Summary
Bu yöntem kan trypanosome ayrılma memeli kan hücreleri daha az negatif olmak onların yüzey şarj bağlı olarak değişir. Enfekte kan yerleştirilir ve bir anyon değiştirici sütun tedavi. Bu yöntem, en uygun teşhis için Afrika tripanozomiyasına, immünolojik, biyolojik, biyokimyasal, ilaç ve moleküler biyoloji İncelemeler için saflaştırılmış parazitler sağlar.
Abstract
Bu yöntem Tripanozomlar, parazit bulaşmış kan hayvan ve insan Afrika tripanozomiyasına için (HAT), sorumlu ayırma verir. Bu ilk aşamasının şapka tanı için en iyi yöntem ve ayrıca bu parazit arıtma yöntemi serolojik izin verir ve araştırmalar araştırma.
ŞAPKA çeçe sineği aktarılan Trypanosoma brucei gambiense tarafından neden olduğu ve T. b. rhodesiense. İlgili Tripanozomlar hayvan tripanozomiyasına sorumlu ajanlar. Trypanosome algılama şapka tanı, tedavi ve takibi için esastır. Burada açıklanan tekniği alan koşulları T. b. gambiense şapka tanı için uyarlanmış en hassas parazit algılama teknik ve bir saat içinde tamamlanabilir. Kan pH 8 daha önce ayarlanmış bir anyon değiştirici sütuna (DEAE selüloz) katmanlı ve elüsyon arabellek eklenir. Daha az olumsuz ücret Tripanozomlar geçmesine ise son derece olumsuz dolu kan hücreleri sütun adsorbe. Toplanan Tripanozomlar Santrifüjü tarafından pelleted ve mikroskopi tarafından görülmektedir. Ayrıca, parazitler hücresel hasar onların infektivite muhafaza ederken hazırlanır.
Arıtılmış Tripanozomlar immünolojik test etmek için gerekli olan; Bunlar trypanolysis tahlil, şapka seroloji altın standart kullanılır. Lekeli parazitler alan seroloji kartı Aglutinasyon test (CATT) kullanılmaktadır. Antijenler gibi değişik yüzey glikoprotein, exoantigens, saflaştırılmış Tripanozomlar üzerinden de çeşitli uzun kullanılır. Burada açıklanan yordamı Afrika Tripanozomlar için tasarlanmıştır; Sonuç olarak, Kromatografi koşulları her trypanosome zorlanma ve daha genel olarak, her tür Ana Memeli kan için adapte zorunda.
Bu patojenler büyüleyici kolayca saflaştırılmış ve kullanmak kullanılabilir vardır biyokimyasal, moleküler ve hücre membran reseptörleri, sinyal ve gen düzeyinde ana bilgisayar-parazit ilişkileri araştırmak için konak hücreleri ile ortak kültür Biyoloji çalışmaları ifade; test içinde in vitroilaç; Gen silme, mutasyon veya metabolik süreçleri, hücre iskeleti Biyogenez ve parazit hayatta kalma overexpression incelenmesi.
Introduction
Yöntemi sunulan açıklanan burada Tripanozomlar, parazitler kan hayvan ve insan Afrika tripanozomiyasına için (HAT), sorumlu ayırma verir. Bu ilk aşamasının şapka tanı için en iyi yöntem ve ayrıca bu parazit arıtma yöntemi sağlam serolojik ve araştırma soruşturma izni.
ŞAPKA çeçe sineği aktarılan Trypanosoma brucei gambiense ve T. b. rhodesiense1ile. neden olur Bu protozoon parazitler (hemolymphatic sahne) hastalığın ilk aşamasında extracellularly kan, lenf ve interstisyel sıvı ile çarpın. Parazitler kan beyin bariyerini geçerken ikinci sahne (meningoencephalitic sahne) başlar; Onun adı "uyku hastalığı" Bu hastalığı verdi, bir uyku bozukluğu dahil olmak üzere nörolojik belirtiler bu ikinci aşama2/ tipik vardır. İlgili Tripanozomlar (T. evansi, T. congolense, T. Samsung, T. b. brucei) hayvan Afrika trypanosomosis (AAT)3sorumlu ajanlar.
Dünya Sağlık Örgütü (WHO) şapka bir halk sağlığı sorunu 2020 yılına kadar ortadan kaldırmak ve iletim 20304tarafından durdurmak için amaçlamaktadır. Geliştirilmiş serolojik tanı1,4,5hızlı tanı testleri son giriş vardır. Birkaç moleküler tanı testleri geliştirilmiştir ancak onların rol alan teşhis kurulan5henüz olmamıştır. Bunlar brucei grup ve atipik tripanozomiyasına parazitler için hayvan trypanosomosis6sorumlu nedeniyle alt türler tanımlamak için kullanılır.
Seroloji yanlış pozitif ve ne yazık ki yanlış negatif sonuçlar1vermek gibi parazit tespiti tanı, tedavi ve takip, için esastır. Bu hemoflagellate protistalar doğrudan microscopical gözlenmesi düşük parasitemias kural olarak T. b. gambiense, (vakaların % 95'den fazla) tarafından şapka için T. b. rhodesiensetarafından bir büyük neden ise neden olduğu şapka durumlarda zordur parazit sayısı sık kanda mevcuttur. Çeşitli toplama teknikleri, kalın damla ve kılcal tüp Santrifüjü (CTC), gibi kullanılmaya başlandı ama parazitler ayrımı anyon değiştirici (DEAE selüloz) bir sütun tarafından kandan ardından Santrifüjü ve mikroskobik gözlenmesi ekleyin cips, en hassas yöntemi (yaklaşık 50 parazitler/mL kan tespit)1,7. Sonuç olarak, bu anyon-değiştiriciler (DEAE selüloz) yöntemi tarafından Tripanozomlar arıtma en iyisi ve bugüne kadar görselleştirme ve şapka tanı için kan parazitleri izole için başvuru yöntemi. Alan koşullarında DEAE selüloz mini bir sütun tanımladınız ve çeşitli iyileştirmeler microscopical gözlem7,8kolaylaştırdı.
Trypanosome ayrılık kan, aşağıda açıklanan yöntem memeli kan hücreleri9daha az negatif parazit yüzey şarj bağlıdır. İlginçtir, bu yöntem 50 yıl önce Dr Sheila Lanham tarafından 1968 yılında geliştirildi ve algılama ve kan dolaşımına Tripanozomlar hazırlanması için altın standart kalır. Hızlı ve salivarian Tripanozomlar memeliler, her iki hayvan ve insan tripanozomiyasına10tanısında izin geniş bir dizi için tekrarlanabilir.
Canlı, saf parazitler elde etmek için enfekte kan bir anyon değiştirici sütun eklenir. Kromatografi koşulları (esas olarak pH, iyonik gücü arabellekleri/medya) her trypanosome türler için ve daha genel olarak, her memeli kan hücreleri ve Tripanozomlar10karışımı için adapte zorunda. Elüsyon arabellek tam olarak pH 8 birçok Afrika Tripanozomlar10için ayarlanır. Parasitemias mikroskobik gözlem yalnız tarafından algılanması için çok düşük olabilir, çünkü bu yöntem hastalar, kanda bulunan parazit konsantrasyonu ayrıcalıklı kılar ve ayrıca laboratuvar araştırma sağlar. Çalışma taze izole Tripanozomlar ile bu tekniği kullanarak enfekte hayvanlardan kan daha çeşitli araştırmalar için çalışmalar laboratuvarda axenic koşullarda belirsiz süreli kültürlü parazit daha uygun.
Ana bilgisayar-parazit ilişkileri en iyi doğal ana bilgisayar, bu nedenle, hastalık bir parazit T. musculi, doğal bir fare parazit ekstraselüler Tripanozomlar temsilcisidir, fare enfeksiyonu da karıştırmak gibi pek çok avantajı vardır ile okudu bir küçük laboratuvar hayvanı ve biohazard güvenlik düzeyi (BSL) koşulları gerektirmez. T. musculi insan patojenleri de dahil olmak üzere diğer birçok Trypanosoma türler aksine immün fare öldürmek değil. T. musculi değil T hücre yoksun farelerde ortadan ve parasitemias gıda ve besin alımını11değiştirerek virüslü farelerde artırılabilir. Bu parazit bağışıklık yanıtı diğer patojenleri12ile birlikte enfeksiyonlar modüle. T. musculi kültürlü T. musculi, gelen virüslü fareleri sergi farklar üzerinden örneğin, membran Fc reseptörleri ifade T. musculi axenic kültürleri, virüslü fareleri13 saf parazitler karşılaştırıldığında kaybolur , 14. Excreted salgıladığı faktörler (ESF) da nitelik ve nicelik daha az ifade axenic trypanosome kültürlerde ve endemik alanları15dakika içinde izole suşları arasında farklılık gösterir. ESF ana bağışıklık sistemi için var olmak göstermek ve bu yüzden bağışıklık yanıtı16ilk ana önemli bir rol oynamak için ilk antijenleri vardır.
Laboratuvar araştırmalar için deneysel olarak enfekte hayvanlarda bu protokol üzerinde parazitler özellikle baskılanmış hayvanlar kullanırken gerekli fare sayısını en aza indirme, daha çok sayıda deneme kolaylaştırır. Kart Aglutinasyon Test tripanozomiyasına (CATT) kitle tarama kullanılır varyant yüzey glikoproteinlerin (VSGs) yine de, fareler yayılır Tripanozomlar gelen saf. Şimdi alanda, kullanım için kullanılabilir olan iki hızlı tanı testleri (tek tek sarılı kaset) yerel VSGs ve kültürlü vitro Tripanozomlar1,4, bir infektif modeli kaynak kullanmaya devam 5. bu DEAE saf selüloz parazitler kolayca doğal olarak veya deneysel olarak virüslü bilgisayarlardan büyük miktarlarda ve belirli, Rodents elde edilebilir ondan beri trypanosome İmmünoloji ve Biyoloji çalışma gelişme kolaylaştırdı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Araştırmalar ana bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı (1996 revize NIH yayın No. 85±23) için standartlarla uyumlu. İletişim kuralları bizim yerel Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. hayvanlar
- 8-10 hafta yaşlı, 20-25 g, on beş gün önce her deney tesisi konut bir hayvan yaşlı kadın İsviçre (OF-1) fareler tutun. Onları bir korumalı, sıcaklık (22 ° C) ve nem (% 50) tutulur havalandırılmış kutularındaki ev Oda, açık/kapalı ışık-siklet 12 saat ile kontrol.
- Hayvanlar yiyecek ve su için ücretsiz erişim sağlar. Ağrı, acı ve sıkıntı en aza indirmek ve zenginleştirme ortamı sağlar.
- Konut için düz duvarlı kafesleri, zenginleştirme ahşap sopa ve karton tünelleri ile kullanın. Yavaşça bir hayvan avucunun için kafes aktarmak için bir tünel içine çizin.
- Secde, sosyal izolasyon, vücut yaralanma, fırfır yakalı saç ya da-sizlik çekmek-in damat değerlendirmek için günlük izleme yapmayı.
- Haftada bir kez her hayvan tartın. Bir veteriner tarafından düzenli denetimler gerçekleştirir.
- Doğal parazitler, parasitemia zirvesinde hayvan ölümüne neden olan parazit için kan toplamak, sözde ölümünden önce gün kan toplamak.
Not: Tüm deneylerin bulaşıcı ajanlar ile özel odalarda Üniversitesi onaylı kurallarına göre gerçekleştirilir.
2. arabellekleri, medya ürünleri
- Her madde tartmak ve aşağıdaki arabellekleri için distile su ekleyin:
- Yoğun fosfat tamponlu tuz çözeltisi hazırlamak (2 x):
Na2HPO4 (susuz) (MW 141.96 g) 10.14 g
NaH2PO4∙2H2O (MW 156.01 g) 0,62 g
NaCl (MW 58.44 g) 2.55 g
H2O 1 M'ye distile - Fosfat tamponlu tuz-glikoz hazırlayın:
Na2HPO4 (susuz) (MW 141.96 g) 5,39 g
NaH2PO4∙2H2O (MW 156.01 g) 0.31 g
NaCl (MW 58.44 g) 1.70 g
Glikoz (MW 180 g) 10 g
H2O 1 M'ye distile - 1 M KH2PO4hazırlayın.
- Elüsyon arabellek hazırlayın: Fosfat tamponlu tuz-glikoz ile ek
Penisilin (100 U/mL), streptomisin (100 µg/mL) ve fenol red (5 µg/mL).
- Yoğun fosfat tamponlu tuz çözeltisi hazırlamak (2 x):
3. DEAE-selüloz hazırlanması
- Yaklaşık 5 saat DEAE-selüloz hazırlık planı.
- DEAE-selüloz 100 g dar boyunlu bir balonun içinde distile su ile yıkama ve yerleşmek, sonra ince parçacıklar atmak için izin. Süpernatant temiz olana yıkar yineleyin.
- 3 L konsantre 2 x Phosphate-Buffered tuzlu ve heyecan ekleyin.
- 1 M KH2PO4 ile 8,0 pH ayarlama ve süpernatant atın.
- İki kez distile su ile yıkayın ve yerleşmek bırakın.
- Yıkama ve iki kez 3 litre Phosphate-Buffered serum-glikoz ile yerleşmek ve supernatants atmak için izin.
- Selüloz hacmi ölçmek ve eşit bir birim Phosphate-Buffered serum-glikoz eklemek, plastik şişe dağıtmak ve -20 ° C'de depolayın
4. parazitler
- Trypanosome suşları için insan ve hayvan tripanozomiyasına endemik bölgelerde toplamak. Sıvı nitrojen içinde donmuş parazitler tutun.
Not: Trypanosoma musculi insanlar için olmayan-patojen ve güvenli bir şekilde çeşitli laboratuvar deneyleri patojenik Tripanozomlar değiştirmek için kullanılan bir hücre dışı trypanosome. - İnsan patojenleri gerektiren laboratuvar soruşturma durumunda bakım adanmış uygun biohazard güvenlik düzeyi (BSL) koşullar ve önlemler ile deneyler idare; BSL2 T. d. gambiense ve T. b. rhodesienseiçin BSL3 için. Alan koşullarında, standart Mikrobiyolojik uygulama kurulur: güvenli örnekleme, mekanik pipetting, yüzeyler sık dekontaminasyonu ve atık sterilizasyon.
5. fare enfeksiyon
- Hızla parazitler 37 ° C'de bir su banyosunda tezcan
- Çözdürülen enfekte kan bir damla ile mikroskop gözlemlemek. Parazit canlılığı hareketli formları17yüzdesi ölçerek değerlendirmek.
- Parazitler intraperitoneally fareler (fare başına 0.5 mL) içine enjekte. Her gün, sonrası enfeksiyon, iğne ponksiyon tarafından 20 µL kuyruk kan toplamak ve mikroskop altında gözlemlemek. Parasitemia Herbert ve Lumsden18 göre parazitler birkaç mikroskop alanlardaki sayma veya bir haemocytometer kullanarak değerlendirmek.
- Parasitemia her zorlanma için tanımlanan bir eşiğe ulaştığında, kan (1 mL/fare) heparin (10 U/mL) içeren elüsyon arabellekte (5 mL/fare) toplamak.
Not: Birçok ana bilgisayar/parazit türü bir pH 8.0 hisse senedi çözümden için serum glikoz fosfat en uygun iyonik gücü arabelleğe Lanham ve Godfrey özgün ve yeni çalışmalarını bildirdi.
6. parazit ayırma
Not: Bu noktadan itibaren tüm deneylerin eldiven giymiş bir doku kültürü mahallede yapılmalıdır. Oda sıcaklık ve nem kullanılan laboratuarlarında 22 ° C % 45 idi. Alan koşullarında, parazit ayırma başarıyla 34 ° C'de yapılmıştır
- Bir 10 mL şırınga dikey desteğinde yerleştirin ve daha önce kesilmiş dairesel, filtre kağıdı, cam yünü veya selüloz sünger parçası ekleyin.
- 8 mL düzeyine ulaştı ve sonra elüsyon arabellek 25 mL ile yıkayın kadar DEAE selüloz şırınga dökün.
- Dikkatli bir şekilde sütunun üst kısmında 2 mL sulandırılmış kan ekleyin ve sonra elüsyon orta ekleyin. Düzenli olarak elüsyon arabellek Tripanozomlar transit göre ekleyin.
- Bir santrifüj tüpü sütunlarda atık su damlaları toplamak ve parazit varlığı için bir mikroskopla düzenli olarak kontrol edin.
- Parazitler artık sütun atık algılandığı zaman, tüp (1800 x g, 10 dakika, laboratuvarda 4 ° C'de ve alan koşullarında ortam sıcaklığında) santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant kaldırmak ve parazitler sonraki araştırmacı adım için gerekli ilgili orta 1 ml askıya alma.
- Bir hemasitometre parazit saymak ve onları seyreltik uygun ortamda gerekirse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arıtılmış Tripanozomlar ilaç testlerinde kullanılmaktadır. Parazitler belirli ilaçların tek başına ya da karışık19seri dilutions içeren kültür kuyu aktarılır. Mikroskobik gözlemler, motilite değerlendirilmesi bir belirtecidir canlılık, sadece birkaç Dug'lar test edilen gerçekleştirilebilir, AlamarBlue hücre canlılığı tahlil büyük hareketliliği deneyleri için mükemmel bir yöntem20eleme ilaç sırasında ise. Pentamidine, şapka tedavisinde kullanılan bir başvuru ilaç etkisini şekil 1' de görüntülenir.
Makrofajlar besleyici hücreler olarak kültürlerde çok yararlıdır. Onlar izin, in vitro başlatılması ve trypanosome gelişimi kültürlerin21. Biz alternatif olarak aktif makrofajlar numaralarını hangi onlar parazit büyüme22lehine trypanosome enfekte memelilerde artan bildirdi. Bu alternatif makrofaj harekete geçirmek L-Ornitin, parazit büyümesi için gerekli olan malzemeleri. Vitro makrofaj-parazit ortak kültürler Tripanozomlar makrofaj alternatif harekete geçirmek salgılanan etkenler yoluyla teşvik göstermiştir. Hücre dışı Tripanozomlar makrofaj mannoz bağlama reseptörleri parazit farklılaşma ve çarpma23,24 ( lehine L-Ornitin üretim sağlarken arginase ifadesi inducing bağlayan bir kinesin salgılar Şekil 2). Mannoz kinesin bağlama ve arginase indüksiyon engeller ve mannoz reseptörü eksikliği fareler kinesin makrofajlar (şekil 3) üzerinde hedef aydınlatmak.
Çok sayıda trypanosome genleri şimdi sıralı ve açıklamalı beri bu büyük veri kümeleri yararlanmak mümkün olmuştur. Daha sonra biz ileriye ve geriye doğru genetik Bu parazitler üzerine dışarı taşımak mümkün olmuştur. Bu verileri kullanarak, saf kan dolaşımına formu Tripanozomlar karakterize ve kamçı cep (FP) ve onun ilişkili sitoiskeleti gibi önemli yapıları çözümlemek için kullanılır. FP endo ve Tripanozomlar ekzositozu tek sitedir ve da nerede değişken yüzey glikoproteinlerin endomembrane sistemi25ticareti. Kamçılı cep yaka (FPC) bir annüler noktada kamçı FP çıkar, ama son zamanlarda az FPC protein bileşenlerinin hakkında bilinen kadar bağlı olduğu yapısı şeklinde olduğunu. FPC, TbBILBO1, büyük bir protein kimliklerini teşhis ettik ve kültürlü böcek çeçe sineği formu hem de kan dolaşımına formu26parazit hayatta kalmak için önemli olduğunu göstermiştir. TbBILBO1 RNAi tarafından nakavt FP oluşumunu önler ve yapım tüm patojen Tripanozomlar FPC ve FP önemli hedefler araya girmesi için çok diğer önemli hücre iskeleti yapıları, dipnotlar engeller. Sondalama arıtılmış veya kültürlü parazit hücreleri TbBILBO1 antikorlar ile kan ve procyclic (böcek) formunda, kamçı circumvents halka şeklinde bir yapı oluşturur gösterir. Böyle etiketleme, kan dolaşımına form üzerinde şekil 4' te gösterilmiştir.
Saf kan dolaşımına formu Tripanozomlar peroxisome gibi organellerin (bkz şekil 5) glycosomes denilen yer alır glikoz metabolizmasını da dahil olmak üzere birçok sıradışı biyokimyasal ve metabolik özellikleri, karakterizasyonu sağladı. Genel olarak o pyruvate glikoz metabolizması ile hemen hemen hiçbir üretim süksinat ve asetat mitokondri içinde kan dolaşımına Tripanozomlar tarafından atılır büyük son ürünü olduğunu kabul. Buna ek olarak, procyclic Tripanozomlar treonin asetat ve glikoz süksinat ve asetat27,28haline dönüştürmek. Trypanosomatids enerji metabolizmasını adaptasyon mevcut karbon kaynaklarına göre değerlendirilebilir. Ters genetik ve metabolomic analizler birleştirerek mitokondride imalatı asetat pyruvate glikoz kaynaklı ve treonin kan dolaşımına Tripanozomlar, hem de üretim süksinat glikoz19,20 doğruladı (Şekil 5). Örneğin, 1H-NMR analizi son ürün 4 mM glikoz, içeren PBS inkübe kan dolaşımına formu Tripanozomlar tarafından atılır ortaya glikoz pyruvate atılan son ürünleri (%85.1), esas olarak dönüştürülür küçük üretimi ile alanin (%9,2), asetat (% 4.9) ve süksinat (% 0.8)29. Küçük metabolik akı pyruvate üretim için glikoz karşılaştırıldığında açısından, bu yollar parazit büyümesi için gereklidir. Süksinat üretim yolu böylece yeni trypanocidal uyuşturucu gelişimi için iyi bir potansiyel hedef olarak kabul edilebilir.
Resim 1 : Üzerinde pentamidine vitro etkisi T. b. brucei. Pentamidine dilutions % 50 oranında (IC50) parazit büyüme inhibe konsantrasyonu belirlemek için 2 x 105 parazitler için eklenmiştir. Az 24 saat kültürünün doz-etki eğrileri. Hata çubukları 5 bağımsız deneylerden ortalama standart hatasını temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Arginase trypanosome-aracılı indüksiyon. Tripanozomlar tarafından yayımlanan bir kinesin C tipi lektin reseptörleri arginase indüksiyon için önde gelen bağlar. Bu L-Ornitin ve polyamines, parazit büyüme ve farklılaşma, artan üretim ve L-Arginin tükenmesi, sitotoksik No makrofaj NOS II tarafından daha düşük üretim sonuçlanan sonuçlanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Makrofaj arginase etkinlik. Kontrol fare ve mannoz reseptörü knock (KO) fareler dışarı makrofajlar faaliyete arginase 48 saat, ile ya da ezelî kinesin ya da mannoz vitro ortamda kültürlü. Hata çubukları 5 bağımsız deneylerden ortalama standart hatasını temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : TB BILBO1 kan dolaşımına şeklinde etiketleme Trypanosoma brucei brucei hücre Kan dolaşımına, kültür formu, 427 probed anti-BILBO1 Monoklonal antikor ile 90-13 hücre FITC etiketli bir anti-fare antikor tarafından takip etiketlerine göre ve ultraviyole ışık, (Tb kullanarak görüntülenir(a)ayirt BILBO1 yeşil Anüler sinyalleri vardır) ve (B) A boya DAPI (mavi sinyalleri) bağlama DNA birleştirme görüntülerin DAPI, anti-BILBO1 ve faz kontrast A. ölçek çubuğu eşittir 10 µm. Anti-BILBO1 monoklonal fareydi PBS ve ikincil antikor (seyreltilmiş 1:10 Anti-IgM FITC) seyreltilmiş 1: 100 fareydi. Görüntüler üzerinde bir dijital fotoğraf makinesi ile donatılmış bir mikroskop alınmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Kan dolaşımına formu Tripanozomlar glikoz ve treonin metabolizmasının şematik gösterim. Atılan son-Urun glikoz ve treonin metabolizma kutulu. Kalın mavi oklar ana son ürün Glikoliz atılır pyruvate üretimi için önde gelen glikoz metabolizmasının enzimatik adımları gösterir. Siyah okları temsil göz ardı parazit büyümesi için gerekli olan küçük metabolik yollar glikoz ve treonin bozulması, dan. Belirtilen enzimler katkısını deneysel olarak doğrulandı: ACH, acetyl-CoA thioesterase (EC 3.1.2.1); ASCT, asetat: süksinat CoA-transferaz (AK 2.8.3.18); AKCT, 2-amino-3-ketobutyrate koenzim A ligaz (AK 2.3.1.29); PEPCK, phosphoenolpyruvate carboxykinase (AK 4.1.1.49); PDH, pyruvate dehidrogenaz kompleksi (AK 1.2.4.1); TDH, treonin 3-dehidrogenaz (AK 1.1.1.103). Kısaltmalar: AcCoA, acetyl-CoA; AOB, amino oxobutyrate; DHAP, dihidroksi aseton fosfat; G3P, gliseraldehit 3-fosfat; MAL, malat; OA, oxaloacetate; PEP, phosphoenolpyruvate; PYR, pyruvate. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Arıtılmış Tripanozomlar İmmünoloji, biyokimya, hücresel ve moleküler biyoloji çalışma için güçlü bir araç temsil eder. Veri ve sonuçları büyük expanses Tripanozomlar elde edilmiştir hangi sonra diğer ökaryotik hücreler30' dan itibaren bilgi edinmek için yardımcı oldu. Çünkü onlar hayatta ve iki çok farklı ortamlarda büyümeye izin vermek çok sayıda mekanizmaları tasarlanmış Tripanozomlar önemli ve ilginç araştırma Ayrıca vardır: çeçe sineği vektör ve memeli ev sahibi23, 31. Tripanozomlar yalıtmak için çeşitli teknikleri bildirilmiştir ve havacilik tabanlı yaklaşımlar üzerine bir inceleme son zamanlarda yayımlanan32olmuştur. Bu nedenle, tekrarlanabilir ve sağlam bir parazit yalıtım gerekli olduğunu.
Vazgeçilmez bir adım bu parazit hazırlık protokolünde DEAE selüloz hazırlıktır. Çamaşır koşullarına sahip ince parçacıklar ortadan kaldırmak ve reçine equilibrate için dikkatli bir şekilde gerçekleştirilecek ve pH kesin olarak ayarlanması gerekir (pH 8.0 için en trypanosome tür apt). Tüm adımları parazit arıtma geliştirmek ve parazit canlılığı ve hücresel özellikleri korunarak verim için ayarlanması gerekir. Önemlisi, parazit canlılığı ve infektivite arıtma üzerinden DEAE-selüloz sütun sonra bakımı yapıldı mı. Ancak, bazı suşları diğerlerinden daha kırılgan ve arıtma33sonra daha az infektif olabilir. Bu nedenle, pellicular membran bileşenleri, parazit metabolizma, sinyal, nükleik asit işlevleri ve hayvan infektivite, ayrılık koşullara etkisi değerlendirilmek ve ayırma koşulları uygun şekilde adapte zorunda.
Bu teknik sınırlamalar bu yordamı her trypanosome tür bir konağın içinde adapte zorunda ve de zaman alan vardır. Ayrıca, DEAE selüloz şimdi pahalıdır. Ön deneyleri ayırma koşulları, değişen iyonik güçlü ve hassas bir pH olabilir özellikle medya, en iyi duruma getirmek gereklidir. Ön sütun adımları, antikoagülan seçim, eritrositler, buffy kat kullanımı ve eritrosit lizis, çoğunluğu kaldırmak için önceki Santrifüjü dahil olmak üzere her deney göre seçilir. Tek bir parametre (arabellekleri, iletişim kuralı Santrifüjü parametreleri boyunca sıcaklık) hassas değişiklikleri sayısı büyük ölçüde artırabilir, arıtma derecesi ve parazitler canlılık elde edilen33. Yeni ayırma parametrelerine göre parazit türleri ve ayrılması için memeli kan hücreleri gelişmekte, gerekli olabilir. İlk Lanham ve Godfrey'in Protokolü ayarlamalar biyolojik ve antigenically korunmuş T. cruzi kan34üzerinden arıtma izin verdi. Yeni reçineler de test ve farklı türler35için uygun koşullar ile kullanilir.
Trypanosomatids tarafından atılır/salgıladığı faktörler (ES) önemli rol vurgulanmış16zamanlarda. ES molekülleri patoloji ve Tripanozomlar24arasında korunmuş kinesin gibi immunomodulation katılan içerir. ES hazırlık arıtılmış parazitler üzerinden elüsyon ortam bileşenleri ve lysed parazitler tarafından kirlenmesini önlemek için özel dikkat gerektirir.
LEISHMANIAkarşı ilgili bir parazit, etkili bir ES-esaslı aşı zaten var ve mevcut (CaniLeish Virbac)36. Korunmuş molekülleri parazit hayatta kalma ve büyüme önemli roller oynayan Derneği olarak, insanlar ve hayvanlar, bir sağlık yaklaşımı Tripanozomlar karşı gelecek bir aşı için temsil edebilir. DEAE-selüloz sütunlarla gelişmeler, kanla gelen Afrika Tripanozomlar Arıtma parazitleri için çok sayıda ihtiyacını ve endemik bölgelerde düşük parasitemias ile doğal ana trypanosome algılaması için altın standart kalır deneysel araştırmalar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz tüm üyeleri UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux, teşekkür ederim. Bu araştırma iç Bordeaux Üniversitesi fon tarafından desteklendi ve destek LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024 ANR ve derneğin pour le développement de la recherche en parasitologie et médecine tropicale ve hizmet de coopération et d'action culturelle de l'Ambassade de France à Bangui (Centrafrique).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
References
- Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. Human African trypanosomiasis. Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).
- Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. Human African trypanosomiasis. Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).
- Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review. Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).
- Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454 (2017).
- Büscher, P., Deborggraeve, S. How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis? Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).
- Truc, P., et al. Atypical human infections by animal trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256 (2013).
- Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).
- Büscher, P., et al. Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471 (2009).
- Lanham, S. M. Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers. Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).
- Lanham, S. M., Godfrey, D. G. Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose. Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).
- Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice. Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).
- Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization. Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).
- Vincendeau, P., Daëron, M., Daulouede, S. Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages. Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).
- Vincendeau, P., Daëron, M. Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses. Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).
- Holzmuller, P., et al. Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics. Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).
- Holzmuller, P., et al. How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages? Frontiers in Immunology. 9, 778 (2018).
- Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi. Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).
- Herbert, W. J., Lumsden, W. H. Trypanosoma brucei: a rapid "matching" method for estimating the host's parasitemia. Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).
- Dauchy, F. A., et al. Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125 (2016).
- Raz, B., Iten, M., Grether-Bühler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro. Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).
- Albright, J. W., Albright, J. F. In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol. International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).
- Gobert, A. P., et al. L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis. Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).
- De Muylder, G., et al. A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731 (2013).
- Nzoumbou-Boko, R., et al. Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog. Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).
- Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated. PLoS Biology. 6 (5), e105 (2008).
- Albisetti, A., et al. Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei. PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710 (2017).
- Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate. Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).
- Bringaud, F., Rivière, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).
- Mazet, M., et al. Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587 (2013).
- Coutton, C., et al. Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human. Nature Communications. 9 (1), 686 (2018).
- Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake. Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).
- Barrett, M. P., et al. Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes. Pathogens. 6 (4), (2017).
- Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes. Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).
- Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism. Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).
- Cruz-Saavedra, L., et al. Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies. Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).
- Lemesre, J. L., et al. Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial. Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).
