Summary
在这里, 我们提出一个基于荧光素酶的生物传感器, 以量化的激酶活性的大抑癌 (拉图)-一个中心激酶在河马信号通路。该生物传感器在基础和平移研究中有不同的应用, 目的是在体外和体内对河马通路调节器进行调查。
Abstract
河马信号通路是器官大小的守恒调节器, 在发育和肿瘤生物学中具有重要作用。由于技术上的挑战, 很难评估这一信号通路的活动, 并在生物环境中加以解释。现有的关于大肿瘤抑制物 (拉图) 的文献依赖于定性和不易放大的方法进行筛查。最近, 我们已经开发了一种生物发光传感器来监测拉图的激酶活性--河马激酶级联的核心成分。在这里, 我们描述了如何使用这种拉图生物传感器 (拉图 BS) 来描述河马通路调节器的过程。首先, 我们提供了一个详细的协议, 以调查抗原蛋白候选者 (例如, VEGFR2) 对拉图活动的影响, 使用拉图 BS。然后, 我们展示了如何使用的拉图 BS 可用于小规模激酶抑制剂屏幕。这项协议可以进行放大, 以执行更大的屏幕, 这无疑将确定新的管理者的河马路径。
Introduction
河马信号通路首先被确定在果蝇作为一个新的调节细胞生长和动物大小1,2。自初步发现以来, 越来越多的证据令人信服地表明, 河马通路在发展中起着关键作用 (如早期胚胎发育、器官大小控制和三维 [3 D] 形态学), 肿瘤发生 (例如, 肿瘤的发育、转移、血管生成、免疫逃逸、基因组不稳定、应激反应和耐药性, 以及组织稳态 (例如, 损伤后的干细胞更新和分化及组织再生)3,4,5,6,7,8,9,10. 河马信号频繁地失调在各种各样的癌症 7,8,9,10,11,12。因此, 阐明河马通路在肿瘤生物学、治疗和再生医学中的作用已成为生物医学研究中最热的领域之一。
简而言之, 在河马通路中, 在上游调控器 (例如, 细胞接触, 营养压力和细胞外基质 [ECM]) 激活后, MST1/2 (MST;果蝇河马的哺乳动物同系物) 丝氨酸/苏氨酸 (s-/T) 激酶phosphorylate/激活适配器蛋白 hMOB1 和 WW45, 以及 LATS1/2 (拉图) 激酶, 随后, phosphorylate 转录的联合激活剂狂吠和它的 paralog 在保存的黄叶 (h/R/K) XX (S/T) (h, 组氨酸;R、精氨酸;K, 赖氨酸;S, 丝氨酸;T, 苏氨酸;X, 任何氨基酸) 的图案, 包括 YAP-S127 和 TAZ-S8911,12。S127-phosphorylated 狂吠 (YAP-pS127) 和 S89-phosphorylated (TAZ-pS89) 被泛或绑定到细胞质蛋白 14-3-3, 并防止与 TEAD1-4 转录因子在细胞核中的 transactivate 下游的互动细胞增殖和凋亡相关的基因 (图 1)。尽管对河马的路径有极大的兴趣, 但很少有测量河马信号的工具, 那些在历史上仅限于狂吠/TEAD 转录输出的记者。事实上, 直到最近, 没有任何工具, 以定量, 实时, 高通量, 和非侵入性的方式测量河马信号成分在体外和体内的动态和活动。
鉴于我们对蛋白质-蛋白质相互作用在生理学和病理学中的作用的认识日益加深, 人们非常感兴趣的是开发可用于定量和实时方式研究这些相互作用的工具13, 14,15,16。事实上, 生物分析战略的发展取得了重大进展, 其中包括酵母双杂交 (Y2H)17、表面等离子体共振 (SPR)18和 Förster 共振能量转移 (烦恼)19化验,来评估蛋白质与蛋白质的相互作用。然而, 这些方法的局限性是要求对记者的定位进行重要的优化, 这样就必须对许多构造进行测试以找到一个有效的。此外, 这些方法也有一个相对较低的信噪比, 这样辨别一个真正的正面信号可能是挑战。
为了克服这些局限性, 研制了蛋白质互补测定。第一代蛋白质互补检测是基于分裂多色荧光蛋白, 不能解决上述限制20。多色荧光蛋白仅由一个域组成, 使得很难将它们分成两个独立的稳定片段, 它们的亲和力和背景噪声为21。随后, 萤火虫荧光素酶被确定为一种新的候选体, 用于发展分裂蛋白互补测定。在这种方法中, 萤火虫荧光素酶被分成两个片段 (N 终端和 C 末端荧光素酶 [NLuc 和 CLuc]), 每个片段融合到目标蛋白的兴趣。如果 NLuc 和 CLuc 在两个靶蛋白的相互作用附近被带入接近度, 荧光素酶活性被重组, 并且在荧光素基底和 ATP22的存在下产生发光光。在 2001年, 通过使用一个包含 NLuc 和 CLuc 片段的库进行组合筛选, 在不同的地点切割并附着在斯坦福大学不同连接器、Paulmurugan 和 Gambhir 的蛋白质上, 开发出了一种优化的分裂萤火虫荧光素酶片段辅助互补系统用于蛋白质-蛋白质相互作用23。在这个系统中, 萤火虫荧光素酶被切割在氨基酸 (aa) 398 形成 NLuc 和 CLuc, 这是附加到两个感兴趣的蛋白质, 使用一个灵活的链接八甘氨酸残留和两个丝氨酸残留。
采用类似的方法, 我们最近开发了一种新的拉图-BS, 通过融合 NLuc 到 15 aa 在 S127 (YAP15) 的拉图磷酸化部位和 CLuc 与 14-3-3。没有使用全长的狂吠蛋白, 以避免其他上游监管机构对狂吠 (如其他部位的磷酸化和泛) 进行后转化后的混杂信号。在这里提出的拉图 BS 可以无创监测河马信号活动的活体细胞和体内的小鼠20,24 (图 2)。在这里, 我们描述了一个详细的协议, 以测量的拉图激酶活性的体外使用的拉图 BS。首先, 我们展示了如何使用拉图 BS 来研究抗原蛋白对拉图活性的影响。然后, 我们展示了如何使用生物传感器来监测河马通路的治疗后, 与调控河马路径的活动。该协议可用于识别和表征信号通路或刺激调节拉图激酶活性。
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Protocol
1. 对一个假定的河马信号调节器的调查用拉图-BS
-
细胞的电镀和转染
- 细胞培养的制备
- 暖 1x PBS, DMEM 含有10% 的血清和1% 青霉素/链霉素, 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 到37°c 在一个水浴约30分钟。
- 彻底清洁一个安全柜与70% 乙醇。
- 将组织培养皿, 巴斯德吸管, 血清吸管, 和吸管提示进入组织培养罩, 根据需要。
- 从水浴中取出 1x PBS、培养基和胰蛋白酶-EDTA, 用70% 乙醇清洗, 然后放在引擎盖里。
- 转染用细胞的维护和电镀
- 选择一个高转染效率 (如HEK293) 的细胞系进行实验。检查这个细胞系中的河马通路成分的表达, 以确保河马信号是活跃的。
- 在 DMEM 10 厘米培养皿中生长 HEK293 细胞, 在37摄氏度和 5% CO2。每天观察显微镜下的细胞。通过下面描述的细胞, 当80–90% 融合观察。
- 将5毫升的 1x PBS 加入盘子中, 轻轻地旋转盘子, 完全吸干介质, 以洗涤细胞。
- 加入1毫升的胰蛋白酶-EDTA 到盘子里。旋转盘子, 确保胰蛋白酶均匀地覆盖细胞。
- 孵化的细胞在37°c 在 CO2孵化器5分钟或直到所有的细胞被分离。
- 添加4毫升的培养基 (10% 的血清和1% 青霉素/链霉素), 以中和胰蛋白酶, 并用重悬细胞通过吹打几次, 并分配 1/10 (0.5 毫升) 的细胞成新的100毫米板 (为及格率 1:10) 包含9.5 毫升的完整的媒体。
- 对拉图-BS转染, 计数的细胞使用 hemocytometer 和板 2 x 105细胞入每井12井板 24 h 在转染之前。
注: 使用较高的细胞数可能会增加背景发光信号, 因为河马信号活动是由细胞融合调节。使用较低的细胞数可以增加细胞对转染试剂的敏感性, 并增加细胞死亡24。
- 单独或与候选基因一起转染拉图 BS
- Miniprep 拉图-bs 质粒 (NLuc-YAP15-pcDNA3.1 水份和 14-3-3-CLuc-pcDNA3.1-水份) 新鲜从 DH5a 细菌液体培养 (必要达到最佳的拉图 BS 表达)。
- 1 h 在转染前, 从盘子中吸取培养基, 将500µL 的完全生长介质添加到12井板的每一个井中, 并将细胞归还给孵化器。
注: 下面的协议描述了使用一种商业上可用的聚合物转染试剂的转染方法。其他转染试剂也可适用于转染;然而, 我们还没有对它们进行测试。 - 如表 1所述, 使解决方案 A 和 B。对于 N transfections, 使 (n + 0.5) x 溶液 B 预混料。
- 立即添加稀释聚合物为基础的转染试剂 (溶液 B) 到 DNA (溶液 A)。吸管上下轻轻地混合。
- 在室温下孵化样品15分钟, 允许转染复合物形成。
- 将转染复合物的总容积 (76 µL) 滴到 12-井板的每一个井中, 并轻轻旋转。
- 夜间孵化细胞 (18–24 h) 在37摄氏度。
注: 对于敏感于高分子的转染试剂的细胞, 孵化时间可降至5小时。 - 转染后的一天, 删除转染复杂的介质, 并用新鲜完整的介质替换它。培养细胞在37°c 另一天进行荧光素酶检测。
- 细胞培养的制备
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荧光素酶测定
注: 荧光素酶报告仪检测萤火虫和Renilla在一项实验中被用于荧光素酶的测定。如果Renilla未被用作内部控制, 则在不添加Renilla检测试剂的情况下, 通过添加 LARII 来执行一步荧光素酶检测。- 细胞裂解物的制备
- 用蒸馏水稀释5x 无源裂解缓冲器 (小巴) 如下:
- 所需的1x 小巴总容积 = n x (50 ul 5x 小巴 + 200 ul dH2O) = n x 250 ul 的1x 小巴每井12井板 (N = 样品数量)。
- 完全吸入介质。在每个井中加入1毫升的 1x PBS。轻轻地旋转盘子以去除分离的细胞和剩余的生长介质。完全吸入 1x PBS。确保在添加1x 公共小巴之前没有剩余的 1x PBS。
- 添加 250 ul 1x 小巴/井。
- 将文化板块放在一个摇摆的平台上, 用柔和的摇摆来确保完整甚至覆盖1x 小巴的细胞单层。在室温下将培养皿摇动15分钟, 使细胞溶解。
- 将裂解液转移到1.5 毫升离心管。
- 生物发光信号的测量
- 从-80 摄氏度取出 LARII (20 ul/样品), 平衡到室温。
- 准备Renilla检测试剂: 添加 (n + 1) x 0.4 ul 50x 基板到 (N + 1) x 19.6 ul 的缓冲。
- Predispense 10 ul 每个细胞裂解到1.5 毫升管。
- 程序 a 紫外线执行 2 s premeasurement 延迟, 其次为每双荧光素酶检测的10秒测量周期。
注: 第一次和第二次测量将分别对应于拉图-BS 信号和Renilla内部控制信号。任何与单一或双荧光素酶兼容的紫外线都可以使用。 - 小心转移 20 ul 的 LARII 试剂到一个管和快速吸管上下3x 混合。
- 立即将管子放在紫外线中, 开始阅读。
- 从紫外线中取出样品管, 立即添加 20 Renilla试剂 ul, 并吹打上下3x 混合。把样品带进紫外线, 然后开始下一读。记录测量结果。
- 丢弃反应管并继续下一个样品。
- 细胞裂解物的制备
2. 使用拉图-BS 识别河马通路调节器的屏幕
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细胞培养与 transfections
- 文化 HEK293AD 细胞如第1.1 节所述。
注意: HEK293AD 比其他 HEK293 细胞系更具黏附, 这使得它成为一个良好的细胞线用于屏幕。 - 按照1.1.2 节中的说明分离单元格。计数和板 2 x 106细胞在100毫米板材 24 h 在转染之前。
- 1 h 在转染前, 从盘子中吸取介质, 并用5毫升新鲜完整的生长介质替换它们。
- 如表 2所述, 使解决方案 A 和 B。
- 立即添加稀释聚合物为基础的转染试剂 (溶液 B) 到 DNA (溶液 A)。吸管上下混合。
- 在室温下孵化样品15分钟, 允许转染复合物形成。
- 将转染复合物的总容积 (500 µL) 添加到带有柔和旋转的细胞中。
- 在37摄氏度的夜间孵化细胞。
- 第二天, 胰蛋白酶处理和计数的细胞。板材 1 x 104到 2 x 104个细胞入每井一个96井板材在总容量100µL 媒介每井。再孵化一天。
- 第二天, 添加代理/小分子调节河马路径在最终浓度为每井10µM, 第1-4 h 在执行荧光素酶检测。
注意: 对于大多数小分子/药物, 4 小时的治疗在10µM 不影响细胞的生存能力。如果使用较低浓度, 治疗可能延长一段时间。
- 文化 HEK293AD 细胞如第1.1 节所述。
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荧光素酶测定
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体外荧光素酶检测
- 完全从细胞中吸入介质。在每个井中用100µL 的 1x PBS 冲洗细胞。完全吸入。
- 添加20µL 的1x 公共小巴 (如步骤1.2.1.1 所述) 入每井96井板。
- 把文化板块放在一个摇摆的平台上, 在室温下轻轻摇摆15分钟。
- 小心地将20µL LARII 试剂放入每个井中, 并将吸管上下3x 混合。
- 立即将盘子放在一盘阅读紫外线中, 开始阅读。
- 活体细胞荧光素酶测定
- 使11x 荧光素的库存如下: 在1毫升正常培养基中溶解1.5 毫克的 d-荧光素粉末。
- 将10µL 的11x 荧光素到每个井中, 并轻轻地与已经在井中的介质混合。
- 将细胞替换成孵化器10分钟。
- 将盘子放在紫外线中, 开始阅读。
注: 如果信号强度不够强, 在这种浓度的 d-荧光素, 另10µL 的荧光素股票可能会添加到细胞。
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体外荧光素酶检测
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Representative Results
cotransfected 用不同的基因对其对拉图活性的影响进行了评价 (图 3)。在本实验中, Renilla被用作内部控制。YAP-5SA 的瞬态表达是狂吠的本构活动形式, 它导致狂吠转录靶点的增加, 并通过建立的反馈通路25增加了拉图激酶活性。MST, 在河马路径中的拉图上游活化剂 (图 1), 也增加了生物传感器的信号强度。然而, 受体过度表达, 触发 PI3K/MAPK 信号, 抑制拉图和降低信号强度的拉图 BS。
在第二个协议中, 拉图-BS 被转染成 HEK293AD, 24 小时后, 细胞被传递到96井板块。40小时后转染, 细胞被治疗的不同已知的小分子调节器的河马信号后, 荧光素酶检测 (图 4)。受体、PI 3 激酶和细胞能量水平是三已知的拉图激酶24的负调节因子。在本实验中, GDS0941, PI 3 激酶抑制剂, 阿西替尼和 SU4312, 受体抑制剂和2维葡萄糖, 通过抑制葡萄糖代谢和 ATP 生产, 导致能量紧张, 被用来激活拉图 BS。相反, 溶血磷脂酸, S1P 和 TPA 被用来抑制拉图-BS。实验表明, 该方法可用于测定小分子对拉图激酶活性的活化和抑制效应。
| 解决方案 A | |
| pCDNA3.1-水份-NLuc-YAP15 | 1 ul (50 ng) |
| pCDNA3.1-水份-14-3-3-CLuc | 1 ul (50 ng) |
| 表达候选基因的质粒 (如 MST) | 1 ul (400 ng) |
| 或空向量 (如pcDNA3.1-水份) | |
| Renilla 向量 (可选) | 1 ul (20 ng) |
| DMEM (无血清/抗生素) | 34 ul |
| 总容积 | 38 ul |
| 解决方案 B | |
| 聚合物基转染试剂 | 1.5 ul |
| (3:1 与总微克 DNA 的比值) | |
| DMEM (无血清/抗生素) | 36.5 ul |
| 总容积 | 38 ul |
表 1: 使用基于聚合物的转染试剂进行溶液 a 和 B 的协议, 用于调查与拉图 BS 有关的河马通路的假定调节器。
| 解决方案 A | |
| pCDNA3.1-水份-NLuc-YAP15 | 10 ul (3 微克) |
| pCDNA3.1-水份-14-3-3-CLuc | 10 ul (3 微克) |
| DMEM (无血清/抗生素) | 230 ul |
| 总容积 | 250 ul |
| 解决方案 B | |
| 聚合物基转染试剂 | 18 ul |
| (3:1 与总微克 DNA 的比值) | |
| DMEM (无血清/抗生素) | 232 ul |
| 总容积 | 250 ul |
表 2: 使用基于聚合物的转染试剂进行筛查以识别河马通路的调节器的协议 A 和 B。
图 1: 哺乳动物中的河马通路.河马通路通过磷酸化和抑制狂吠和狂暴来限制器官大小。当河马通路被激活, LATS1/2, 和暴民是磷酸化和激活的 MST1/2。活化 LATS1/2 phosphorylates 在保守的丝氨酸含有的地方的吠/狂暴。14-3-3 相互作用与磷酸化狂吠/狂暴, 从而抑制其核定位和转录激活的下游基因目标通过 TEADs。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 基于荧光素酶的拉图-BS 分离蛋白互补试验.荧光素酶 N 和 C 终点域 (NLuc 和 CLuc) 分别附着在15的氨基酸周围 YAP-S127 和 14-3-3。YAP15/14-3-3 在拉图磷酸化后的结合促进荧光素的互补和生物发光信号的发射。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 一个典型的实验结果, 评估基因对拉图活动的影响.生物传感器可以单独表达或与其他基因在 HEK293AD 细胞中, 以调查其对拉图激酶活性的影响 (均值 SD;n = 3, **p < 0.01, ***p < 0.001)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 一个典型的实验结果, 评估小分子对 HEK293AD 细胞中的拉图活性的影响.HEK293AD 细胞转染的拉图-BS 和治疗以下药物: PI3K 抑制剂 (GDC0941), 10 微米4小时;受体抑制剂 (阿西替尼), 10 微米为 4 h;2-deoxyglucose, 25 毫米为 1 h;10微米, 1 小时;sphingosine-1-phosphophate (S1P), 1 微米为 1 h;12-tetradecanoylphorbol-13-醋酸盐 (TPA), 5 nM 1 h;受体抑制剂 (SU4312), 10 微米为 4 h (平均 * SD;n = 3, **p < 0.01, ***p < 0.001)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
虽然河马通路在各种生物过程中起着关键作用, 失调的河马通路导致癌症6, 但如何根据各种刺激来调节河马通路是不完全理解的。此外, 还没有定量和实时系统来评估河马核心成分的活动。最近, 我们研制并验证了一种新的生物传感器, 用于测量河马通路24中的拉图激酶活性。这种生物传感器不仅可以定量和准确地监测活细胞中的河马信号活动, 而且还可用于针对河马路径进行癌症治疗的药物筛网。此外, 基于生物传感器的筛选可以导致发现新的基因负责调控河马通路。鉴于河马信号在癌症中的重要性, 发现其他基因和河马通路之间的关键串扰将是对所有癌症生物学家进行的宝贵研究。因此, 这种生物传感器有潜力在目前的癌症治疗中进行创新, 并可能为癌症的成功治疗提供一个有用的新的治疗策略。
在使用拉图 BS 时, 有几个重要的问题需要考虑。首先, 在我们的经验中, 当用于转染的质粒从细菌中提取出来时, 拉图 BS 具有最大的灵敏度。第二, 转染成细胞的拉图-bs 质粒的数量会影响到拉图的灵敏度和信号强度。质粒 DNA 的数量可以增加到 400 ng/片段的拉图 BS 和 600 ng 的基因的利益每一个12井板。一般来说, 使用更多的质粒会给信号强度较高, 但灵敏度较低。第三, 细胞融合会影响到拉图-BS 信号的背景。与河马信号在细胞对融合的反应中的良好作用一致, 我们观察到, 高融合细胞有一个更高的背景拉图-BS 信号由于活化的内源性拉图。因此, 稀疏镀细胞显示一个较低的拉图-BS 背景信号。最佳细胞融合可以选择根据实验的目的 (高融合观察拉图抑制; 低融合用于观察拉图活化)。第四, Renilla可作为转染效率的内部控制, 对于硬到染细胞 (如MCF10A), 转染试剂: DNA 比可修改为4:1。最后, 我们强烈建议 cotransfecting MST2 作为一个积极的控制和 YAP-S127A 作为一个负控制每次使用生物传感器。
每个工具都有其局限性。拉图 BS 是一种内源蛋白的人工基质, 它总能击败感兴趣蛋白质的真正基质。这种效应被称为生物传感器的缓冲效应。改进具有较高信号强度和较低表达水平的生物传感器可能有助于克服这一问题。另一个限制是反馈通路可能会使对数据的解释复杂化。有许多线性和非线性相互作用的信号通路可能会影响到拉图-BS 信号。拉图-BS 仅显示了刺激对拉图激酶活性的累积效应。然而, 应该指出的是, 这一限制并不唯一的拉图-BS, 而是通常遇到的研究, 分子生物学。因此, 应在多项证明实验的背景下解释拉图 BS 数据。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了加拿大卫生研究所 ( CIHR # 119325 , 148629 ) 和加拿腺癌基金会 ( CBCF ) 提供给 XY 的赠款的支持。TA 得到加拿大 Vanier 研究生奖学金和安大略省国际研究生奖学金的支持。HJJVR 获得伊丽莎白二世科技研究生奖学金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 2520056 | 0.25% |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | DMEM with high glucose |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| 5x Passive lysis buffer | Promega | E194A | 30 ml |
| Dual-Glo® Luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 ml kit |
| 20/20 luminometer | Turner Biosystems | 998-2036 | Single tube reader luminometer |
| GloMax®Navigator with dual injectors | Promega | GM2010 | 96-well plates reader luminometer |
References
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