Summary
Este método de separación de tripanosoma de sangre depende de su carga superficial ser menos negativa que mamífero las células de la sangre. Sangre infectada es colocada y tratada en una columna de intercambiador de aniones. Este método, más apropiado diagnóstico de la tripanosomiasis africana, proporciona parásitos purificados para las investigaciones inmunológicas, biológicas, bioquímicas, farmacéutica y biología molecular.
Abstract
Este método permite la separación de tripanosomas, parásitos responsables de tripanosomiasis africana humana y animal (sombrero) de sangre infectada. Este es el mejor método para el diagnóstico de la primera etapa sombrero y además este método de purificación del parásito permite serológica e investigación las investigaciones.
SOMBRERO es causado por la mosca tsetsé transmitidos Trypanosoma brucei gambiense y T. b. rhodesiense. Relacionados con tripanosomas son los agentes causativos de tripanosomiasis animal. Detección de tripanosoma es esencial para el diagnóstico, tratamiento y seguimiento de sombrero. La técnica descrita aquí es la técnica de detección de parásito más sensible, adaptada a condiciones de campo para el diagnóstico de T. b. gambiense sombrero y puede ser completada dentro de una hora. Es capas de sangre sobre una columna de Intercambiador aniónico (DEAE celulosa) previamente ajustada a pH 8, y se añade tampón de elución. Cargadas altamente negativa de las células sanguíneas son adsorbidas en la columna mientras que los tripanosomas menos negativamente cargadas pasan a través. Tripanosomas recogidos son peleteados por centrifugación y observados por microscopia. Por otra parte, parásitos están preparados sin daño celular manteniendo su infectividad.
Tripanosomas purificadas se requiere para las pruebas inmunológicas; se utilizan en el análisis de trypanolysis, el estándar de oro para serología de sombrero. Tinción de parásitos se utilizan en la prueba de aglutinación de la tarjeta (CATT) para serología de campo. Antígenos de tripanosomas purificados, como la glicoproteína variante de superficie, exoantígenos, también se utilizan en diferentes inmunoensayos. El procedimiento descrito aquí está diseñado para tripanosomas africanos; en consecuencia, tienen condiciones de cromatografía para adaptarse a cada cepa de Tripanosoma y más generalmente, a la sangre de cada especie de mamífero anfitrión.
Estos fascinantes patógenos son fácilmente purificada y disponible para usar en Bioquímica, molecular y estudios de la biología incluyendo co-cultivo con células hospedadoras para investigar las relaciones huésped-parásito en el nivel de receptores de membrana, la señalización y el gen de la célula expresión; la droga de prueba in vitro; investigación de canceladura del gene, mutación o sobreexpresión de procesos metabólicos, biogénesis del citoesqueleto y supervivencia del parásito.
Introduction
El método se describe aquí permite la separación de tripanosomas, parásitos responsables de tripanosomiasis africana humana y animal (HAT), de la sangre. Este es el mejor método para el diagnóstico de la primera etapa sombrero y además este método de purificación del parásito permite sólida investigación serológica y la investigación.
SOMBRERO es causado por la mosca tsetsé transmitidos Trypanosoma brucei gambiense y T. b. rhodesiense1. Estos parásitos protozoarios se multiplican extracelularmente en el torrente sanguíneo, linfa y líquidos intersticiales durante la primera etapa de la enfermedad (etapa hemolinfáticos). La segunda etapa (etapa meningoencephalitic) comienza cuando parásitos cruzan la barrera hematoencefálica; signos neurológicos, incluyendo un trastorno del sueño, que ha dado su nombre "enfermedad del sueño" a esta enfermedad, son típicas de esta segunda etapa2. Relacionados con tripanosomas (T. evansi, T. congolense, T. vivax, T. b. brucei) son los agentes causativos de animal Tripanosomosis Africana (AAT)3.
La Organización Mundial de la salud (OMS) tiene como objetivo eliminar el sombrero como un problema de salud pública de aquí a 2020 y detener la transmisión por 20304. La reciente introducción de pruebas de diagnóstico rápido tiene mejor diagnóstico serológico1,4,5. Se han desarrollado varias pruebas diagnóstico moleculares, pero su papel en el diagnóstico de campo aún no ha sido establecido5. Se utilizan para identificar las sub-especies del grupo brucei y tripanosomiasis anormal causada por parásitos responsables de la Tripanosomosis animal6.
La detección del parásito es esencial para el diagnóstico, tratamiento y seguimiento, como la serología puede dar resultados falsos positivos y por desgracia falsos negativos1. La observación microscópica directa de estos protistas hemoflagelados es difícil en los casos de sombrero que son causados por T. b. gambiense, (más de 95% de los casos) como bajas parasitemias son la regla, considerando que para sombrero causada por T. b. rhodesiense, una gran número de parásitos está con frecuencia presente en la sangre. Se han utilizado varias técnicas de concentración, como la gota gruesa y centrifugación del tubo capilar (CTC), pero la separación de los parásitos de la sangre por una columna de Intercambiador aniónico (DEAE celulosa) seguido por centrifugación y observación microscópica de la pellet, es el método más sensible (alrededor de 50 parásitos/mL de sangre puede detectarse)1,7. En consecuencia, la purificación de tripanosomas por este método de intercambiadores de aniones (DEAE celulosa) es el mejor y hasta la fecha, el método de referencia para visualizar y aislar parásitos de la sangre para el diagnóstico de sombrero. En condiciones de campo, una pequeña columna de DEAE celulosa se ha utilizado con éxito y varias mejoras han facilitado la observación microscópica7,8.
El método de separación de tripanosoma de sangre, que se describe a continuación, depende de la carga superficial del parásito, que es menos negativo que el mamífero células de sangre9. Curiosamente, este método fue desarrollado hace 50 años, en 1968 por el Dr. Sheila Lanham y sigue siendo el estándar de oro para la detección y preparación de tripanosomas de la sangre. Es rápido y reproducible para tripanosomas salivarian de una amplia gama de mamíferos, permitiendo el diagnóstico de ambos de tripanosomiasis animal y humana10.
Para obtener vida, purificados de parásitos, sangre infectada se agrega en una columna de intercambiador de aniones. Condiciones de cromatografía (principalmente pH, fuerza iónica de tampones y medios) tienen que adaptarse a cada especie de Tripanosoma y más generalmente, para cada mezcla de mamíferas células de sangre y tripanosomas10. Tampón de elución es precisamente ajustado a pH 8 por tripanosomas africanos más10. Este método favorece la concentración de parásitos que se encuentran en la sangre de los pacientes, porque parasitemias pueden ser demasiado bajos para ser detectados por observación microscópica solamente, y también permite que las investigaciones del laboratorio. Trabajar con tripanosomas recién aislados y en la sangre de animales infectados, usando esta técnica, es más pertinente para las diversas investigaciones que estudios con parásitos que han sido cultivadas en condiciones axénicos en el laboratorio durante un período indefinido.
Las relaciones huésped-parásito se estudian mejor con un parásito que infecta a su huésped natural, por lo tanto, T. musculi, un parásito murino natural, que es representante de tripanosomas extracelulares, tiene muchas ventajas como infección murine consiste en un animal de laboratorio pequeño y no requiere condiciones de nivel (BSL) de seguridad de sustancias biopeligrosas. T. musculi no mata a los ratones inmunocompetentes, a diferencia de muchas otras especies de Trypanosoma , incluyendo patógenos humanos. T. musculi no se eliminan en los ratones desprovistos de la célula de T y parasitemias puede ser aumentada en los ratones infectados mediante la modificación de la ingesta de alimentos y nutrientes11. Este parásito modula la respuesta inmune en coinfección con otros patógenos12. T. musculi de ratones infectados exhiben diferencias de cultivo T. musculi, por ejemplo, la expresión de receptores de Fc de la membrana se pierde en cultivos axénicos T. musculi , comparados con parásitos purificados de ratones infectados13 , 14. factores Excreted secretada (FSE) son también cualitativamente y cuantitativamente menos expresada en cultivos axénicos Tripanosoma y difieren entre las cepas aisladas en áreas endémicas15. FSE son los antígenos primera muestra al sistema inmune anfitrión y así juegan un papel importante en la acogida inicial de la respuesta inmune16.
En animales infectados experimentalmente para las investigaciones del laboratorio, este protocolo facilita la experimentación con un mayor número de parásitos, reduciendo al mínimo el número de ratones requerida especialmente cuando se utilizan animales inmunosuprimidos. Las glicoproteínas de superficie variables (VSGs) que se utilizan en la prueba de aglutinación de tarjeta para tripanosomiasis (CATT) en la detección de masas todavía son purificadas de tripanosomas que se propagan en ratas. Las dos pruebas de diagnóstico rápido (cassettes individualmente) que ahora están disponibles para su uso en el campo, siguen utilizando una fuente infecciosa modelo nativa VSGs y no en vitro cultivados tripanosomas1,4, 5. el avance en el estudio de tripanosoma Inmunología y la biología se ha facilitado ya que estos parásitos DEAE celulosa purificada pueden obtenerse fácilmente en grandes cantidades de hosts infectados natural o experimentalmente y en particulares, roedores.
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Protocol
Las investigaciones conforman a las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio (NIH Publication no. 85±23, revisado 1996). Protocolos fueron aprobados por el Comité de ética local.
1. los animales
- Mantener los ratones femeninos de Suiza (de-1) de edad de ocho a diez semanas, 20-25 g, en un animal vivienda instalaciones quince días antes de cada experimento. Casa en cajas ventiladas que se mantienen en una protegida, temperatura (22 ° C) y humedad (50%) control de habitación, con 12 horas ciclo de luz de encendido/apagado.
- Dar animales libre acceso a alimentos y agua. Minimizar el dolor, el sufrimiento y el malestar y proporcionar enriquecimiento del medio ambiente.
- Para la cubierta, use jaulas paredes claro, enriquecimiento con palillos de madera y cartón túneles. Suavemente dibuja un animal en un túnel para transferir de la jaula a la palma de la mano.
- Realizar seguimiento diario para evaluar signos de postración, aislamiento social, lesión del cuerpo, cabello rizado o falta de aseo personal.
- Pesar cada animal una vez por semana. Realizar inspecciones regulares por un veterinario.
- Para los parásitos naturales, recoja la sangre en el pico de parasitemia y de parásitos, causando la muerte de animales, recolección de sangre el día antes de la muerte presunta.
Nota: Todos los experimentos con agentes infecciosos se realizan en salas dedicadas, según las directrices de la Universidad aprobada.
2. tampones, preparación de medios de comunicación
- Pesar cada sustancia y añadir agua destilada para los siguientes topes:
- Preparación concentrada solución salina tamponada con fosfato (2 x):
Na2HPO4 (anhidro) (MW 141,96 g) 10,14 g
NaH2PO4∙2H2O (MW 156,01 g) 0,62 g
NaCl (MW 58,44 g) 2,55 g
Agua destilada H2O a 1 L - Preparar el tampón fosfato salino-glucosa:
Na2HPO4 (anhidro) (MW 141,96 g) g 5,39
NaH2PO4∙2H2O (MW 156,01 g) 0,31 g
NaCl (MW 58,44 g) 1,70 g
Glucosa (MW 180 g) 10 g
Agua destilada H2O a 1 L - Preparar 1 M KH2PO4.
- Preparar el tampón de elución: Suplemento con tampón fosfato salino-glucosa con
Penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 μg/mL) y rojo de fenol (5 μg/mL).
- Preparación concentrada solución salina tamponada con fosfato (2 x):
3. preparación de la DEAE-celulosa
- Plan de unas 5 horas para la preparación de DEAE-celulosa.
- Lavar 100 g de DEAE-celulosa con agua destilada en un matraz con un cuello estrecho y dejar asentarse y partículas finas. Repita los lavados hasta que el sobrenadante esté claro.
- Añada 3 L de concentrado 2 x Phosphate-Buffered salina y mezclar.
- Ajustar el pH a 8.0 con 1 M de KH2PO4 y descartar el sobrenadante.
- Lavar dos veces con agua destilada y dejar de instalarse.
- Lave y deje que doble con 3 litros Phosphate-Buffered solución salina y glucosa y descartar el sobrenadante.
- Medir el volumen de la celulosa y añadir un volumen igual de solución salina de Phosphate-Buffered-glucosa, distribuir en botellas de plástico y almacenar a-20 ° C.
4. parásitos
- Recoger las cepas de Trypanosoma en áreas endémicas para la tripanosomiasis humana y animal. Mantener parásitos congelados en nitrógeno líquido.
Nota: Trypanosoma musculi no patógeno a los seres humanos y es un Tripanosoma extracelular utilizado para reemplazar con seguridad tripanosomas patógenos en varios experimentos de laboratorio. - En el caso de las investigaciones del laboratorio que requieren los patógenos humanos, manejar experimentos con cuidado en las condiciones de riesgo biológico apropiado dedicado seguridad nivel (BSL) y precauciones; BSL2 para T. b. gambiense y BSL3 de T. b. rhodesiense. En condiciones de campo, prácticas microbiológicas estándar se establecieron: garantizar muestreo, pipeteado mecánico, frecuentes descontaminación de superficies y esterilización de los residuos.
5. infección de ratón
- Descongelar rápidamente parásitos en un baño de agua a 37 ° C.
- Observar una gota de sangre infectada descongelada con un microscopio. Midiendo el porcentaje de formas móviles17evaluar la viabilidad del parásito.
- Inyectar parásitos por vía intraperitoneal en ratones (0,5 mL por ratón). Cada día post-infección, recoger 20 μl de sangre de la cola por punción de la aguja y observar bajo un microscopio. Evaluar parasitemia según Herbert y Lumsden18 conteo de parásitos en varios campos de microscopio, o usando un hemocitómetro.
- Cuando la parasitemia alcanza un umbral que se define para cada cepa, recoger la sangre (1 mL/ratón) en el tampón de elución (5 mL/ratón) que contiene heparina (10 U/mL).
Nota: El trabajo original y novedoso de Lanham y Godfrey divulgado que la fuerza óptima iónica de fosfato tampón salina glucosa para varias especies de huésped/parásito de una solución madre a pH 8.0.
6. separación parásito
Nota: Todos los experimentos de aquí en adelante deben realizarse en una campana de cultivo de tejidos con guantes. La temperatura y la humedad en los laboratorios utilizados fueron de 22 ° C y 45% respectivamente. En condiciones de campo, separación del parásito se ha realizado con éxito en 34 ° C.
- Colocar una jeringa de 10 mL en un soporte vertical y añadir una circular previamente cortada, pedazo de papel de filtro, lana de vidrio o esponja de celulosa.
- Vierta el DEAE celulosa en la jeringa hasta que el nivel de 8 mL es alcanzado y luego lavar con 25 mL de tampón de elución.
- Cuidadosamente añadir 2 mL de sangre diluida en la parte superior de la columna y añadir medio de elución. Regularmente añadir tampón de elución según el tránsito de los tripanosomas.
- Recoge gotas de efluentes de las columnas en un tubo de centrífuga y comprobar regularmente la presencia de parásitos con un microscopio.
- Cuando ya no se detectan parásitos en el efluente de la columna, centrifugar el tubo (1.800 x g, 10 minutos, a 4 ° C en el laboratorio y en la temperatura ambiente en condiciones de campo).
- Quite el sobrenadante y suspender los parásitos en 1 mL del medio relevante necesario para el siguiente paso de la investigación.
- Contar los parásitos con un hemocitómetro y les diluya en medio apropiado si es necesario.
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Representative Results
Purificada tripanosomas se han utilizado en pruebas farmacéuticas. Parásitos se transfieren en pocillos de cultivo que contiene diluciones seriadas de fármacos específicos, ya sea solo o mezclado19. Observaciones microscópicas, evaluar la motilidad es un marcador de viabilidad, puede realizarse con sólo unas pocas drogas están siendo analizadas, mientras que AlamarBlue análisis de viabilidad de la célula es un excelente método para ensayos de gran motilidad durante20de detección de drogas. El efecto de pentamidina, un fármaco de referencia utilizado en terapia de sombrero, se muestra en la figura 1.
Los macrófagos son muy útiles en culturas como las células de alimentador. Permiten que, in vitro, la iniciación y desarrollo de tripanosoma culturas21. Nos han informado que el número de macrófagos alternativamente activados aumentan en los mamíferos infectados por el Tripanosoma que favorecen crecimiento de parásito22. Esta activación de macrófagos alternativas fuentes de L-ornitina, que es esencial para el crecimiento del parásito. In vitro macrófago-parásito co-cultivos han demostrado que los tripanosomas inducen activación alternativa de macrófagos vía factores secretados. Tripanosomas extracelulares secretan una quinesina que se une a receptores de Unión manosa macrófago induce la expresión de la arginasa ofreciendo producción de L-ornitina favorece parásito diferenciación y multiplicación23,24 ( Figura 2). Manosa inhibe la quinesina vinculante y la inducción de arginasa y ratones deficientes en receptores de manosa aclarar el destino de quinesina sobre macrófagos (figura 3).
Puesto que numerosos genomas de tripanosoma ahora han sido ordenados y anotados, hemos podido tomar ventaja de estos grandes conjuntos de datos. Posteriormente, hemos podido llevar a cabo la genética hacia adelante y hacia atrás en estos parásitos. Con estos datos, purificada forma torrente sanguíneo tripanosomas se han utilizado para caracterizar y analizar las estructuras importantes como el bolsillo flagelar (PF) y su citoesqueleto asociado. La FP es el único sitio de endo y exocitosis en tripanosomas y es también donde se trafica con las glicoproteínas de superficie variable del Sistema endomembranoso25. El cuello de bolsillo flagelar (FPC) es un anular en forma de estructura que se une al flagelo en el punto donde sale el FP, pero hasta hace poco se conocía poco acerca de los componentes de la proteína de la FPC. Han identificado una proteína principal de la FPC, BILBO1 Tby han demostrado que es esencial para la supervivencia del parásito en el torrente sanguíneo forma26tanto en la forma de cultivo insectos mosca de tsetse. Caída de BILBO1 Tbpor ARNi previene la formación de FP e inhibe la biogénesis de muchas otras estructuras citoesqueléticas importantes, que el CPF y los objetivos importantes de FP para la intervención en los tripanosomas patógenos. Parásito purificadas o cultivadas las células con anticuerpos BILBO1 Tbde sondeo indica que en forma de sangre y forma procíclicas (insecto), se crea una estructura en forma de anillo que evita el flagelo. Tal etiquetado en forma de torrente sanguíneo, se muestra en la figura 4.
Torrente sanguíneo purificado forma tripanosomas han permitido la caracterización de muchas peculiaridades bioquímicas y metabólicas inusuales, incluyendo el metabolismo de la glucosa, que ocurre en el peroxisome-como organelles llamado glycosomes (ver figura 5). Estaba generalmente aceptado que piruvato es el producto final principal excretado de metabolismo de la glucosa por los tripanosomas de la circulación sanguínea, con prácticamente ninguna producción de succinato y acetato dentro de la mitocondria. En contraste, los tripanosomas procíclicas convierten treonina en acetato y la glucosa en acetato y succinato de27,28. Metabolismo energético de trypanosomátidos puede evaluarse por la adaptación a fuentes de carbono disponibles. Combinación de genética reversa y análisis metabolómicos confirmó la producción en la mitocondria de tripanosomas de la sangre del acetato del piruvato derivado de la glucosa y treonina, así como la producción de succinato de glucosa19,20 (Figura 5). Por ejemplo, 1análisis de H-NMR de los productos finales excretados por torrente sanguíneo tripanosomas de forma incubadas en PBS con glucosa de 4 mM, reveló que la glucosa se convierte principalmente en piruvato (85,1% de los productos finales excretados), con menor producción de alanina (9.2%), acetato (4,9%) y succinato (0,8%)29. Estos caminos, que son menores en términos de flujo metabólico en comparación a la producción de piruvato de la glucosa, son esenciales para el crecimiento del parásito. La vía de producción de succinato puede considerarse así como un buen objetivo potencial para el desarrollo de nuevos fármacos tripanocidas.
Figura 1 : Efecto in vitro de pentamidina en T. b. brucei. Diluciones de pentamidina agregaron a 2 x 105 parásitos para determinar la concentración de inhibición de crecimiento del parásito en un 50% (IC50). Curvas de dosis-efecto en 24 horas de cultivo. Barras de error representan el error estándar de la media de 5 experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Inducción de arginasa mediada por tripanosoma. Un kinesin lanzado por tripanosomas se une a los receptores de lectina tipo C hacia la inducción de arginasa. Esto resulta en aumento de la producción de L-ornitina y poliaminas, esenciales para el crecimiento del parásito y la diferenciación y en agotamiento de la L-arginina, resultando en menor producción de NO citotóxica de macrófagos NOS II. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Actividad de arginasa macrófago. Actividad de arginasa en macrófagos de ratones control y manosa receptor knock out (KO) ratones cultivadas en vitro en medio durante 48 horas, con o sin kinesin o manosa. Barras de error representan el error estándar de la media de 5 experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : TB BILBO1 etiquetado de una forma de flujo sanguíneo Trypanosoma brucei brucei célula (A) inmunofluorescencia etiquetado de un torrente sanguíneo, la forma de la cultura, 427 90-13 celular que ha sido sondeado con anticuerpo monoclonal de anti-BILBO1 seguido de un anticuerpo anti-ratón marcado con FITC y visualizados con luz ultravioleta, (Tb BILBO1 son el anulares señales verdes) y el ADN vinculante colorante DAPI (azul señales) (B) A fusión de imágenes de contraste DAPI, anti-BILBO1 y fase de iguales de la barra de escala de A. 10 μm. Anti-BILBO1 monoclonal de ratón fue diluido 1:10 en PBS y el anticuerpo secundario ( anti-mouse IgM FITC) fue diluido 1: 100. Imágenes fueron tomadas en un microscopio equipado con una cámara digital. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Representación esquemática del metabolismo de la glucosa y treonina en tripanosomas forma de flujo sanguíneo. Excreta los productos finales del metabolismo de la glucosa y la treonina son en caja. Las flechas azules gruesas indican pasos enzimáticos del metabolismo de la glucosa hacia la producción de piruvato, que es el principal producto final excretado de glucólisis. Flechas negras representan alto menores caminos metabólicos de la degradación de glucosa y treonina, que son esenciales para el crecimiento del parásito. La contribución de las enzimas indicadas ha sido validada experimentalmente: ACH, acetil – CoA thioesterase (CE 3.1.2.1); ASCT, acetato de: succinato CoA-transferasa (EC 2.8.3.18); AKCT, 2-amino-3-cetobutirato coenzima A ligasa (CE 2.3.1.29); PEPCK, fosfoenolpiruvato carboxicinasa (CE 4.1.1.49); PDH, complejo de piruvato deshidrogenasa (EC 1.2.4.1); TDH, treonina 3-deshidrogenasa (EC 1.1.1.103). Abreviaturas: AcCoA, acetil-CoA; AOB, amino oxobutyrate; DHAP, dihidroxiacetona fosfato; G3P, gliceraldehído 3-fosfato; MAL, malato; OA, oxaloacetato; PEP, fosfoenolpiruvato; PYR, piruvato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Tripanosomas purificadas representan un medio poderoso para estudiar Inmunología, bioquímica, biología celular y molecular. Grandes extensiones de datos y resultados se han obtenido de tripanosomas, que luego ha ayudado a obtener información de otras células eucariotas30. Tripanosomas son también el tema de investigación importante e interesante porque han ideado numerosos mecanismos que les permiten sobrevivir y crecer en dos ambientes muy diferentes: el vector de la mosca tsetsé y el del huésped mamífero23, 31. diversas técnicas para aislar tripanosomas se han divulgado, y una revisión sobre los enfoques basados en microfluídica ha sido recientemente publicado32. Por lo tanto, es esencial un medio reproducible y robusto de aislamiento del parásito.
DEAE celulosa preparación es un paso indispensable en este protocolo de preparación del parásito. Condiciones de lavado deben realizarse con cuidado para eliminar las partículas finas y para equilibrar la resina y el pH deberá ajustarse precisamente (pH 8.0 es apto para muchas especies de tripanosoma). Todos los pasos tienen que ser ajustado para mejorar la purificación del parásito y rendimiento manteniendo propiedades de viabilidad y celular del parásito. Lo importante, infectividad y viabilidad del parásito se han mantenido después de la purificación a través de una columna de DEAE-celulosa. Sin embargo, algunas cepas son más frágiles que otros y podrían ser menos infecciosas después de purificación33. Por lo tanto, el impacto de las condiciones de la separación en componentes de la membrana pelicular, metabolismo del parásito, de señalización, funciones de ácidos nucleicos e infectividad animal, tienen que ser evaluadas y las condiciones de separación tienen que adaptarse en consecuencia.
Limitaciones de esta técnica son que este procedimiento tiene que ser adaptado a cada especie de tripanosoma en un equipo dado y también mucho tiempo. Por otra parte, DEAE celulosa ahora es cara. Ensayos preliminares son necesarios para optimizar las condiciones de separación, en particular los medios de comunicación, que pueden tener diferentes fuerzas iónicas y pH preciso. Pasos de la columnas, incluyendo la selección de anticoagulantes, previa centrifugación para eliminar la mayoría de los eritrocitos, el uso de la capa anteada y lisis de eritrocitos, se eligen según cada experimento. Precisa cambios en un solo parámetro (buffers, temperatura durante el protocolo, parámetros de centrifugación) podría aumentar el número, grado de purificación y la viabilidad de los parásitos obtienen33. Desarrollo de nuevos parámetros de separación según especies y mamíferos sangre a separarse, puede ser necesario. Ajustes en el Protocolo inicial de Lanham y de Godfrey ha permitido la purificación biológica y antigénicamente conservada T. cruzi de sangre34. Las nuevas resinas pueden probadas y utilizadas con las condiciones apropiadas para diferentes especies35.
El papel fundamental de excreta/secretada factores (ES) de trypanosomátidos ha sido recientemente destacado16. ES contener moléculas implicadas en la patología y la inmunomodulación como kinesin, que se conserva entre tripanosomas24. ES preparación de parásitos purificadas requiere especial cuidado para evitar la contaminación por componentes de los medios de elución y sometidas a lisis de parásitos.
Una vacuna basada en ES eficaz contra la Leishmania, un parásito relacionado, ya existe y está disponible (CaniLeish Virbac)36. Asociación de moléculas conservadas juega un papel esencial en el crecimiento y la supervivencia del parásito podría representar la base para una futura vacuna contra tripanosomas, para los seres humanos y animales, en un enfoque de salud de uno. Purificación de tripanosomas africanos de sangre por las columnas de la DEAE-celulosa, con mejoras, sigue siendo el estándar de oro para la detección de tripanosoma en hospederos naturales con bajas parasitemias en áreas endémicas y la necesidad de parásitos en grandes números para investigaciones experimentales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a todos los miembros de la UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Esta investigación fue apoyada por el financiamiento interno de la Universidad de Burdeos y el apoyo de la ANR, la empresa LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024 y de la Asociación pour le développement de la recherche en parasitologie et médecine tropicale y el servicio de Service de Coopération et d ' action culturelle de l ' Ambassade de France à Bangui (Centroafricana).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
References
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