Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Overvågning Hippo signalering Pathway aktivitet ved hjælp af en Luciferase-baserede store Tumor Suppressor (LATS) Biosensor

Published: September 13, 2018 doi: 10.3791/58416
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenterer vi en luciferase-baserede biosensor for at kvantificere kinase aktiviteten af stor tumor suppressor (LATS)-en central kinase i Hippo signalering pathway. Denne biosensor har forskellige programmer i basic og Translationel forskning med henblik på at undersøge Hippo pathway lovgivere i in vitro og i vivo.

Abstract

Hippo signalering pathway er en bevaret regulator af orgel størrelse og har vigtige roller i udvikling og kræft biologi. På grund af tekniske udfordringer, er det stadig vanskeligt at vurdere aktiviteten af denne signalvejen og fortolke det i en biologisk sammenhæng. Den eksisterende litteratur om store tumor suppressor (LATS) bygger på metoder, der kvalitativt og ikke kan nemt blive skaleret op til screening. For nylig, har vi udviklet en bioluminescens-baserede biosensor for at overvåge kinase aktiviteten af LATS-en kernekomponent i Hippo kinase cascade. Her, beskrive vi procedurer for hvordan denne LATS biosensor (LATS-BS) kan bruges til at karakterisere Hippo pathway regulatorer. Først, vi leverer en detaljeret protokol for at undersøge effekten af en overexpressed protein kandidat (f.eks.VEGFR2) på LATS aktivitet ved hjælp af LATS-BS. Derefter, vi viser, hvordan LATS-BS kan bruges til en mindre kinase inhibitor skærm. Denne protokol kan realistisk være skaleres op til at udføre større skærme, som uden tvivl vil identificere roman regulatorer af Hippo pathway.

Introduction

Hippo signalering pathway blev først identificeret i Drosophila som en roman regulator af cellevækst og dyrenes størrelse1,2. Siden sin første opdagelse, montering beviser har overbevisende vist at Hippo pathway spiller afgørende roller i udviklingen (f.eks., tidlige fosterudviklingen, organ størrelse kontrol, og tre-dimensionelle [3D] morfologi) () tumordannelse fx, tumor udvikling, metastase, angiogenese, immun unddragelse, genomisk ustabilitet, stressrespons og resistens), og væv homeostase (fx, stamcelle fornyelse og differentiering og vævsregeneration efter skade) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. hippo signalering er ofte dysregulated i forskellige kræftformer7,8,9,10,11,12. Derfor er belyse funktioner af Hippo pathway i kræft biologi og therapeutics og regenerativ medicin blevet et af de hotteste områder i biomedicinsk forskning.

I korte, i Hippo pathway ved aktivering af upstream tilsynsmyndigheder (f.eks.celle-celle kontakt, næringsstof stress og ekstracellulære matrix [ECM]), MST1/2 (MST; pattedyr homologs i Drosophila Hippo) Serin/Threonin (S/T) kinaser phosphorylate/aktivere adapteren proteiner hMOB1 og WW45, samt LATS1/2 (LATS) kinaser, som efterfølgende phosphorylate transcriptional Co aktivator YAP og dens paralog TAZ på bevarede HX(H/R/K)XX(S/T) (H, histidin; Rasmussen, arginin; K, lysin; Sørensen, Serin; T, threonin; X, alle aminosyrer) motiver, herunder YAP-S127 og TAZ-S8911,12. S127-fosforyleret YAP (YAP-pS127) og S89-fosforyleret TAZ (TAZ-pS89) er nedbrudt af ubiquitination eller binde til cytoplasmatiske protein 14-3-3 og er forhindret i at interagere med TEAD1-4 transskriptionsfaktorer i cellekernen til transactivate nedstrøms gener involveret i celleproliferation og apoptose (figur 1). Trods den enorme interesse i Hippo pathway, få værktøjer til måling af Hippo signalering findes og dem, der have været historisk begrænset til indberettere af YAP/TAZ/TEAD transcriptional output. Ja, indtil for nylig var der ingen værktøjer til at måle dynamikken og aktivitet af Hippo signalering komponenter i en kvantitativ, real-time, høj overførselshastighed og non-invasiv måde både in vitro- og in vivo.

I betragtning af vores nye forståelse af protein-protein interaktioner i fysiologi og patologi rolle, er der stor interesse i udviklingen af værktøjer, der kan bruges til at studere disse interaktioner i en kvantitativ og real-time måde13, 14,15,16. Faktisk er der sket betydelige fremskridt i udviklingen af bio-analytiske strategier, herunder gær to-hybrid (Y2H)17, overflade plasmon resonans (SPR)18og Förster resonans energi overførsel (FRET)19 assays, at evaluere protein-protein interaktioner. Men disse tilgange bære begrænsning af kræver betydelig optimering af reporter orientering, således at mange konstruktioner skal afprøves for at finde en effektiv. Yderligere, disse tilgange også har et relativt lavt signal / støj-forhold, så kræsne et sandt positive signaler kan være udfordrende.

Protein komplementering assays blev udviklet for at overvinde disse begrænsninger. Den første generation af protein komplementering assays blev baseret på split multicolor fluorescens proteiner og kunne ikke løse ovennævnte begrænsninger20. Flerfarvet fluorescens proteiner består af kun ét domæne, hvilket gør det vanskeligt at opdele dem i to separate stabil fragmenter med lav affinitet og baggrund støj21. Efterfølgende, blev firefly luciferase identificeret som en ny kandidat til brug i udviklingen af split protein komplementering assays. I denne tilgang, er firefly luciferase opdelt i to fragmenter (N-terminal og C-terminale luciferase [NLuc og CLuc]) med hver fragment smeltet til en target protein af interesse. Hvis NLuc og CLuc er bragt i nærhed af samspillet mellem to mål proteinerne, luciferase aktivitet er rekonstitueret og en bioluminescerende light er genereres luciferin substrat og ATP22. I 2001, ved at udføre en kombinatorisk screening ved hjælp af et bibliotek som indeholder NLuc og CLuc fragmenter skåret på forskellige steder og fastgjort til proteiner med forskellige linkers, Paulmurugan og Gambhir på Stanford Universitet udviklet en optimeret split-firefly luciferase fragment-assisteret komplementering system for protein-protein interaktioner23. I dette system, er firefly luciferase bagfjerding aminosyre (aa) 398 danner NLuc og CLuc, som er knyttet til to proteiner af interesse ved hjælp af en fleksibel linker otte glycin restkoncentrationer og to Serin restkoncentrationer.

Ved hjælp af en lignende tilgang, vi for nylig udviklet en ny LATS-BS ved at fusionere NLuc til 15 aa af YAP omkring LATS fosforylering websted på S127 (YAP15) og CLuc med 14-3-3. Fuld længde YAP protein var ikke anvendes, at undgå forstyrrende signaler af posttranslationelle modifikationer af YAP (fx, fosforylering på andre sites og ubiquitination) af andre opstrøms regulatorer. LATS-BS præsenteres her kan ikke-invasivt overvåge Hippo signalering aktivitet, både in vitro i levende celler og vivo på mus20,24 (figur 2). Her beskriver vi en detaljeret protokol til måling af LATS kinase aktivitet in vitro- brug LATS-BS. Vi viser først, hvordan LATS-BS kan bruges til at undersøge effekten af en overexpressed protein på LATS aktivitet. Derefter, vi viser, hvordan biosensor kan bruges til at overvåge aktiviteten på Hippo pathway efter behandling med agenter regulering Hippo pathway. Denne protokol kan bruges til at identificere og karakterisere signaling veje eller stimuli regulering LATS kinase aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. undersøgelse af et formodet Regulator af Hippo signalering, ved hjælp af LATS-BS

  1. Plating og Transfektion af celler
    1. Forberedelse af cellekultur
      1. Varm 1 x PBS, DMEM som indeholder 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin og 0,25% trypsin-EDTA til 37 ° C i vandbad i ca 30 min.
      2. Grundigt rense en biosikkerhed kabinet med 70% ethanol.
      3. Placere vævskultur retter, Pasteur pipetter, serologisk pipetter og pipette tips i vævskultur hood som krævet.
      4. Tag 1 x PBS, medierne og trypsin-EDTA fra vandbadet, rense dem med 70% ethanol, og placere dem i hætten.
    2. Vedligeholdelse og klædningen af celler for Transfektion
      1. Vælg en cellelinje med høj Transfektion effektivitet (f.eks.HEK293) for forsøget. Check for udtryk for Hippo pathway komponenter i denne cellelinie af vestlige skamplet for at sikre Hippo signalering er aktiv.
      2. Vokse HEK293 celler i DMEM i 10 cm petriskåle i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Overvåge cellerne under et mikroskop hver dag. Passage af celler, som beskrevet nedenfor, når 80-90% confluency er observeret.
      3. Cellerne vaskes ved at tilføje 5 mL PBS, 1 x i en plade, forsigtigt hvirvlende pladen og sugning medierne fuldstændigt.
      4. Der tilsættes 1 mL af trypsin-EDTA til pladen. Swirl plade for at sikre, at trypsin jævnt dækker cellerne.
      5. Inkuber celler ved 37 ° C i en CO2 inkubator i 5 min eller indtil alle celler er frakoblet.
      6. Tilsættes 4 mL af medier (med 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin) til at neutralisere trypsin, resuspend cellerne af pipettering op og ned flere gange, og undvære en tiendedel (0,5 mL) af celler ind i nye 100 mm plader (for en forbipasserende forholdet 1:10) indeholdende 9,5 mL komplet media.
      7. For LATS-BS Transfektion, Tæl de celler ved hjælp af en hemocytometer og plade 2 x 105 celler i hver brønd med en 12-godt plade 24 timer før Transfektion.
        Bemærk: Ved hjælp af højere celle numre kan øge baggrunden en bioluminescerende signal som Hippo signalering aktivitet er reguleret af cellen confluency. Ved hjælp af lavere celle numre kan øge celle følsomhed til Transfektion reagenser og øge celle død24.
    3. Transfektion af LATS-BS alene eller sammen med kandidat-gen
      1. Miniprep LATS-BS plasmider (NLuc-YAP15-pcDNA3.1-Hygro og 14-3-3-CLuc-pcDNA3.1-Hygro) frisk fra DH5a bakterier flydende kultur (nødvendigt for at opnå en optimal LATS-BS udtryk).
      2. 1 h før Transfektion, Aspirér medium fra pladen, tilsæt 500 µL af komplet vækstmedium til hver brønd af 12-godt plader og returnere cellerne til rugemaskine.
        Bemærk: Følgende protokol beskriver Transfektion metoder ved hjælp af en kommercielt tilgængelig polymer-baserede Transfektion reagens. Andre Transfektion reagenser kan også være egnet til Transfektion; men vi har ikke endnu testet dem.
      3. Gøre løsninger A og B som beskrevet i tabel 1. For N transfections, gøre (N + 0,5) x løsning B premix.
      4. Straks tilføje fortyndet polymer-baserede Transfektion reagens (løsning B) til DNA (opløsning A). Pipetteres op og ned forsigtigt for at blande.
      5. Inkuber prøve ved stuetemperatur i 15 min. at tillade Transfektion komplekser til form.
      6. Tilføje det samlede volumen (76 µL) af Transfektion komplekser dråbevis til hvert hul i den 12-godt plade med blid hvirvlende.
      7. Inkuber celler natten (18 – 24 h) ved 37 ° C.
        Bemærk: For celler, der er følsomme over for polymer-baserede Transfektion reagenser, at inkubationstiden kan reduceres til 5 h.
      8. Dagen efter Transfektion, fjerne den Transfektion-kompleks-holdige medier og erstatte det med friske komplet media. Kultur celler ved 37 ° C i en anden dag til at udføre luciferase assay.
  2. Luciferase assay
    Bemærk: Luciferase Reporter Assay systemet opdage firefly og Renilla sammen i én analyse anvendes for luciferase assays. Hvis Renilla ikke blev brugt som en intern kontrol, udføre et-trins luciferase assay ved at tilføje LARII uden at tilføje Renilla påvisning reagens.
    1. Forberedelse af cellelysater
      1. Fortynd 5 x passive lysering buffer (PLB) med destilleret vand som følger:
      2. Samlede volumen i 1 x PLB krævede = N x (50 μL af 5 x PLB) + 200 μl af dH2O = N x 250 μL af 1 x PLB pr. brønd af 12-godt plader (N = antallet af udtagne prøver).
      3. Opsug medierne fuldstændigt. Der tilsættes 1 mL af 1 x PBS i hvert hul. Swirl plade forsigtigt at fjerne løsrevet celler og resterende vækst medier. Opsug 1 x PBS helt. Sørg for ingen resterende 1 x PBS rester før tilsætning af 1 x PLB.
      4. Tilsæt 250 μL 1 x PLB/godt.
      5. Placere kultur plader på en vuggende platform med blid vuggende for at sikre fuldstændig og endda dækning af celle éncellelag med 1 x PLB. Rock kultur plader ved stuetemperatur i 15 min. at tillade cellerne til at lyse.
      6. Overførsel af lysate til en 1,5 mL microcentrifuge tube.
    2. Måling af en bioluminescerende signal
      1. Tage ud af LARII (20 μL/eksempel) fra-80 ° C og reagensglasset det stuetemperatur.
      2. Forberede N assays Renilla påvisning reagens: tilføje (N + 1) x 0,4 μL af 50 x substrat (N + 1) x 19,6 μL af bufferen.
      3. Predispense 10 μL af hver celle lysate 1,5-mL-rør.
      4. Programmere en luminometrisk til at udføre en 2-s premeasurement forsinkelse, efterfulgt af en 10-s måleperioden for hver dobbelt luciferase assay.
        Bemærk: De første og anden målinger vil svarende til LATS-BS signal og Renilla intern kontrolsignal, henholdsvis. Enhver kompatibel med en enkelt eller dobbelt luciferase luminometrisk kan bruges.
      5. Omhyggeligt overføre 20 μL LARII reagens ind i et rør og hurtigt pipetteres op og ned 3 x at blande det.
      6. Straks røret anbringes i en luminometrisk og indlede læsning.
      7. Fjerne prøveglas fra en luminometrisk, straks tilsættes 20 μL Renilla reagens og mix af pipettering op og ned 3 x. Bringe prøven i luminometrisk og indlede den næste læsning. Optage målingerne.
      8. Kassér reaktion tube og gå videre til den næste prøve.

2. en skærm til at identificere Hippo Pathway tilsynsmyndigheder ved hjælp af LATS-BS

  1. Cellekultur og transfections
    1. Kultur HEK293AD celler som beskrevet i afsnit 1.1.
      Bemærk: HEK293AD er mere vedhængende end andre HEK293 cellelinjer, hvilket gør det en god cellelinie til brug i skærme.
    2. Frigør celler, som beskrevet i afsnit 1.1.2. Tælle og plade 2 x 106 celler i 100 mm plader 24 timer før Transfektion.
    3. 1 time før Transfektion, Aspirér medier fra pladen og erstatte dem med 5 mL frisk komplet vækst medier.
    4. Gøre løsninger A og B som beskrevet i tabel 2.
    5. Straks tilføje fortyndet polymer-baserede Transfektion reagens (løsning B) til DNA (opløsning A). Pipetteres op og ned for at blande.
    6. Inkuber prøve ved stuetemperatur i 15 min. at tillade Transfektion komplekser til form.
      1. Tilføje det samlede volumen (500 µL) af Transfektion komplekser dråbevis til celler med blid hvirvlende.
      2. Inkuber celler natten over ved 37 ° C.
      3. Den næste dag, trypsinize og tælle cellerne. Plade 1 x 104 2 x 104 celler i hver brønd af en 96-brønd plade i en samlet maengde paa 100 µL af medier pr. brønd. Der inkuberes i en anden dag.
    7. Den næste dag, tilføje agenter/små molekyler regulering Hippo pathway i en endelig koncentration på 10 µM til hver brønd, 1-4 h før du udfører luciferase assay.
      Bemærk: For de fleste små molekyler/agenter, en 4 h behandling på 10 µM ikke påvirker cellernes levedygtighed. Benyttes en lavere koncentration, kan behandlingen forlænges for en længere periode.
  2. Luciferase assay
    1. In vitro luciferase assay
      1. Opsug medier fra cellerne fuldstændigt. Cellerne vaskes med 100 µL 1 x PBS i hvert hul. Opsug helt.
      2. Tilføj 20 µL 1 x PLB (forberedt som beskrevet i trin 1.2.1.1) til hvert hul i 96-brønd plader.
      3. Placere kultur plader på en vuggende platform med blid vuggende ved stuetemperatur i 15 min.
      4. Omhyggeligt overføre 20 µL LARII reagens til hver brønd og pipetteres op og ned 3 x at blande.
      5. Straks pladen anbringes i en plade-læsning luminometrisk og indlede læsning.
    2. Levende celle luciferase assay
      1. Gøre 11 x D-luciferin lager som følger: 1,5 mg af D-luciferin pulver i 1 mL af normale dyrkningsmedier opløses.
      2. Overfør 10 µL af 11 x D-luciferin i hver godt og bland det forsigtigt med de medier, der allerede er i brønden.
      3. Erstatte cellerne i rugemaskinen i 10 min.
      4. Pladen anbringes i en luminometrisk og indlede læsning.
        Bemærk: Hvis signal intensitet ikke er stærk nok i denne koncentration af D-luciferin, en anden 10 µL af D-luciferin lager kan føjes til cellerne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LATS-BS var cotransfected med forskellige gener til at vurdere deres effekt på LATS aktivitet (figur 3). I dette eksperiment, blev Renilla brugt som en intern kontrol. Den forbigående udtryk af YAP-5SA, en konstitutiv aktiv form af YAP, forårsager stigende niveauer af YAP transcriptional mål og en efterfølgende stigning i LATS kinase aktivitet gennem en etableret feedback pathway25. MST, opstrøms aktivator af LATS i Hippo pathway (figur 1), øger også biosensor signal intensitet. Dog VEGFR overekspression, der udløser PI3K/MAPK signalering, hæmmer LATS og nedsætter signal intensiteten af LATS-BS.

I den anden protokol, LATS-BS var transfekteret i HEK293AD, og 24 timer efter Transfektion, celler blev overført til 96-brønd plader. 40 h efter Transfektion, cellerne blev behandlet med forskellig kendt lille molekyle regulatorer af Hippo signalering, efterfulgt af en luciferase assay (figur 4). VEGFR, PI 3-kinase, og cellulære energiniveau er tre kendte negative regulatorer af LATS kinase24. I dette eksperiment, GDS0941, PI 3-kinase inhibitor, axitinib og SU4312, blev hæmmere af VEGFR, og 2-D glukose, som forårsager energi stress ved en hæmning af glukose metabolisme og ATP produktion, brugt til at aktivere LATS-BS. Omvendt, blev LPA, S1P og TPA brugt til at hæmme LATS-BS. Dette eksperiment viser at LATS-BS kan bruges til at måle både aktivisering og hæmning effekten af et lille molekyle på LATS kinase aktivitet.

Løsning A
pCDNA3.1-Hygro-NLuc-YAP15 1 μL (50 ng)
pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc 1 μL (50 ng)
Plasmid udtrykker en kandidat genet (f.eks. MST) 1 μL (400 ng)
eller tom vektor (f.eks. pcDNA3.1-Hygro)
Renilla vektor (pRL-TK) (valgfri) 1 μL (20 ng)
DMEM (intet serum/antibiotika) 34 ΜL
Samlede volumen 38 ΜL
Løsning B
Polymer-baserede Transfektion reagens 1,5 ΜL
(3:1 forholdet med samlede μg DNA)
DMEM (intet serum/antibiotika) 36,5 ΜL
Samlede volumen 38 ΜL

Tabel 1: Protokol for at lave løsninger A og B ved hjælp af et polymer-baseret Transfektion reagens for at undersøge en formodede regulator af Hippo pathway med LATS-BS.

Løsning A
pCDNA3.1-Hygro-NLuc-YAP15 10 μL (3 μg)
pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc 10 μL (3 μg)
DMEM (intet serum/antibiotika) 230 ΜL
Samlede volumen 250 ΜL
Løsning B
Polymer-baserede Transfektion reagens 18 ΜL
(3:1 forholdet med samlede μg DNA)
DMEM (intet serum/antibiotika) 232 ΜL
Samlede volumen 250 ΜL

Tabel 2: Protokol for at lave løsninger A og B ved hjælp af et polymer-baseret Transfektion reagens screening for at identificere regulatorer af Hippo pathway ved hjælp af LATS-BS.

Figure 1
Figur 1: The Hippo pathway i pattedyr. Hippo pathway begrænser orgel størrelse af phosphorylating og hæmme YAP og TAZ. Når Hippo pathway aktiveres, er SAV, LATS1/2 og MOB fosforyleret og aktiveres af MST1/2. Aktiveret LATS1/2 phosphorylates YAP/TAZ på bevarede Serin-holdige steder. 14-3-3 interagerer med fosforyleres YAP/TAZ, dermed hæmme deres nukleare lokalisering og co transactivation af downstream gen mål gennem TEADs. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: LATS-BS split-protein komplementering analysen baseret på luciferase. Luciferase N - og C-terminus domæner (NLuc og CLuc) er knyttet til 15 amino syre omkringliggende YAP-S127 og 14-3-3, hhv. YAP15/14-3-3 bindende efter LATS fosforylering fremmer luciferase komplementering og bioluminescens signal emission. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: resultater fra en repræsentativ eksperiment evaluere effekten af et gen på LATS aktivitet. Biosensor kan udtrykkes alene eller sammen med andre gener i HEK293AD celler til at undersøge deres indvirkning på LATS kinase aktivitet (gennemsnit ± SD; n = 3, **p < 0,01, ***p < 0,001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: resultater fra en repræsentativ eksperiment evaluere effekten af små molekyler på LATS aktivitet i HEK293AD celler. HEK293AD celler blev transfekteret med LATS-BS og behandlet med de følgende stoffer: PI3K hæmmer (GDC0941), 10 μM for 4 h; VEGFR hæmmer (axitinib), 10 μM for 4 h; 2-deoxyglucose, 25 mM for 1 h; LPA, 10 μM i 1 time; sphingosine-1-phosphophate (S1P), 1 μM i 1 time; 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA), 5 nM for 1 h; VEGFR hæmmer (SU4312), 10 μM for 4 h (gennemsnit ± SD; n = 3, **p < 0,01, ***p < 0,001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens Hippo pathway spiller vigtige roller i forskellige biologiske processer og dysregulering af Hippo sti fører til kræft6, er hvordan Hippo pathway er reguleret i respons på forskellige stimuli ikke helt forstået. Derudover er der ingen kvantitative og real-time system til at vurdere aktiviteten af Hippo kernekomponenter. For nylig har vi udviklet og valideret en roman biosensor til måling af LATS kinase aktivitet i Hippo pathway24. Denne biosensor kan bruges ikke blot for kvantitativt og præcist overvågning Hippo signalering aktivitet i levende celler, men også for skærme af narkotika målretning Hippo vej for kræftbehandling. Derudover kan biosensor-baseret screening føre til opdagelsen af nye gener ansvarlige for reguleringen af Hippo pathway. Betragtning af betydningen af Hippo signalering i kræft, ville at finde afgørende krydstale mellem andre gener og Hippo pathway være en værdifuld undersøgelse at forpligte sig til alle kræft biologer. Derfor, denne biosensor har potentiale til at gøre nyskabelser i den nuværende behandling af kræft og kan udgøre en nyttig ny terapeutisk strategi for vellykkede behandlinger af kræft.

Der er flere vigtige punkter, der bør overvejes, når du bruger LATS-BS. Først, i vores erfaring, LATS-BS har den største følsomhed når plasmider bruges til Transfektion udpakkes frisk fra bakterier. Andet, mængden af LATS-BS plasmider transfekteret i celler påvirker LATS-BS følsomhed og signal intensitet. Mængden af plasmid DNA kan øges til 400 ng/fragment for LATS-BS og 600 ng for gen af interesse pr. brønd af et 12-godt plade. I almindelighed vil benytter flere plasmid give en højere signal intensitet men mindre følsomhed. For det tredje kan celle confluency påvirke LATS-BS signal baggrund. Overensstemmelse med Hippo signalering i cellulære svar til confluency, vi har observeret, at celler med højere confluency har en højere baggrund LATS-BS signal på grund af aktivering af endogene LATS veletableret rolle. I overensstemmelse hermed, tyndt forgyldt celler viser en lavere LATS-BS baggrund signal. Optimal celle confluency kan vælges afhængigt af formålet med eksperiment (høj confluency for observere LATS hæmning; lav confluency til observation LATS aktivering). For det fjerde Renilla kan bruges som en intern kontrol for Transfektion effektivitet, og for svært at transfect celler (f.eks.MCF10A), Transfektion reagens: DNA-forholdet kan ændres til 4:1. Endelig, vi anbefaler cotransfecting MST2 som positiv kontrol og YAP-S127A som en negativ kontrol hver gang biosensor bruges.

Hvert værktøj har sine begrænsninger. LATS-BS er den kunstige substrat en endogene protein, som kan altid outcompete true underlaget af protein af interesse. Denne effekt er kendt som en Bufferkapacitet virkning af biosensor. Forbedre biosensor med højere signal intensitet og lavere udtryk kan bidrage til at overvinde dette problem. En anden begrænsning er, at feedback veje kan komplicere fortolkningen af data fra LATS-BS. Der er mange lineære og ikkelineære interagere signalering veje, som sandsynligvis påvirke LATS-BS signal. LATS-BS viser kun den kumulative virkning af en stimulus på LATS kinase aktivitet. Det bemærkes dog, at denne begrænsning er ikke enestående for LATS-BS men snarere er almindeligt stødt på studier af molekylær biologi. Således er skal LATS-BS data fortolkes i forbindelse med flere bevisværdi eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den canadiske Institut for sundhedsforskning (CIHR #119325, 148629) og den canadiske Breast Cancer Foundation (CBCF) til XY. TA er støttet af Vanier Canada Graduate stipendium og Ontario International Graduate stipendium. HJJVR understøttes af en dronning Elizabeth II Graduate stipendium i videnskab og teknologi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin-EDTA  Life Technologies 2520056 0.25%
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F1051
DMEM Sigma D6429-500ml DMEM with high glucose 
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122
PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent  Signagen SL100688.5
5x Passive lysis buffer Promega E194A 30 ml
Dual-Glo® Luciferase Assay System Promega E2940 100 ml kit
20/20 luminometer Turner Biosystems 998-2036 Single tube reader luminometer
GloMax®Navigator with dual injectors Promega GM2010 96-well plates reader luminometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
  2. Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).
  3. Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The Hippo Pathway: Immunity and Cancer. Cancers. 10 (4), 94 (2018).
  4. Maugeri-Saccà, M., De Maria, R. The Hippo pathway in normal development and cancer. Pharmacology & Therapeutics. 186, 60-72 (2018).
  5. van Rensburg, H. J. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  6. Yeung, B., Yu, J., Yang, X. Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis. International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).
  7. Zhao, Y., Yang, X. The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance. International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).
  8. Yu, F. -X., Guan, K. -L. The Hippo pathway: regulators and regulations. Genes & Development. 27 (4), 355-371 (2013).
  9. Yang, X., Xu, T. Molecular mechanism of size control in development and human diseases. Cell Research. 21 (5), 715 (2011).
  10. Visser, S., Yang, X. LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis. Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).
  11. Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes & Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).
  12. Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP. Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).
  13. Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein. Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).
  14. Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. Characterization of oligomer formation of amyloid-β peptide using a split-luciferase complementation assay. Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).
  15. Decock, M., et al. Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing. FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).
  16. Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1. European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).
  17. Brückner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  18. Pattnaik, P. Surface plasmon resonance. Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).
  19. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).
  20. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  21. Hu, C. -D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
  22. Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).
  23. Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).
  24. Azad, T., et al. A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis. Nature Communications. 9 (1), 1061 (2018).
  25. Moroishi, T., et al. A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis. Genes & Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).

Tags

Kræftforskning sag 139 LATS LATS biosensor Hippo pathway split luciferase assay cellekultur stof screening kinase
Overvågning Hippo signalering Pathway aktivitet ved hjælp af en Luciferase-baserede store Tumor Suppressor (LATS) Biosensor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Azad, T., Nouri, K., Janse van… More

Azad, T., Nouri, K., Janse van Rensburg, H. J., Hao, Y., Yang, X. Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor (LATS) Biosensor. J. Vis. Exp. (139), e58416, doi:10.3791/58416 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter