Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Monitoraggio di Hippo segnalazione attività di via utilizzando un biosensore di basati su Luciferase grande tumore soppressore (LATS)

Published: September 13, 2018 doi: 10.3791/58416
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University
* These authors contributed equally

Summary

Qui presentiamo un biosensore basato su luciferase per quantificare l'attività della chinasi del soppressore del tumore grande (LATS)-una centrale chinasi della via di segnalazione di Ippona. Questo biosensore ha diverse applicazioni nella ricerca di base e traslazionale, volta ad indagare Hippo pathway regolatori in vitro e in vivo.

Abstract

L'ippopotamo via di segnalazione è un regolatore conservato della dimensione dell'organo e ha ruoli importanti nella biologia sviluppo e cancro. A causa di problemi tecnici, resta difficile valutare l'attività di questa via di segnalazione e interpretarla all'interno di un contesto biologico. La letteratura esistente sulla grande oncosoppressore (LATS) si basa su metodi qualitativi e non possono facilmente essere su vasta scala per lo screening. Recentemente, abbiamo sviluppato un biosensore basato su bioluminescenza per monitorare l'attività della chinasi di componente di LATS-a base della cascata della chinasi di ippopotamo. Qui, descriviamo le procedure per come questo biosensore LATS (LATS-BS) può essere utilizzato per caratterizzare i regolatori della via di ippopotamo. In primo luogo, forniamo un protocollo dettagliato per lo studio dell'effetto di un candidato di proteina overexpressed (ad es., VEGFR2) sull'attività LATS utilizzando il LATS-BS. Quindi, vi mostriamo come il LATS-BS può essere utilizzato per uno schermo di inibitore di chinasi su piccola scala. Questo protocollo può essere concretamente su vasta scala per eseguire schermi più grandi, che senza dubbio individuerà nuovi regolatori del pathway di ippopotamo.

Introduction

L'ippopotamo signaling pathway è stato identificato in Drosophila come un romanzo regolatore di crescita delle cellule e animali dimensione1,2. Fin dalla sua scoperta iniziale, le prove crescenti ha dimostrato in modo convincente che il pathway di Hippo svolge ruoli critici nello sviluppo (per esempio, lo sviluppo embrionale precoce, controllo delle dimensioni dell'organo e morfologia tridimensionale [3D]), nella tumorigenesi ( ad esempio, lo sviluppo del tumore, metastasi, l'angiogenesi, evasione immune, instabilità genomica, risposta allo stress e resistenza ai farmaci) e dell'omeostasi tissutale (ad es., rinnovamento delle cellule staminali e differenziazione e rigenerazione dei tessuti dopo l'infortunio) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. segnalazione hippo è frequentemente dysregulated in vari cancri7,8,9,10,11,12. Di conseguenza, delucidamento funzioni del pathway ippopotamo nella biologia del cancro e terapeutica e della medicina rigenerativa è diventata una delle aree più calde nella ricerca biomedica.

In breve, nella via dell'ippopotamo, al momento dell'attivazione di regolatori a Monte (ad es., contatto della cellula-cellula, lo stress nutritivo e matrice extracellulare [ECM]), chinasi serina/treonina (S/T) MST1/2 (MST; mammiferi omologhi di Drosophila Ippona) fosforilare/attivare adattatore proteine hMOB1 e WW45, così come chinasi di LATS1/2 (LATS) che, successivamente, fosforilano coattivatore trascrizionale YAP e relativo paralog TAZ a HX(H/R/K)XX(S/T) conservata (H, istidina; R, arginina; K, lisina; S, Serina; T, treonina; X, qualsiasi aminoacidi) motivi, tra cui YAP-S127 e TAZ-S8911,12. S127-fosforilato YAP (YAP-pS127) e TAZ S89-fosforilato (TAZ-pS89) sono degradati da ubiquitinazione o legarsi alla proteina citoplasmatica 14-3-3 e viene impedito che interagiscono con fattori di trascrizione di TEAD1-4 nel nucleo a transactivate a valle geni coinvolti nella proliferazione cellulare e apoptosi (Figura 1). Nonostante l'enorme interesse nella via dell'ippopotamo, esistono alcuni strumenti per la misurazione dell'ippopotamo di segnalazione e quelli che sono stati storicamente limitato ai giornalisti di output trascrizionale YAP/TAZ/TEAD. Infatti, fino a poco tempo fa, non c'erano nessun strumenti per misurare la dinamica e l'attività del Hippo segnalazione componenti in maniera quantitativa, in tempo reale, ad alta velocità e non invasivo sia in vitro che in vivo.

Data la nostra comprensione del ruolo delle interazioni proteina-proteina in fisiologia e patologia emergenti, c'è grande interesse nello sviluppo di strumenti che possono essere utilizzati per lo studio di queste interazioni in una maniera quantitativa e in tempo reale13, 14,15,16. Infatti, c'è stato un progresso significativo nello sviluppo di strategie bioanalitici, inclusi il lievito due-ibrido (Y2H)17, surface plasmon resonance (SPR)18e saggi di Förster risonanza energy transfer (FRET)19 , per valutare le interazioni proteina-proteina. Tuttavia, questi approcci portano la limitazione di che richiedono ottimizzazione significativa dell'orientamento reporter, tale che molti costrutti devono essere testati per trovare uno efficiente. Ulteriormente, questi approcci hanno anche un rapporto segnale-rumore relativamente basso, tale che può essere difficile discernere un vero positivo di segnalazione.

Analisi di complementazione di proteina sono state sviluppate per superare queste limitazioni. La prima generazione di analisi di complementazione di proteina è stata basata sulle proteine di fluorescenza multicolore di Spalato e non riusciva a risolvere le limitazioni di cui sopra20. Fluorescenza multicolore proteine consistono di un solo dominio, rendendo difficile per dividerli in due frammenti separati stabile con bassa affinità e sfondo rumore21. Successivamente, luciferasi firefly è stato identificato come un nuovo candidato per l'utilizzo nello sviluppo di analisi di complementazione di proteina Spalato. In questo approccio, luciferasi firefly sono diviso in due frammenti (N-terminale e C-terminale luciferasi [NLuc e CLuc]) con ogni frammento fusa ad una proteina dell'obiettivo di interesse. Se il NLuc e CLuc sono portati in prossimità sull'interazione delle proteine due bersaglio, l'attività luciferasica è ricostituito e luce bioluminescente viene generata in presenza di substrato luciferina e ATP22. Nel 2001, eseguendo uno screening combinatorio utilizzando una libreria contenente frammenti NLuc e CLuc tagliato in vari siti e associata a proteine con differenti linkers, Paulmurugan e Giacon presso la Stanford University ha sviluppato un ottimizzato Spalato-lucciola sistema di complementazione frammento-assistita di luciferasi per di interazioni proteina-proteina23. In questo sistema, luciferasi firefly viene tagliata due residui di serina e dell'aminoacido (aa) 398 per formare NLuc e CLuc, fissate alle due proteine di interesse utilizzando un linker flessibile di otto residui di glicina.

Utilizzando un approccio simile, abbiamo recentemente sviluppato un nuovo LATS-BS fondendo NLuc a 15 aa di YAP che circondano il sito di fosforilazione lettoni al S127 (YAP15) e CLuc con 14-3-3. La proteina di YAP full-length non è stata utilizzata, per evitare di confondere i segnali di modificazioni post-traduzionali di YAP (ad es., fosforilazione in altri siti e ubiquitinazione) da altri regolatori a Monte. Il LATS-BS qui presentato non invadente può monitorare Hippo segnalazione attività sia in vitro in cellule viventi e in vivo in topi20,24 (Figura 2). Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la misurazione LATS chinasi attività in vitro utilizzando il LATS-BS. In primo luogo, vi mostriamo come il LATS-BS può essere utilizzato per studiare l'effetto di una proteina overexpressed sull'attività lettoni. Quindi, vi mostriamo come biosensore può essere utilizzato per monitorare l'attività del pathway ippopotamo dopo il trattamento con agenti che regolano il pathway di ippopotamo. Questo protocollo potrebbe essere usato per identificare e caratterizzare le vie di segnalazione o stimoli che regolano l'attività della chinasi LATS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. indagine di un putativo regolatore di Hippo segnalazione utilizzando il LATS-BS

  1. Placcatura e transfezione delle celle
    1. Preparazione della coltura delle cellule
      1. Caldo, 1x PBS DMEM contenente 10% FBS e 1% di penicillina/streptomicina e 0,25% tripsina-EDTA a 37 ° C a bagnomaria per circa 30 min.
      2. Pulire un mobile di biosicurezza con etanolo al 70%.
      3. Piatti di coltura del tessuto, le pipette Pasteur, pipette sierologiche e puntali per inserire il cappuccio di coltura del tessuto come richiesto.
      4. Prendere fuori 1X PBS, i media e la tripsina-EDTA dal bagnomaria, pulirli con etanolo al 70% e metterli nella cappa.
    2. Manutenzione e placcatura delle cellule per la transfezione
      1. Scegliere una linea cellulare con un'efficienza di trasfezione alta (ad es., HEK293) per l'esperimento. Verifica per l'espressione delle componenti del pathway di ippopotamo in questa linea cellulare mediante western blot per assicurarsi di Hippo segnalazione è attivo.
      2. Crescere le cellule HEK293 in DMEM in 10cm di Petri in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2. Monitorare le cellule al microscopio ogni giorno. Passaggio le celle come descritto di seguito quando è osservato confluency di 80 – 90%.
      3. Lavare le cellule aggiungendo 5 mL di PBS 1X in una piastra, agitando delicatamente la piastra, e aspirando i media completamente.
      4. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA alla piastra. Agitare la piastra per garantire che la tripsina copre in modo uniforme le cellule.
      5. Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore a CO2 per 5 minuti o fino a quando tutte le celle sono staccate.
      6. Aggiungere 4 mL di media (con 10% FBS e 1% penicillina/streptomicina) per neutralizzare la tripsina, risospendere le cellule pipettando su e giù per diverse volte e dispensare un decimo (0,5 mL) delle cellule in nuove piastre di 100 mm (per un rapporto di passaggio di 01:10) contenente 9,5 mL di completa per i media.
      7. Per la transfezione LATS-BS , contare le celle utilizzando un emocitometro e piastra 2 x 105 celle in ogni pozzetto di una piastra 12-24 h prima di transfezione.
        Nota: Utilizzando più alti numeri di cellulare può aumentare il segnale di fondo bioluminescenti come Hippo segnalazione attività è regolata da confluency di cella. Utilizzando i numeri di cellulare più bassi può aumentare la sensibilità delle cellule ai reagenti di transfezione e aumentare delle cellule morte24.
    3. Transfezione di LATS-BS da solo o in combinazione con il gene candidato
      1. Fresco a Miniprep LATS-BS plasmidi (NLuc-YAP15-pcDNA3.1-igrometro e 14-3-3-CLuc-pcDNA3.1-Hygro) da coltura liquido DH5a dei batteri (necessaria per ottenere un'ottima espressione LATS-BS).
      2. 1 h prima di transfezione, aspirare il mezzo dalla piastra, aggiungere 500 µ l di terreno di crescita completa in tutti i pozzetti delle piastre 12-pozzetti e restituire le cellule nell'incubatore.
        Nota: Il seguente protocollo descrive metodi di transfezione utilizzando un reagente di transfezione commercialmente disponibile a base di polimeri. Altri reagenti di transfezione possono essere idonei per la transfezione; Tuttavia, non è stato testato ancora li.
      3. Rendere le soluzioni A e B come descritto nella tabella 1. Per transfezioni N, rendere (N + 0.5) x premiscela di soluzione B.
      4. Immediatamente aggiungere il reagente di transfezione diluito a base di polimeri (soluzione B) al DNA (soluzione A). Pipettare delicatamente su e giù per mescolare.
      5. Incubare il campione a temperatura ambiente per 15 min consentire complessi di transfezione per modulo.
      6. Aggiungere il volume totale (76 µ l) di complessi di transfezione goccia a goccia in ciascun pozzetto della piastra 12-pozzetti con agitando delicatamente.
      7. Incubare le cellule durante la notte (18-24 h) a 37 ° C.
        Nota: Per le celle che sono sensibili ai reagenti di transfezione a base di polimeri, il tempo di incubazione può ridursi a 5 h.
      8. Il giorno dopo la trasfezione, rimuovere il supporto di transfezione-complesso-contenente e sostituirlo con fresco multimediale completo. Le cellule a 37 ° C per un altro giorno eseguire analisi di luciferase della coltura.
  2. Analisi di luciferase
    Nota: Il sistema di analisi di Luciferase Reporter rilevazione firefly e Renilla insieme in un dosaggio viene utilizzato per i saggi di luciferasi. Se Renilla non è stato utilizzato come controllo interno, è possibile eseguire analisi di luciferase One-Step aggiungendo LARII senza aggiungere il reagente di rivelazione Renilla .
    1. Preparazione dei lisati cellulari
      1. Diluire il buffer di lisi passivo x 5 (PLB) con acqua distillata come segue:
      2. Volume totale di 1 x PLB richiesto = N x (50 μL di 5x PLB) + 200 μL di dH2O = N x 250 μL di 1 x PLB per pozzetto delle piastre 12-pozzetti (N = numero di campioni).
      3. Aspirare i media completamente. Aggiungere 1 mL di 1X PBS in ciascun pozzetto. Agitare la piastra delicatamente per rimuovere staccato cellule e crescita residua media. Aspirare il PBS 1X completamente. Non assicurarsi che nessun residuo 1X PBS resti prima dell'aggiunta di 1 x PLB.
      4. Aggiungere 250 µ l di 1 x PLB/pozzetto.
      5. Posizionare le piastre di coltura su una piattaforma a dondolo con dolce dondolo per garantire una copertura completa e persino di strato monomolecolare della cellula con 1 x PLB. Le piastre di coltura a temperatura ambiente per 15 minuti consentire alle cellule di lisare della roccia.
      6. Trasferire il lisato una microcentrifuga da 1,5 mL.
    2. Misura il segnale bioluminescente
      1. Estrarre il LARII (20 μL/Campione) da-80 ° C e si stabilizzare a temperatura ambiente.
      2. Preparazione del reagente di rilevamento Renilla per saggi N: aggiungere (N + 1) x 0,4 μL di 50 x substrato a (N + 1) x 19,6 μL di Buffer.
      3. Predispense 10 μL di ogni cella lysata per provette da 1,5 mL.
      4. Programmare un luminometro per eseguire un ritardo di 2-s premeasurement, seguito da un periodo di misurazione 10-s per ogni analisi di luciferase dual.
        Nota: Le misurazioni prime e la seconda saranno pari al segnale LATS-BS e il segnale di controllo interno di Renilla , rispettivamente. Può essere utilizzato qualsiasi luminometro compatibile con un singolo o doppio luciferasi.
      5. Trasferire con cautela 20 μL di reagente LARII in una provetta e pipettare rapidamente su e giù 3 x per mescolarlo.
      6. Immediatamente collocare la provetta nel luminometro e avviare la lettura.
      7. Togliere la provetta dal luminometro, immediatamente aggiungere 20 μL di reagente Renilla e Miscelare pipettando su e giù x 3. Portare il campione sul luminometro e avviare la lettura successiva. Registrare le misurazioni.
      8. Gettare la provetta di reazione e procedere con il campione successivo.

2. uno schermo per identificare Hippo Pathway regolatori utilizzando il LATS-BS

  1. Coltura cellulare e transfezioni
    1. Cellule di HEK293AD di cultura come descritto nella sezione 1.1.
      Nota: HEK293AD è più aderente rispetto altre linee di cellule HEK293, che lo rende una buona varietà di cellula per uso nelle schermate.
    2. Staccare le cellule come descritto nella sezione 1.1.2. Contare e piastra 2 x 106 cellule in piastre 100 mm 24 h prima di transfezione.
    3. 1 h prima di transfezione, aspirare i media dalla piastra e sostituirli con 5 mL di mezzi freschi di sviluppo completo.
    4. Rendere le soluzioni A e B come descritto nella tabella 2.
    5. Immediatamente aggiungere il reagente di transfezione diluito a base di polimeri (soluzione B) al DNA (soluzione A). Pipettare su e giù per mescolare.
    6. Incubare il campione a temperatura ambiente per 15 min consentire complessi di transfezione per modulo.
      1. Aggiungere goccia a goccia il volume totale (500 µ l) di complessi di transfezione alle celle con agitando delicatamente.
      2. Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C.
      3. Il giorno successivo, tripsinizzano e contare le celle. Piastra di 1 x 104 a 2 x 104 cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti in un volume totale di 100 µ l di media per pozzetto. Incubare per un altro giorno.
    7. Il giorno successivo, aggiungere molecole di agenti/piccole che regolano il pathway di Hippo ad una concentrazione finale di 10 µM in ciascun pozzetto, 1 – 4 h prima di eseguire l'analisi di luciferase.
      Nota: Per la maggior parte delle piccoli molecole/agenti, un trattamento di 4 h a 10 µM non influisce la vitalità cellulare. Se viene utilizzata una concentrazione più bassa, il trattamento può essere prorogato per un periodo di tempo più lungo.
  2. Analisi di luciferase
    1. In vitro l'analisi di luciferase
      1. Aspirare i media dalle cellule completamente. Lavare le cellule con 100 µ l di 1X PBS in ciascun pozzetto. Aspirare completamente.
      2. Aggiungere 20 µ l di 1 x PLB (preparato come descritto nel passo 1.2.1.1) in tutti i pozzetti di piastre a 96 pozzetti.
      3. Posizionare le piastre di coltura su una piattaforma a dondolo con dolce dondolo a temperatura ambiente per 15 min.
      4. Attentamente trasferire 20 µ l di reagente LARII in ciascun pozzetto e pipettare su e giù per 3 volte per mescolare.
      5. Immediatamente posto la piastra in un luminometro lettura targhe e avviare la lettura.
    2. Analisi di luciferase cellula vivente
      1. Fare 11 x Stock in D-luciferina come segue: sciogliere 1,5 mg di D-luciferina di polvere in 1 mL di terreno di coltura normale.
      2. Trasferire 10 µ l di 11 x D-luciferina in ogni bene e mescolare delicatamente con i media che è già nel pozzo.
      3. Sostituire le cellule in incubatrice per 10 min.
      4. Posizionare la piastra sul luminometro e avviare la lettura.
        Nota: Se l'intensità del segnale non è abbastanza forte a questa concentrazione di D-luciferina, un altro 10 µ l di brodo D-luciferina possono essere aggiunti alle cellule.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Il LATS-BS è stato cotransfected con geni differenti per valutare il loro effetto sull'attività LATS (Figura 3). In questo esperimento, Renilla è stato utilizzato come controllo interno. L'espressione transitoria di YAP-5SA, una forma attiva costitutiva di YAP, cause aumentando i livelli di target trascrizionali YAP e un successivo incremento nell'attività della chinasi lettoni attraverso un feedback stabiliti percorso25. MST, l'attivatore a Monte di LATS nella via dell'ippopotamo (Figura 1), aumenta anche l'intensità di segnale del biosensore. Tuttavia, la sovraespressione di VEGFR, che innesca la segnalazione PI3K/MAPK, inibisce lettoni e diminuisce l'intensità di segnale della LATS-BS.

Nel secondo protocollo, LATS-BS è stato transfected nelle HEK293AD e 24 ore dopo la trasfezione, le cellule erano passate in piastre da 96 pozzetti. 40 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state trattate con regolatori diversi noti piccola molecola di Hippo segnalazione seguita da un'analisi di luciferase (Figura 4). VEGFR, PI 3-kinase, cellulare e livello di energia sono tre noti regolatori negativi della chinasi LATS24. In questo esperimento, GDS0941, PI 3-chinasi inibitore, axitinib e SU4312, inibitori di VEGFR e 2-D glucosio, che è causa di stress energia tramite un'inibizione del metabolismo del glucosio e la produzione di ATP, sono stati utilizzati per attivare il LATS-BS. Inversamente, LPA, S1P e TPA sono stati usati per inibire il LATS-BS. Questo esperimento mostra che il LATS-BS può essere utilizzato per misurare sia l'attivazione e l'effetto di inibizione di una piccola molecola su attività della chinasi LATS.

Soluzione A
pCDNA3.1-igro-NLuc-YAP15 1 μL (50 ng)
pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc 1 μL (50 ng)
Plasmide esprimente un gene candidato (ad es. MST) 1 μL (400 ng)
o vettore vuoto (es. pcDNA3.1-Hygro)
Renilla vettore (pRL-TK) (opzionale) 1 μL (20 ng)
DMEM (senza siero/antibiotici) 34 ΜL
Volume totale 38 ΜL
Soluzione B
Reagente di transfezione a base di polimeri 1,5 ΜL
(rapporto 3:1 con totale μg di DNA)
DMEM (senza siero/antibiotici) 36,5 ΜL
Volume totale 38 ΜL

Tabella 1: Protocollo per rendere le soluzioni A e B usando un reagente di transfezione a base di polimeri per indagare un putativo regolatore del pathway ippopotamo con il LATS-BS.

Soluzione A
pCDNA3.1-igro-NLuc-YAP15 10 μL (3 μg)
pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc 10 μL (3 μg)
DMEM (senza siero/antibiotici) ΜL 230
Volume totale 250 ΜL
Soluzione B
Reagente di transfezione a base di polimeri 18 ΜL
(rapporto 3:1 con totale μg di DNA)
DMEM (senza siero/antibiotici) 232 ΜL
Volume totale 250 ΜL

Tabella 2: Protocollo per rendere le soluzioni A e B usando un reagente di transfezione a base di polimeri per lo screening per identificare i regolatori del pathway Hippo utilizzando il LATS-BS.

Figure 1
Figura 1: Via ippopotamo in mammiferi. Il pathway di Hippo limita la dimensione dell'organo fosforilante ed inibendo YAP e TAZ. Quando viene attivato il pathway di ippopotamo, SAV, LATS1/2 e MOB sono fosforilato e attivato da MST1/2. LATS1/2 attivato fosforila YAP/TAZ conservati siti contenenti serina. 14-3-3 interagisce con YAP/TAZ fosforilato, inibendo la loro localizzazione nucleare e co-transactivation di geni a valle bersaglio attraverso TEADs. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: analisi di complementazione di Spalato-proteina LATS-BS basata sulla luciferasi. Domini N - e C-terminale di luciferasi (NLuc e CLuc) sono collegate alle 15 ammino acido circostante YAP-S127 e 14-3-3, rispettivamente. Il legame di YAP15/14-3-3 dopo fosforilazione LATS promuove la complementazione di luciferase ed emissione del segnale di bioluminescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: risultati da un esperimento rappresentanza valutando l'effetto di un gene su LATS attività. Il biosensore può essere espresso da solo o insieme ad altri geni in cellule di HEK293AD per indagare il loro effetto sull'attività della chinasi LATS (media ± SD; n = 3, * *p < 0.01, * * *p < 0,001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: risultati da un esperimento rappresentanza valutare l'effetto di piccole molecole sulle attività di lettoni in cellule di HEK293AD. HEK293AD cellule sono state trasfettate con il LATS-BS e trattate con i seguenti farmaci: inibitore di PI3K (GDC0941), 10 μM per 4 h; Inibitore VEGFR (RCC), 10 μM per 4 h; 2-deossiglucosio, 25 mM per 1 h; LPA, 10 μM per 1 h; sfingosina-1-phosphophate (S1P), 1 μM per 1 h; 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA), 5 nM per 1 h; Inibitore VEGFR (SU4312), 10 μM per 4 h (media ± SD; n = 3, * *p < 0.01, * * *p < 0,001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mentre la via di Hippo svolge ruoli critici in vari processi biologici e disregolazione del pathway Hippo conduce a cancro6, come il pathway di Hippo è regolamentato in risposta a vari stimoli completamente non è capito. Inoltre, c' non è stato nessun sistema quantitativo e in tempo reale per valutare l'attività dei componenti di base di ippopotamo. Recentemente, abbiamo sviluppato e validato un biosensore romanzo per misurare l'attività della chinasi lettoni del Hippo pathway24. Questo biosensore può essere utilizzato non solo per quantitativamente e accurato monitoraggio Hippo segnalazione attività in cellule viventi, ma anche per gli schermi di droghe che designano come la via di Ippona per la terapia del cancro. Inoltre, lo screening basato su biosensore può portare alla scoperta di nuovi geni responsabili della regolazione del pathway di ippopotamo. Data l'importanza di Hippo segnalazione in cancro, individuazione diafonia cruciale tra altri geni e pathway ippopotamo sarebbe un valido studio di intraprendere per tutti i biologi di cancro. Di conseguenza, questo biosensore ha il potenziale per fare innovazioni nel trattamento corrente di cancro e potrebbe fornire una nuova strategia terapeutica utile per trattamenti di successo di cancro.

Ci sono diversi punti importanti da considerare quando si utilizza il LATS-BS. In primo luogo, nella nostra esperienza, il LATS-BS ha la massima sensibilità quando i plasmidi usati per la transfezione vengono estratti freschi dai batteri. In secondo luogo, la quantità di plasmidi LATS-BS transfettate nelle cellule influenzerà l'intensità di segnale e sensibilità di LATS-BS. La quantità di DNA del plasmide può essere aumentata a 400 ng/frammento per il LATS-BS e a 600 ng per il gene di interesse per pozzetto di una piastra 12-pozzetti. In generale, l'utilizzo di plasmide più darà una maggiore intensità di segnale ma minore sensibilità. In terzo luogo, confluency di cella possono influenzare il segnale sfondo LATS-BS. Coerentemente con il ruolo ormai consolidato di Hippo segnalazione nelle risposte cellulari al confluency, abbiamo osservato che le cellule con maggiore confluenza hanno un segnale di fondo LATS-BS superiore grazie all'attivazione del LATS endogeno. Di conseguenza, le cellule scarsamente placcati mostrano un basso segnale di fondo di LATS-BS. Confluency di cellulare ottimale può essere selezionata a seconda dello scopo dell'esperimento (alto confluency per osservare l'inibizione lettoni; basso confluency per osservare l'attivazione LATS). In quarto luogo, Renilla può essere utilizzato come controllo interno per l'efficienza di trasfezione, e per duro transfect cellule (per esempio, MCF10A), il rapporto di reagente: DNA di transfezione può essere modificato a 4:1. Infine, è consigliabile cotransfecting MST2 come controllo positivo e YAP-S127A come controllo negativo ogni volta che viene utilizzato il biosensore.

Ogni strumento ha i suoi limiti. Il LATS-BS è il substrato artificiale di una proteina endogena, che può sempre prevalere il vero substrato della proteina di interesse. Questo effetto è noto come un effetto tampone del biosensore. Migliorando il biosensore con maggiore intensità di segnale e più bassi livelli di espressione può aiutare a superare questo problema. Un'altra limitazione è che le vie di feedback possono complicare l'interpretazione dei dati da LATS-BS. Ci sono molti lineari e non lineari che interagiscono vie che probabilmente influenzano il segnale LATS-BS di segnalazione. Il LATS-BS dimostra solo l'effetto cumulativo di uno stimolo su attività della chinasi lettoni. Occorre, tuttavia, che tale limitazione non è univoco per il LATS-BS ma piuttosto è incontrata comunemente negli studi di biologia molecolare. Così, i lettoni-BS dati devono essere interpretati nel contesto di esperimenti multipli probatorio.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni dall'Istituto canadese di ricerca salute (CIHR n. 119325, 148629) e la Fondazione canadese per la cancro seno (CBCF) a XY. TA è supportato dalla borsa di studio di laurea Canada Vanier e Ontario International Graduate Scholarship. HJJVR è supportato da una regina Elizabeth II Graduate Scholarship in scienza e tecnologia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin-EDTA  Life Technologies 2520056 0.25%
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F1051
DMEM Sigma D6429-500ml DMEM with high glucose 
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122
PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent  Signagen SL100688.5
5x Passive lysis buffer Promega E194A 30 ml
Dual-Glo® Luciferase Assay System Promega E2940 100 ml kit
20/20 luminometer Turner Biosystems 998-2036 Single tube reader luminometer
GloMax®Navigator with dual injectors Promega GM2010 96-well plates reader luminometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
  2. Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).
  3. Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The Hippo Pathway: Immunity and Cancer. Cancers. 10 (4), 94 (2018).
  4. Maugeri-Saccà, M., De Maria, R. The Hippo pathway in normal development and cancer. Pharmacology & Therapeutics. 186, 60-72 (2018).
  5. van Rensburg, H. J. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  6. Yeung, B., Yu, J., Yang, X. Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis. International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).
  7. Zhao, Y., Yang, X. The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance. International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).
  8. Yu, F. -X., Guan, K. -L. The Hippo pathway: regulators and regulations. Genes & Development. 27 (4), 355-371 (2013).
  9. Yang, X., Xu, T. Molecular mechanism of size control in development and human diseases. Cell Research. 21 (5), 715 (2011).
  10. Visser, S., Yang, X. LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis. Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).
  11. Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes & Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).
  12. Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP. Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).
  13. Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein. Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).
  14. Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. Characterization of oligomer formation of amyloid-β peptide using a split-luciferase complementation assay. Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).
  15. Decock, M., et al. Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing. FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).
  16. Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1. European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).
  17. Brückner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  18. Pattnaik, P. Surface plasmon resonance. Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).
  19. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).
  20. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  21. Hu, C. -D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
  22. Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).
  23. Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).
  24. Azad, T., et al. A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis. Nature Communications. 9 (1), 1061 (2018).
  25. Moroishi, T., et al. A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis. Genes & Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).

Tags

Ricerca sul cancro problema 139 LATS biosensore LATS via di ippopotamo dividere l'analisi di luciferase coltura cellulare lo screening di stupefacenti chinasi
Monitoraggio di Hippo segnalazione attività di via utilizzando un biosensore di basati su Luciferase grande tumore soppressore (LATS)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Azad, T., Nouri, K., Janse van… More

Azad, T., Nouri, K., Janse van Rensburg, H. J., Hao, Y., Yang, X. Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor (LATS) Biosensor. J. Vis. Exp. (139), e58416, doi:10.3791/58416 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter