Summary
Denne metoden trypanosome separasjon fra blod avhenger sine overflaten kostnader blir mindre negativ enn blod pattedyrceller. Infisert blod er plassert og behandlet på en anion-veksler kolonne. Denne metoden, den mest passende diagnose på Sovesyke, gir immunologiske, biologiske, biokjemiske, farmasøytisk og molekylærbiologi undersøkelser renset parasitter.
Abstract
Denne metoden tillater separasjon av trypanosomes, parasitter ansvarlig for dyr og menneskelige Sovesyke (HAT), fra infisert blod. Dette er den beste metoden for diagnostisering av første etappe lue og videre denne parasite rensing metoden tillater serologisk og forskning undersøkelser.
HAT er forårsaket av Tsetse fly overført Trypanosoma brucei gambiense og T. b. rhodesiense. Relaterte trypanosomes er den forårsaker agenter av dyr trypanosomiasis. Trypanosome påvisning er viktig for HAT diagnose, behandling og oppfølging. Teknikken er beskrevet her er det mest sensitive parasitten oppdagelsen teknikken, tilpasset feltforhold for diagnostisering av T. b. gambiense lue og kan fullføres innen én time. Blod er lagdelt på en anion-veksler kolonne (DEAE cellulose) tidligere justert til pH 8, og elueringsbufferen er lagt. Svært negativt ladde blod celler er adsorbert på kolonnen mens de mindre negativt ladde trypanosomes passerer gjennom. Samlet trypanosomes pelleted med sentrifugering og observert av mikroskopi. Videre er parasitter utarbeidet uten cellular skade samtidig som deres infectivity.
Renset trypanosomes kreves for immunologiske testing; de brukes i trypanolysis analysen, gullstandarden i HAT serologi. Farget parasitter benyttes i kortet agglutinerende test (CATT) for feltet serologi. Antigener fra renset trypanosomes, som variant overflaten glykoprotein, exoantigens, brukes også i ulike immunanalyser. Fremgangsmåten som er beskrevet her er beregnet for afrikanske trypanosomes; Følgelig må kromatografi forholdene tilpasses til hver trypanosome stamme, og mer generelt, blod hver art av verten pattedyr.
Disse fascinerende patogener er lett renset og tilgjengelig for bruk i biokjemiske, molekylære og cellen biologi studier inkludert co kultur med verten cellene til å undersøke vert-parasitten relasjoner på nivå med membran reseptorer, signalisering og genet uttrykk. Drug testing i vitro; undersøkelse av genet sletting, mutasjon eller overuttrykte på metabolske prosesser, cellen cytoskjelett biogenesis og parasitten overlevelse.
Introduction
Metoden presentert beskrevet her kan separasjon av trypanosomes, ansvarlig for dyr og menneskelige Sovesyke (HAT), blod parasitter. Dette er den beste metoden for diagnostisering av første etappe lue og videre denne parasite rensing metoden tillater robust serologisk og forskning etterforskning.
HAT er forårsaket av Tsetse fly overført Trypanosoma brucei gambiense og T. b. rhodesiense1. Parasittene protozoan multiplisere extracellularly i blodet, lymfe og interstitiell væske under den første fasen av sykdommen (hemolymphatic scenen). Den andre fasen (meningoencephalitic scenen) begynner når parasitter krysser blod-hjernebarrieren; nevrologiske tegn, inkludert en søvnforstyrrelse, som har gitt sitt navn "Sovesyke" denne sykdommen, er typisk for denne andre fase2. Relaterte trypanosomes (T. evansi, T. congolense, T. Samsung, T. b. brucei) er den utløsende agenter dyr afrikanske trypanosomosis (AAT)3.
World Health Organization (WHO) har som mål å eliminere HATTEN som et folkehelseproblem 2020 og unngå overføring av 20304. Den nylige lanseringen av rask diagnose tester har forbedret serologisk diagnose1,4,5. Flere molekylær diagnostiske tester har blitt utviklet, men deres rolle i feltet diagnostikk er ennå ikke etablert5. De brukes til å identifisere underarter av brucei grupper og atypiske trypanosomiasis skyldes parasitter ansvarlig for dyr trypanosomosis6.
Gjenkjenning av parasitten er viktig for diagnostisering, behandling og oppfølging, som serologi kan gi falske positive og dessverre falske negative resultater1. Direkte microscopical observasjon av disse hemoflagellate er vanskelig i HAT saker som er forårsaket av T. b. gambiense, (mer enn 95% av tilfellene) som lav parasitemias er regelen, mens for HAT forårsaket av T. b. rhodesiense, en stor antall parasitter er ofte tilstede i blodet. Ulike konsentrasjon teknikker har blitt brukt og tykk drop og kapillær tube sentrifugering (CTC), men separasjon av parasitter fra blod fra en kolonne av anion-veksler (DEAE cellulose) etterfulgt av sentrifugering og mikroskopiske observasjon av den pellets, er den mest sensitive metoden (rundt 50 parasitter/mL blod kan oppdages)1,7. Følgelig rensing av trypanosomes av denne anion-vekslere (DEAE cellulose) metoden er best, og til dags dato, metoden referanse for å visualisere og isolere parasitter fra blod for HAT diagnose. I feltforhold, en mini kolonne med DEAE cellulose har blitt brukt og flere forbedringer har tilrettelagt microscopical observasjon7,8.
Metoden trypanosome atskillelse fra blod, beskrevet nedenfor, avhengig av parasitten overflaten kostnad, som er mindre negativ enn blod pattedyrceller9. Interessant, denne metoden ble utviklet 50 år siden, i 1968 av Dr. Sheila Lanham, og fortsatt gullstandarden for deteksjon og utarbeidelse av blodet trypanosomes. Det er raskt og reproduserbar for salivarian trypanosomes fra et bredt spekter av pattedyr, tillater diagnostisering av både dyr og menneskelige trypanosomiasis10.
For å få levende, renset parasitter, er infisert blod lagt inn på en anion-veksler kolonne. Kromatografi forhold (hovedsakelig pH, ionisk styrke av buffere/media) må tilpasses til hver trypanosome arter, og mer generelt, til hver blanding av pattedyr blodceller og trypanosomes10. Elueringsbufferen justeres nøyaktig til pH 8 for de fleste afrikanske trypanosomes10. Denne metoden favoriserer konsentrasjonen av parasitter som finnes i blodet av pasienter, fordi parasitemias kan være for lav til å bli oppdaget av mikroskopiske observasjon alene, og det gjør også laboratorieundersøkelser. Arbeide med fersk isolerte trypanosomes og blod fra infiserte dyr, bruker denne teknikken, er mer relevant for ulike undersøkelser enn studier med parasitter som har vært kultivert i axenic forhold i laboratoriet på ubestemt tid.
Host-parasitten relasjoner er best studerte med en parasitt infeksjon naturlig verten, derfor T. musculi, en naturlig murine parasitten, som er representant for ekstracellulære trypanosomes, har mange fordeler som murine infeksjon innebærer i en lite laboratorium dyr og krever ikke biohazard sikkerhetsforhold nivå (BSL). T. musculi dreper ikke immunkompetente mus, i motsetning til mange andre Trypanosoma arter, inkludert mennesker. T. musculi er ikke eliminert i T celle-belastede mus og parasitemias kan økes i infiserte mus ved å endre mat og næringsstoff inntak11. Denne parasitten modulerer immunrespons i co infeksjoner med12andre patogener. T. musculi fra infiserte mus utstillingen forskjeller fra kulturperler T. musculi, for eksempel uttrykk for membran Fc reseptorer er tapt i T. musculi axenic kulturer, sammenlignet med parasitter renset fra infiserte mus13 , 14. Excreted-utskilles faktorer (ESF) er også kvalitativt og kvantitativt mindre uttrykt i axenic trypanosome kulturer og forskjellige stammer isolert i endemiske områder15. ESF er de første antigener vises for immunforsvaret vert og så spille en viktig rolle i første verten immunrespons16.
I eksperimentelt infiserte dyr for laboratorieundersøkelser forenkler denne protokollen eksperimenter på et større antall parasitter, minimere antall mus kreves særlig når benytter svekket immunapparat dyr. De varianten overflate glykoproteiner (VSGs) som brukes i kortet agglutinerende testen for Trypanosomiasis (CATT) i masse screening er fortsatt renset fra trypanosomes som gjennomføres i rotter. De to rask diagnostiske testene (individuelt pakket kassetter) som er nå tilgjengelig for bruk i feltet fortsatt bruker en infeksiøs modell kilde til opprinnelig VSGs og ikke i vitro kultivert trypanosomes1,4, 5. fremme i studiet av trypanosome immunologi og biologi har blitt lettere siden disse DEAE cellulose renset parasitter kan lett få store mengder fra naturlig eller eksperimentelt infiserte verter og spesielt gnagere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøkelser likedannet retningslinjene og bruk av forsøksdyr (NIH publikasjonen nr. 85±23, revidert 1996). Protokollene ble godkjent av våre lokale etikk.
1. dyr
- Holde kvinnelig sveitsisk (i-1) mus alderen åtte til ti ukens gamle, 20-25 g, i et dyr boliger anlegget femten dager før hvert eksperiment. Huset seg i ventilert boksene beholdes i en beskyttet, temperatur (22 ° C) og fuktighet (50%) kontrollerte rom med 12 timer på/av lyset sykle.
- Gi dyr gratis tilgang til mat og vann. Minimere smerte, lidelse og nød og gi berikelse av miljøet.
- For boliger, bruke clear vegger bur, berikelse med tre pinner og papp tunneler. Forsiktig trekke et dyr i en tunnel overføre den fra buret til håndflaten av hånden.
- Utføre daglig overvåking for å vurdere tegn på sammenbrudd, sosial isolasjon, organ skade, ruffled hår eller mangel på grooming.
- Veie hvert dyr en gang per uke. Utføre regelmessige inspeksjoner av en veterinær.
- For naturlige parasitter, samle blod på toppen av parasitemia og parasitter forårsaker dyr død, samle blod dagen før antatte død.
Merk: Alle eksperimenter med smittestoffer utføres i dedikert rom, ifølge university godkjente retningslinjer.
2. buffere, media forberedelser
- Veie ut hvert stoff og legge destillert vann til følgende bufferne:
- Forberede konsentrert fosfat-bufret Saline (2 x):
Na2HPO4 (vannfri) (MW 141.96 g) 10.14 g
NaH2PO4∙2H2O (MW 156.01 g) 0.62 g
NaCl (MW 58.44 g) 2,55 g
Destillert H2O til 1 L - Forbered fosfat-bufret Saline-glukose:
Na2HPO4 (vannfri) (MW 141.96 g) 5.39 g
NaH2PO4∙2H2O (MW 156.01 g) 0.31 g
NaCl (MW 58.44 g) 1,70 g
Glukose (MW 180 g) 10 g
Destillert H2O til 1 L - Forberede 1 M KH2PO4.
- Forbered elueringsbufferen: Supplere fosfat-bufret Saline-glukose med
Penicillin (100 U/mL), Streptomycin (100 µg/mL), og fenol rød (5 µg/mL).
- Forberede konsentrert fosfat-bufret Saline (2 x):
3. forberedelse av DEAE innen
- Planlegge rundt 5 timer for DEAE innen utarbeidelse.
- Vask 100 g DEAE innen med destillert vann i en bolle med halsen er smal og tillater å bosette seg, og forkaste fine partikler. Gjenta vasker til nedbryting er klart.
- Legge 3 L konsentrert 2 x Phosphate-Buffered saltvann og rør.
- Justere pH til 8.0 med 1 M KH2PO4 og kast nedbryting.
- Vaske to ganger med destillert vann og la bosette.
- Vask og betale to ganger med 3 liter Phosphate-Buffered Saline-glukose og forkaste supernatants.
- Måle volumet av cellulose og legge en like volum av Phosphate-Buffered Saline-glukose, distribuere i plastflasker og lagre på 20 ° C.
4. parasitter
- Samle trypanosome stammer i områder endemisk for mennesker og dyr trypanosomiasis. Holde parasitter frosset i flytende nitrogen.
Merk: Trypanosoma musculi er ikke-patogene for mennesker og en ekstracellulære trypanosome brukes til å erstatte trygt sykdomsfremkallende trypanosomes i ulike laboratorieforsøk. - Ved laboratorieundersøkelser krever mennesker, håndtere eksperimenter med forsiktighet i dedikert riktig biohazard sikkerhetsforhold nivå (BSL) og forholdsregler; BSL2 for T. b. gambiense og BSL3 for T. b. rhodesiense. I feltforhold, standard mikrobiologisk praksis er etablert: sikre prøvetaking, mekanisk pipettering, hyppige dekontaminering av overflater og sterilisering av avfall.
5. musen infeksjon
- Raskt tine parasitter i et vannbad på 37 ° C.
- Observere en dråpe tinte infisert blod med et mikroskop. Vurdere parasitten levedyktighet av måler delen motile skjemaer17.
- Injisere parasitter intraperitoneally i mus (0,5 mL per musen). Hver dag, etter infeksjon, samle 20 µL av halen blod av nålen punktering og observere under et mikroskop. Evaluere parasitemia etter Herbert og Lumsden18 ved telling parasitter i flere mikroskop felt, eller en haemocytometer.
- Når parasitemia når en grense som er definert for hver stamme, samle blod (1 mL/mus) i elueringsbufferen (5 mL/mus) som inneholder heparin (10 U/mL).
Merk: Opprinnelige og romanen arbeid hevder og Godfrey rapportert optimal ioniske styrke fosfat bufret saltvann glukose for flere vert/parasitten arter fra en pH 8.0 lagerløsning.
6. parasitten separasjon
Merk: Alle eksperimentene herfra måles arb videre må gjøres i en vev kultur hette på seg hansker. Rom temperatur og luftfuktighet i laboratoriene brukt var 22 ° C og 45% henholdsvis. I feltforhold, har parasitten separasjon blitt utført på 34 ° C.
- Plasser en 10 mL sprøyte i en vertikal støtte og legge til en tidligere kuttet rundt, filter papir, glass ull eller cellulose svamp.
- Hell den DEAE cellulosevatt i sprøyten til 8 mL nivået er nådd, og deretter vaske med 25 mL av elueringsbufferen.
- Forsiktig legge 2 mL utvannet blod på toppen av kolonnen og legger elueringsrør medium. Regelmessig legge til elueringsbufferen etter for trypanosomes.
- Samle avløpsvann dråper fra kolonnene i en sentrifuge rør og sjekk regelmessig etter parasitter med et mikroskop.
- Når parasitter oppdages ikke lenger i kolonnen avløpsvann, sentrifuge røret (1800 x g, 10 minutter, 4 ° C i laboratoriet og omgivelsestemperaturen i feltforhold).
- Fjern nedbryting og suspendere parasitter i 1 mL av aktuelle mediet kreves for neste undersøkende trinn.
- Telle parasitter med en hemocytometer og fortynne dem i riktig medium, om nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Renset trypanosomes har blitt brukt i farmasøytisk tester. Parasitter overføres i kultur brønner som inneholder føljetong fortynninger av konkrete narkotika, enten alene eller blandet19. Mikroskopiske observasjoner, evaluere motilitet er en markør for levedyktighet, kan utføres når bare noen dugs blir testet, mens AlamarBlue celle levedyktighet analysen er en utmerket metode for store motilitet analyser i narkotikarelaterte screening20. Effekten av pentamidine, en referanse stoff som brukes i HAT terapi, vises i figur 1.
Makrofager er svært nyttige i kulturer som mater celler. De tillater, i vitro, . initiering og utvikling av trypanosome kulturer21. Vi har rapportert at antallet alternativt aktivert makrofager er økt trypanosome-infiserte pattedyr som de ønsker parasitten vekst22. Denne alternative macrophage aktivisering leverer L-ornithine, som er viktig for parasitten vekst. In vitro macrophage-parasitten co kulturer har vist at trypanosomes induserer macrophage alternativ aktivisering via utskilles faktorer. Ekstracellulære trypanosomes skiller en kinesin som binder macrophage mannose bindende reseptorer inducing arginase uttrykk gir L-ornithine produksjon favoriserer parasitten differensiering og multiplikasjon23,24 ( Figur 2). Mannose hemmer kinesin bindende og arginase induksjon og mannose reseptor-mangelfull mus belyse målet for kinesin på makrofager (Figur 3).
Siden mange trypanosome genomer har nå blitt sekvensert og kommentert, har vi kunnet dra nytte av disse store datasett. Deretter har vi kunnet utføre revers genetikk på disse parasittene. Bruker disse dataene, renset blodet skjemaet trypanosomes har blitt brukt til å karakterisere og analysere viktig strukturer som flagellar lomme (FP) og dens tilknyttede cytoskjelett. FP er det eneste nettstedet endo og exocytosis i trypanosomes og er også der de variable overflate glykoproteiner smugles fra endomembrane systemet25. Flagellar lomme krage (FPC) er en Ringformet formet struktur som er knyttet til flagell på punktet hvor det avslutter FP, men inntil nylig lite var kjent om protein spesialpreparatets FPC. Vi har identifisert et større protein av FPC, TbBILBO1, og har vist at det er viktig for parasitten overlevelse i skjemaet kulturperler insekt tsetse fly og i blodet form26. Knockdown av TbBILBO1 av RNAi hindrer FP dannelse og hemmer biogenesis av mange andre viktige cellen cytoskjelett strukturer, gjør FPC og FP viktig målene for intervensjon i alle sykdomsfremkallende trypanosomes. Verifiserer renset eller kulturperler parasitten celler med antistoffer mot TbBILBO1 angir at i blodet og procyclic (insekt) skjemaet, det skaper en ringformede struktur som omgår flagell. Slik merking, i blodet skjemaer, er vist i Figur 4.
Renset blodet skjemaet trypanosomes har tillatt karakterisering av mange uvanlige biokjemiske og metabolske særegenheter, inkludert metabolismen av glukose, som foregår i peroxisome-lignende organeller kalt glycosomes (se figur 5). Det var generelt akseptert at pyruvate er det store sluttproduktet utskilt fra glukose metabolisme av blodet trypanosomes, med nesten ingen produksjon av succinate og acetate i mitokondrie. Derimot konvertere procyclic trypanosomes threonin til acetate og glukose i succinate og acetate27,28. Energi metabolisme av trypanosomatids kan evalueres ved tilpasning til tilgjengelig karbon kilder. Omvendt genetikk og metabolomic analyser bekreftet produksjon i mitokondrie av blodet trypanosomes acetatark glukose-avledet pyruvate og threonin, samt produksjon av succinate glukose19,20 (Figur 5). For eksempel avslørte 1H-NMR analyse av sluttprodukter utskilles av blodet skjemaet trypanosomes ruges i PBS inneholder 4 mM glukose, at glukose hovedsakelig konverteres til pyruvate (85.1% av de utskilles produktene), med mindre produksjon av alanin (9,2%), acetate (4,9%) og succinate (0,8%)29. Disse veier, som er mindre i metabolske flux forhold til pyruvate produksjon fra glukose, er avgjørende for veksten av parasitten. Succinate produksjonen veien kan dermed betraktes som en god potensielle mål for utviklingen av nye trypanocidal stoffer.
Figur 1 : In vitro effekten av pentamidine på T. b. brucei. Fortynninger av pentamidine ble lagt til 2 x 105 parasitter å bestemme konsentrasjonen begrenser parasitten vekst med 50% (IC50). Dose-effekt kurver på 24 timer kultur. Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt fra 5 uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Trypanosome-mediert arginase induksjon. En kinesin utgitt av trypanosomes binder til C-type Lektiner reseptorer fører til arginase induksjon. Dette resulterer i økt produksjon av L-ornithine og polyaminer, avgjørende for parasitten vekst og differensiering, og i L-arginine utarming, noe som resulterer i lavere produksjon av cytotoksiske nei ved macrophage NOS II. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Macrophage arginase aktivitet. Arginase aktivitet i makrofager kontroll mus og Mannose reseptor slå ut (KO) mus kultivert i vitro i medium i 48 timer, med eller uten kinesin eller mannose. Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt fra 5 uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : TB BILBO1 merking av et blodet skjema Trypanosoma brucei brucei celle (A) Immunofluorescence merking av blodbanen, kultur skjemaet 427 90-13 cellen som har vært analysert med anti-BILBO1 monoklonalt antistoff etterfulgt av en FITC-merket anti-musen antistoff og visualisert ved hjelp av ultrafiolett lys, (Tb BILBO1 er grønn ringformede signaler) og DNA bindende fargestoff DAPI (blå signaler) (B) A flette DAPI, anti-BILBO1 og fase kontrast bilder av A. skala bar lik 10 µm. Anti-BILBO1 monoklonalt var fortynnes 1:10 i PBS og sekundære antistoff ( anti-mus IgM FITC) var fortynnes 1: 100. Bildene ble tatt på et mikroskop utstyrt med et digitalt kamera. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Skjematisk fremstilling av glukose og threonin metabolisme i blodet skjemaet trypanosomes. Utskilles-produkter fra glukose og threonin metabolisme er eske. De tykke blå pilene angir enzymatisk trinnene av glukose metabolisme fører til pyruvate produksjon, som er det viktigste sluttproduktet utskilt fra Glykolysen. Svarte piler representerer oversett mindre metabolske veier fra glukose og threonin fornedrelse, som er essensielle for veksten av parasitten. Bidraget fra de angitte enzymene er validert eksperimentelt: ACH, acetyl-CoA thioesterase (EC 3.1.2.1); ASCT, acetat: succinate CoA-transferase (EC 2.8.3.18); AKCT, 2-amino-3-ketobutyrate koenzym A ligase (EC 2.3.1.29); PEPCK, phosphoenolpyruvate carboxykinase (EC 4.1.1.49); PDH, pyruvate dehydrogenase komplekse (EC 1.2.4.1); TDH, threonin 3-dehydrogenase (EC 1.1.1.103). Forkortelser: AcCoA, acetyl-CoA; AOB, amino oxobutyrate; DHAP, dihydroxyacetone fosfat; G3P, glyceraldehyde 3-fosfat; MAL, malate; OA, oxaloacetate; PEP, phosphoenolpyruvate; PYR, pyruvate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Renset trypanosomes representerer en kraftig måte å studere immunologi, biokjemi, mobil og molekylærbiologi. Store flater og resultatene er anskaffet fra trypanosomes, som deretter har bidratt til å hente informasjon fra andre eukaryotic celler30. Trypanosomes er også gjenstand for viktig og interessant forskning fordi de har utformet flere mekanismer som tillater dem å overleve og vokse i to svært forskjellige miljøer: tsetse fly vektoren og pattedyr vert23, 31. ulike teknikker for å isolere trypanosomes har blitt rapportert, og en gjennomgang på microfluidics tilnærminger har nylig blitt publisert32. Derfor er en reproduserbar og robust måte parasitten isolasjon viktig.
DEAE cellulose forberedelse er et essensielt skritt i denne parasitten forberedelse protokollen. Vask forholdene må utføres forsiktig for å eliminere de fine partiklene og equilibrate harpiks, og pH må justeres nøyaktig (pH 8.0 er passende for de fleste trypanosome arter). Alle trinn må justeres for å forbedre parasite rensing og gir samtidig parasitten levedyktighet og cellular egenskaper. Viktigere, har parasitten levedyktighet og infectivity blitt opprettholdt etter gjennom en DEAE innen kolonne. Men noen spenninger er mer sårbar enn de andre og kan være mindre infeksiøs etter rensing33. Derfor virkningen av separasjon forholdene på pellicular membran komponenter, parasitten metabolisme, signalnettverk, nukleinsyre funksjoner og dyr infectivity, må vurderes og separasjon forholdene må være tilpasset deretter.
Begrensninger på denne teknikken er at denne prosedyren skal tilpasses hver trypanosome Art i en gitt vert og er også tid forbruker. Videre er DEAE cellulose nå dyrt. Foreløpige analyser er nødvendig å optimalisere separasjon forhold, særlig media, som kan ha varierende ioniske styrke og en presis pH. Pre kolonne, medregnet antikoagulerende valg, tidligere sentrifugering fjerne fleste erytrocytter, buffy pels, og røde blodlegemer lysis, velges etter hvert eksperiment. Presis endringer på en enkelt parameter (buffere, temperatur i hele protokollen, sentrifugering parametere) kan øke antallet, grad av rensing og levedyktigheten til parasitter innhentet33. Utvikle nye separasjon parametere parasitten arter og blod pattedyrceller skilles, kan være nødvendig. Justeringer i første hevder og Godfrey er protokollen har tillatt rensing av biologisk og antigenically bevart T. cruzi fra blod34. Nye harpikser kan også testet og brukes med riktig forhold for ulike arter35.
Hovedrollen utskilles/utskilles faktorer (ES) av trypanosomatids har nylig blitt understreket16. ES inneholder molekyler involvert i patologi og immunomodulation, som kinesin, som er bevart blant trypanosomes24. ES forberedelse fra renset parasitter krever spesiell forsiktighet for å unngå forurensning av elueringsrør media komponentene og lysed parasitter.
En ES-baserte vaksine effektivt mot Leishmania, en relaterte parasitt, allerede finnes og er tilgjengelig (CaniLeish Virbac)36. Sammenslutning av bevarte molekyler spiller viktige roller i parasitten overlevelse og vekst kan representere grunnlaget for en fremtidig vaksine mot trypanosomes, både mennesker og dyr, i en en-helse tilnærming. Rensing av afrikanske trypanosomes fra blod av DEAE innen kolonner, med forbedringer, forblir gullstandarden for gjenkjenning av trypanosome i naturlige vertene med lav parasitemias i endemiske områder og behovet for parasitter i store tall for eksperimentell undersøkelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmer av UMR 177 INTERTRYP IFU CIRAD Université de Bordeaux. Denne forskningen ble støttet av interne finansiering fra Universitetet i Bordeaux og støtte fra ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024, og fra Association pour le développement de la recherche no parasitologie et médecine tropicale og tjenesten de coopération et d'action culturelle de l'Ambassade de France à Bangui (Centrafrique).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
References
- Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. Human African trypanosomiasis. Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).
- Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. Human African trypanosomiasis. Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).
- Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review. Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).
- Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454 (2017).
- Büscher, P., Deborggraeve, S. How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis? Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).
- Truc, P., et al. Atypical human infections by animal trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256 (2013).
- Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).
- Büscher, P., et al. Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471 (2009).
- Lanham, S. M. Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers. Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).
- Lanham, S. M., Godfrey, D. G. Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose. Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).
- Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice. Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).
- Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization. Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).
- Vincendeau, P., Daëron, M., Daulouede, S. Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages. Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).
- Vincendeau, P., Daëron, M. Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses. Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).
- Holzmuller, P., et al. Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics. Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).
- Holzmuller, P., et al. How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages? Frontiers in Immunology. 9, 778 (2018).
- Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi. Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).
- Herbert, W. J., Lumsden, W. H. Trypanosoma brucei: a rapid "matching" method for estimating the host's parasitemia. Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).
- Dauchy, F. A., et al. Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125 (2016).
- Raz, B., Iten, M., Grether-Bühler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro. Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).
- Albright, J. W., Albright, J. F. In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol. International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).
- Gobert, A. P., et al. L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis. Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).
- De Muylder, G., et al. A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731 (2013).
- Nzoumbou-Boko, R., et al. Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog. Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).
- Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated. PLoS Biology. 6 (5), e105 (2008).
- Albisetti, A., et al. Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei. PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710 (2017).
- Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate. Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).
- Bringaud, F., Rivière, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).
- Mazet, M., et al. Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587 (2013).
- Coutton, C., et al. Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human. Nature Communications. 9 (1), 686 (2018).
- Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake. Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).
- Barrett, M. P., et al. Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes. Pathogens. 6 (4), (2017).
- Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes. Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).
- Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism. Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).
- Cruz-Saavedra, L., et al. Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies. Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).
- Lemesre, J. L., et al. Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial. Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).
