Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

ניטור היפו איתות לשביל פעילות באמצעות ביוסנסור משתיק קול (באמת) מבוסס-לוציפראז הגידול גדול

Published: September 13, 2018 doi: 10.3791/58416
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University
* These authors contributed equally

Summary

כאן אנו מציגים ביוסנסור מבוססי לוציפראז לכמת את פעילות קינאז מדכאי גדולים (באמת)-קינאז המרכזית בההיפופוטם איתות. ביוסנסור הזה יש יישומים שונים ומגוונים במחקר בסיסי והתרגום שמטרתה לחקור היפו מסלול הרגולטורים במבחנה וב -vivo.

Abstract

ההיפופוטם איתות הוא מווסת ההכפלה של גודל איבר ויש לו תפקידים חשובים לביולוגיה סרטן ופיתוח. בשל האתגרים הטכניים, זה נשאר קשה להעריך את הפעילות של מסלול איתות זה ומפרשים בתוך הקשר הביולוגי. הספרות הקיימת על מדכאי גדולים (באמת) מסתמך על שיטות הינן איכותיות, לא יכול בקלות להיות קנה המידה להמציא להקרנה. לאחרונה, פיתחנו ביוסנסור מבוססי ביולומינסנציה כדי לפקח על הפעילות קינאז של רכיב מרכזי נצמדתי-a של המפל קינאז היפו. כאן, אנו מתארים את נהלי איך הזה ביוסנסור נצמדתי (השרירים-BS) יכול לשמש כדי לאפיין היפו מסלול הרגולטורים. ראשית, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור חוקרים את השפעת מועמד חלבונים overexpressed (למשל, VEGFR2) על פעילות השרירים באמצעות השרירים-BS. לאחר מכן, אנו מראים איך נצמדתי-BS יכול לשמש עבור מסך מעכבי קינאז בקנה מידה קטן. פרוטוקול זה יתכן כבניין יכול להיות קנה המידה-up כדי לבצע במסכים גדולים יותר, אשר ללא ספק יזהה הרגולטורים הרומן של הנתיב היפו.

Introduction

ההיפופוטם איתות לשביל זוהה לראשונה בדרוזופילה כרגולטור הרומן של צמיחת תאים ושל בעלי חיים בגודל1,2. מאז גילויו הראשונית, הרכבה ראיות בצורה משכנעת הראו כי מסלול היפו משחק תפקידים חיוניים לפיתוח (למשל, התפתחות עוברית מוקדמת, בקרת גודל האיבר, תלת-ממדית [תלת-ממד] מורפולוגיה), tumorigenesis ( למשל, התפתחות גידולים, גרורות, אנגיוגנזה, התחמקות המערכת החיסונית, אי יציבות גנומית, תגובת המתח, עמידות לתרופות), והומאוסטזיס רקמות (למשל, חידוש תאי גזע, בידול, התחדשות רקמות לאחר פציעה) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. היפו איתות לעתים קרובות הוא dysregulated שונים סרטן7,8,9,10,11,12. לכן, שחקרתי פונקציות של מסלול היפו סרטן ביולוגיה ו הרפוי ורפואה רגנרטיבית הפך אחד האזורים החמים ביותר בתחום המחקר הביו-רפואי.

באופן קצר, בשביל היפו, בעת הפעלת ועדות נגד הזרם (למשל, תא-תא מגע, מזין דחק (סטרס) מטריצה חוץ-תאית [ECM]), MST1/2 (MST; homologs בתרבית של היפו דרוזופילה ) סרין/תראונין (S/T) kinases phosphorylate/להפעיל מתאם חלבונים hMOB1 ואת WW45, כמו גם kinases LATS1/2 (באמת), אשר, לאחר מכן, phosphorylate activator תעתיק שיתוף הפה, paralog שלה, טאז-HX(H/R/K)XX(S/T) שנשמרת (H, היסטידין; R, ארגינין; K, ליזין; S, סרין; T, תראונין; X, כל חומצות אמינו) מוטיבים, כולל11,הפה-S127 ו TAZ-S8912. S127 phosphorylated הפה (הפה-pS127), טאז S89-phosphorylated (טאז-pS89) הם נפגמים בשל ubiquitination או לאגד חלבון cytoplasmic 14-3-3, תימנע אינטראקציה עם גורמי שעתוק TEAD1-4 בגרעין כדי transactivate במורד הנהר גנים המעורבים התפשטות תאים, אפופטוזיס (איור 1). למרות האינטרס מסלול היפו עצומה, קיימים כמה כלים למדידת היפו איתות ואלו היו מוגבלים מבחינה היסטורית כתבים של פלט תעתיק הפה/טאז/TEAD. אכן, עד ממש לאחרונה, היו אין כלים למדידת את הדינמיקה ואת הפעילות של ההיפופוטם איתות רכיבים באופן כמותי, בזמן אמת, תפוקה גבוהה, לא פולשנית גם במבחנה וגם בתוך vivo.

בהתחשב שלנו מתעוררים הבנה של התפקיד של אינטראקציות חלבון פיזיולוגיה, פתולוגיה, יש עניין רב בפיתוח של כלים שבהם ניתן להשתמש כדי ללמוד אינטראקציות אלה באופן כמותי, בזמן אמת13, 14,15,16. אכן, חלה התקדמות משמעותית בפיתוח של אסטרטגיות ביו-אנליטית, כולל שמרים 2-היברידית (Y2H)17, משטח פלזמון תהודה (SPR)18ו פורסטר תהודה אנרגיה העברה (סריג)19 מבחני, להערכת אינטראקציות חלבון חלבון. עם זאת, גישות אלה נושאים המגבלה של דרישת אופטימיזציה משמעותית כיוון הכתב, כך מבנים רבים חייבים להיבדק כדי למצוא יעיל. עוד, גישות אלה יש גם יחס אות לרעש נמוכה יחסית, כך אניני טעם איתות חיובי אמיתי עשויה להיות מאתגרת.

חלבון קומפלמנטציה מבחני פותחו כדי להתגבר על מגבלות אלה. הדור הראשון של חלבון קומפלמנטציה מבחני התבססה על פיצול פלורסצנטיות ססגוניות חלבונים, לא יכלו לפתור את המגבלות הנ ל20. קרינה פלואורסצנטית ססגוניות חלבונים מורכבים של תחום אחד בלבד, ולכן קשה לפצל אותם שני קטעים יציב נפרד עם זיקה נמוכה, רעש רקע21. לאחר מכן, גחלילית לוציפראז מזוהה בתור מועמד חדש לשימוש בפיתוח מבחני קומפלמנטציה חלבון פיצול. בגישה זו, גחלילית לוציפראז מחולק שני קטעים (N-מסוף ו- C-מסוף לוציפראז [NLuc, CLuc]) עם כל שבר דבוקה חלבון המטרה של עניין. אם NLuc ואת CLuc מועברים אל תוך הקרבה על האינטראקציה של החלבונים שני היעד, פעילות לוציפראז הוא מחדש, אור זוהרים נוצר בנוכחות סובסטרט luciferin ו- ATP22. בשנת 2001, על ידי ביצוע הקרנה קומבינטורית באמצעות ספריה המכילה שברי NLuc ו- CLuc באתרים שונים גזורה מחוברים חלבונים עם linkers שונים, Paulmurugan ו- Gambhir באוניברסיטת סטנפורד פיתחה של אופטימיזציה של פיצול-גחלילית לוציפראז קומפלמנטציה פרגמנט בסיוע מערכת עבור אינטראקציות חלבון-חלבון23. במערכת זו, נחתך גחלילית לוציפראז-חומצת אמינו (aa) 398 כדי ליצור NLuc ו CLuc, אשר מחוברים שני חלבונים עניין באמצעות מקשר (linker) גמיש של שמונה שאריות גליצין, שני סרין ומשקעים.

שימוש בגישה דומה, לאחרונה פיתחנו נצמדתי חדשה-תואר BS מאת פיוזינג NLuc ל-15 aa של הפה סביב אתר זרחון נצמדתי-S127 (YAP15), CLuc עם 14-3-3. החלבון הפה באורך מלא היה לא רגיל, כדי למנוע בלבול אותות על ידי שינויים post-translational של הפה (למשל, זרחון על אתרים אחרים, ubiquitination) על ידי הרגולטורים במעלה אחרים. נצמדתי-BS שהוצגו כאן לא-פולשנית לנטר היפו איתות פעילות הן חוץ גופית בתוך תאים חיים והן ויוו עכברים20,24 (איור 2). כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט למדידת נצמדתי קינאז הפעילות במבחנה באמצעות השרירים-BS. ראשית, אנו מראים איך נצמדתי-BS יכול לשמש כדי לחקור את השפעת חלבונים overexpressed בפעילות השרירים. לאחר מכן, אנו מראים איך החיישן יכול לשמש כדי לפקח על הפעילות של השביל היפופוטם לאחר הטיפול עם סוכנים להסדרת מסלול היפו. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות ולאפיין איתות המסלולים או גירויים ויסות פעילות קינאז השרירים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. חקירת מווסת בשם של היפו איתות באמצעות השרירים-BS

  1. ציפוי, תרביות תאים תאים
    1. הכנת תרבית תאים
      1. חמים 1 x PBS, DMEM המכיל 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 0.25% טריפסין-EDTA עד 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים במשך כ 30 דקות.
      2. ניקוי יסודי ארון אבטחה עם 70% אתנול.
      3. הצב תרביות רקמה מנות, פיפטות פסטר, פיפטות סרולוגית, טיפים פיפטה וחטף תרביות רקמה כנדרש.
      4. להוציא 1 x PBS, התקשורת, טריפסין-EDTA מהאמבטיה מים, לנקות אותם עם 70% אתנול, והציבו אותם בשכונה.
    2. תחזוקה, ציפוי של התאים עבור תרביות תאים
      1. לבחור קו תא ביעילות גבוהה תרביות תאים (למשל, HEK293) עבור הניסוי. בדוק עבור הביטוי מרכיבים מסלול היפו בשורה זו התא על ידי תספיג כדי לוודא היפו איתות פעילה.
      2. לגדל תאים HEK293 DMEM ב- 10 ס מ פטרי באינקובטור 37 ° C ו- 5% CO2. נטר את התאים במיקרוסקופ כל יום. המעבר את התאים כפי שמתואר להלן, כאשר 80-90% confluency נצפית.
      3. לשטוף את התאים על ידי הוספת 5 מ של PBS 1 x לתוך צלחת, מתערבל בעדינות את הצלחת וכ רפה בעברית התקשורת לחלוטין.
      4. להוסיף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA לצלחת. מערבולת את הצלחת על מנת להבטיח טריפסין מכסה באופן שווה את התאים.
      5. דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס ב CO2 החממה במשך 5 דקות או עד כל התאים הם צמודי קרקע.
      6. להוסיף 4 מ"ל של מדיה (עם 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין) לנטרל את טריפסין, resuspend את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים, וכן לוותר על עשירית (0.5 מ"ל) של התאים חדשים לוחות 100 מ מ (עבור העברת יחס של 1:10) המכיל 9.5 מ ל התקשורת מלאה.
      7. עבור השרירים-BS תרביות תאים, לספור את התאים באמצעות תאי 2 x 105 hemocytometer וצלחת לתוך כל טוב של צלחת 12-ובכן 24 שעות לפני תרביות תאים.
        הערה: באמצעות מספרי הטלפון הנייד גבוה יותר עשוי להגביר את האות רקע זוהרים כמו היפופוטם איתות פעילות מוסדר על ידי תא confluency. באמצעות מספרי הטלפון הנייד נמוך עשוי להגביר את רגישות תא תרביות תאים ריאגנטים ולהגדיל תא מוות24.
    3. תרביות תאים של השרירים-BS לבד או יחד עם הגן המועמד
      1. Miniprep השרירים-BS פלסמידים (NLuc-YAP15-pcDNA3.1-Hygro ו- 14-3-3-CLuc-pcDNA3.1-Hygro) טרי מן DH5a חיידקים תרבית נוזלית (הכרחי להשגת ביטוי נצמדתי-BS האופטימלי).
      2. h 1 לפני תרביות תאים, תשאף המדיום מהצלחת, להוסיף 500 µL של מדיום הגידול מלאה כל טוב של הלוחות 12-ובכן, לחזור התאים החממה.
        הערה: פרוטוקול הבאים מתאר שיטות תרביות תאים באמצעות תגובה כימית תקנים מבוסס פולימר זמינים מסחרית. ריאגנטים תרביות תאים אחרים יכול להיות גם מתאים תקנים; עם זאת, לא כבר בדקנו אותם.
      3. להפוך פתרונות A ו- B כפי שמתואר בטבלה 1. עבור N transfections, לבצע (N + 0.5) x premix פתרון B.
      4. מיד להוסיף תקנים מבוסס פולימר מדולל הכימית (פתרון B) ה-DNA (פתרון A). פיפטה מעלה מטה בעדינות לערבב.
      5. דגירה המדגם בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לאפשר תקנים מתחמי לטופס.
      6. הוסף את הנפח הכולל (76 µL) של תרביות תאים מתחמי dropwise כל טוב של 12-ובכן לצלחת עם מתערבל עדין.
      7. דגירה התאים בין לילה (18 – 24 h) ב 37 º C.
        הערה: עבור תאים הרגישים ריאגנטים מבוסס פולימר תרביות תאים, זמן הדגירה יכול להיות מופחת על 5 שעות.
      8. יום אחרי תרביות תאים, מסיר את המדיה תרביות תאים המכיל קומפלקס ולהחליף אותו עם מדיה מלאה טריים. התרבות התאים ב 37 ° C ליום אחר לביצוע לוציפראז וזמינותו.
  2. לוציפראז assay
    הערה: כתב לוציפראז Assay המערכת מזהה גחלילית ו Renilla יחד assay אחד משמש את מבחני לוציפראז. אם לא שימש Renilla בקרה פנימית, לבצע צעד אחד לוציפראז assay על-ידי הוספת LARII ללא הוספת ריאגנט לזיהוי של Renilla .
    1. הכנת lysates תא
      1. לדלל 5 מאגר פירוק פסיבי x (PLB) עם מים מזוקקים כדלקמן:
      2. הנפח הכולל של 1 x PLB נדרש = N x (50 μL של 5 x PLB) + 200 μL של dH2O = N x 250 μL 1 x PLB לכל טוב של הלוחות 12-טוב (N = מספר דוגמאות).
      3. האחות התקשורת לחלוטין. להוסיף 1 מ"ל של 1 x PBS כל טוב. מערבולת את הצלחת בעדינות כדי להסיר מנותק תאים צמיחה שיורית מדיה. האחות של PBS 1 x לחלוטין. ודא 1 שיורית x PBS שרידים לפני התוספת של 1 x PLB.
      4. להוסיף 250 μL 1 x PLB/טוב.
      5. מניחים את הצלחות תרבות על פלטפורמה נדנדה עם נדנדה עדין כדי להבטיח כיסוי מוחלט ואפילו של טפט התא עם 1 x PLB. רוק הלוחות התרבות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לאפשר לתאים lyse.
      6. להעביר את lysate אל צינור microcentrifuge 1.5 mL.
    2. מדידת האות זוהרים
      1. להוציא את LARII (20 μL לדוגמה) מ- 80 ° C, equilibrate אותו לטמפרטורת החדר.
      2. להתכונן ריאגנט לזיהוי Renilla N מבחני: להוסיף (N + 1) x 0.4 μL של 50 x המצע (N + 1) x 19.6 μL של המאגר שלו.
      3. Predispense 10 μL של כל תא lysate אל צינורות 1.5-mL.
      4. תוכנית של luminometer כדי לבצע עיכוב 2-s premeasurement, ואחריו נקודה מדידה 10-s עבור כל assay לוציפראז כפול.
        הערה: המדידות הראשון והשני להיות המייצגים את האות נצמדתי-BS, האות בקרה פנימית Renilla , בהתאמה. ניתן להשתמש בכל luminometer תואם לוציפראז יחידה או כפולה.
      5. להעביר בזהירות μL 20 של ריאגנט LARII לתוך שפופרת אחת, במהירות פיפטה לאורך 3 x כדי לערבב את הכל.
      6. מיד למקם את הצינור luminometer וליזום את הקריאה.
      7. להסיר את הצינור מדגם luminometer, מיד להוסיף 20 μL של ריאגנט Renilla ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה 3 x. מביאים את הדגימה luminometer וליזום את הקריאה הבאה. להקליט את המידות.
      8. למחוק את הצינור התגובה והמשך הדוגמה הבאה.

2. מסך כדי לזהות היפו מסלול הרגולטורים באמצעות השרירים-BS

  1. תרבית תאים ו- transfections
    1. תרבות HEK293AD תאים כמתואר בסעיף 1.1.
      הערה: HEK293AD הוא חסיד יותר מאשר שורות תאים אחרים HEK293, מה שהופך אותו קו תא טוב עבור שימוש במסכים.
    2. ניתוק התאים כמתואר בסעיף 1.1.2. לספור, לוחית רישוי 2 x 106 תאים ב- 100 מ מ לוחות 24 שעות לפני תרביות תאים.
    3. h 1 לפני תרביות תאים, תשאף התקשורת מהצלחת והחלף אותם 5 מ של צמיחה מלאה טריים מדיה.
    4. להפוך פתרונות A ו- B כפי שמתואר בטבלה 2.
    5. מיד להוסיף תקנים מבוסס פולימר מדולל הכימית (פתרון B) ה-DNA (פתרון A). פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב.
    6. דגירה המדגם בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לאפשר תקנים מתחמי לטופס.
      1. להוסיף את הנפח הכולל (500 µL) של תרביות תאים מתחמי dropwise לתאים עם מתערבל עדין.
      2. דגירה התאים בן לילה ב 37 º C.
      3. למחרת, trypsinize ולספור את התאים. צלחת עונה 1 פרק 104 2 x 104 תאים לתוך כל טוב של צלחת 96-ובכן בהנפח הכולל של 100 µL של המדיה לכל טוב. דגירה ליום אחר.
    7. למחרת, להוסיף מולקולות סוכנים/קטן להסדרת מסלול היפו-ריכוז 10 מיקרומטר, כדי כל טוב, 1 – 4 h לפני ביצוע וזמינותו לוציפראז הסופי.
      הערה: עבור מולקולות קטנות ביותר/סוכנים, טיפול 4 h ב- 10 מיקרומטר אינו משפיע על התא הכדאיות. אם ריכוז נמוך, יורחב הטיפול לתקופה ארוכה יותר של זמן.
  2. לוציפראז assay
    1. במבחנה לוציפראז assay
      1. האחות המדיה מן התאים לחלוטין. לשטוף את התאים עם µL 100 ל- PBS x 1 היטב בכל. מחוק לגמרי לגמרי.
      2. הוסף 20 µL 1 x PLB (להכין כשלב שמתואר 1.2.1.1) לתוך כל טוב של הלוחות 96-ובכן.
      3. מניחים את הצלחות תרבות על פלטפורמה נדנדה עם נדנדה עדין בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
      4. העברת µL 20 של ריאגנט LARII לבאר כל ובזהירות פיפטה לאורך 3 x לערבב.
      5. מיד למקם את הצלחת luminometer לקריאת צלחת וליזום את הקריאה.
    2. חיים תא לוציפראז assay
      1. מרוויחה 11 x D-luciferin המניות כדלקמן: להמיס 1.5 מ ג של אבקת D-luciferin ב 1 מ"ל של מדיה תרבות נורמליים.
      2. העברת 10 µL של 11 x D-luciferin לתוך כל טוב ומערבבים בעדינות עם התקשורת אשר כבר נמצאת הבאר.
      3. להחליף את התאים לתוך החממה למשך 10 דקות.
      4. הכנס את הצלחת luminometer וליזום את הקריאה.
        הערה: אם עוצמת האות אינה חזקה מספיק בריכוז זה של D-luciferin, ניתן להוסיף עוד 10 µL של המניה D-luciferin לתאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

נצמדתי-BS היה cotransfected עם גנים שונים כדי להעריך את השפעתם על פעילות השרירים (איור 3). בניסוי זה, שימש Renilla בקרה פנימית. הביטוי ארעית של הפה-5SA, צורה פעילה המכונן של הפה, גורם להגברת רמות של מטרות תעתיק הפה עלייה עוקבות נצמדתי פעילות קינאז דרך מסלול משוב הוקמה25. MST, activator במעלה הזרם של השרירים בשביל היפו (איור 1), גם מגביר את עוצמת האות ביוסנסור. עם זאת, ביטוי VEGFR, אשר מפעילה PI3K/MAPK איתות, מעכב נצמדתי ומקטינות את עוצמת האות של השרירים-BS.

פרוטוקול השני, נצמדתי-BS היה transfected לתוך HEK293AD ו, 24 שעות לאחר תרביות תאים, התאים הועברו לתוך צלחות 96-ובכן. 40 h לאחר תרביות תאים, התאים שטופלו הרגולטורים שונים מולקולה קטנה ידוע היפו איתות ואחריו וזמינותו לוציפראז (איור 4). VEGFR, פאי 3-קינאז, ואת הסלולר רמת האנרגיה הם שלושת הרגולטורים שלילי ידוע קינאז נצמדתי24. ב הניסוי הזה, GDS0941, פאי 3-קינאז מעכב, axitinib, SU4312, מעכבי VEGFR, 2-D גלוקוז, אשר גורמת מתח אנרגיה על ידי עיכוב של מטבוליזם הגלוקוז וייצור ATP, שימשו כדי להפעיל את השרירים-BS. . הפוך, LPA S1P, TPA שימשו כדי לעכב את השרירים-BS. ניסוי זה מראה כי השרירים-BS יכול לשמש כדי למדוד את ההפעלה והן עיכוב ההשפעה של מולקולה קטנה על פעילות קינאז נצמדתי.

פתרון A
pCDNA3.1-Hygro-NLuc-YAP15 1 μL (50 ng)
pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc 1 μL (50 ng)
פלסמיד לבטא גן המועמד (למשל MST) 1 μL (400 ng)
ריקה וקטור (לדוגמה: pcDNA3.1-Hygro)
וקטור Renilla (pRL-TK) (אופציונלי) 1 μL (20 ng)
DMEM (ללא סרום/אנטיביוטיקה) 34 ΜL
הנפח הכולל 38 ΜL
פתרון ב'
ריאגנט תקנים מבוסס פולימר 1.5 ΜL
(3:1 יחס עם הכולל μg DNA)
DMEM (ללא סרום/אנטיביוטיקה) 36.5 ΜL
הנפח הכולל 38 ΜL

טבלה 1: פרוטוקול להכנת פתרונות A ו- B באמצעות ריאגנט מבוסס פולימר תקנים עבור חוקרים בשם הרגולטור של מסלול היפו עם השרירים-BS.

פתרון A
pCDNA3.1-Hygro-NLuc-YAP15 10 μL (3 μg)
pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc 10 μL (3 μg)
DMEM (ללא סרום/אנטיביוטיקה) 230 ΜL
הנפח הכולל 250 ΜL
פתרון ב'
ריאגנט תקנים מבוסס פולימר 18 ΜL
(3:1 יחס עם הכולל μg DNA)
DMEM (ללא סרום/אנטיביוטיקה) 232 ΜL
הנפח הכולל 250 ΜL

טבלה 2: פרוטוקול להכנת פתרונות A ו- B באמצעות תגובה כימית מבוסס פולימר תרביות תאים להקרנה לזיהוי הרגולטורים של מסלול היפו באמצעות השרירים-BS.

Figure 1
איור 1: היפופוטם מסלול יונקים. מסלול היפו מגבילה את גודל איבר phosphorylating, מעכב הפה, טאז. מסלול היפו מופעל, סאב LATS1/2, אספסוף phosphorylated הינם מופעל ע י MST1/2. LATS1 מופעל/2 phosphorylates הפה/טאז באתרים המכילים סרין ההכפלה. 14-3-3 אינטראקציה עם phosphorylated הפה/טאז, ובכך מעכבים שלהם לוקליזציה גרעינית, שותף transactivation של מטרות הגן במורד הזרם דרך TEADs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: השרירים-BS פיצול-חלבון קומפלמנטציה assay בהתבסס על לוציפראז. תחומים ו C-אמיני לוציפראז (NLuc ו- CLuc) מחוברים 15 אמינו חומצה שמסביב הפה-S127 ו- 14-3-3, בהתאמה. כריכת YAP15/14-3-3 אחרי נצמדתי זרחון מקדם לוציפראז קומפלמנטציה ביולומינסנציה אות פליטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: תוצאות ניסוי נציג הערכת ההשפעה של הגן על פעילות השרירים. ניתן לבטא את החיישן לבד או יחד עם אחרים גנים בתאים HEK293AD לחקור את השפעתם על פעילות קינאז נצמדתי (זאת אומרת ± SD; n = 3, * *p < 0.01, * * *p < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: תוצאות ניסוי נציג הערכת ההשפעה של מולקולות קטנות על פעילות השרירים בתאים HEK293AD. HEK293AD התאים היו transfected עם השרירים-BS ומטופל עם התרופות הבאות: מעכב PI3K (GDC0941), μM 10 במשך 4 שעות; VEGFR מעכב (axitinib), μM 10 במשך 4 שעות; 2-deoxyglucose, 25 מ מ לשעה; LPA, μM 10 עבור 1 h; sphingosine-1-phosphophate (S1P), μM 1 לשעה; 12-O-tetradecanoylphorbol-13-אצטט (TPA), 5 nM עבור 1 h; VEGFR מעכב (SU4312), μM 10 במשך 4 שעות (זאת אומרת ± SD; n = 3, * *p < 0.01, * * *p < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ואילו השביל היפו משחק תפקידים חיוניים תהליכים ביולוגיים שונים, ומוביל dysregulation של הנתיב היפו סרטן6, איך מסלול היפו מוסדר בתגובה לגירויים שונים אינה מובנת לחלוטין. בנוסף, חלה לא כמותית ומערכת בזמן אמת כדי להעריך את הפעילות של רכיבי הליבה היפו. לאחרונה, אנחנו פיתח ואומת על ביוסנסור הרומן למדידת פעילות קינאז נצמדתי מסלול היפו24. ביוסנסור הזה יכול לשמש לא רק לניטור באופן כמותי ומדויק היפו איתות פעילות בתאים חיים, אלא גם עבור מסכי של שהתרופות המתוות מסלול היפו לטיפול בסרטן. בנוסף, הסרט מבוסס ביוסנסור יכול להוביל גילוי הרומן גנים האחראים להסדרת של הנתיב היפו. בהתחשב בחשיבות של היפו איתות ב סרטן, מציאת crosstalk מכריע בין גנים אחרים מסלול היפו יהיה מחקר חשוב לבצע עבור כל סרטן ביולוגים. לכן, ביוסנסור הזה יש פוטנציאל להפוך חידושים בטיפול הנוכחי של סרטן, עשויה לספק אסטרטגיה טיפולית חדשה שימושי עבור טיפולים מוצלחים של סרטן.

ישנן מספר נקודות חשובות שיש להתייחס בעת שימוש נצמדתי-BS. ראשית, מניסיוננו, נצמדתי-BS יש את הרגישות הגדולה ביותר כאשר פלסמידים משמש תרביות תאים מופקים ומחונך חיידקים. שנית, כמות השרירים-BS פלסמידים transfected לתוך תאים ישפיעו על עוצמת רגישות ושידור נצמדתי-BS. ניתן להגדיל את כמות פלסמיד DNA ng/מקטע 400 נצמדתי-BS, 600 ng עבור הגן עניין לכל טוב של צלחת 12-. טוב. באופן כללי, באמצעות פלסמיד עוד ייתן של עוצמת האות גבוה יותר אבל פחות רגישות. שלישית, confluency תא יכול להשפיע על רקע אותות השרירים-BS. בקנה אחד עם תפקידו ומבוססת של היפו איתות ב הסלולר התגובות confluency, הבחנו כי תאים עם confluency גבוהה יותר יש אות רקע נצמדתי-BS גבוה יותר עקב הפעלת השרירים אנדוגני. בהתאם לכך, מצופה בדלילות תאים מראים אות רקע נמוך יותר של השרירים-BS. ניתן לבחור confluency תא אופטימלית בהתאם למטרת הניסוי (גבוהה confluency להתבוננות עיכוב נצמדתי; נמוך confluency להתבוננות הפעלת השרירים). רביעית, Renilla יכולה לשמש פקד פנימי ליעילות תרביות תאים, עבור קשה-עד-transfect תאים (למשל, MCF10A), היחס ריאגנט: DNA תקנים ניתן לשנות ל- 4:1. לבסוף, אנו ממליצים MST2 cotransfecting כפקד חיובית ואת הפה-S127A כפקד שלילי בכל פעם שמשמש את החיישן.

כל כלי יש מגבלות משלו. נצמדתי-BS הוא סובסטרט מלאכותי של חלבון אנדוגני, אשר תמיד יכול לגבור המצע האמיתי של החלבון עניין. אפקט זה נקרא תופעת חציצה החיישן. לשפר את החיישן עם עוצמת האות גבוה יותר, רמות נמוכות יותר של הביטוי עשוי לעזור כדי להתגבר על בעיה זו. מגבלה נוספת היא משוב מסלולים עלול לסבך את הפרשנות של נתונים נצמדתי-BS. ישנם רבים ליניארית ולא לינארי אינטראקציה איתות המסלולים צפויה להשפיע על האות נצמדתי-BS. נצמדתי-BS רק מדגים ההשפעה המצטברת של גירוי על פעילות קינאז השרירים. יצוין, עם זאת, כי מגבלה זו אינה ייחודית נצמדתי-BS אבל מעדיף בדרך נתקל בלימודי ביולוגיה מולקולרית. לפיכך, נצמדתי-BS נתונים יש לפרש בהקשר של ניסויים להוכחת מרובים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ קנדי המכון לבריאות למחקר (CIHR #119325, 148629), את קנדי השד סרטן הקרן (CBCF) כדי XY. TA נתמך על ידי את המלגה לתואר שני של קנדה וניהר הבינלאומי אונטריו המלגה לתואר שני. HJJVR נתמך על ידי המלכה אליזבת השנייה במלגה ללימודי תואר שני במדע וטכנולוגיה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin-EDTA  Life Technologies 2520056 0.25%
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F1051
DMEM Sigma D6429-500ml DMEM with high glucose 
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122
PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent  Signagen SL100688.5
5x Passive lysis buffer Promega E194A 30 ml
Dual-Glo® Luciferase Assay System Promega E2940 100 ml kit
20/20 luminometer Turner Biosystems 998-2036 Single tube reader luminometer
GloMax®Navigator with dual injectors Promega GM2010 96-well plates reader luminometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
  2. Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).
  3. Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The Hippo Pathway: Immunity and Cancer. Cancers. 10 (4), 94 (2018).
  4. Maugeri-Saccà, M., De Maria, R. The Hippo pathway in normal development and cancer. Pharmacology & Therapeutics. 186, 60-72 (2018).
  5. van Rensburg, H. J. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  6. Yeung, B., Yu, J., Yang, X. Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis. International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).
  7. Zhao, Y., Yang, X. The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance. International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).
  8. Yu, F. -X., Guan, K. -L. The Hippo pathway: regulators and regulations. Genes & Development. 27 (4), 355-371 (2013).
  9. Yang, X., Xu, T. Molecular mechanism of size control in development and human diseases. Cell Research. 21 (5), 715 (2011).
  10. Visser, S., Yang, X. LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis. Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).
  11. Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes & Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).
  12. Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP. Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).
  13. Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein. Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).
  14. Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. Characterization of oligomer formation of amyloid-β peptide using a split-luciferase complementation assay. Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).
  15. Decock, M., et al. Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing. FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).
  16. Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1. European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).
  17. Brückner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  18. Pattnaik, P. Surface plasmon resonance. Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).
  19. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).
  20. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  21. Hu, C. -D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
  22. Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).
  23. Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).
  24. Azad, T., et al. A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis. Nature Communications. 9 (1), 1061 (2018).
  25. Moroishi, T., et al. A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis. Genes & Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).

Tags

חקר הסרטן גיליון 139 השרירים נצמדתי ביוסנסור מסלול היפו לפצל לוציפראז assay תרבית תאים והתרופות הקרנה קינאז
ניטור היפו איתות לשביל פעילות באמצעות ביוסנסור משתיק קול (באמת) מבוסס-לוציפראז הגידול גדול
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Azad, T., Nouri, K., Janse van… More

Azad, T., Nouri, K., Janse van Rensburg, H. J., Hao, Y., Yang, X. Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor (LATS) Biosensor. J. Vis. Exp. (139), e58416, doi:10.3791/58416 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter