Summary
Deze methode van trypanosoom afscheiding van bloed is afhankelijk van hun oppervlakte lading minder negatief dan bloed zoogdiercellen. Geïnfecteerd bloed is geplaatst en worden behandeld op een anionenwisselaar kolom. Deze methode, de meest passende diagnose voor slaapziekte, biedt gezuiverde parasieten voor immunologische, biologische, biochemische, farmaceutische en moleculaire biologie onderzoek.
Abstract
Met deze methode kunt de scheiding van trypanosomen, parasieten die verantwoordelijk is voor mens en dier Afrikaanse trypanosomiasis (hoed), van besmet bloed. Dit is de beste methode voor diagnose van eerste fase hoed en bovendien deze parasiet reiniging methode toelaat serologische en onderzoek van onderzoeken.
HOED wordt veroorzaakt door de tseetseevlieg verzonden Trypanosoma brucei gambiense en T. b. rhodesiense. Verwante trypanosomen zijn de causatieve agenten van dierlijke trypanosomiasen. Opsporing van trypanosoom is essentieel voor de diagnose, de behandeling en de follow-up van de hoed. De hier beschreven techniek is de meest gevoelige parasiet detectie techniek, aangepast aan de veldomstandigheden voor de diagnose van T. b. gambiense hoed en binnen een uur kan worden voltooid. Bloed is gelaagd op een anionenwisselaar kolom (cellulose Gebondenkleurstof) eerder aangepast aan de pH 8, en elutie buffer wordt toegevoegd. Zeer negatief geladen bloedcellen zijn geadsorbeerde op de kolom, terwijl de minder negatief geladen trypanosomen passeren. Verzamelde trypanosomen zijn Ingehuld door centrifugeren en waargenomen door microscopie. Parasieten zijn bovendien bereid zonder cellulaire schade met behoud van hun infectiviteit.
Gezuiverde trypanosomen zijn vereist voor immunologische testen; ze worden gebruikt in de trypanolyse test, de gouden standaard in HAT serologie. Gekleurd parasieten worden gebruikt in de kaart agglutinatietest (CATT) voor veld serologie. Antigenen van gezuiverde trypanosomen, zoals variant oppervlakte glycoproteïne, exoantigens, worden ook gebruikt in verschillende immunoassay. De hier beschreven procedure is ontworpen voor Afrikaanse trypanosomen; chromatografie voorwaarden hebben bijgevolg elk trypanosoom-stam, en meer in het algemeen, worden aangepast aan het bloed van elke soort host zoogdier.
Deze fascinerende ziekteverwekkers zijn gemakkelijk gezuiverde en beschikbaar voor gebruik biochemische, moleculaire en cel biologie studies, met inbegrip van co cultuur met cellen van de gastheer om gastheer-parasiet-relaties op het niveau van de membraan receptoren, signalering en gene te onderzoeken expressie; drug testen in vitro; onderzoek van gene schrapping, mutatie of overexpressie stofwisselingsprocessen, cytoskeletal biogenese en parasiet overleven.
Introduction
De methode voorgesteld beschreven hier kunnen de scheiding van trypanosomen, parasieten die verantwoordelijk is voor mens en dier Afrikaanse trypanosomiasis (hoed), uit bloed. Dit is de beste methode voor diagnose van eerste fase hoed en bovendien deze parasiet reiniging methode vergunningen robuuste serologische en onderzoek onderzoek.
HOED wordt veroorzaakt door de tseetseevlieg verzonden Trypanosoma brucei gambiense en T. b. rhodesiense1. Deze eencellige parasieten vermenigvuldigen extracellularly in de bloedsomloop, lymfe en interstitiële vocht tijdens de eerste fase van de ziekte (hemolymphatic fase). De tweede fase (meningoencephalitic fase) begint als parasieten over de bloed-hersenbarrière; neurologische symptomen, met inbegrip van een wanorde van de slaap, die haar naam "slaapziekte" aan deze ziekte heeft gegeven, zijn typerend voor deze tweede fase2. Verwante trypanosomen (T. b. brucei, T. vivax, T. congolense, T. evansi) zijn de causatieve agenten van dier Afrikaanse trypanosomosis (AAT)3.
De World Health Organization (WHO) wil elimineren hoed als een probleem voor de volksgezondheid in 2020 en stoppen van de transmissie door 20304. De recente invoering van snelle diagnose tests heeft verbeterde serologische diagnose1,4,5. Verschillende moleculair diagnostische tests zijn ontwikkeld, maar hun rol in de diagnostische gegevens van het veld nog niet is vastgesteld5. Ze worden gebruikt voor het identificeren van de sub-soorten van de brucei groep en atypische trypanosomiase veroorzaakt door parasieten die verantwoordelijk zijn voor dierlijke trypanosomosis6.
De detectie van de parasiet is essentieel voor de diagnose, de behandeling en de follow-up, zoals serologie kan valse positieve en helaas valse negatieve resultaten1geven. De directe microscopische observatie van de protisten van deze hemoflagellate is moeilijk in HAT gevallen die worden veroorzaakt door t.b. gambiense, (meer dan 95% van de gevallen) als lage parasitemias de regel zijn, terwijl voor hoed veroorzaakt door t.b. rhodesiense, een grote aantal parasieten zijn vaak aanwezig in het bloed. Verschillende concentratie technieken zijn gebruikt, zoals de daling van de dikke en capillair centrifugeren (CTC), maar de scheiding van parasieten van bloed door een kolom van anionenwisselaar (cellulose Gebondenkleurstof) gevolgd door centrifugatie en microscopische observatie van de pellet, is de meest gevoelige methode (ongeveer 50 parasieten/mL bloed kunnen worden gedetecteerd)1,7. Bijgevolg, de zuivering van trypanosomen door deze methode anion-wisselaars (cellulose Gebondenkleurstof) is de beste en, tot op heden, de referentiemethode voor het visualiseren en isoleren van parasieten uit bloed voor hoed diagnose. In veldomstandigheden, een mini kolom van cellulose Gebondenkleurstof is succesvol gebruikt en verschillende verbeteringen hebben vergemakkelijkt microscopische observatie7,8.
De methode van trypanosoom scheiding van bloed, hieronder beschreven, hangt af van parasiet oppervlakte heffing, welke minder negatief dan bloed zoogdiercellen9is. Interessant is dat deze methode 50 jaar geleden, in 1968 door Dr. Sheila Lanham werd ontwikkeld, en blijft de gouden standaard voor detectie en voorbereiding van de bloedbaan trypanosomen. Het is snel en reproduceerbare voor salivaria trypanosomen uit een breed scala van zoogdieren, de diagnose van zowel mens en dier van trypanosomiasis10het toelaat.
Met het oog op een levend, gezuiverde parasieten, wordt geïnfecteerd bloed op een anionenwisselaar kolom toegevoegd. Chromatografie voorwaarden (voornamelijk pH, Ionische sterkte van buffers/media) hebben elk trypanosoom soorten, en meer in het algemeen, worden aangepast aan elke mix van zoogdieren bloed cellen en de trypanosomen10. Elutie buffer wordt juist ingesteld op pH 8 voor de meeste Afrikaanse trypanosomen10. Deze methode geeft voorrang aan de concentratie van parasieten gevonden in het bloed van patiënten, omdat parasitemias kan te laag worden gedetecteerd door microscopische observatie alleen, en hierdoor ook laboratoriumonderzoek. Werken met vers geïsoleerde trypanosomen en op het bloed van besmette dieren, met behulp van deze techniek, is meer relevant voor verschillende onderzoeken dan studies met parasieten die in een van de omstandigheden in het laboratorium hebben zijn gekweekt voor onbepaalde tijd.
Gastheer-parasiet-relaties worden best bestudeerd met een parasiet infecteren de natuurlijke gastheer, daarom, T. musculi, een natuurlijke lymfkliertest parasiet, die representatief is voor de extracellulaire trypanosomen, heeft vele voordelen zoals lymfkliertest infectie gaat in een kleine proefdier en vereist geen biohazard veiligheidsvoorwaarden niveau (BSL). T. musculi doodt niet immunocompetent muizen, in tegenstelling tot vele andere soorten van Trypanosoma , waaronder de menselijke pathogenen. T. musculi zijn in T-cel-beroofd muizen niet geëlimineerd en parasitemias bij besmette muizen kan worden verhoogd door het wijzigen van voedsel en voedingsstoffen inname11. Deze parasiet moduleert de immuunrespons bij co-infecties met andere ziekteverwekkers12. T. musculi van geïnfecteerde muizen vertonen verschillen van gekweekte T. musculi, bijvoorbeeld de uitdrukking van membraan Fc receptoren is verloren gegaan in T. musculi Axenische culturen, in vergelijking met parasieten gezuiverd van geïnfecteerde muizen13 , 14. Excreted-uitgescheiden factoren (ESF) zijn ook kwalitatief en kwantitatief minder uitgesproken in een trypanosoom culturen en verschillen tussen stammen geïsoleerd in endemische gebieden15. ESF zijn de eerste antigenen om te worden weergegeven om het immuunsysteem van de gastheer en dus spelen een belangrijke rol in de oorspronkelijke host immuunrespons16.
In experimenteel geïnfecteerde dieren voor laboratoriumonderzoek vergemakkelijkt dit protocol experimenten met een groter aantal parasieten, minimaliseren van het aantal muizen vereist vooral bij gebruik van immunosuppressie dieren. De variant oppervlakte glycoproteïnen (VSGs) die worden gebruikt in de Card Agglutination Test for Trypanosomiasis (CATT) in mass screening zijn nog gezuiverd van trypanosomen die worden doorgegeven bij ratten. De twee snelle diagnostische tests (individueel verpakt cassettes) die nu beschikbaar zijn voor gebruik in het veld zijn nog steeds met een besmettelijk model bron van inheemse VSGs en niet in vitro gekweekt trypanosomen1,4, 5. de vooruitgang in de studie van de trypanosoom immunologie en celbiologie heeft bevorderd aangezien deze parasieten van de gezuiverde cellulose Gebondenkleurstof gemakkelijk worden in grote hoeveelheden van nature of experimenteel geïnfecteerde hosts, en met name knaagdieren verkregen kunnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Onderzoek voldaan aan de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren (NIH publicatie No. 85±23, herziene versie van 1996). Protocollen werden goedgekeurd door onze lokale ethische commissie.
1. dieren
- Houden vrouwelijke Swiss (van-1) muizen leeftijd van acht tot tien weken oud, 20-25 g, in een dier huisvesting faciliteit vijftien dagen vóór elk experiment. Huis hen in geventileerde vakken die worden bewaard in een beveiligde, temperatuur (22 ° C) en luchtvochtigheid (50%) kamer, met 12 uur aan/uit lichte cyclus gecontroleerd.
- Dieren gratis toegang geven tot voedsel en water. Minimaliseren van pijn, lijden en ongemak en verrijking van het milieu te bieden.
- Gebruik voor het omkasten, duidelijk Meerwandig kooien, verrijking met houten stokken en kartonnen tunnels. Zachtjes trekken een dier in een tunnel voor het overbrengen van de kooi naar de palm van de hand.
- Het uitvoeren van dagelijkse controle om te beoordelen van tekenen van prostration, sociaal isolement, lichaam schade, gegolfde haren of gebrek aan verzorging.
- Wegen elk dier eenmaal per week. Het uitvoeren van regelmatige inspecties door een dierenarts.
- Voor natuurlijke parasieten, verzamelen van bloed op het hoogtepunt van parasitemia en voor parasieten die dieren dood veroorzaakt, het verzamelen van bloed eergisteren veronderstelde dood.
Opmerking: Alle experimenten met infectieuze agentia worden uitgevoerd in speciale kamers, volgens de richtlijnen van de Universiteit goedgekeurd.
2. buffers, media preparaten
- Weeg van elke stof en Voeg gedistilleerd water voor de volgende buffers:
- Bereiden van geconcentreerde-fosfaatgebufferde zoutoplossing (2 x):
NB2HPO4 (watervrij) (MW 141.96 g) 10.14 g
NaH2PO4∙2H2O (MW 156.01 g) 0.62 g
NaCl (MW 58.44 g) 2.55 g
Gedistilleerd H2O tot 1 L - Bereiden-fosfaatgebufferde zoutoplossing-Glucose:
NB2HPO4 (watervrij) (MW 141.96 g) 5.39 g
NaH2PO4∙2H2O (MW 156.01 g) 0.31 g
NaCl (MW 58.44 g) 1.70 g
Glucose (MW 180 g) 10 g
Gedistilleerd H2O tot 1 L - 1 M KH2PO4voor te bereiden.
- Bereiden elutie Buffer: Met fosfaat gebufferde zoutoplossing-Glucose aanvulling
Penicilline (100 U/mL), streptomycine (100 µg/mL), en fenol rood (5 µg/mL).
- Bereiden van geconcentreerde-fosfaatgebufferde zoutoplossing (2 x):
3. bereiding van DEAE-gemengd met cellulose
- Plan rond 5 uur voor de voorbereiding van de DEAE-gemengd met cellulose.
- 100 g DEAE-gemengd met cellulose met gedestilleerd water in een maatkolf met een smalle nek wassen en laten regelen, dan verwijderen van fijne deeltjes. Herhaal wast totdat het supernatans helder is.
- Voeg 3 L geconcentreerde 2 x Phosphate-Buffered zout toe en roer.
- Breng pH op 8.0 met 1 M KH2PO4 en weggeworpen.
- Spoel tweemaal met gedestilleerd water en laten regelen.
- Wassen en laat regelen tweemaal met 3 liter Phosphate-Buffered Saline-Glucose en negeren het supernatant.
- Meten van de omvang van de cellulose en voeg een gelijk volume van Phosphate-Buffered Saline-Glucose, verdelen over plastic flessen en opslaan bij-20 ° C.
4. parasieten
- Verzamelen van trypanosoom stammen in gebieden endemisch voor mens en dier van trypanosomiasis. Houd parasieten ingevroren in vloeibare stikstof.
Opmerking: Trypanosoma musculi is niet pathogeen voor de mens en een extracellulair trypanosoom gebruikt ter vervanging van pathogene trypanosomen in verschillende laboratoriumexperimenten veilig. - In het geval van laboratoriumonderzoek waarvoor menselijke pathogenen, omgaan met experimenten met zorg in specifieke passende biohazard veiligheidsvoorwaarden niveau (BSL) en voorzorgsmaatregelen; BSL2 voor t.b. gambiense en BSL3 voor T. b. rhodesiense. In veldomstandigheden, standaard microbiologische praktijk is gevestigd: secure bemonstering, mechanische pipetteren, regelmatige ontsmetting van oppervlakken en sterilisatie van afval.
5. muis infectie
- Snel ontdooien van parasieten in een waterbad bij 37 ° C.
- Observeer een druppel ontdooide besmette bloed met een microscoop. Levensvatbaarheid van de parasiet door meting van het percentage van motile formulieren17te beoordelen.
- Injecteren parasieten intraperitoneally muizen (0,5 mL per muis). Elke dag, na infectie, verzamelen van 20 µL van staart bloed door naald punctie en observeren onder een microscoop. Parasitemia volgens Herbert en Lumsden18 evalueren door het tellen van parasieten in verschillende velden van de Microscoop, of met behulp van een haemocytometer.
- Wanneer de parasitemia een drempel die is gedefinieerd voor elke stam bereikt, verzamelen van het bloed (1 mL/muis) in de elutie buffer (5 mL/muis) met heparine (10 U/mL).
Opmerking: Het oorspronkelijke en het nieuwe werk van Lanham en Godfrey gemeld dat de optimale Ionische sterkte van fosfaat gebufferde zoutoplossing glucose voor verschillende soorten van de gastheer/parasiet van een stamoplossing pH 8,0.
6. parasiet scheiding
Opmerking: Alle experimenten vanaf dat moment moeten gebeuren in de kap van een weefselkweek dragen van handschoenen. De kamer temperatuur en vochtigheid in de laboratoria die gebruikt waren 22 ° C en 45% respectievelijk. In veldomstandigheden, is parasiet scheiding met succes uitgevoerd bij 34 ° C.
- Plaats van een 10 mL spuit in een verticale steun en voeg een eerder gesneden circulaire, stukje filtreerpapier, glaswol of spons van cellulose.
- Giet de cellulose Gebondenkleurstof in de spuit totdat de 8 mL-niveau wordt bereikt en daarna wassen met 25 mL van elutie buffer.
- Voeg voorzichtig 2 mL verdunde bloed op de top van de kolom en vervolgens voegt elutie medium. Regelmatig voegen elutie buffer volgens de doorvoer van de trypanosomen.
- Verzamelen van afvalwater druppels uit de kolommen in een centrifugebuis en regelmatig controleren op de aanwezigheid van parasieten met een microscoop.
- Wanneer er parasieten zijn niet meer gedetecteerd in de kolom afvalwater, centrifugeer de buis (1800 x g, 10 minuten, bij 4 ° C in het laboratorium en bij kamertemperatuur in veldomstandigheden).
- Verwijder het supernatant en Suspendeer de parasieten in 1 mL van het betrokken medium nodig is voor de volgende stap van onderzoekend.
- Tellen van parasieten met een hemocytometer en vul ze in geschikte voedingsbodem indien nodig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gezuiverde trypanosomen werden gebruikt in farmaceutische proeven. Parasieten worden overgebracht naar cultuur putten met seriële verdunningen van bepaalde drugs, hetzij alleen of gemengde19. Microscopische opmerkingen, evaluatie van de motiliteit is een marker van levensvatbaarheid kan worden uitgevoerd wanneer slechts een paar dugs worden getest, overwegende dat de AlamarBlue cel levensvatbaarheid assay is een uitstekende methode voor grote beweeglijkheid testen tijdens drug screening van20. Het effect van pentamidine, een referentie drug die wordt gebruikt in HAT therapie, is weergegeven in Figuur 1.
Macrofagen zijn zeer nuttig in culturen als feeder cellen. Zij toestaan dat, in vitro, de inleiding en ontwikkeling van trypanosoom culturen21. We hebben gemeld dat het aantal alternatief geactiveerde macrofagen zijn toegenomen in de trypanosoom-besmette zoogdieren waarin ze parasiet groei22 gunst. Deze alternatieve macrofaag activering levert L-ornithine, die is essentieel voor groei van de parasiet. In vitro macrofaag-parasiet co culturen hebben aangetoond dat trypanosomen macrofaag alternatieve activering via secreted factoren veroorzaken. Extracellulaire trypanosomen afscheiden een kinesin die bindt macrofaag mannose bindend receptoren inducerende arginase zinsnede het verrichten van L-ornithine productie ten gunste van de parasiet differentiatie en vermenigvuldiging23,24 ( Figuur 2). Mannose remt kinesin binding en arginase inductie en mannose receptor-deficiënte muizen verhelderen het doelwit van kinesin op macrofagen (Figuur 3).
Aangezien talrijke trypanosoom genomen zijn nu sequenced en geannoteerd, heeft men kunnen profiteren van deze grote gegevenssets. Vervolgens heeft men kunnen uitvoeren van forward en reverse genetics op deze parasieten. Met behulp van deze gegevens, gezuiverd bloedbaan formulier trypanosomen zijn gebruikt voor het karakteriseren en analyseren van belangrijke structuren zoals de flagellar zak (FP) en de bijbehorende cytoskelet. De FP is de enige site van endo- en exocytose in trypanosomen en ook waar de variabele oppervlakte glycoproteïnen van het endomembrane systeem25worden verhandeld. De flagellar zak kraag (FPC) is een ringvormige structuur die is gekoppeld aan het flagellum op het punt waar het verlaten van de FP, maar pas onlangs is weinig bekend over de bestanddelen van de eiwitten van het FPC gevormd. Wij hebben een grote proteïne van het FPC, TbBILBO1, geïdentificeerd en hebben aangetoond dat het essentieel om te overleven van de parasiet in de vorm van gekweekte insecten tseetseevlieg zowel in de bloedbaan vorm26. Knockdown van TbBILBO1 door RNAi voorkomt FP vorming en remt de biogenese van vele andere belangrijke cytoskeletal structuren, waardoor de FPC en de belangrijke doelstellingen van de FP voor interventie in alle pathogene trypanosomen. Indringende parasiet van gezuiverde of gekweekte cellen met antilichamen tegen TbBILBO1 geeft aan dat in de bloedbaan en procyclische (insect) vorm, het creëert een ringvormige structuur die het flagellum omzeilt. Dergelijke etikettering, op een formulier van de bloedbaan en wordt weergegeven in Figuur 4.
Gezuiverde bloedbaan formulier trypanosomen hebben toegestaan de karakterisering van vele ongewone biochemische en metabole eigenaardigheden, met inbegrip van metabolisme van glucose, die in peroxisoom-achtige organellen genaamd glycosomes plaatsvindt (Zie Figuur 5). Het was algemeen aanvaard dat pyruvaat is het belangrijkste eindproduct uitscheiding van glucose metabolisme door de bloedbaan trypanosomen, met vrijwel geen productie van succinaat en acetaat in het mitochondrion. In tegenstelling, converteren de procyclische trypanosomen threonine acetaat en glucose in succinaat en acetaat27,28. Energiemetabolisme van trypanosomatids kan worden geëvalueerd door aanpassing aan de koolstof van de beschikbare bronnen. Het combineren van omgekeerde genetica en metabolomic analyses bevestigd productie in het mitochondrion van bloedbaan trypanosomen van acetaat uit pyruvaat glucose-afgeleide en threonine, evenals de productie van tocoferolsuccinaat van glucose19,20 (Figuur 5). Bijvoorbeeld, bleek 1H-NMR analyse van eindproducten uitgescheiden door de bloedbaan formulier trypanosomen geïncubeerd in PBS met 4 mM glucose, dat glucose wordt voornamelijk omgezet in pyruvaat (85,1% van de uitgescheiden eindproducten), met een kleine productie van Alanine (9.2%), acetaat (4,9%) en succinaat (0,8%),29. Deze trajecten, die minder belangrijk in termen van metabole flux in vergelijking met pyruvaat productie van glucose zijn, zijn essentieel voor de groei van de parasiet. De succinaat productietraject kan dus worden beschouwd als een goede potentieel doelwit voor de ontwikkeling van nieuwe trypanociede drugs.
Figuur 1 : In vitro effect van pentamidine op T. b. brucei. Verdunningen van pentamidine werden toegevoegd aan 2 x 105 parasieten te bepalen van de concentratie remming van de groei van de parasiet met 50% (IC50). Dosis / effect-curven 24 uur van cultuur. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde van 5 onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Trypanosoom-gemedieerde arginase inductie. Een kinesin uitgebracht door trypanosomen bindt aan C-type lectine receptoren leidt tot arginase inductie. Dit resulteert in verhoogde productie van L-ornithine en Polyaminen, essentieel zijn voor de parasiet groei en differentiatie, en L-arginine uitputting, resulterend in lagere productie van cytotoxische Nee macrofaag NOS II. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Macrophage arginase activiteit. Arginase activiteit in macrofagen van controle muizen en Mannose receptor knock out (KO) muizen gekweekt in vitro in medium gedurende 48 uur, met of zonder kinesin of mannose. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde van 5 onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : TB BILBO1 labelen van een bloedbaan formulier Trypanosoma brucei brucei cel (A) immunofluorescentie labeling van een bloedbaan, cultuur vorm, 427 90-13 cel heeft zijn gesondeerd met anti-BILBO1 monoklonaal antilichaam gevolgd door een anti-muis FITC-gelabelde antilichamen en gevisualiseerd met behulp van ultraviolet licht, (Tb BILBO1 zijn de groene ringvormige signalen) en het DNA binden kleurstof DAPI (blauwe signalen) (B) A samenvoegen van DAPI, anti-BILBO1 en fase contrast beelden van A. schaal bar is gelijk aan 10 µm. Anti-BILBO1 muis monoclonal verdunde 1:10 in PBS en de (secundair antilichaam was anti-muis IgM FITC) was verdunde 1:100. Beelden werden genomen op een microscoop voorzien van een digitale camera. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Schematische weergave van glucose en threonine metabolisme in de bloedbaan formulier trypanosomen. Uitgescheiden eindproducten van glucose en threonine metabolisme zijn verpakt. De dikke blauwe pijlen geven enzymatische stappen van glucose metabolisme, wat leidt tot pyruvaat productie, die de belangrijkste eindproduct uitgescheiden uit glycolyse. Zwarte pijlen vertegenwoordigen over het hoofd gezien kleine stofwisselingsroutes uit glucose en threonine afbraak, die essentieel voor de groei van de parasiet zijn. De bijdrage van de aangegeven enzymen experimenteel is gevalideerd: ACH, acetyl-CoA thioesterase (EG 3.1.2.1); ASCT, acetaat: succinaat CoA-transferase (EG 2.8.3.18); AKCT, 2-amino-3-ketobutyrate co-enzym A ligase (EG 2.3.1.29); PEPCK, phosphoenolpyruvate carboxykinase (EG 4.1.1.49); PDH, pyruvaat dehydrogenase complexe (EG 1.2.4.1); TDH, threonine 3-dehydrogenase (EG 1.1.1.103). Afkortingen: AcCoA, acetyl-CoA; AOB, amino oxobutyrate; DHAP, dihydroxyacetone fosfaat; G3P, glyceraldehyde 3-fosfaat; MAL, malate; OA, oxaalazijnzuur; PEP, phosphoenolpyruvate; PYR, pyruvaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gezuiverde trypanosomen vertegenwoordigen een krachtig instrument om te studeren, immunologie, biochemie, cellulaire en moleculaire biologie. Grote delen van de gegevens en resultaten zijn verkregen van trypanosomen, die vervolgens geholpen om informatie te verkrijgen van andere eukaryotische cellen30. Trypanosomen zijn ook het onderwerp van belangrijke en interessante onderzoek omdat zij talrijke mechanismen waarmee ze te overleven en te groeien in twee zeer verschillende omgevingen hebben bedacht: de tseetseevlieg vector en de zoogdieren host23, 31. diverse technieken om te isoleren van trypanosomen hebben gemeld, en een review op microfluidics gebaseerde benaderingen is onlangs gepubliceerde32. Vandaar dat een reproduceerbare en robuust middel van parasiet isolatie is essentieel.
DEAE cellulose voorbereiding is een essentiële stap in dit protocol parasiet voorbereiding. Wassen voorwaarden moeten voorzichtig worden uitgevoerd om de fijne deeltjes te elimineren, en equilibreer de hars en de pH moet juist worden aangepast (pH 8.0 is geschikt voor de meeste trypanosoom soorten). Alle maatregelen moeten worden aangepast om de verbetering van de parasiet reiniging en opleveren met behoud van de levensvatbaarheid en mobiele eigenschappen van de parasiet. Bovenal parasiet levensvatbaarheid en infectiviteit gehandhaafd na zuivering door een kolom DEAE-gemengd met cellulose. Echter, sommige stammen zijn kwetsbaarder dan anderen en misschien wel minder besmettelijk na zuivering33. Daarom, de gevolgen van scheiding op pellicular membraan componenten, metabolisme van de parasiet, signalering, nucleic zuur functies, en dierlijke infectiviteit, moeten worden beoordeeld en scheiding voorwaarden moeten dienovereenkomstig worden aangepast.
Beperkingen met betrekking tot deze techniek zijn dat deze procedure moet worden aangepast aan elke trypanosoom soorten in een bepaalde host en ook tijdrovend is. Cellulose Gebondenkleurstof is bovendien nu duur. Voorbereidende tests zijn nodig om het optimaliseren van scheiding voorwaarden, met name de media, die verschillende Ionische sterke en een nauwkeurige pH wellicht. Pre kolom stappen, met inbegrip van anticoagulatie keuze, voorafgaande centrifugeren te verwijderen van de meerderheid van de erytrocyten, buffy coat gebruik en lysis van de erytrocyt, zijn gekozen op basis van elk experiment. Precieze wijzigingen op een enkele parameter (buffers, temperatuur in het gehele protocol, centrifugeren parameters) het aantal sterk kan toenemen, mate van zuivering en levensvatbaarheid van parasieten verkregen33. Ontwikkeling van nieuwe scheiding parameters volgens parasiet soorten en de zoogdieren bloedcellen worden gescheiden, kan het nodig zijn. Aanpassingen van het oorspronkelijke Lanham en Godfrey's protocol heeft toegestaan de zuivering van biologisch en antigenisch bewaarde T. cruzi van bloed34. Nieuwe harsen kunnen ook worden getest en gebruikt met passende voorwaarden voor verschillende soorten35.
De grote rol van uitgescheiden/uitgescheiden factoren (ES) door trypanosomatids is onlangs benadrukte16. ES bevatten moleculen betrokken bij pathologie en immunomodulatie, zoals kinesin, die wordt bewaard onder trypanosomen24. ES bereiding op basis van gezuiverde parasieten vereist bepaalde zorg om verontreiniging door elutie mediacomponenten en lysed parasieten te voorkomen.
Een effectief tegen Leishmania, een verwante parasiet, ES gebaseerde vaccin al bestaat en beschikbaar (CaniLeish Virbac)36. Vereniging van geconserveerde moleculen spelen essentiële rol in de parasiet overleven en groeien kan vormen de basis voor een toekomstige vaccin tegen trypanosomen, voor zowel mensen als dieren, in een één-gezondheid-aanpak. Zuivering van Afrikaanse trypanosomen uit bloed door DEAE-gemengd met cellulose kolommen, met verbeteringen, blijft de gouden standaard voor de opsporing van trypanosoom in natuurlijke gastheren met lage parasitemias in endemische gebieden en voor de noodzaak van parasieten in groten getale voor experimentele onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken alle leden van UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Dit onderzoek werd gesteund door interne financiering van de Universiteit van Bordeaux en steun van de ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024, en van de Association pour le développement de la recherche nl Parasitology et médecine tropicale en de Service Coopération et d'action culturelle de ambassade de France à Bangui (Centrafrique).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
References
- Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. Human African trypanosomiasis. Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).
- Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. Human African trypanosomiasis. Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).
- Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review. Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).
- Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454 (2017).
- Büscher, P., Deborggraeve, S. How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis? Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).
- Truc, P., et al. Atypical human infections by animal trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256 (2013).
- Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).
- Büscher, P., et al. Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471 (2009).
- Lanham, S. M. Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers. Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).
- Lanham, S. M., Godfrey, D. G. Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose. Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).
- Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice. Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).
- Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization. Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).
- Vincendeau, P., Daëron, M., Daulouede, S. Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages. Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).
- Vincendeau, P., Daëron, M. Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses. Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).
- Holzmuller, P., et al. Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics. Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).
- Holzmuller, P., et al. How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages? Frontiers in Immunology. 9, 778 (2018).
- Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi. Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).
- Herbert, W. J., Lumsden, W. H. Trypanosoma brucei: a rapid "matching" method for estimating the host's parasitemia. Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).
- Dauchy, F. A., et al. Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125 (2016).
- Raz, B., Iten, M., Grether-Bühler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro. Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).
- Albright, J. W., Albright, J. F. In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol. International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).
- Gobert, A. P., et al. L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis. Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).
- De Muylder, G., et al. A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731 (2013).
- Nzoumbou-Boko, R., et al. Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog. Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).
- Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated. PLoS Biology. 6 (5), e105 (2008).
- Albisetti, A., et al. Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei. PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710 (2017).
- Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate. Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).
- Bringaud, F., Rivière, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).
- Mazet, M., et al. Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587 (2013).
- Coutton, C., et al. Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human. Nature Communications. 9 (1), 686 (2018).
- Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake. Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).
- Barrett, M. P., et al. Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes. Pathogens. 6 (4), (2017).
- Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes. Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).
- Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism. Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).
- Cruz-Saavedra, L., et al. Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies. Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).
- Lemesre, J. L., et al. Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial. Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).
