Summary
Este método de separação de tripanossoma do sangue varia de acordo com sua carga de superfície, sendo menos negativo do que células de sangue de mamíferos. Sangue contaminado é colocado e tratado em uma coluna de permutador de aniões. Esse método, o mais apropriado diagnóstico para tripanossomíase africana, fornece parasitas purificadas para investigações de imunológicos, biológicas, bioquímicas, farmacêuticas e de biologia molecular.
Abstract
Este método permite a separação dos tripanosomas, parasitas responsáveis pela tripanossomíase africana animal e humana (chapéu), do sangue infectado. Este é o melhor método para o diagnóstico da primeira etapa de chapéu e além disso, este método de purificação do parasita permite serológico e investigações de pesquisa.
CHAPÉU é causada pela mosca tsé-tsé transmitida o Trypanosoma brucei gambiense e T. b. rhodesiense. Tripanosomas relacionadas são os agentes causadores da tripanossomíase animal. Detecção de tripanossoma é essencial para o diagnóstico, tratamento e acompanhamento de chapéu. A técnica descrita aqui é a técnica de deteção de parasita mais sensível, adaptada às condições de campo para o diagnóstico de T. b. gambiense chapéu e pode ser concluída no prazo de uma hora. Sangue é mergulhado em uma coluna de permutador de aniões (celulose DEAE) previamente ajustada ao pH 8 e tampão de eluição é adicionado. Altamente negativamente carregados de glóbulos são adsorvidos na coluna Considerando que atravessam as tripanosomas menos negativamente carregadas. Tripanosomas coletadas peletizadas por centrifugação e observadas por microscopia. Além disso, parasitas preparam-se, sem dano celular, embora mantendo sua infecciosidade.
Tripanosomas purificadas são necessárias para testes imunológicos; Eles são usados no ensaio de trypanolysis, o padrão-ouro na serologia de chapéu. Manchado de parasitas são utilizadas no teste de aglutinação de cartão (CATT) para sorologia de campo. Antígenos de tripanosomas purificadas, como a glicoproteína de superfície variante, exoantigens, também são utilizados em diversos imunoensaios. O procedimento descrito aqui é projetado para tripanosomas africanas; por conseguinte, condições cromatográficas tem que ser adaptado para cada estirpe tripanossoma e mais geralmente, para o sangue de cada espécie de hospedeiro mamífero.
Estas fascinantes patógenos são facilmente purificada e disponíveis para uso em bioquímicos, moleculares e estudos de biologia, incluindo co-cultura com células hospedeiras para investigar relações hospedeiro-parasita a nível dos receptores de membrana, sinalização e gene da pilha expressão; drogas testes em vitro; investigação de exclusão genética, mutação ou superexpressão em processos metabólicos, a biogênese do citoesqueleto e a sobrevivência do parasita.
Introduction
O método apresentado descrito aqui, permite a separação dos tripanosomas, parasitas responsáveis pela tripanossomíase africana animal e humana (chapéu), do sangue. Este é o melhor método para o diagnóstico da primeira etapa de chapéu e além disso, este método de purificação de parasita permite robusto inquérito sorológico e pesquisa.
CHAPÉU é causada pela mosca tsé-tsé transmitida o Trypanosoma brucei gambiense e T. b. rhodesiense1. Estes protozoários parasitas multiplicam extracelularmente no sangue, linfa e líquidos intersticiais durante a primeira fase da doença (estágio hemolinfático). O segundo estágio (meningoencephalitic) começa quando parasitas atravessam a barreira hemato-encefálica; sinais neurológicos, incluindo um distúrbio do sono, que deu o seu nome "doença do sono" para esta doença, são típicos deste segundo estágio2. Tripanosomas relacionadas (T. evansi, T. congolensee, T. vivax, T. b. brucei) são os agentes causadores de animal tripanossomose Africana (AAT)3.
A Organização Mundial de saúde (OMS) tem como objetivo eliminar o chapéu como um problema de saúde pública até 2020 e para parar a transmissão por 20304. A recente introdução de testes de diagnóstico rápido tem melhorado diagnóstico sorológico1,4,5. Foram desenvolvido vários testes de diagnóstico molecular, mas seu papel no diagnóstico de campo ainda não foi estabelecido5. Eles são usados para identificar as sub-espécies do grupo brucei e tripanossomíase atípica causada por parasitas responsáveis pela tripanossomose animal6.
A detecção do parasita é essencial para o diagnóstico, tratamento e acompanhamento, como serologia pode dar resultados falsos positivos e infelizmente falso negativo1. A observação microscópica direta destes protistas hemoflagelado é difícil nos casos de chapéu que são causados por T. b. gambiense, (mais de 95% dos casos) como parasitemias baixas são a regra, Considerando que para chapéu causada por T. b. rhodesiense, um grande número de parasitas está frequentemente presente no sangue. Várias técnicas de concentração têm sido utilizadas, tais como a gota espessa e centrifugação do tubo capilar (CTC), mas a separação de parasitas do sangue por uma coluna de permutador de aniões (celulose DEAE) seguido de centrifugação e observação microscópica do pellet, é o método mais sensível (cerca de 50 parasitas/mL de sangue pode ser detectado)1,7. Consequentemente, a purificação de tripanosomas por esse método de ânion-trocadores (celulose DEAE) é o melhor e, até à data, o método de referência para visualização e isolando os parasitas do sangue para o diagnóstico de chapéu. Em condições de campo, uma mini coluna de celulose DEAE tem sido utilizada com sucesso e várias melhorias facilitaram a observação microscópica7,8.
O método de separação de tripanossoma do sangue, descrito abaixo, depende a carga superficial do parasita, que é menos negativa do que células de sangue de mamíferos9. Curiosamente, este método foi desenvolvido há 50 anos atrás, em 1968 pelo Dr. Sheila Lanham e continua a ser o padrão ouro para detecção e preparação de tripanosomas da corrente sanguínea. É rápido e reprodutível para salivarian tripanosomas de uma grande variedade de mamíferos, permitindo o diagnóstico de ambos tripanossomíase humana e animal,10.
Para obter vida, purificadas de parasitas, sangue infectado é adicionado em uma coluna de permutador de aniões. Condições cromatográficas (principalmente pH, força iônica de amortecedores/mídia) têm de ser adaptadas a cada espécie de tripanossoma e mais geralmente, para cada combinação de células de sangue de mamíferos e tripanosomas10. Tampão de eluição é precisamente ajustada ao pH de 8 para mais africano tripanosomas10. Esse método favorece a concentração de parasitas no sangue dos pacientes, porque parasitemias pode ser muito baixa para ser detectada por observação microscópica sozinha, e também permite a exames laboratoriais. Trabalhar com tripanosomas recém isoladas e no sangue de animais infectados, usando esta técnica, é mais pertinente para diversas investigações do que os estudos com parasitas que têm sido cultivadas em condições de axénica no laboratório por um período indeterminado.
Relações hospedeiro-parasita são mais bem estudadas com um parasita a infectar seu hospedeiro natural, portanto, T. disponibilizado, um parasita murino natural, que é representante de tripanosomas extracelulares, tem muitas vantagens como infecção murino envolve-se em um animal de laboratório pequeno e não requer condições de nível (BSL) de segurança de risco biológico. T. disponibilizado não mata camundongos imunocompetentes, ao contrário de muitas outras espécies de Trypanosoma , incluindo patógenos humanos. T. disponibilizado não são eliminadas em ratos privados de células T e parasitemias pode ser aumentada em ratos infectados, modificando a ingestão de alimentos e nutrientes11. Este parasita modula a resposta imune em co-infecções com outros patógenos12. T. disponibilizado de diferenças de exposição de ratos infectados de culta T. disponibilizado, por exemplo, a expressão de receptores de membrana Fc é perdida em culturas de axénica T. disponibilizado , em comparação com parasitas purificadas de ratos infectados13 , 14. fatores secretados por Excreted (FSE) também são qualitativa e quantitativamente menos expressos em culturas de tripanossoma axénica e diferem entre as cepas isoladas em áreas endêmicas15. ESF são os antígenos primeiros a ser exibido para o sistema imunológico do hospedeiro e portanto desempenham um papel importante no acolhimento inicial da resposta imune16.
Em animais experimentalmente infectados para exames laboratoriais, este protocolo facilita a experimentação em um número maior de parasitas, minimizando o número de ratos necessárias especialmente ao utilizar animais imunossuprimidos. As glicoproteínas de superfície variantes (VSGs) que são usadas no teste de aglutinação de cartão para tripanossomíase (CATT) em triagem em massa ainda são purificadas de tripanosomas que são propagadas em ratos. Os dois testes diagnósticos rápidos (cassettes embrulhados individualmente) que agora estão disponíveis para uso no campo, ainda estão usando uma fonte infecciosa modelo de nativo VSGs e não em vitro cultivadas tripanosomas1,4, 5. o avanço no estudo da imunologia tripanossoma e biologia tem sido facilitado, desde que estes DEAE celulose purificada parasitas podem ser facilmente obtidas em grandes quantidades de hospedeiros naturalmente ou experimentalmente infectados e em particulares, roedores.
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Protocol
Investigações em conformidade com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório (NIH publicação n º 85±23, revista em 1996). Os protocolos foram aprovados pelo nosso Comitê de ética local.
1. os animais
- Manter camundongos Swiss (de-1) fêmeas com idade de oito a dez semanas de idade, 20-25 g, em um animal habitação facilidade quinze dias antes de cada experimento. Colocá-los em caixas ventiladas que são mantidas em um protegido, temperatura (22 ° C) e umidade (50%) controlado por quarto, com 12 horas on/off ciclo de luz.
- Dê animais livre acesso à comida e água. Minimizar a dor, sofrimento e angústia e proporcionar o enriquecimento do ambiente.
- Para a carcaça, use clear-murado gaiolas, enriquecimento com varas de madeira e papelão túneis. Delicadamente, desenhe um animal dentro de um túnel para transferi-lo da gaiola para a palma da mão.
- Realize monitoramento diário para avaliar sinais de prostração, isolamento social, lesão de corpo, cabelo babado ou falta de higiene.
- Pese cada animal uma vez por semana. Realize inspecções periódicas por um veterinário.
- Para parasitas naturais, coletar sangue no pico da parasitemia e parasitas causando a morte de animais, coletar sangue na véspera da morte presumida.
Nota: Todas as experiências com agentes infecciosos são realizadas em salas dedicadas, de acordo com as diretrizes da Universidade aprovada.
2. buffers, preparações de mídia
- Pesar cada substância e adicionar água destilada para os buffers de seguintes:
- Prepare-se concentrada tampão fosfato-salino (2x):
Na2HPO4 (anidro) (MW 141,96 g) g 10,14
NaH2PO4∙2H2O (MW 156,01 g) 0,62 g
NaCl (58,44 g de MW) 2,55 g
Destilada, H2O para 1 L - Prepare o tampão fosfato salino-glicose:
Na2HPO4 (anidro) (MW 141,96 g) 5,39 g
NaH2PO4∙2H2O (MW 156,01 g) 0,31 g
NaCl (58,44 g de MW) 1,70 g
Glicose (180g de MW) 10 g
Destilada, H2O para 1 L - Prepare 1 M KH2PO4.
- Preparar o tampão de eluição: Suplemento tampão fosfato salino-glicose com
Penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 µ g/mL) e vermelho de fenol (5 µ g/mL).
- Prepare-se concentrada tampão fosfato-salino (2x):
3. preparação do DEAE-celulose
- Plano de cerca de 5 horas para a preparação de DEAE-celulose.
- Lave a 100 g de DEAE-celulose com água destilada em um balão com uma garganta estreita e deixe para resolver e, em seguida, descartar partículas finas. Repita lavagens até que o sobrenadante é claro.
- Adicione 3 L de concentrado 2x Phosphate-Buffered salina e mexa.
- Ajustar o pH para 8,0 com 1 M KH2PO4 e descartar o sobrenadante.
- Lave duas vezes com água destilada e deixe repousar.
- Lave e deixe de resolver duas vezes com 3 litros Phosphate-Buffered salina-glicose e descartar os sobrenadantes.
- Medir o volume de celulose e adicionar um volume igual de solução salina Phosphate-Buffered-glicose, distribuir em garrafas de plástico e armazenar a-20 ° C.
4. parasitas
- Recolha as estirpes tripanossoma em áreas endêmicas para tripanossomíase humana e animal. Manter parasitas congeladas em nitrogênio líquido.
Nota: Trypanosoma disponibilizado é não-patogênicas para os seres humanos e é uma tripanossoma extracelular usada para substituir com segurança tripanosomas patogênicas em vários experimentos de laboratório. - No caso de exames laboratoriais que exigem agentes patogénicos humanos, lidar com experiências com cuidado em condições de nível (BSL) apropriadas de risco biológico dedicado segurança e precauções; BSL2 por T. b. gambiense e BSL3 por T. b. rhodesiense. Em condições de campo, prática padrão microbiológica é estabelecida: secure amostragem, pipetagem mecânica, frequente descontaminação de superfícies e esterilização de resíduos.
5. infecção do Mouse
- Descongelar rapidamente parasitas em banho maria a 37 ° C.
- Observa-se uma gota de sangue infectado descongelada com um microscópio. Avalie a viabilidade de parasita medindo a porcentagem de formas móveis17.
- Injete parasitas intraperitonealmente em camundongos (0,5 mL por rato). Cada dia, pós infecção, coletar 20 µ l de sangue por punção com agulha e observar ao microscópio. Avalie a parasitemia de acordo com Herbert e Lumsden18 pela contagem de parasitas em vários campos, microscópio, ou usando um haemocytometer.
- Quando a parasitemia atinge um limite definido para cada estirpe, colete o sangue (1 mL/mouse) no tampão de eluição (5 mL/mouse) contendo heparina (10 U/mL).
Nota: O trabalho original e inovador de Lanham e Godfrey relatou que a força iônica ideal de fosfato tamponado salina glicose para diversas espécies de parasita/hospedeiro de uma solução de pH 8.0.
6. separação de parasita
Nota: Todas as experiências a partir deste momento devem ser feitas em uma capa de tecido cultura usando luvas. A temperatura e a umidade nos laboratórios utilizados foram a 22 ° C e 45% respectivamente. Em condições de campo, separação do parasita tem sido realizou com sucesso a 34 ° C.
- Coloque uma seringa de 10 mL em um suporte vertical e adicionar uma circular previamente cortada, pedaço de papel de filtro, lã de vidro ou uma esponja de celulose.
- Despeje a celulose DEAE a seringa até o nível 8 mL é alcançada e em seguida lavar com 25 mL de tampão de eluição.
- Cuidadosamente, adicionar 2 mL de sangue diluído no topo da coluna e em seguida, adicionar meio de eluição. Regularmente adicione tampão de eluição de acordo com o trânsito dos tripanosomas.
- Coletar efluentes gotas de colunas em um tubo de centrífuga e verificar regularmente a presença de parasitas com um microscópio.
- Quando parasitas já não são detectadas no efluente da coluna, centrifugar o tubo (1.800 x g, 10 minutos, a 4 ° C no laboratório e à temperatura ambiente em condições de campo).
- Remover o sobrenadante e suspender os parasitas em 1 mL de meio de relevantes necessário para o próximo passo da investigação.
- Contagem de parasitas com um hemocytometer e diluí-los em meio apropriado, se necessário.
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Representative Results
Tripanosomas purificadas foram usadas em testes farmacêuticos. Parasitas são transferidas para poços de cultura contendo diluições em série de drogas específicas, sozinho ou misturado19. Observações microscópicas, avaliar a motilidade é um marcador da viabilidade, pode ser executada quando estão a ser testados apenas alguns dugs, Considerando que o ensaio da viabilidade de células AlamarBlue é um excelente método para ensaios de grande mobilidade durante20de despistagem de drogas. O efeito de pentamidina, um medicamento de referência usado na terapia de chapéu, é exibido na Figura 1.
Os macrófagos são muito úteis em culturas como células do alimentador. Eles permitem, in vitro, a iniciação e desenvolvimento do tripanosoma culturas21. Informamos que o número de macrófagos alternativamente ativados é aumentado em mamíferos infectados com tripanossoma em que eles favorecem o crescimento de parasita22. Essa ativação de macrófagos alternativo fornece L-ornitina, que é essencial para o crescimento do parasita. Em vitro macrófagos-parasita co as culturas têm mostrado que os tripanosomas induzem ativação alternativo do macrófagos através de fatores secretados. Tripanosomas extracelulares secretam uma cinesina que se liga a receptores de ligação de manose macrófagos induzindo a expressão de arginase, proporcionando a produção de L-ornitina, favorecendo o parasita diferenciação e multiplicação23,24 ( Figura 2). Manose inibe a cinesina vinculação e indução de arginase, e os ratos deficientes em receptores de manose elucidar o destino da cinesina em macrófagos (Figura 3).
Desde que numerosos genomas tripanossoma agora foram sequenciadas e anotadas, fomos capazes de aproveitar esses grandes conjuntos de dados. Posteriormente, conseguimos realizar genética direta e inversa nestes parasitas. Usando esses dados, purificada forma corrente sanguínea tripanosomas têm sido usadas para caracterizar e analisar estruturas importantes, tais como o bolso flagelar (FP) e seu associado citoesqueleto. O FP é o único site de endo e exocitose em tripanosomas e é também onde as glicoproteínas de superfície variáveis são traficadas de sistema endomembranoso25. O colar de bolso flagelar (FPC) é um anulares em forma de estrutura que é anexada para o flagelo no ponto onde sai o FP, mas até recentemente pouco se sabia sobre os constituintes da proteína do FPC. Podemos ter identificado uma proteína principal do FPC, BILBO1 Tbe têm mostrado que é essencial para a sobrevivência do parasita na forma culta inseto mosca tsé-tsé e na corrente sanguínea formulário26. Knockdown de BILBO1 Tbpor RNAi evita a formação de FP e inibe a biogênese de muitas outras importantes estruturas do citoesqueleto, tornando o FPC e os alvos importantes de FP para intervenção em todos os tripanosomas patogênicas. Sondagem purificada ou cultivadas parasita células com anticorpos para BILBO1 Tbindica que, na forma de corrente sanguínea e formulário procyclic (inseto), ele cria uma estrutura em forma de anel que contorna o flagelo. Tal rotulagem, em um formulário da corrente sanguínea, é mostrado na Figura 4.
Corrente sanguínea purificada forma tripanosomas permitiram a caracterização das muitas peculiaridades metabólicas e bioquímicas incomuns, incluindo o metabolismo da glicose, que ocorre em organelas Peroxissoma semelhante chamado glycosomes (ver Figura 5). Foi geralmente aceite que o piruvato é o principal produto final excretado do metabolismo da glicose por tripanosomas a corrente sanguínea, com praticamente nenhuma produção de ácido succínico e acetato dentro da mitocôndria. Em contraste, as tripanosomas procyclic convertem treonina em acetato e glicose em succinato e acetato de27,28. Metabolismo energético de tripanossomatídeos pode ser avaliado pela adaptação às fontes de carbono disponível. Combinação genética reversa e metabolómica análises confirmou a produção na mitocôndria de tripanosomas da corrente sanguínea de acetato de piruvato glicose-derivado e treonina, bem como a produção de succinato de glicose19,20 (Figura 5). Por exemplo, 1análise de H-NMR de produtos finais excretada pela corrente sanguínea formulário tripanosomas incubadas em PBS contendo glicose de 4mm, revelou que a glicose é convertida principalmente em piruvato (85,1% dos produtos excretados final), com menor produção de alanina (9,2%), acetato (4,9%) e succinato (0,8%)29. Estes caminhos, que são menores em termos de fluxo metabólico em comparação com a produção de piruvato de glicose, são essenciais para o crescimento do parasita. O percurso de produção de ácido succínico, portanto, pode ser considerado como um bom alvo potencial para o desenvolvimento de novas drogas tripanossomicida.
Figura 1 : Efeito in vitro de pentamidina na T. brucei b.. Diluições de pentamidina foram adicionadas a 2 x 105 parasitas para determinar a concentração de inibir o crescimento do parasita em 50% (IC50). Curvas dose-efeito em 24 horas de cultura. Barras de erro representam o erro padrão da média de 5 experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Indução mediada por tripanossoma arginase. Uma cinesina lançada pela tripanosomas vincula-se aos receptores de lectina tipo C levando à indução de arginase. Isso resulta em aumento da produção de L-ornitina e poliaminas, essenciais para o crescimento do parasita e diferenciação e no empobrecimento da L-arginina, resultando em menor produção de citotóxico não por macrófago II n º s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Atividade de macrófagos arginase. Atividade da arginase em macrófagos de ratos controle e batida de receptor de manose fora ratos (KO) cultivados em vitro em média por 48 horas, com ou sem cinesina ou manose. Barras de erro representam o erro padrão da média de 5 experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : TB BILBO1 rotulagem de uma forma de corrente sanguínea Trypanosoma brucei brucei celular Imunofluorescência (A) rotulagem de uma corrente sanguínea, forma de cultura, 427 90-13 célula que tem sido sondado com anticorpo monoclonal de anti-BILBO1, seguido por um anticorpo anti-rato marcado com FITC e visualizadas usando luz ultravioleta, (Tb BILBO1 são os sinais de anulares verdes) e o DNA de ligação corante DAPI (sinais azuis) (B) A fusão de imagens de contraste DAPI, anti-BILBO1 e fase de iguais de bar r. escala 10 µm. Anti-BILBO1 rato monoclonal foi diluído 01:10 em PBS e o anticorpo secundário ( anti-rato IgM FITC) foi diluído 1: 100. Imagens foram tiradas em um microscópio equipado com uma câmera digital. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Representação esquemática do metabolismo de glicose e treonina em tripanosomas de forma corrente sanguínea. Excretados produtos finais do metabolismo de glicose e treonina são in a box. As setas azuis grossas indicam passos enzimáticos do metabolismo de glicose, levando a produção de piruvato, que é o principal produto final excretado da glicólise. Setas pretas representam negligenciado pequenas vias metabólicas da degradação da glicose e treonina, que são essenciais para o crescimento do parasita. A contribuição das enzimas indicadas foi validada experimentalmente: ACH, thioesterase de acetil-CoA (CE 3.1.2.1); INITIO, acetato: succinato CoA-transferase (EC 2.8.3.18); AKCT, 2-amino-3-ketobutyrate coenzima A ligase (EC 2.3.1.29); PEPCK, fosfoenolpiruvato carboxiquinase (EC 4.1.1.49); PDH, complexo piruvato desidrogenase (EC 1.2.4.1); TDH, treonina 3-desidrogenase (CE 1.1.1.103). Abreviaturas: AcCoA, acetil-CoA; AOB, amino oxobutyrate; DHAP, dihidroxiacetona fosfato; G3P, gliceraldeído-3-fosfato; MAL, malato; OA, oxaloacetato; PEP, fosfoenolpiruvato; PYR, piruvato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Tripanosomas purificadas representam um meio poderoso para estudar imunologia, bioquímica, celular e biologia molecular. Grandes extensões de dados e os resultados foram obtidos de tripanosomas, que então tem ajudado a obter informações de outras células eucarióticas30. Tripanosomas são também objecto de investigação importante e interessante porque eles criaram numerosos mecanismos que lhes permitam sobreviver e crescer em dois ambientes muito diferentes: o vetor mosca tsé-tsé e o hospedeiro mamífero23, 31. registaram-se várias técnicas para isolar os tripanosomas, e uma revisão sobre abordagens baseadas em microfluídica foi recentemente publicados32. Portanto, um meio robusto e reprodutível de isolamento do parasita é essencial.
Preparação de DEAE celulose é um passo indispensável no presente protocolo de preparação do parasita. Condições de lavagem devem ser realizada com cautela para eliminar as partículas finas e equilibrar a resina, e o pH deve ser precisamente ajustado (pH 8.0 está apto para a maioria das espécies de tripanossoma). Todos os passos tem que ser ajustado para melhorar a purificação do parasita e rendimento, mantendo as propriedades de viabilidade e celular do parasita. Importante, infectividade e a viabilidade do parasita foram mantidas após a purificação através de uma coluna DEAE-celulose. No entanto, algumas cepas são mais frágeis do que os outros e podem ser menos infectantes após purificação33. Portanto, o impacto das condições de separação dos componentes de membrana pelicular, metabolismo do parasita, sinalização, funções de ácido nucleico e infecciosidade animal, tem que ser avaliado e separação condições têm de ser adaptadas em conformidade.
Limitações a esta técnica são que este procedimento deve ser adaptada para cada espécie de tripanossoma em um determinado host e também é demorado. Além disso, o DEAE celulose agora é caro. Os ensaios preliminares são necessários para otimizar as condições de separação, nomeadamente a mídia, que pode ter diferentes pontos fortes iônicos e pH preciso. Etapas pré-colunas, incluindo a escolha do anticoagulante, prévia centrifugação para remover a maioria dos eritrócitos, uso casaco buffy e lise de eritrócitos, são escolhidas de acordo com cada experiência. Mudanças precisas em um único parâmetro (amortecedores, temperatura em todo o protocolo, parâmetros de centrifugação) pode aumentar significativamente o número, grau de purificação e viabilidade de parasitas obtidos33. Desenvolvimento de novos parâmetros de separação de acordo com a espécie de parasita e as células dos mamíferos ser separado, pode ser necessário. Ajustes no protocolo Lanham e Godfrey inicial permitiu que a purificação biológica e antigenicamente preservada T. cruzi de sangue34. Novas resinas também podem ser testadas e usadas com condições adequadas para diferentes espécies de35.
O principal papel dos fatores excretada/secretado (ES) por tripanossomatídeos recentemente tem sido enfatizado16. ES contêm moléculas envolvidas na patologia e imunomodulação, tais como a cinesina, que é conservada entre tripanosomas24. Preparação de ES de parasitas purificadas requer cuidado especial para evitar a contaminação por componentes de mídia de eluição e lisadas parasitas.
Uma vacina baseada em ES eficaz contra Leishmania, um parasita relacionado, já existentes e disponíveis (CaniLeish Virbac)36. Associação de moléculas conservadas papéis essenciais no crescimento e sobrevivência do parasita pode representar a base para uma futura vacina contra tripanosomas, para os seres humanos e animais, em uma abordagem de saúde-1. Purificação de tripanosomas africanas de sangue por colunas DEAE-celulose, com melhorias, continua a ser o padrão ouro para detecção de tripanossoma em hospedeiros naturais com parasitemias baixas em áreas endêmicas e para a necessidade de parasitas em grande número para investigações experimentais.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a todos os membros do UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Esta pesquisa foi apoiada pelo financiamento interno da Universidade de Bordeaux e apoio da ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024 e da Associação pour le développement de la recherche en parasitologie et médecine tropicale e o serviço de Coopération et d'Action culturelle de L'Ambassade de France à Bangui (Centrafrique).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
References
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