Summary
혈액에서 trypanosome 분리의이 방법은 포유류 혈액 세포 보다 덜 부정 되 고 그들의 표면 충전에 따라 다릅니다. 감염 된 혈액은 놓이고 음이온 교환기 열에 치료. 이 방법, 아프리카 trypanosomiasis에 대 한 가장 피팅 진단 면역학, 생물학, 생화학, 제약 및 분자 생물학 수사에 대 한 정화 기생충을 제공합니다.
Abstract
이 메서드는 trypanosomes, 기생충 감염 된 혈액에서 인간과 동물 아프리카 trypanosomiasis (모자)에 대 한 책임의 분리 수 있습니다. 첫 번째 무대 모자의 진단 위한 가장 좋은 방법 이며 또한이 기생충 정화 방법 serological 허가 하 고 조사 연구.
모자는 체체파리 비행 전송 Trypanosoma brucei gambiense 에 의해 발생 및 T. b. rhodesiense. 관련된 trypanosomes는 동물 trypanosomiasis의 원인이 되는 에이전트. Trypanosome 탐지 모자 진단, 치료 및 후속 필수적 이다. 여기에 설명 된 기술은 가장 중요 한 기생충 검출 기법, T. b. gambiense 모자의 진단에 대 한 필드 조건에 적응 이며, 1 시간 이내 완료 될 수 있다. 혈액은 pH 8, 이전 조정 하는 음이온 교환기 열 (DEAE 셀 룰 로스)에 층이 고 차입 버퍼 추가 됩니다. 덜 부정 청구 trypanosomes 통과 하는 반면 매우 부정적으로 위탁 된 혈액 세포는 열에 흡착 됩니다. 수집 된 trypanosomes 원심 분리에 의해 수송과 있으며 현미경으로 관찰. 또한, 기생충은 그들의 infectivity 유지 하는 동안 세포 손상 없이 준비 됩니다.
순화 trypanosomes는 필요한 면역 테스트; 그들은 trypanolysis 분석 결과, 모자 혈 청 학에 골드 표준에에서 사용 됩니다. 얼룩진된 기생충 필드 혈 청 학에 대 한 카드 교착 시험 (CATT)에 활용 됩니다. 항 원은 변형 표면 당단백질, exoantigens, 같은 순화 trypanosomes에서 다양 한 immunoassays에도 사용 됩니다. 여기에 설명 된 절차는 아프리카 trypanosomes;에 대 한 설계 되었습니다. 따라서, 크로마토그래피 조건 호스트 포유동물의 각 종족의 피를 각 trypanosome 스트레인, 그리고 더 일반적으로 적용할 수 있다.
병원 체를 매혹적인 이들은 쉽게 순화 하 고 사용 수 생화학, 분자 세포 생물학 연구 호스트 세포 막 수용 체, 신호 전달, 유전자의 수준에서 호스트 기생충 관계 조사와 공동 문화를 포함 하 여 식; 약물 테스트 시험관; 유전자 삭제, 돌연변이, 또는 신진 대사 과정, cytoskeletal 속 기생충 생존에 overexpression의 조사.
Introduction
제시 하는 방법을 설명 여기 trypanosomes, 기생충 혈액에서 인간과 동물 아프리카 trypanosomiasis (모자)에 대 한 책임의 분리를 수 있습니다. 이 첫 번째 무대 모자의 진단 위한 가장 좋은 방법 이며이 기생충 정화 방법 강력한 serological 및 연구 조사를 허용 하는 또한.
모자는 체체파리 비행 전송 Trypanosoma brucei gambiense 와 T. b. rhodesiense1. 발생 이 protozoan 기생충 질병 (hemolymphatic 단계)의 첫 번째 단계에서 혈 류, 림프, 및 간 질 성 체액 extracellularly 곱하면 됩니다. 2 단계 (meningoencephalitic stage) 시작 때 기생충 혈액 뇌 장벽; 신경 징후,이 질병에 그것의 이름을 "잠자는 병" 주신, 수 면 장애를 포함 하 여이 2 단계2의 전형입니다. 관련된 trypanosomes (T. evansi, T. congolense, T. vivax, T. b. brucei)는 동물 아프리카 trypanosomosis (AAT)3의 원인이 되는 에이전트.
세계 보건 기구 (WHO) 2020 공중 보건 문제로 모자를 제거 하 고 20304전송 중지를 목표로 합니다. 급속 한 진단 테스트의 최근 소개는 향상 된 혈 청 학적인 진단1,,45. 여러 가지 분자 진단 테스트 개발 되었습니다 하지만 필드 진단에 그들의 역할은 아직 되지 설립된5. 그들은 brucei 그룹 및 기생충 동물 trypanosomosis6에 대 한 책임에 의해 발생 하는 비정형 trypanosomiasis의 하위 종류를 식별 하는 데 사용 됩니다.
혈 청 학 틀린 긍정적이 고 불행 하 게도 틀린 부정적인 결과1을 줄 수 있는 기생충의 검출 진단, 치료 및 후속, 필수적 이다. 이러한 hemoflagellate 원생의 직접적인 현미경 관찰 모자 경우 발생 하는 T. b. gambiense, (케이스의 95% 이상)에 의해 낮은 parasitemias는 규칙으로 모자에 대 한 T. b. rhodesiense, 큰에 의해 발생 하는 반면에 어렵습니다. 기생충의 수는 자주 혈액에 존재 한다. 다양 한 농도 기술은 사용 된 두꺼운 드롭 등 세관 원심 분리 (CTC), 하지만 음이온 교환기 (DEAE 셀 룰 로스)의 열에 의해 혈액에서 기생충의 분리 다음 원심 분리와 현미경 관찰은 작은, 가장 민감한 방법 (혈액의 약 50 기생충/mL를 검출 될 수 있다)1,7. 따라서,이 음이온 교환기 (DEAE 셀 룰 로스) 메서드에서 trypanosomes의 정화는 최고 고, 데이트, 시각화 및 격리 모자 진단 위한 혈액에서 기생충에 대 한 참조 방법. 필드 조건에서 DEAE 룰의 미니 열 성공적으로 사용 되 고 현미경 관찰7,8을 촉진 하는 몇 가지 개선.
혈액, 아래 설명에서 trypanosome 분리의 방법은 포유류 혈액 세포9보다 덜 부정적 이다 기생충 표면 충전에 따라 다릅니다. 흥미롭게도,이 방법은 50 년 전, 박사 쉴라 란 햄에 의해 1968 년에 개발 되었다 고 검색 및 혈 류 trypanosomes의 준비에 대 한 황금 표준 남아. 그것은 빠르고 다양 한 포유류, 허용 하는 둘 다 인간과 동물 trypanosomiasis10의 진단에서에서 salivarian trypanosomes에 대 한 재현.
생활, 정화 기생충, 감염 된 혈액은 음이온 교환기 열에 추가 됩니다. 크로마토그래피 조건 (주로 pH, 이온 강도 버퍼/미디어의) 포유류 혈액 세포와 trypanosomes10각 믹스를 각 trypanosome 종, 그리고 더 일반적으로 적용할 수 있다. 차입 버퍼 pH 8 대부분의 아프리카 trypanosomes10정확 하 게 조정 됩니다. Parasitemias 너무 낮은 혼자, 현미경 관찰에 의해 검출 될 수 있기 때문에이 방법은 환자의 혈액에서 발견 하는 기생충의 농도 호의 하 고 실험실 조사 수 있습니다. 일 갓 격리 된 trypanosomes와이 기술을 사용 하 여 감염 된 동물의 혈액에 무기한 기간에 대 한 실험실에 있는 axenic 조건에서 배양 된 기생충으로 연구 보다는 다양 한 조사에 대 한 관련입니다.
호스트 기생충 관계는 기생충 감염, 따라서, 그것의 자연적인 호스트 T. musculi, 자연 murine 기생충, 세포 외 trypanosomes의 대표, murine 감염에 관련 된 많은 이점이 가장 공부를 작은 실험실 동물 생물 안전 수준 (BSL) 조건 필요 하지 않습니다. T. musculi 인간 병원 체를 포함 하 여 다른 많은 Trypanosoma 종 달리 immunocompetent 쥐 죽 일 하지 않습니다. T. musculi 는 T 세포를 박탈 쥐에서 제거 되지 하 고 parasitemias 식품 및 영양소 섭취 량11를 수정 하 여 감염 된 생쥐에서 증가할 수 있다. 이 기생충에는 다른 병원 체12co 감염에 면역 반응 조절 한다. T. musculi 교양된 T. musculi 에서 감염 된 쥐 전시 차이에서 예를 들어 막 Fc 수용 체의 식 T. musculi axenic 문화, 기생충 감염된 쥐13 에서 정화에 비해 손실 됩니다. , 14. Excreted 분 비 요소 (ESF) 또한 질적 및 양적 덜 axenic trypanosome 문화 표현 되며 발병 지역15에 고립 된 긴장 사이 다. ESF는 호스트 면역 시스템에 표시 되 고 그래서 플레이 초기 호스트에서 중요 한 역할 면역 응답16를 첫 번째 항.
실험적 감염 동물 실험실 조사,이 프로토콜 마우스 immunosuppressed 동물을 사용할 때에 특히 필요한 수를 최소화 하는 기생충의 더 많은 수에 용이. 변형 표면 glycoproteins (VSGs)에 사용 되는 카드 교착 테스트 Trypanosomiasis (CATT)에 대 한 대량 검사에는 여전히 쥐에서 전파 되는 trypanosomes에서 순화 된다. 2 급속 한 진단 테스트 (개별적으로 감싸인된 카세트)는 필드에서 사용 하기 위해 사용할 수 있는 네이티브 VSGs와 trypanosomes에 체 외에서 배양 하지1,4, 의 감염 모델 소스를 사용 하 아직도 5. 이후 자연스럽 게 또는 실험적으로 감염 된 호스트에서 대량 및 특히, 설치류 DEAE 룰 정화 기생충이 쉽게 얻을 수 있습니다 trypanosome 면역학 및 생물학의 연구에서 발전 촉진 되었습니다 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
조사 관리 및 실험 동물 사용 (NIH 간행물 번호 85±23, 개정 1996)에 대 한 지침을 준수. 프로토콜은 우리의 지역 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. 동물
- 8 10 주 오래 된, 20-25 g, 주택 시설 15 일전 각 실험 동물에서 세 여성 스위스 (의 1) 마우스를 유지. 보호, 온도 (22 ℃)와 습도 (50%)에 보관 통풍이 상자에 그들을 집합니다 룸, 12 시간 라이트 사이클 온/오프 제어.
- 에 게 동물 무료로 음식과 물. 통증, 고통 및 고통을 최소화 하 고 환경의 농축을 제공.
- 주택, 일반 벽 감 금 소, 농축 나무 막대기와 골 판지 터널을 사용 합니다. 부드럽게 그것을 전송 케이지에서 손바닥에 터널으로 동물을 그립니다.
- 의식, 사회적 고립, 신체 상해, 뻗 치고 머리 또는 손질의 부족의 징후를 평가 하기 위해 일일 모니터링을 수행 합니다.
- 한 번 주 당 각 동물의 무게. 수 의사에 의해 정기적으로 검사를 수행 합니다.
- 자연 기생충에 대 한 parasitemia의 및 동물 죽음을 일으키는 원인이 되는 기생충에 대 한 피크에 혈액 수집, 추정 된 죽음 전날 혈액을 수집.
참고: 전염 성 요원으로 모든 실험 대학 승인 지침에 따라 전용된 객실에서 수행 됩니다.
2입니다. 버퍼, 미디어 준비
- 각 물질을 무게와 증류수 다음 버퍼에 대 한 추가:
- 집중된 인산 염 버퍼 식 염 수를 준비 (2 x):
나2HPO4 (무수) (MW 141.96 g) 10.14 g
NaH2포4∙2H2O (MW 156.01 g) 0.62 g
NaCl (MW 58.44 g) 2.55 g
H2O 1 l 증류수 - 인산 염 버퍼 식 염 포도 당을 준비:
나2HPO4 (무수) (MW 141.96 g) 5.39 g
NaH2포4∙2H2O (MW 156.01 g) 0.31 g
NaCl (MW 58.44 g) 1.70 g
포도 (MW 180 g) 당 10 g
H2O 1 l 증류수 - 1 M KH2포4를 준비 합니다.
- 인산 염 버퍼 염 분-포도 당으로 보충 차입 버퍼를 준비:
페니실린 (100 U/mL), 스 (100 µ g/mL), 페 놀 레드 (5 µ g/mL).
- 집중된 인산 염 버퍼 식 염 수를 준비 (2 x):
3입니다. DEAE-셀 루 로스의 준비
- DEAE-셀 루 로스 준비를 위해 약 5 시간을 계획 합니다.
- 100 g DEAE-셀 루 로스의 좁은 목 플라스 크에 증류수 세척과 후 정착, 미세 입자를 삭제 수 있습니다. 세척을 반복 하는 상쾌한 분명 하다.
- Phosphate-Buffered 염 분 및 저 어 집중 2 3 L를 추가 합니다.
- 1 M KH2포4 8.0 pH를 조정 하 고 상쾌한 삭제.
- 두 번 증류수로 세척 하 고 정착을 두고.
- 세척 하 고 두 번와 3 리터 Phosphate-Buffered 염 분-포도 당을 정착 하 고는 supernatants 삭제.
- 셀 룰 로스의 볼륨 측정 고 동일한 볼륨의 Phosphate-Buffered 염 분-포도 당 추가, 플라스틱 병에 배포-20 ° c.에 저장
4입니다. 기생충
- 인간과 동물 trypanosomiasis 발병 지역에서 trypanosome 종자를 수집 합니다. 액체 질소에서 냉동 기생충을 유지.
참고: Trypanosoma musculi 인 간에 게 병원 성 비 이며 안전 하 게 다양 한 실험실 실험에서 병원 성 trypanosomes를 대체 하는 데 사용 하는 extracellular trypanosome입니다. - 실험실 조사 인간 병원 체를 요구, 경우 처리 전용된 적절 한 생물 안전 수준 (BSL) 조건 및 주의; 주의 실험 T. b. gambiense 및 BSL3 T. b. rhodesiense에 대 한 BSL2. 필드 조건에서 표준 미생물학 연습 설립: 샘플링, 기계적 pipetting, 표면의 빈번한 오염 및 폐기물의 살 균을 확보.
5. 마우스 감염
- 빠르게 37 ° c.에 물 목욕에 기생충을 녹여
- 해 동된 감염 된 혈액의 드롭 현미경으로 관찰 합니다. 운동 형태17의 비율을 측정 하 여 기생충 생존 능력을 평가 합니다.
- Intraperitoneally 마우스 (마우스 당 0.5 mL)에 기생충을 삽입할. 매일, 감염 된 후, 바늘 구멍에 의해 꼬리 혈액의 20 µ L를 수집 하 고 현미경 관찰. 나는 haemocytometer를 사용 하 여 여러 현미경 분야의 기생충을 계산 하 여 허버트 강평18 에 따라 parasitemia를 평가 합니다.
- Parasitemia는 각 변형에 대해 정의 된 임계값에 도달 하면 헤 파 린 (10 U/mL)를 포함 하는 차입 버퍼 (5 mL/마우스)에 혈액 (1 mL/마우스)를 수집 합니다.
참고: Lanham Godfrey의 원래 고 소설 작품 인산 염의 최적의 이온 강도 버퍼링 염 포도 당 pH 8.0 재고 솔루션에서 여러 호스트/기생충 종에 대 한 보고.
6. 기생충 분리
참고: 이후이 시점에서 모든 실험은 장갑을 끼고 조직 문화 후드에서 수행 되어야 합니다. 실내 온도 습도 실험실 사용에 22 ° C와 45%에 각각 했다. 필드 조건에서 기생충 분리 성공적으로 수행 되었습니다 34 ° c.에
- 수직 지원에 10 mL 주사기를 놓고 이전 컷된 원형 필터 종이, 유리 솜 또는 셀 루 로스 갯 솜의 조각을 추가 합니다.
- 붓고 DEAE 룰 주사기 8 mL 수준에 도달 하면, 다음 차입 버퍼의 25 mL로 씻어 때까지.
- 신중 하 게 칼럼의 상단에 희석된 혈액의 2 개 mL를 추가 하 고 추가 차입 매체. 정기적으로 trypanosomes의 이동에 따라 차입 버퍼를 추가 합니다.
- 원심 분리기 튜브에서 열에서 유출 액을 수집 하 고 현미경으로 기생충의 존재에 대 한 정기적으로 확인.
- 때 기생충 이상 열 유출에 감지, 원심 관 (1800 x g, 10 분, 실험실에서 4 ° C에 주위 온도 필드 조건에).
- 상쾌한을 제거 하 고 조사 단계에 필요한 관련 매체의 1 mL에 기생충을 중단.
- hemocytometer와 기생충을 계산 하 고 필요한 경우 적절 한 매체에서 그들을 희석.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
순화 trypanosomes 제약 테스트에 사용 되었습니다. 기생충은 포함 하는 특정 약물, 혼자 또는 혼합19의 직렬 희석 문화 우물으로 전송 됩니다. 현미경 관찰, 운동 성 평가 생존의 표식만 몇 dugs 테스트 중인 때 수행할 수 있습니다, 그리고 반면 AlamarBlue 세포 생존 능력 분석 결과 약20를 심사 하는 동안 큰 운동 성 분석에 대 한 훌륭한 방법입니다. Pentamidine, 모자 치료에 사용 되는 참조 약물의 효과 그림 1에 표시 됩니다.
대 식 세포 피더 세포로 문화에 매우 유용 하다. 그들은 허용, 생체 외에서, 개시 및 trypanosome의 개발21문화. 우리 보고 trypanosome 감염 된 포유류는 그들이 기생충 성장22호의 또는 활성화 된 대 식 세포 수가 증가 된다. 이 대체 대 식 세포 활성화 공급 L ornithine는 기생충의 성장을 위해 필수적 이다. 대 식 세포 기생충 생체 외에서 공동 문화 trypanosomes 대 식 세포 분 비 요소를 통해 대체 활성화 유도 나타났습니다. 세포 외 trypanosomes arginase 식 L ornithine 생산 기생충 차별화와 곱하기23,24 ( 를 선호 제공 하를 유도 대 식 세포만 노 오 스 바인딩 수용 체를 바인딩하는 kinesin 분 비 그림 2). 만 노 오 스 억제 kinesin 바인딩 및 arginase 유도, 그리고만 노 오 스 수용 체 불충분 한 쥐 명료 (그림 3) 대 식 세포에는 kinesin의 대상.
이후 수많은 trypanosome 게놈 시퀀싱 및 주석 지금 있다, 우리는 이러한 큰 데이터 세트를 활용 하 수 있다. 그 후, 우리는 이러한 기생충에 앞으로 역 유전학을 수행할 수 되었습니다. 이러한 데이터를 사용 하 여 정화 혈 류 형태 trypanosomes 특성화 및 flagellar 주머니 (FP) 등 관련된 골격의 중요 한 구조를 분석 하는 이용 되었다. FP도 및 trypanosomes에 exocytosis의 유일한 사이트 이며 또한 변수 표면 glycoproteins endomembrane 시스템25에서 매매 됩니다. Flagellar 포켓 칼라 (FPC) 된 FP, 종료 하지만 약간 최근에 FPC의 단백질 성분에 대 한 알려진 때까지 지점에서 생물체에 연결 된 구조는 환상 이다. 우리 FPC, TbBILBO1의 주요 단백질을 발견 했다 고 교양된 곤충 체체파리 비행 형태와 혈 류 형태26에 기생충 생존을 위해 필수적입니다 것으로 나타났습니다. RNAi에 의해 결핵BILBO1의 최저 FP 형성을 방지 하 고 억제 하는 많은 다른 중요 한 cytoskeletal 구조, 모든 병원 성 trypanosomes에는 FPC와 개입에 대 한 FP 중요 한 목표를 만들기의 속. TbBILBO1 항 체를 순화 또는 교양 기생충 셀 프로 빙 나타냅니다 혈 류 형태와 procyclic (곤충) 양식, 그것은 생물체를 circumvents 고리 모양의 구조를 만듭니다. 이러한 라벨, 혈 류 형태에는 그림 4에 표시 됩니다.
순화 된 혈 류 형태 trypanosomes 많은 특이 한 생 화 학적 및 대사 특성, glycosomes ( 그림 5참조) 라는 peroxisome 같은 세포에서 일어나는 포도 당 대사를 포함 하 여 특성을 허용 했다. 그것은 일반적으로 그 pyruvate는 주요 최종 제품 혈 류 trypanosomes 호박에 mitochondrion 내부 아세테이트의 거의 아무 생산에 의해 포도 당 대사에서 배설 받아들여졌다. 대조적으로, procyclic trypanosomes 아세테이트 및 포도 당 합성 및 아세테이트27,28에 트레오닌을 변환합니다. 에너지 대사 trypanosomatids의 사용 가능한 탄소 소스에 적응 하 여 평가할 수 있습니다. 포도 당 파생 pyruvate를 트레오닌, 아세테이트의 혈 류 trypanosomes의에 mitochondrion에서 생산 뿐만 아니라 포도 당19,20에서에서 호박의 생산 확인 반전 유전학 및 metabolomic 분석 결합 (그림 5). 예를 들어, 1H NMR 분석 4 mM 포도 당를 포함 하는 PBS에서 incubated 혈 류 형태 trypanosomes에 의해 배설 하는 최종 제품의 공개 포도 당을 pyruvate (배설된 최종 제품의 85.1%)를 주로 변환의 작은 생산 알라닌 (9.2%), 아세테이트 (4.9%) 그리고 호박 (0.8%)29. 포도 당에서 pyruvate 생산에 비해 대사 속에서 사소한 이러한 경로 기생충의 성장을 위해 필수적입니다. 호박 생산 통로 따라서 trypanocidal 신약의 개발에 대 한 좋은 잠재적인 대상으로 여겨질 수 있다.
그림 1 :에 pentamidine의 효력 생체 외에서 T. b. brucei입니다. Pentamidine의 희석은 50% (IC50) 기생충의 성장을 억제 하는 농도 결정 하기 위해 2 × 105 기생충에 추가 되었습니다. 문화의 24 시간 복용량-효과 곡선. 오차 막대는 5 독립 실험에서 의미의 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Trypanosome 중재 arginase 유도. Trypanosomes에 의해 발표 kinesin arginase 유도로 이어지는 C 형 lectin 수용 체에 바인딩합니다. 이 결과 L ornithine polyamines, 기생충 성장 및 분화, 필수의 생산 증가 및 L-아르기닌 고갈, NOS II 대 식 세포에 의해 세포 독성의 낮은 생산의 결과로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 대 식 세포 arginase 활동. Arginase 활동 제어 마우스 및만 노 오 스 수용 체 노크 (KO) 마우스에서 대 식 세포에 생체 외에서 매체에 48 시간와 함께 또는 없이 kinesin 또는 노 오 스에 대 한 교양. 오차 막대는 5 독립 실험에서 의미의 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : Tb BILBO1 혈 류 폼의 라벨 Trypanosoma brucei brucei 셀 (A) 면역 형광 검사 혈 류, 문화 양식, 427 FITC 표시 반대로 마우스 항 체 이어서 안티-BILBO1 단일 클론 항 체로 조사 되어 90-13 셀의 라벨 및 자외선, (Tb 를 사용 하 여 시각화 BILBO1는 녹색 환상 신호)와 염료 DAPI (푸른 신호)를 묶는 DNA (B) A DAPI, 안티-BILBO1 및 위상 이미지 A. 규모 바 같음 10 µ m. 안티-BILBO1 마우스 단일 클로 널은 PBS에 이차 항 체 (1:10 희석된의 병합 반대로 마우스 IgM FITC) 희석된 배율을 사용 했다. 이미지는 디지털 카메라를 장착 하는 현미경에 찍은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 혈 류 형태 trypanosomes에서 포도 당 및 트레오닌 물질 대사의 도식 대표. 포도 당 및 트레오닌 물질 대사에서 배설된 최종 제품 박스입니다. 두꺼운 파란색 화살표는 주요 최종 제품에서 분해 배설 pyruvate 생산을 선도 하는 포도 당 대사의 효소 단계를 나타냅니다. 검은 화살표 대표 간과 기생충의 성장을 위한 필수적인 포도 당 및 트레오닌 저하에서 사소한 변화 통로. 표시 된 효소의 기여 실험적으로 검증: 크, 아 세 틸 coa thioesterase (EC 3.1.2.1); ASCT, 아세테이트: 호박 CoA 전이 효소 (적 능력 2.8.3.18); AKCT, 2-아미노-3-ketobutyrate 보 효소 A 리가 (EC 2.3.1.29); PEPCK, phosphoenolpyruvate carboxykinase (EC 4.1.1.49); PDH, pyruvate 효소 복잡 한 (EC 1.2.4.1); TDH, 트레오닌 3-효소 (적 능력 1.1.1.103) 약어: AcCoA, 아 세 틸 coa; AOB, 아미노 oxobutyrate; DHAP dihydroxyacetone 인산 염; G3P, glyceraldehyde 3 인산 염; 말, 말라; OA, oxaloacetate; 흠, phosphoenolpyruvate; PYR, pyruvate입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
순화 trypanosomes 면역학, 생화학, 세포 및 분자 생물학을 공부 하는 강력한 수단을 나타냅니다. 데이터 및 결과의 큰 확대는 다음 도움이 되는 정보를 얻기 위해 다른 진 핵 세포30trypanosomes에서 얻은 되어 있다. Trypanosomes는 또한 중요 하 고 흥미로운 연구 주제 때문에 그들은 생존 하 고 두 개의 매우 다른 환경에서 성장 하는 그들을 허용 하는 수많은 기계 장치를 고안 했다: 체체파리 비행 벡터 및 포유류 호스트23, 31. trypanosomes을 다양 한 기술을 보고 되었습니다, 그리고 마이크로-기반 접근에 대 한 리뷰는 최근 게시 된32. 따라서, 기생충 분리의 재현성 및 강력한 수단 필수적 이다.
DEAE 룰 준비는이 기생충 준비 프로토콜에서 필수적인 단계 이다. 세척 조건 미세 입자를 제거 하 고 수 지, equilibrate를 신중 하 게 수행 하 고 pH를 정확 하 게 조정 해야 합니다 (pH 8.0 쉽다 대부분 trypanosome 종). 모든 단계는 개선 기생충 정화 기생충 생존 능력 및 휴대 속성을 유지 하면서 항복을 조정 해야 합니다. 중요 한 것은, 기생충 생존 및 infectivity DEAE-셀 루 로스 열 통해 정화 후 유지 되었습니다. 그러나, 일부 종자는 다른 사람 들 보다 더 약 고 정화33후 덜 감염 수 있습니다. 따라서, 기생충 대사, 신호, 핵 산, 기능과 동물 infectivity pellicular 막 구성 요소에 대 한 분리 조건의 영향 평가 하 고 분리 조건을 적절 하 게 적용할 수 있다.
이 기술의 한계는이 이렇게 주어진된 호스트에 각 trypanosome 종에 적응 하는 또한 시간이 소요 됩니다. 또한, DEAE 셀 루 로스는 지금 비싸다. 예비 분석 분리 조건, 특히 미디어는 다양 한 이온 힘과 정확한 pH를 최적화 하는 데 필요한 있습니다. 전 열 단계, 항 응 혈 약 선택, 적혈구, 버 피 코트 사용, 및 적혈구 세포의 대부분을 제거 하려면 이전 원심 분리를 포함 하 여 각 실험에 따라 선택 됩니다. 단일 매개 변수 (버퍼, 프로토콜, 원심 분리 매개 변수를 통해 온도)에 정확한 변화 수를 크게 증가 수 있습니다, 정화 및 기생충의33. 기생충 종 및 포유류 혈액 세포 분리 될 새로운 분리 매개 변수를 개발 할 수도 있습니다. 초기 란 햄과 Godfrey의 프로토콜을 조정 혈액34에서 생물학 및 antigenically 보존된 T. cruzi 의 정화를 허용 했다. 새로운 수 지 또한 테스트 하 고 종35에 대 한 적절 한 조건을 함께 사용할 수 있습니다.
Trypanosomatids에 의해 배설/분 비 요소 (ES)의 주요 역할은 최근 강조16되었습니다. ES 분자 병 리 및 trypanosomes24중 보존 kinesin 같은 immunomodulation에 관련 된 포함 되어 있습니다. ES 준비 정화 기생충에서 차입 미디어 구성 요소와 lysed 기생충에 의해 오염 되지 않도록 특히 주의 해야 합니다.
ES 기반 백신 Leishmania, 관련된 기생충에 대 한 효과 이미 존재 하 고 사용할 수 있는 (CaniLeish Virbac)36. 기생충 생존 및 성장에 필수적인 역할을 재생 하는 보존된 분자의 협회 trypanosomes에 대 한 미래 백신에 대 한, 인간과 동물, 건강 한 접근 방식에 대 한 기초를 나타낼 수 있습니다. DEAE-셀 루 로스 열, 개선, 혈액에서 아프리카 trypanosomes의 정화 발병 지역에서 낮은 parasitemias와 자연 호스트에서 trypanosome 감지 하 고 기생충에 대 한 큰 숫자에 대 한 필요성에 대 한 황금 표준 남아 실험적인 수사입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD 대학교 드 보르도의 모든 회원을 감사합니다. 이 연구는 보르도의 대학에서 내부 자금에 의해 지원 되었다 및 지원 LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024, ANR 및 협회에서 부 르 지속 가능성 드 라 검색 en parasitologie 외 두개골 트로피와 서비스 드 coopération 동부 표준시 d'action culturelle de l'Ambassade de 프랑스 à 방기 (Centrafrique).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
References
- Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. Human African trypanosomiasis. Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).
- Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. Human African trypanosomiasis. Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).
- Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review. Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).
- Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454 (2017).
- Büscher, P., Deborggraeve, S. How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis? Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).
- Truc, P., et al. Atypical human infections by animal trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256 (2013).
- Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).
- Büscher, P., et al. Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471 (2009).
- Lanham, S. M. Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers. Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).
- Lanham, S. M., Godfrey, D. G. Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose. Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).
- Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice. Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).
- Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization. Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).
- Vincendeau, P., Daëron, M., Daulouede, S. Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages. Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).
- Vincendeau, P., Daëron, M. Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses. Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).
- Holzmuller, P., et al. Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics. Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).
- Holzmuller, P., et al. How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages? Frontiers in Immunology. 9, 778 (2018).
- Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi. Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).
- Herbert, W. J., Lumsden, W. H. Trypanosoma brucei: a rapid "matching" method for estimating the host's parasitemia. Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).
- Dauchy, F. A., et al. Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125 (2016).
- Raz, B., Iten, M., Grether-Bühler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro. Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).
- Albright, J. W., Albright, J. F. In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol. International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).
- Gobert, A. P., et al. L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis. Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).
- De Muylder, G., et al. A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731 (2013).
- Nzoumbou-Boko, R., et al. Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog. Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).
- Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated. PLoS Biology. 6 (5), e105 (2008).
- Albisetti, A., et al. Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei. PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710 (2017).
- Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate. Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).
- Bringaud, F., Rivière, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).
- Mazet, M., et al. Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587 (2013).
- Coutton, C., et al. Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human. Nature Communications. 9 (1), 686 (2018).
- Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake. Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).
- Barrett, M. P., et al. Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes. Pathogens. 6 (4), (2017).
- Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes. Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).
- Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism. Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).
- Cruz-Saavedra, L., et al. Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies. Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).
- Lemesre, J. L., et al. Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial. Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).
