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Neuroscience

Aislamiento de núcleos de adultos de la médula espinal para secuenciación masivamente paralela solo núcleo ARN

doi: 10.3791/58413 Published: October 12, 2018

ERRATUM NOTICE

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para aislar rápidamente a núcleos de alta calidad del tejido fresco o congelado para la descendente secuencia de RNA masivamente paralelo. Nos incluyen tejido detergente-mecánica y de mecánica hipotónica interrupción y célula opciones de lisis, que pueden utilizarse para el aislamiento de los núcleos.

Abstract

Sondeo de genes de una célula individual permite la identificación del tipo celular y el estado de la célula. La secuencia de RNA unicelular ha surgido como una poderosa herramienta para el estudio de perfiles transcripcionales de las células, particularmente en tejidos heterogéneos tales como el sistema nervioso central. Sin embargo, métodos de disociación para la secuencia de la célula pueden conducir a cambios experimentales en la gene expresión y muerte celular. Además, estos métodos están generalmente restringidos a tejido fresco, limitando así los estudios sobre archivos y material bio-Banco. Solo núcleo RNA secuencia (snRNA-Seq) es una alternativa atractiva para estudios transcripcionales, dado que precisamente identifica tipos de la célula, permite el estudio de los tejidos congelados o difícil de disociar, y reduce la disociación inducida transcripción. Aquí, presentamos un protocolo de alto rendimiento para el aislamiento rápido de núcleos para abajo snRNA-SS. Este método permite el aislamiento de los núcleos de las muestras frescas o congeladas de la médula espinal y puede combinarse con dos plataformas de encapsulación de gota masiva y en paralelo.

Introduction

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El sistema nervioso se compone de grupos heterogéneos de células que muestran una gran variedad de propiedades morfológicas, bioquímicas y electrofisiológicas. Mientras que la secuencia de RNA a granel ha sido útil para determinar cambios de todo el tejido en la expresión de genes en diferentes condiciones, excluye la detección de cambios transcripcionales a nivel unicelular. Los avances recientes en el análisis transcripcional unicelulares han permitido la clasificación de las células heterogéneas en grupos funcionales basados en su repertorio molecular e incluso se pueden aprovechar para detectar grupos de neuronas que habían sido recientemente activas. 1 , 2 , 3 , 4 en los últimos diez años, el desarrollo de RNA de la célula única secuenciación (scRNA-Seq) ha permitido el estudio de la expresión génica en células individuales, proporcionando una visión en la diversidad de tipo de la célula. 5

La aparición de métodos escalables como tratamiento masivo en paralelo scRNA-Seq, ha proporcionado plataformas para tejidos heterogéneos de la secuencia, incluyendo muchas regiones del sistema nervioso central. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 sin embargo, métodos de disociación celular solo pueden llevar a la muerte celular así como los cambios experimentales en la expresión génica. 16 trabajo reciente ha adaptado métodos de secuenciación de unicelular para preservación de perfiles transcripcionales endógenos. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 estas estrategias han sido particularmente convenientes para la detección inmediata temprana expresión del gen (IEG) después de estímulo sensorial o comportamiento. 3 , 4 en el futuro, esta estrategia podría también ser utilizada para estudiar los cambios dinámicos en los tejidos en Estados de enfermedad o en respuesta al estrés. De estos métodos, la secuencia solo núcleo RNA (snRNA-Seq) es un enfoque prometedor que implican estrés induce la disociación celular y puede ser utilizado en difícil de disociar del tejido (por ejemplo, la médula espinal), así como congelado tejido. 4 , 17 , 18 , 19 adaptado de los métodos de aislamiento de los núcleos anteriores,20,21,22,23,25 snRNA-Seq típicamente utiliza el celular y la interrupción de tejido rápido lisis en condiciones de frío, centrifugación y separación de los núcleos de la ruina celular. 4 núcleos pueden ser aislados para la secuenciación de próxima generación descendente en múltiples plataformas de encapsulación de gotita de microfluidos. 4 , 7 , 24 , 25 este método permite una instantánea de la actividad transcripcional de miles de células en un momento en el tiempo.

Existen múltiples estrategias para la liberación de los núcleos de las células antes de aislamiento y secuencia, cada uno con sus ventajas y desventajas. Aquí, describimos y comparar dos protocolos para permitir el aislamiento de los núcleos de la médula espinal adulta para el tratamiento masivo en paralelo abajo snRNA-Seq: lisis mecánica detergente y lisis hipotónica-mecánica. Lisis de detergente-mecánica proporciona la interrupción completa del tejido y un mayor rendimiento final de los núcleos. Mecánica-lisis hipotónica incluyen un grado controlable de disrupción del tejido, proporcionando una oportunidad para la selección de un equilibrio entre la cantidad y la pureza de la producción nuclear final. Estos enfoques proporcionan rendimiento comparable de RNA detectado un número de genes por núcleo y mediante perfiles tipo de la célula y también pueden tanto ser utilizados con éxito para snRNA-SS.

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Protocol

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Todos los trabajos de animales se realizan según un protocolo aprobado por el Instituto Nacional de desórdenes neurológicos y movimiento Animal cuidado y uso. Equilibrado de las muestras de hombres y mujeres ICR/CD-1 tipo salvaje ratones, entre 8 y 12 semanas viejo, fueron utilizados para todos los experimentos. Ratones deben ser manejados con arreglo a directrices institucionales Animal Care y Comité de uso locales.

1. preparación de materiales y Buffers

  1. Preparar todos los búferes del día de uso y enfriado previamente en hielo (ver tabla 1).
    1. Si utiliza detergente industrial lisis, preparar el tampón de lisis detergente (> 500 μL por muestra), buffer de sacarosa bajo (> 6 mL por muestra), buffer de densidad de sacarosa (> 12,5 mL por muestra) y la solución de resuspensión (> 1 mL).
    2. Si utiliza lisis hipotónica-mecánica, preparar el tampón de lisis hipotónica (> 5 mL por muestra), medio HEB (> 5 mL por muestra), buffer sucrosa bajo (> 3 mL por muestra), buffer de densidad de sacarosa (> 12,5 mL por muestra) y la solución de resuspensión (> 1 mL).
    3. Añadir 25 μL de Ditiotreitol (DTT) otro 25 μL de la TDT a 25 mL de la solución de gradiente de densidad de sacarosa y 25 mL de la solución de sacarosa baja justo antes de iniciar el protocolo.
  2. Cubrir la superficie de disección con papel de aluminio para minimizar la contaminación de la muestra con las fibras de papel toallas o protectores de banco, que pueden obstruir microfluídicos canales utilizados para la captura de núcleos individuales.
  3. Rocíe la herramientas de disección y espacio del Banco con una solución de descontaminación de Rnasa. Además, rocíe el interior del tubo de Homogeneizadores Dounce (si está usando la lisis celular de detergente-mecánica) y Oak Ridge tubo con una solución de descontaminación de Rnasa. Enjuague el tubo con agua ultrapura, libre de ARNasa Dounce y Oak Ridge.
  4. Enfriar previamente todos los tubos (50 mL cónico, roble Ridge) y tubos de Homogeneizadores Dounce en hielo.
  5. Fuego polaco una serie de Pipetas Pasteur (si está usando lisis hipotónica mecánica celular).

2. preparación de la médula espinal

  1. Si se utiliza tejido fresco, eutanasia el ratón por la inhalación de CO2 . Después de eutanasia, rocíe la capa del ratón con etanol al 70% para minimizar la contaminación del cabello en la muestra.
  2. Decapitar el ratón con tijeras quirúrgicas agudos, libre de ARNasa. A continuación, levantando suavemente los abdominales la piel con pinzas y hacer una incisión a lo largo de la longitud del cuerpo para exponer los órganos internos.
  3. Desentrañan el ratón tirando de los órganos internos de la cavidad del cuerpo con unas pinzas. No use toallas de papel para limpiar el área o a quitar órganos, esto puede introducir contaminantes. Con unas tijeras, cortar la columna vertebral entre las vértebras L2 y L3 de la columna.
    Nota: Con la práctica, este paso se logra en menos de 30 segundos.
    1. Para expulsar la médula espinal, colocar una jeringa de 3 mL con PBS helado con una aguja de 25 G 1/4 pulgada. Coloque la punta de la aguja en el extremo sacro de la columna vertebral. Use dos dedos para pellizcar las vértebras para crear un sello hermético alrededor de la punta de la aguja y presione el émbolo para expulsar la médula rostral. Lugar la médula espinal en una placa de Petri con PBS helado.
    2. En este punto, congelar el tejido y conservarlo a-80 ° C o utilizar inmediatamente para detergente-mecánica (paso 3) o lisis de hipotónica-mecánica (paso 4).
  4. Si usando tejido congelado, mantener el tejido en hielo seco, proceder a detergente-mecánica (paso 3) o lisis de hipotónica-mecánica (paso 4).

3. lisis de la célula detergente industrial

  1. Lugar de la médula espinal lumbar en un homogeneizador de Dounce previamente enfriado y añadir 500 mL previamente enfriada tampón de lisis detergente.
    Nota: Una médula espinal lumbar de ratón es 325,5 mg ± mg 63,9 error estándar de la media (SEM, N = 4). 50 mg-1.5 g de tejido se puede utilizar con éxito.
  2. Dounce con 5 golpes de mortero de una (Maja 'flojo'), luego 5 a 10 golpes de mortero B ('tight' Maja). Evite levantar el homogenizador de la solución de lisis entre trazos y evitar la introducción de burbujas.
  3. Coloque un filtro de 40 mm sobre un tubo cónico de 50 mL previamente enfriada y prewet con 1 mL de tampón de sacarosa bajo.
  4. Añadir 1 mL de tampón baja sacarosa al Dounce homogeneizador que contiene los núcleos crudos en el buffer de lisis y suavemente mezclar mediante pipeteo de 2 – 3 veces.
  5. Pasar la preparación de núcleos crudo sobre el tamiz de 40 mm en el tubo cónico de 50 mL previamente enfriada.
  6. Traspasar un adicional 1 mL de tampón de sacarosa bajo el tamiz de 40 mm, que el volumen final de 3 mL de la solución de sacarosa baja y 500 mL de la solución de lisis.
  7. Repita los pasos 3.1-3.6 Si la combinación de múltiples cables, puesta en común en el mismo tubo cónico.
  8. Centrifugar la muestra a 3.200 x g por 10 min a 4 ° C. Una vez finalizada la centrifugación, decantar el sobrenadante. Proceda al paso 5.

4 lisis celular hipotónica-mecánico

  1. Lugar de la médula espinal lumbar en 5 mL de la solución de lisis hipotónica en un plato de cultivo de tejidos. Usar el extremo despuntado de tijeras primavera atraviesan la médula espinal, luego usar primavera tijeras para cortar el cable en trozos de 3 – 4 mm, pero no pique.
    Nota: 50 mg a 1,5 g de tejido puede ser utilizado con éxito.
  2. Incubar en hielo por 15 min, Remolino 2 – 3 veces.
  3. Añadir 5 mL de medio HEB para diluir el buffer de lisis hipotónica.
  4. Triturate el tejido 10 veces con una pipeta serológica de 5 mL o hasta que todas las piezas del tejido mover suavemente a través de la abertura de la pipeta.
  5. Triturate con una serie de tres pipetas de Pasteur fuego pulido con diámetros progresivamente más estrechos (~ 900-600 mm).
    1. Para cada pipeta triturate 5 - 15 veces, permite el tejido colocar, quitar 1 – 2 mL del sobrenadante que contiene núcleos disociados y pasar por un tamiz de 40 mm en un tubo cónico de 50 mL previamente enfriada.
    2. Después de trituración con la pipeta Pasteur más pequeño tamaño, asegúrese de que el homogeneizado fluye suavemente a través de la punta de la pipeta. Pase la solución restante sobre el tamiz de 40 mm en el tubo cónico de 50 mL.
      Nota: El número total de trituraciones se puede ajustar como desee. Las meninges de la médula espinal de ratón serán siendo, pero es importante triturate cualquier trozos visibles de médula espinal. Pase el homogeneizado quedan sobre el tamiz de 40 m. Evitar la introducción de burbujas durante la trituración.
  6. Centrifugue la muestra filtrada a 1.000 x g durante 10 min a 4 ° C. Una vez finalizada la centrifugación, decante y descarte el sobrenadante. Proceda al paso 5.

5. homogeneización y gradiente de densidad de sacarosa

  1. Después de paso 3 o 4, Resuspender el precipitado con 3 mL de solución de sacarosa bajo. Agitar suavemente para eliminar el sedimento de la pared para facilitar la resuspensión. Deje que la muestra se sientan en hielo durante 2 minutos y transferir la suspensión a un tubo de Oak Ridge.
  2. Con el homogeneizador en posición 1, homogeneizar los núcleos en tampón baja sacarosa durante 15 – 30 s., manteniendo la muestra en hielo.
    Nota: Utilice 15 s si usa uno medular lumbar o 30 s si agruparon muestras o una médula espinal entera.
  3. Utilizando una pipeta serológica, capa 12,5 mL de solución de sacarosa de densidad debajo el homogeneizado de buffer sucrosa bajo, teniendo cuidado de no para crear una burbuja que altera las capas de densidad.
  4. Centrifugar los tubos a 3.200 x g por 20 min a 4 ° C.
  5. Una vez finalizada la centrifugación, inmediatamente decante el sobrenadante en un movimiento de cajón.
    Nota: Un volumen residual (menos de 400 mL) de tampón de sacarosa se puede desechar si se desea producir un volumen más bajo y el limpiador de la muestra final, pero este volumen residual contienen núcleos y puede ser conservado para maximizar el rendimiento de los núcleos.
  6. Utilizando 100 mL - 1 mL de solución de resuspensión, resuspender los núcleos restantes en la pared. Evitar la mielina 'entrecejo' que sigue con la preparación base de detergente.
  7. Los núcleos del filtro a través de un filtro de tamaño de poro de 30 – 35 mm y recoger en un tubo previamente enfriado.
  8. Determinar los núcleos rendimiento utilizando un hemocitómetro para contar núcleos bajo un objetivo de X 10.
    Nota: Puede añadirse azul de tripano para visualizar núcleos, que deben aparecer en azul. Tenga en cuenta la cantidad de detritos celulares.
  9. Proceda al paso 6 o 7.

6. masivamente paralelo secuenciación del snRNA: plataforma académica7

  1. Realizar la secuenciación masivamente paralela snRNA (p. ej., gota-Seq) método como se ha descrito7 con las siguientes modificaciones:4
    1. Ajustar los núcleos a una concentración final de 225 núcleos por mL.
    2. Preparar cuentas con código de barras en una concentración de 250 granos por mL.
    3. Preparar el tampón de lisis con sarkosyl de 0,7%.
    4. Ajustar las tasas de flujo a 35 mL / min para granos, 35 mL por minuto por núcleos y 200 mL por minuto de aceite.

7. masivamente paralelo secuenciación del snRNA: plataforma comercial26

  1. SnRNA-secuenciación masivamente paralela utilizando la plataforma comercial (p. ej., cromo única célula Gene expresión solución) de realizar productos de acuerdo de las instrucciones del fabricante de la26 con la siguiente modificación:
    1. Tras reverso-transcripción, añadir un ciclo PCR adicionales a la cantidad calculada de ciclos para la amplificación del cDNA basado en la recuperación de la célula objetivo para compensar la disminución del cDNA de los núcleos en comparación con las células.

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Representative Results

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Aquí, realizamos aislamiento de núcleos de la médula espinal lumbar ratón adulto para la descendente secuencia de RNA masivamente paralela. El protocolo participan tres componentes principales: tejido celular e interrupción lisis, homogeneización y sacarosa densidad centrifugación (figura 1). En cuestión de segundos la lisis mecánica de detergente rindió una preparación cruda de núcleos con un gran número de núcleos, así como desechos celulares y del tejido (figura 2Atabla 2). Después de quince minutos, la lisis hipotónica mecánica produjo una preparación cruda de núcleos que tenía menos residuos, pero también menos núcleos (figura 2Btabla 2). Ambas preparaciones experimentaron la homogeneización (figura 2 y D) y centrifugación gradiente de densidad de sacarosa antes de resuspensión en PBS con BSA 0.04% (Figura 2E y F). En promedio, una médula espinal lumbar de ratón (325,5 mg ± mg 63,9 error estándar de la media, SEM, N = 4) rindió 5.1 x 105 núcleos (± 6.3 x 104 SEM, N = 3) después de la lisis mecánica de detergente y 2.0 x 105 núcleos (± 5.9 x 104 SEM, N = 3) después de la lisis hipotónica-mecánica. Se estimó el número de núcleos en la médula espinal lumbar de la preparación inicial de crudo después de Dounce homogeneización en el protocolo de lisis mecánica de detergente (2.6 x 106 núcleos ± 4.0 x 105 SEM, N = 3, tabla 2). La muestra final del Protocolo de lisis mecánica detergente consta de 20% de los núcleos iniciales (± 2% SEM, N = 3, tabla 2). La preparación de núcleos crudo desde la lisis hipotónica mecánica después de la trituración contiene 62% de los núcleos iniciales (± 2% SEM, N = 3, tabla 2). La muestra final lisis hipotónica mecánica contiene sólo el 8% de los núcleos iniciales (± 1% SEM, N = 3, tabla 2). No detectamos ninguna diferencia en la producción de RNA total o la producción de cDNA para un gen housekeeping (Gapdh) entre los métodos de preparación de dos. Utilizando qPCR, el método detergente rindió 463.7 ng (± 98.9 SEM, N = 6) de ARN total y un ciclo de la umbral de detección promedio de 25,2 (± 1.3 SEM) para Gapdh cDNA por qPCR y el hipotónico rindió 419.2 ng (± 85,3 SEM, N = 6) de ARN total y un umbral de detección promedio ciclo de 26,1 para el cDNA de Gapdh (SEM ± 0.8). Las dos opciones de lisis tanto aislar núcleos de tejidos difíciles de disociar y proporcionan el material de alta calidad para la secuencia de RNA núcleo solo aguas abajo.

Dado el tamaño de los canales de microfluidos para plataformas de secuenciación masivamente paralela solo núcleo aguas abajo, es fundamental introducir una suspensión de núcleos de partículas grandes o detritos celulares para evitar atascamientos. Siguiendo el protocolo presentado aquí, había no hay casos de obstrucción en la plataforma adaptada de Macosko et al. 2015 (N = 17) y una obstrucción parcial en la plataforma comercial (N = 16).

Los procedimientos de detergente industrial y mecánico hipotónica fueron utilizados para aislar los núcleos con éxito para dos plataformas de encapsulación de gota masivamente paralelo y resultados representativos se muestran en la figura 3. Ambos de estos métodos permitieron perfilamiento transcripcional de miles de núcleos y clasificación de tipos de células en la médula espinal lumbar de ratón adulto (figura 3). 4 estos enfoques dio lugar a genes comparables por núcleo para cada tipo de célula (figura 3 y D). Las tasas de recuperación de núcleos de entrada entre las dos plataformas diferencian. La plataforma adaptada de Macosko et al 2015 con modificaciones de Sathyamurthy et al. 2018 se recuperó aproximadamente el 0,59% de núcleos (± 0.05% SEM, N = 17), mientras que la plataforma comercial recuperó un estimado núcleos de 53,7% (N = 2).

Este protocolo se enriquece un poco para núcleos neuronales en la preparación final. En secciones del tejido de la médula espinal lumbar, se encontró que 27% de los núcleos eran positivo para el marcador neuronal NeuN (N = 7.368 núcleos de 2 animales), mientras que la preparación de núcleos de detergente-mecánica de la médula espinal lumbar resultó en 31.9% del total núcleos expresando NeuN, según clasificación de células activado por fluorescencia (FACS, ± SEM de 2.0%, N = 13 preparaciones de núcleos independientes usando muestras combinadas de múltiples animales en cada preparación, figura 4). Esto es similar a lo observado anteriormente para el porcentaje de núcleos positivos NeuN en la médula espinal entera (20% a 24% dependiendo de la edad),27 incluyendo las regiones cervicales y torácicas que tienen más materia blanca y oligodendrocitos. De nota, NeuN/Rbfox3 no se expresa en todas las neuronas y, por consiguiente, estas cifras son probablemente subestimaciones modestos. Es posible que pequeñas células no neuronales están un poco agotadas durante la purificación de gradiente de sacarosa. Además, parámetros de filtrado y análisis aguas abajo siguiendo la secuencia pueden alterar la distribución final de tipo de la célula porque las neuronas tienen más genes por núcleo (figura 3 y D) y, por lo tanto, son menos propensas a quitarse durante el proceso de filtrado.

Hay varios pasos claves en este protocolo que requieren atención. Douncing primero, excesiva o trituración (en los pasos 3 y 4, respectivamente) puede conducir a un aumento en la formación celular de escombros y partículas. Aunque la filtración y la centrifugación de densidad de sacarosa pueden separar partículas grandes, una vez que las partículas pequeñas se generan durante la lisis celular, son difíciles de eliminar. En segundo lugar, durante la homogeneización, no coloque el homogenizador directamente sobre la parte inferior del tubo de Oak Ridge. En cambio, sumerja el extremo de la homogeneizadora en la solución de sacarosa bajo que contiene núcleos resuspendidos, sin tocar el fondo del tubo. Homogenización mejora el aislamiento nuclear por eliminación de detritos celulares y la reducción de grumos y multiplets (figura 5). Tras centrifugación de densidad de sacarosa, es fundamental para extraer inmediatamente el tubo de la Oak Ridge de la centrifugadora y rápidamente decantar el sobrenadante en un rápido movimiento 'cajón'. Cuando resuspender los núcleos de la pared del tubo de Oak Ridge, Resuspender el precipitado 'salado' de a medio camino entre la banda de mielina y la parte inferior del tubo. Tenga en cuenta que la pastilla no sea visible. Resuspender núcleos mayores a lo largo del tubo puede resultar en contaminación de mielina en la preparación de núcleos. La lisis celular y pasos de centrifugación de densidad de sacarosa son los más críticos a la reducción de las partículas que podrían obstruir canales de microfluidos para uso río abajo.

Nombre del Material / equipo Concentración stock Concentración final Volumen / cantidad
Tampón de lisis detergente
Almacenador intermediario bajo sacarosa - - 600 ΜL
Triton-X 20% 0.10% 3 ΜL
Tampón de lisis hipotónica
Tris-HCl (pH = 7,4) 1 M 10 mM 100 ΜL
NaCl 5 M 10 mM 20 ΜL
MgCl2 1 M 3 mM 30 ΜL
Nonidet P40 - 0.01% 1 ΜL
Agua libre de nucleasas hasta 10 mL
Medio HEB
A hibernar - - 10 mL
Glutamax - - 100 ΜL
B27 - - 200 ΜL
Almacenador intermediario bajo sacarosa
Sacarosa - 0,32 M 2.75 g
HEPES (pH = 8.0) 1 M 10 mM 250 ΜL
CaCl2 1 M 5 mM 125 ΜL
MgAc 1 M 3 mM 75 ΜL
EDTA 0.5 M 0,1 mM 5 ΜL
TDT 1 M 1 mM 25 ΜL
Agua libre de nucleasas hasta 25 mL
Buffer de densidad de sacarosa
Sacarosa - 1 M 8.6 g
HEPES (pH = 8.0) 1 M 10 mM 250 ΜL
MgAc 1 M 3 mM 75 ΜL
TDT 1 M 1 mM 25 ΜL
Agua libre de nucleasas hasta 25 mL
Solución de resuspensión
1 X PBS - - 1 mL
BSA 20 mg/mL 0,4 mg/mL 20 ΜL
Inhibidor de Rnasa 40 U/ΜL 0,2 U/ΜL 5 ΜL

Tabla 1: Tabla de soluciones.

Crudo Homogeneizada Final
Detergente-mecánica 100 ± 15% 87 ± 9% 20 ± 2%
Hipotónico-mecánica 62 ± 12% 35 ± 4% 8 ± 1%

Tabla 2: rendimiento de núcleos en cada paso en el protocolo de. El número de núcleos en la preparación inicial de crudo después de dounce homogeneización en el protocolo de lisis mecánica de detergente se utilizó para estimar el número de núcleos en la médula espinal lumbar. Rendimiento de los núcleos iniciales (2.6 x 106 núcleos ± 4.0 x 105 SEM, N = 3) se utilizó para calcular el rendimiento de los núcleos en cada paso río abajo para ambos protocolos de lisis mecánica hipotónica y detergente. El número de núcleos aislados por la preparación mecánica hipotónica se normalizó a los núcleos iniciales estimados. Valores de la tabla son media ± SEM, N = 3.

Figure 1
Figura 1: esquema de aislamiento nuclear. Núcleos de la médula espinal adulta pueden ser aislados mediante lisis de detergente industrial o hipotónica-mecánica de la célula, seguida de la homogenización y la centrifugación gradiente de densidad de sacarosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Representante brightfield y núcleos teñidos de DAPI en clave los pasos en el protocolo de.  (A, B) núcleos crudo después de lisis de detergente-mecánica o mecánica hipotónica. (C, D) Núcleos después de la homogeneización. (E, F) Núcleos serán suspendidos en PBS con BSA 0,04% tras centrifugación de densidad de sacarosa. Los núcleos se fijaron con paraformaldehído al 2% y posteriormente teñidos utilizando azul de tripán o DAPI. Imágenes se tomaron 10 X (barra de escala = 100 μm) usando brightfield y epi-fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Representante tSNE parcela de núcleos secuenciados: usando detergente-mecánica y de mecánica hipotónica lisis. (A) resultados de secuenciación más 17.000 núcleos de la médula espinal lumbar ratón adulto disecado tras la lisis mecánica de detergente y según Macosko et al 2015 con modificaciones de Sathyamurthy et al. 2018. esta figura se ha modificado con permiso de Sathyamurthy et al. 2018.4 (B) resultados obtenidos de los 5.000 núcleos la secuencia desde el expulsado medular lumbar adulto, tras la lisis hipotónica-mecánica y una plataforma de encapsulación de microfluidos comercial unicelular. 26  (C, D) genes promedio por resultados núcleo clústeres principales tipos de células en la médula espinal de ratón adulto ± SEM. De la nota, el procedimiento de lisis mecánica detergente seguido de la Macosko et al. plataforma 2015 se realizó mediante disecado de la médula espinal lumbar, mientras que la lisis hipotónica mecánico seguida de la plataforma comercial se realizó utilizando expulsado lumbar de la médula espinal (como se describe en este protocolo). Teniendo en cuenta que expulsar el cable elimina los ganglios de raíz dorsal y dura, el cúmulo de células meníngeas/Schwann está ausente de la figura 3B y D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Diagrama de FACS de NeuN+ núcleos tras la lisis mecánica de detergente. Parcela de FACS mostrando núcleos fijos manchadas para NeuN (promedio 31.9% del total núcleos ± 2.0% SEM, N = 13), aislado mediante el protocolo de lisis mecánica de detergente. Para la fijación inmediata, núcleos para la validación de la FACS, una preparación cruda de núcleos se obtuvo por dounce homogeneización de médulas espinales con la preparación mecánica de detergente, seguida de fijación inmediata con 1% PFA con un período de incubación de 5 minutos. Fijación fue apagada con glicina 250 mM, y se obtuvieron núcleos. Se efectuó la tinción con anticuerpos anti-NeuN en solución. FACS fue realizada en fijo, núcleos de NeuN manchado usando un clasificador de células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: preparación de núcleos sin homogeneización. Los núcleos fueron suspendidos antes de la centrifugación de densidad de sacarosa después de A detergente industrial o lisis hipotónica-mecánica de B , sin homogeneización. * Denota la ruina celular que une a los núcleos (A) y un multiplet de núcleos Unidos por detritos celulares (B). Núcleos serán suspendidos en PBS con BSA 0,04% tras centrifugación de densidad de sacarosa. Los núcleos se fijaron con paraformaldehído al 2% y posteriormente teñidos utilizando azul de tripán o DAPI. Imágenes fueron tomadas a 10 X (escala bar 100 μm) usando brightfield y epi-fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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El objetivo final de este protocolo es aislar a los núcleos que contienen RNA de alta calidad para posteriores análisis transcripcional. Adaptamos métodos snRNA-Seq para Perfil de todos los tipos de células en la médula espinal. Inicialmente, se encontró que célula típica disociación métodos eran ineficaces para secuenciación unicelular RNA, como las neuronas de la médula espinal son especialmente vulnerables a la muerte celular. Además, métodos de disociación celular inducen la expresión de varios genes de la respuesta de estrés y actividad por hasta varios centuplicado. 3 , 4 , 16 dados los inconvenientes asociados con los preparativos de la célula, nosotros y otros hemos usado núcleos como alternativa. 16 , 17 , 18 , 24 este método puede utilizarse también en tejido humano, incluyendo tejido congelado de la médula espinal. 4 , 19 , 24 aquí, nos describirá las fortalezas y limitaciones de este enfoque.

Fortalezas de este método incluyen la evitación de IEGs inducida experimentalmente, así como la habilidad de usar tejido fresco y congelado. 4 por lo tanto, este enfoque puede ser útil para sondear IEGs endógenas después de un comportamiento o estímulo. 1 , 3 , 4 una de las ventajas de este método es que no requiere de dispositivos especializados para la utilización de núcleos de secuenciación masivamente paralela de núcleo único, pero puede utilizar la plataforma desarrollada por Macosko et al 2015, con ajustes menores de tasa de flujo y buffer lisis o uso los sistemas comercialmente disponibles. Por otra parte, la secuencia núcleo único ha demostrado para ser un método comparable a la de secuencia de la célula para la identificación de tipos de la célula, a la fuerza de este enfoque. 28 , 29 sin embargo, hay varias limitaciones importantes de este enfoque. Los núcleos contienen aproximadamente 20-50% de los ARNm celulares,29 y esto se refleja en un menor número de transcripciones por núcleo en comparación con la secuencia de la célula. 18 , 29 incluyendo Lee intronic de snRNA-Seq es una forma de aumentar el número de genes detectados.

Hay varios protocolos disponibles que permiten aislamiento de núcleos de tejido. 2 , 16 , 17 , 18 , 24 , 30 en comparación con la mayoría de los métodos, los protocolos aquí presentados no requieren retiro de mielina, ultracentrifugación, o muchos pasos de centrifugación o lavado que puede conducir a un menor número final de núcleos. Además, este protocolo toma 45 minutos (detergente-mecánico) o 1 hora (hipotónica mecánico) para completar. Comerciales protocolos soportados en plataformas de microfluidos son más del doble el tiempo y requieren muchos más pasos de centrifugación, aumentando el riesgo de pérdida de núcleos. En contraste con los protocolos de aislamiento de núcleos que implican sólo lisis y filtrado, los métodos presentados aquí incluyen un gradiente de sacarosa para aumentar la pureza de los núcleos finales. Este paso es necesario para el tejido de la médula espinal adulta debido al gran porcentaje de la materia blanca y la consiguiente ruina del myelin.

El protocolo de lisis mecánica de detergente se puede utilizar para la disociación del tejido completo y lisis, y el protocolo de lisis hipotónica mecánico puede utilizarse para controlar la cantidad de tejido celular y disociación desperdicios en la aplicación de aguas abajo. Estos protocolos se pueden utilizar para material bio-Banco, difícil de disociar los tejidos y para la investigación de los cambios transcripcionales dependiente de actividad mediante el aislamiento de los núcleos para abajo masivamente paralelo snRNA-SS. Además de secuenciación masivamente paralela solo núcleo RNA, este protocolo se puede utilizar para aislar los núcleos para usos alternativos, incluyendo inmunofluorescencia y FACS y análisis epigenético como estudios de metilación del ADN y ChIP-Seq (figura 4 ). 23

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Disclosures

No tenemos conflictos de interés que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por el programa intramuros de NINDS (1 ZIA NS003153 02) y NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Agradecemos a L. Li y C.I. Dobrott por su apoyo técnico y discusiones útiles y C. Kathe para revisar el manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Invitrogen 15503-022
1 M HEPES (pH = 8.0) Gibco 15630-080
CaCl2 Sigma Aldrich C1016-100G
MgAc Sigma Aldrich M5661-50G
0.5 M EDTA (pH = 8.0) Corning MT-46034CI
Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 10197777001 Add DTT just prior to use
Triton-X Sigma Aldrich T8787
Nuclease-free water Crystalgen 221-238-10
1 M Tris-HCl (pH = 7.4) Sigma Aldrich T2194
5 M NaCl Sigma Aldrich 59222C
1 M MgCl2 Sigma Aldrich M1028
Nonidet P40 Sigma Aldrich 74385
Hibernate-A Gibco A12475-01
Glutamax (100x) Gibco 35050-061
B27 (50x) Gibco 17504-044
1x PBS Crystalgen 221-133-10
0.04% BSA New England Biolabs B9000S
0.2 U/μL RNAse Inhibitor Lucigen 30281-1
Oak Ridge Centrifuge Tube Thermo Scientific 3118-0050
Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-8B
Glass Tissue Dounce (2 mL) Kimble 885303-002
Glass large clearance pestle Kimble 885301-0002
Glass small clearance pestle Kimble 885302-002
T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer IKA 3737001
Dispersing tool (S 10 N – 5G) IKA 3304000
Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher Scientific T10282
40 μm cell strainer Falcon 352340
MACS SmartStrainers, 30 μm Miltenyi Biotec 130-098-458
Conical tubes Denville Scientific 1000799
Sorvall Legend XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004505
Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor Thermo Fisher Scientific 75003698
Sterological Pipettes: 5 mL, 10 mL Denville Scientific P7127
Hemocytometer Daigger Scientific EF16034F
Chemgenes Barcoding Beads Chemgenes Macosko-2011-10
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) Corning 352235
MoFlo Astrios Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns 10X Genomics 120262
Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns 10X Genomics 120267
Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns 10X Genomics
Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm) Corning 353002

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References

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  30. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353, (6302), 925-928 (2016).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.

Step 3.1 was updated from:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.

to:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.

Step 3.6 was updated from:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.

to:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.

Step 5.5 was updated from:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

to:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

Step 5.6 was updated from:

Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

to:

Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.

to:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
Aislamiento de núcleos de adultos de la médula espinal para secuenciación masivamente paralela solo núcleo ARN
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Matson, K. J. E., Sathyamurthy, A., Johnson, K. R., Kelly, M. C., Kelley, M. W., Levine, A. J. Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58413, doi:10.3791/58413 (2018).More

Matson, K. J. E., Sathyamurthy, A., Johnson, K. R., Kelly, M. C., Kelley, M. W., Levine, A. J. Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58413, doi:10.3791/58413 (2018).

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