткани. 2 , 16 , 17 , 18 , 24 , 30 по сравнению с большинства других методов, протоколы, представленные здесь не требуют удаления миелина, ultracentrifugation, или многие центрифугирования шаги или моет, которые могут привести к снижению окончательного числа ядер. Кроме того этот протокол занимает 45 мин (моющее средство механический) или 1 час (гипотоническая механический) для завершения. Коммерческие протоколы поддерживаются на платформах microfluidic вдвое больше, чем время и требуют много больше шагов центрифугирования, увеличивая риск потери ядер. В отличие от протоколы изоляции ядра, которые включают только распад и фильтрация представленные здесь методы включают сахарозу градиент для повышения чистоты окончательного ядер. Этот шаг необходим для взрослых спинного тканей из-за большой процент белого вещества и результате мусора миелина.

Моющее механические лизис протокол может использоваться для полного ткани диссоциации и lysis, и гипотонический механические лизис протокол может использоваться для управления количество ткани диссоциации и сотовой мусора допускается в приложении ниже по течению. Эти протоколы могут использоваться для био банк материал, трудно отделить тканей и для расследования деятельности зависимых transcriptional изменений путем изоляции ядер для вниз по течению массивно параллельной мяРНК Seq. В дополнение к расширенной параллельной одно ядро РНК последовательности, этот протокол может использоваться для изоляции ядра для альтернативных применений, включая иммунофлюоресценции и СУИМ и эпигеномные анализа, например исследования метилирование ДНК и чип-Seq (Рисунок 4 ). 23

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У нас нет конфликта интересов раскрыть.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана в очной программе NINDS (1 Зия NS003153 02) и NIDCD (1 Зия DC000059 18). Мы благодарим L. Li и воспламенением Dobrott за их техническую поддержку и полезные обсуждения и Kathe C. для рассмотрения рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Invitrogen 15503-022
1 M HEPES (pH = 8.0) Gibco 15630-080
CaCl2 Sigma Aldrich C1016-100G
MgAc Sigma Aldrich M5661-50G
0.5 M EDTA (pH = 8.0) Corning MT-46034CI
Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 10197777001 Add DTT just prior to use
Triton-X Sigma Aldrich T8787
Nuclease-free water Crystalgen 221-238-10
1 M Tris-HCl (pH = 7.4) Sigma Aldrich T2194
5 M NaCl Sigma Aldrich 59222C
1 M MgCl2 Sigma Aldrich M1028
Nonidet P40 Sigma Aldrich 74385
Hibernate-A Gibco A12475-01
Glutamax (100x) Gibco 35050-061
B27 (50x) Gibco 17504-044
1x PBS Crystalgen 221-133-10
0.04% BSA New England Biolabs B9000S
0.2 U/μL RNAse Inhibitor Lucigen 30281-1
Oak Ridge Centrifuge Tube Thermo Scientific 3118-0050
Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-8B
Glass Tissue Dounce (2 mL) Kimble 885303-002
Glass large clearance pestle Kimble 885301-0002
Glass small clearance pestle Kimble 885302-002
T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer IKA 3737001
Dispersing tool (S 10 N – 5G) IKA 3304000
Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher Scientific T10282
40 μm cell strainer Falcon 352340
MACS SmartStrainers, 30 μm Miltenyi Biotec 130-098-458
Conical tubes Denville Scientific 1000799
Sorvall Legend XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004505
Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor Thermo Fisher Scientific 75003698
Sterological Pipettes: 5 mL, 10 mL Denville Scientific P7127
Hemocytometer Daigger Scientific EF16034F
Chemgenes Barcoding Beads Chemgenes Macosko-2011-10
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) Corning 352235
MoFlo Astrios Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns 10X Genomics 120262
Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns 10X Genomics 120267
Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns 10X Genomics
Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm) Corning 353002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
  2. Hu, P., et al. Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq. Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).
  3. Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
  4. Sathyamurthy, A., et al. Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior. Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).
  5. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).
  6. Campbell, J. N., et al. A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types. Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).
  7. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  8. Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
  9. Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
  10. Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967 (2016).
  11. Shin, J., et al. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
  12. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
  13. Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
  14. Villani, A. C., et al. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science. 356 (6335), (2017).
  15. Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
  16. Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, 11022 (2016).
  17. Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
  18. Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
  19. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
  20. Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  21. Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  22. Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  23. Halder, R., et al. DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory. Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).
  24. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  25. 10X Genomics. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing (2018).
  26. 10X Genomics. Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).
  27. Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord. Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).
  28. Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).
  29. Bakken, T. E. Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing. bioRxiv. , (2018).
  30. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).

Tags

Нейробиология выпуск 140 ядер РНК последовательности мяРНК Seq массивно параллельной спинного мозга сахароза градиент

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.

Step 3.1 was updated from:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.

to:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.

Step 3.6 was updated from:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.

to:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.

Step 5.5 was updated from:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

to:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

Step 5.6 was updated from:

Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

to:

Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.

to:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
Изоляция взрослых спинной ядра для массивно параллельной сингл ядро РНК последовательности
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Matson, K. J. E., Sathyamurthy, A.,… More

Matson, K. J. E., Sathyamurthy, A., Johnson, K. R., Kelly, M. C., Kelley, M. W., Levine, A. J. Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58413, doi:10.3791/58413 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter