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Cancer Research

एक Luciferase आधारित बड़े ट्यूमर का उपयोग कर मार्ग गतिविधि संकेत हिप्पो की निगरानी (लाटों)-संवेदी

Published: September 13, 2018 doi: 10.3791/58416
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ हम एक luciferase-आधारित के लिए बड़े ट्यूमर दमन (लाटों) के कळेनासे गतिविधि यों तो-एक केंद्रीय कळेनासे में मौजूद हिप्पो संकेतन मार्ग सिग्नलिंग । इस सेंसर बुनियादी और शोधों में इन विट्रो में और vivoमें हिप्पो मार्ग नियामकों की जांच के उद्देश्य से अनुसंधान में विविध अनुप्रयोगों है ।

Abstract

हिप्पो संकेतन मार्ग अंग आकार का एक संरक्षित नियामक है और विकास और कैंसर जीवविज्ञान में महत्वपूर्ण भूमिका है । तकनीकी चुनौतियों के कारण, यह संकेत मार्ग की गतिविधि का आकलन करने के लिए मुश्किल रहता है और यह एक जैविक संदर्भ के भीतर व्याख्या । बड़े ट्यूमर दमन (लाटों) पर मौजूदा साहित्य तरीकों कि गुणात्मक रहे है पर निर्भर करता है और आसानी से स्केल नहीं किया जा सकता स्क्रीनिंग के लिए । हाल ही में, हम लाटों के कळेनासे गतिविधि पर नजर रखने के लिए एक bioluminescence आधारित-संवेदी विकसित किया है-हिप्पो कळेनासे झरना का एक मुख्य घटक । यहाँ, हम इस लाटों (लाटों-बी एस) हिप्पो मार्ग नियामकों को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन । सबसे पहले, हम लाटों-बी एस का उपयोग लाटों गतिविधि पर एक व्यक्त प्रोटीन उंमीदवार (जैसे, VEGFR2) के प्रभाव की जांच के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । फिर, हम बताएंगे कि कैसे लाटों-बी एस एक छोटे पैमाने पर कळेनासे अवरोधक स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल feasibly पैमाने पर बड़े परदे, जो निस्संदेह हिप्पो मार्ग के उपंयास नियामकों की पहचान करेगा प्रदर्शन किया जा सकता है ।

Introduction

हिप्पो संकेतन मार्ग पहले सेल विकास और पशु आकार1,2के एक उपंयास नियामक के रूप में Drosophila में पहचान की थी । अपनी प्रारंभिक खोज के बाद से, बढ़ते सबूत के रूप में दिखाया गया है कि हिप्पो मार्ग के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है (जैसे, जल्दी भ्रूण विकास, अंग आकार नियंत्रण, और तीन आयामी [3-डी] आकृति विज्ञान), tumorigenesis ( उदाहरणके लिए, ट्यूमर विकास, मेटास्टेसिस, angiogenesis, प्रतिरक्षा चोरी, जीनोमिक अस्थिरता, तनाव प्रतिक्रिया, और दवा प्रतिरोध), और ऊतक homeostasis (जैसे, स्टेम सेल नवीकरण और भेदभाव और चोट के बाद ऊतक पुनर्जनन) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. हिप्पो संकेतन विभिन्न कैंसर7,8,9,10,11,12में अक्सर dysregulated है । इसलिए, कैंसर जीवविज्ञान और चिकित्सीय और अपक्षयी चिकित्सा में हिप्पो मार्ग के elucidating कार्य जैव चिकित्सा अनुसंधान में सबसे क्षेत्रों में से एक बन गया है ।

संक्षेप में, हिप्पो मार्ग में, ऊपर नियामकों द्वारा सक्रियण पर (जैसे, सेल-सेल संपर्क, पोषक तत्वों तनाव, और extracellular मैट्रिक्स [ECM]), MST1/2 (MST; स्तनधारी हिप्पो के homologs Drosophila ) serine/threonine (S/टी) kinases phosphorylate/सक्रिय अनुकूलक प्रोटीन hMOB1 और WW45, साथ ही LATS1/2 (लाटों) kinases जो, बाद में, phosphorylate transcriptional सह उत्प्रेरक याप और उसके paralog TAZ में संरक्षित सेमी (एच/आर/K) XX (S/T) (एच, histidine; R, arginine; K, lysine; एस, serine; T, threonine; X, कोई अमीनो एसिड) रूपांकनों, जिसमें याप-S127 और TAZ-S8911,12शामिल हैं । S127-phosphorylated याप (याप-pS127) और S89-phosphorylated TAZ (TAZ-pS89) ubiquitination या cytoplasmic प्रोटीन 14-3-3 से नीचा कर रहे है और TEAD1 के साथ बातचीत से रोका-4 नाभिक में प्रतिलेखन कारकों को transactivate बहाव कोशिका प्रसार और apoptosis में शामिल जीन (चित्रा 1) । हिप्पो मार्ग में जबरदस्त रुचि के बावजूद, हिप्पो संकेतन को मापने के लिए कुछ उपकरण मौजूद है और उन है कि ऐतिहासिक याप/TAZ/TEAD transcriptional उत्पादन के पत्रकारों के लिए सीमित किया गया है । वास्तव में, जब तक बहुत हाल ही में, वहां गतिशीलता और एक मात्रात्मक, वास्तविक समय, उच्च प्रवाह में घटक संकेत हिप्पो की गतिविधि को मापने के लिए कोई उपकरण थे, और गैर इनवेसिव तरीके से दोनों विट्रो में और vivoमें ।

शरीर विज्ञान और विकृति में प्रोटीन की भूमिका की हमारी उभरती हुई समझ को देखते हुए, वहां उपकरण है कि एक मात्रात्मक और वास्तविक समय13तरीके से इन बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के विकास में बहुत रुचि है, 14,15,16. दरअसल, वहां जैव विश्लेषणात्मक रणनीतियों के विकास में उल्लेखनीय प्रगति हुई है, खमीर दो संकर (Y2H)17, सतह plasmon अनुनाद (SPR)18, और Förster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट)19 परख सहित, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का मूल्यांकन करना । हालांकि, इन तरीकों रिपोर्टर अभिविन्यास के महत्वपूर्ण अनुकूलन की आवश्यकता की सीमा ले, ऐसी है कि कई निर्माण एक कुशल एक खोजने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए. इसके अलावा, इन दृष्टिकोण भी एक अपेक्षाकृत कम संकेत करने वाली शोर अनुपात, ऐसी है कि समझदार एक सच्चे सकारात्मक संकेत चुनौतीपूर्ण हो सकता है ।

प्रोटीन पूरक परख इन सीमाओं को दूर करने के लिए विकसित किया गया । प्रोटीन पूरक परख की पहली पीढ़ी के विभाजन बहुरंगा प्रतिदीप्ति प्रोटीन पर आधारित था और aforementioned सीमाओं20हल नहीं कर सका । बहुरंगा प्रतिदीप्ति प्रोटीन केवल एक ही डोमेन से मिलकर बनता है, यह मुश्किल उंहें कम समानता और पृष्ठभूमि शोर21के साथ दो अलग स्थिर टुकड़ों में विभाजित कर । इसके बाद, जुगनू luciferase विभाजित प्रोटीन पूरक परख के विकास में उपयोग के लिए एक नए उंमीदवार के रूप में पहचान की थी । इस दृष्टिकोण में, जुगनू luciferase दो टुकड़ों में विभाजित है (एन टर्मिनल और सी-टर्मिनल luciferase [NLuc और CLuc]) प्रत्येक टुकड़ा ब्याज की एक लक्ष्य प्रोटीन से जुड़े के साथ । यदि NLuc और CLuc दो लक्ष्य प्रोटीन की बातचीत पर निकटता में लाया जाता है, luciferase गतिविधि का पुनर्गठन किया जाता है और bioluminescent प्रकाश luciferin सब्सट्रेट और एटीपी22की उपस्थिति में उत्पन्न होता है । २००१ में, एक मिश्रित NLuc और CLuc विभिंन स्थलों पर काट टुकड़े युक्त पुस्तकालय का उपयोग कर स्क्रीनिंग प्रदर्शन करके और विभिंन लिंकर्स, Paulmurugan और गंभीर के साथ स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय में प्रोटीन से जुड़े एक अनुकूलित विभाजित-जुगनू विकसित प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए luciferase टुकड़ा-असिस्टेड पूरक प्रणाली23. इस प्रणाली में, जुगनू luciferase एमिनो एसिड में कटौती (एए) ३९८ है NLuc और CLuc, जो ब्याज के दो प्रोटीन आठ glycine अवशेषों और दो serine अवशेषों की एक लचीला लिंक का उपयोग करने के लिए संलग्न है फार्म ।

इसी तरह के दृष्टिकोण का प्रयोग, हम हाल ही में एक नया लाटों विकसित-NLuc से 15 ए. ए. फास्फारिलीकरण (S127) और 14-3-3 के साथ YAP15 में लाटों CLuc साइट आसपास के याप के लिए मना कर बी एस । पूर्ण लंबाई याप प्रोटीन का उपयोग नहीं किया गया था, याप के बाद अनुवाद द्वारा संकेतों को प्राप्त करने से बचने के लिए (जैसे, अंय साइटों और ubiquitination में फास्फारिलीकरण) अंय ऊपर नियामकों द्वारा । लाटों-बी एस यहां प्रस्तुत गैर इनवेसिव की निगरानी कर सकते है हिप्पो दोनों में रहने वाले कोशिकाओं में और चूहे20,24 (चित्रा 2) में vivo में गतिविधि संकेतन । यहां, हम लाटों-बी एस का उपयोग इन विट्रो में लाटों कळेनासे गतिविधि को मापने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन । सबसे पहले, हम बताएंगे कि कैसे लाटों-बी एस लाटों गतिविधि पर एक व्यक्त प्रोटीन के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । फिर, हम बताते हैं कि कैसे इस हिप्पो मार्ग को विनियमित एजेंटों के साथ उपचार के बाद हिप्पो मार्ग की गतिविधि पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल की पहचान करने के लिए और संकेत मार्ग या लाटों कळेनासे गतिविधि को विनियमित उत्तेजनाओं की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

1. लाटों-बी एस का उपयोग कर संकेत हिप्पो के एक ख्यात नियामक की जांच

  1. चढ़ाना और कोशिकाओं के अभिकर्मक
    1. सेल कल्चर की तैयारी
      1. गर्म 1x पंजाबियों, DMEM युक्त 10% FBS और 1% पेनिसिलिन/streptomycin, और ०.२५% trypsin-EDTA से ३७ ° c लगभग 30 मिनट के लिए एक जल स्नान में ।
      2. अच्छी तरह से ७०% इथेनॉल के साथ एक सुरक्षा कैबिनेट साफ ।
      3. टिशू कल्चर हुड में आवश्यक के रूप में ऊतक संस्कृति व्यंजन, पाश्चर पिपेट, सीरम वैज्ञानिक पिपेट, और पिपेट सुझावों प्लेस ।
      4. 1x पंजाबियों, मीडिया, और पानी के स्नान से trypsin-EDTA बाहर ले लो, उंहें ७०% इथेनॉल के साथ साफ है, और उंहें हुड में जगह है ।
    2. रखरखाव और अभिकर्मक के लिए कोशिकाओं के चढ़ाना
      1. प्रयोग के लिए उच्च अभिकर्मक दक्षता (उदा., HEK293) वाली सेल लाइन चुनें । हिप्पो संकेतन सक्रिय है यह सुनिश्चित करने के लिए पश्चिमी दाग से इस सेल लाइन में हिप्पो मार्ग घटकों की अभिव्यक्ति के लिए जाँच करें ।
      2. ३७ ° c और 5% CO2में एक मशीन में 10 सेमी पेट्री व्यंजन में DMEM में HEK293 कोशिकाओं को विकसित करें । हर दिन एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की निगरानी । जब 80 के नीचे वर्णित कोशिकाओं के रूप में पारित-90% प्रवाह मनाया जाता है ।
      3. एक थाली में 1x पंजाबियों के 5 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धो, धीरे थाली घूमता है, और पूरी तरह से मीडिया aspirating ।
      4. थाली में trypsin-EDTA की 1 मिलीलीटर डालें । थाली भंवर सुनिश्चित करने के लिए कि trypsin समान रूप से कोशिकाओं को शामिल किया गया ।
      5. 5 मिनट के लिए एक सह2 मशीन में ३७ ° c में कोशिकाओं को मशीन या जब तक सभी कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं ।
      6. trypsin बेअसर करने के लिए मीडिया के 4 मिलीलीटर (10% FBS और 1% पेनिसिलिन/streptomycin) के साथ जोड़ें, कई बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं resuspend, और एक दसवें (०.५ एमएल) कोशिकाओं के नए १०० mm प्लेट्स में वितरण (1:10 के एक गुजरते अनुपात के लिए) के ९.५ मिलीलीटर युक्त पूरा मीडिया ।
      7. लाटों-बी एस अभिकर्मक के लिए, अभिकर्मक से पहले एक 12 अच्छी तरह से प्लेट 24 एच के प्रत्येक कुआं में एक hemocytometer और प्लेट 2 x 105 कोशिकाओं का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना ।
        नोट: उच्च कक्ष संख्याओं का उपयोग करने से पृष्ठभूमि bioluminescent संकेत बढ़ सकता है क्योंकि हिप्पो को संकेत करने वाली गतिविधि सेल के प्रवाह द्वारा विनियमित है । कम सेल संख्या का उपयोग अभिकर्मक रिएजेंट के लिए सेल संवेदनशीलता में वृद्धि और सेल मौत24वृद्धि हो सकती है ।
    3. लाटों के अभिकर्मक -बी एस अकेले या उंमीदवार जीन के साथ एक साथ
      1. Miniprep लाटों-बी एस plasmids (NLuc-YAP15-pcdna 3.1-लुका और 14-3-3-CLuc-pcdna 3.1-लुका) DH5a बैक्टीरिया तरल संस्कृति से ताजा (एक इष्टतम लाटों-बी एस अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए आवश्यक) ।
      2. अभिकर्मक से पहले 1 ज, महाप्राण प्लेट से मध्यम, 12-अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए पूर्ण विकास मध्यम के ५०० µ एल जोड़ें और मशीन के लिए कोशिकाओं को वापस ।
        नोट: निम्न प्रोटोकॉल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बहुलक-आधारित अभिकर्मक एजेंट का उपयोग करते हुए अभिकर्मक विधियों का वर्णन करता है । अन्य अभिकर्मक रिएजेंट भी अभिकर्मक के लिए उपयुक्त हो सकते हैं; हालांकि, हमने अभी तक उनका परीक्षण नहीं किया है ।
      3. समाधान A और B के रूप में तालिका 1में वर्णित करें । के लिए n transfections, make (n + ०.५) x समाधान B premix.
      4. तुरंत (समाधान एक) डीएनए के लिए पतला बहुलक आधारित अभिकर्मक (समाधान ख) जोड़ें । पिपेट ऊपर और नीचे धीरे मिश्रण करने के लिए ।
      5. अभिकर्मक परिसरों के रूप में अनुमति देने के लिए 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूना मशीन ।
      6. अभिकर्मक परिसरों के कुल खंड (७६ µ एल) जोड़ें कोमल घूमता के साथ 12-खैर थाली के प्रत्येक कुआं के लिए dropwise ।
      7. ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर कोशिकाओं (18-24 एच) मशीन ।
        नोट: बहुलक-आधारित अभिकर्मक एजेंट के लिए संवेदनशील कक्षों के लिए, मशीन समय 5 h करने के लिए कम किया जा सकता है ।
      8. अभिकर्मक के बाद दिन, अभिकर्मक-परिसर युक्त मीडिया को हटाने और इसे नए सिरे से पूरा मीडिया के साथ बदलें । संस्कृति एक और दिन के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं luciferase परख प्रदर्शन करने के लिए ।
  2. Luciferase परख
    नोट: Luciferase संवाददाता परख प्रणाली फायर फ्लाई और एक साथ Renilla का पता लगाने में एक परख Luciferase परख के लिए प्रयोग किया जाता है । Renilla एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में उपयोग नहीं किया गया था, तो Renilla डिटेक्शन एजेंट को जोड़ने के बिना LARII जोड़कर एक-चरण luciferase परख करते हैं ।
    1. सेल lysates की तैयारी
      1. इस प्रकार के रूप में आसुत जल के साथ 5x निष्क्रिय lysis बफर (पीएलबी) पतला:
      2. 1x पीएलबी की कुल मात्रा की आवश्यकता = n x (5x पीएलबी के ५० μL + २०० μL of dH2O) = n x २५० μL of 1x पीएलबी की अच्छी तरह से 12-well प्लेट्स (N = नमूनों की संख्या) ।
      3. मीडिया को पूरी तरह से महाप्राण । एक अच्छी तरह से 1x पंजाबियों के 1 मिलीलीटर जोड़ें । थाली धीरे भंवर अलग कोशिकाओं और अवशिष्ट विकास मीडिया को दूर करने के लिए । 1x पंजाबियों को पूरी तरह से महाप्राण । सुनिश्चित करें कि कोई अवशिष्ट 1x पंजाबियों 1x पीएलबी के अलावा करने से पहले रहता है ।
      4. Add २५० μL of 1x पीएलबी/
      5. और भी 1x पीएलबी के साथ सेल monolayer के कवरेज को सुनिश्चित करने के लिए कोमल कमाल के साथ एक कमाल मंच पर संस्कृति प्लेट प्लेस । लाइसे करने के लिए कोशिकाओं की अनुमति देने के लिए 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर संस्कृति प्लेट रॉक ।
      6. lysate को १.५ एमएल microcentrifuge ट्यूब पर ट्रांसफर करें ।
    2. bioluminescent संकेत मापने
      1. -८० डिग्री सेल्सियस से LARII (20 μL/नमूना) बाहर ले लो और यह कमरे के तापमान के लिए equilibrate ।
      2. n परख के लिए Renilla डिटेक्शन एजेंट तैयार करें: जोड़ें (n + 1) x ०.४ μL 50x सब्सट्रेट करने के लिए (n + 1) x १९.६ μL इसके बफर की ।
      3. प्रत्येक कोशिका lysate के 10 μL को १.५-एमएल ट्यूबों के लिए अनिवार्य करें ।
      4. कार्यक्रम एक luminometer एक 2-एस उपाय देरी प्रदर्शन करने के लिए, प्रत्येक दोहरी luciferase परख के लिए एक 10-s माप अवधि के बाद ।
        नोट: पहला और दूसरा माप क्रमशः लाटों-बी एस सिग्नल और Renilla आंतरिक नियंत्रण संकेत करने के लिए संगत हो जाएगा । किसी एकल या दोहरे luciferase के साथ संगत किसी भी luminometer का उपयोग किया जा सकता है ।
      5. ध्यान से एक ट्यूब में LARII एजेंट के 20 μL हस्तांतरण और जल्दी से ऊपर और नीचे 3x इसे मिश्रण करने के लिए पिपेट ।
      6. तुरंत luminometer में ट्यूब जगह और पढ़ने की शुरुआत ।
      7. luminometer से नमूना ट्यूब निकालें, तुरंत Renilla रिएजेंट के 20 μL जोड़ने के लिए, और ऊपर और नीचे 3x pipetting द्वारा मिश्रण । luminometer में नमूना लाओ और अगले पढ़ने शुरू करते हैं । माप रिकॉर्ड ।
      8. प्रतिक्रिया ट्यूब त्यागें और अगले नमूने के लिए आगे बढ़ें ।

2. लाटों-बी एस का उपयोग कर हिप्पो मार्ग नियामकों की पहचान करने के लिए एक स्क्रीन

  1. सेल कल्चर और transfections
    1. अनुभाग १.१ में बताए गए अनुसार कल्चर HEK293AD कक्ष.
      नोट: HEK293AD अन्य HEK293 सेल लाइनों की तुलना में अधिक अनुयाई है, जो इसे स्क्रीन में इस्तेमाल के लिए एक अच्छा सेल लाइन बनाता है ।
    2. अनुभाग 1.1.2 में बताए गए अनुसार कक्षों को अलग करना. गिनती और प्लेट 2 १०० मिमी प्लेटों में एक्स 106 कोशिकाओं 24 अभिकर्मक से पहले एच ।
    3. 1 ज अभिकर्मक से पहले, महाप्राण प्लेट से मीडिया और उंहें नए सिरे से पूरा विकास मीडिया के 5 मिलीलीटर के साथ बदलें ।
    4. तालिका 2में वर्णित समाधान A और B बनाएं ।
    5. तुरंत (समाधान एक) डीएनए के लिए पतला बहुलक आधारित अभिकर्मक (समाधान ख) जोड़ें । पिपेट ऊपर और नीचे मिश्रण करने के लिए ।
    6. अभिकर्मक परिसरों के रूप में अनुमति देने के लिए 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूना मशीन ।
      1. कोमल घूमता के साथ कोशिकाओं को dropwise अभिकर्मक परिसरों की कुल मात्रा (५०० µ एल) जोड़ें.
      2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर कोशिकाओं की मशीन ।
      3. अगले दिन, trypsinize और गिनती कोशिकाओं । प्लेट 1 x 104 से 2 x 104 कोशिकाओं के प्रत्येक अच्छी तरह से १०० µ एल की कुल मात्रा में एक ९६-अच्छी तरह से थाली में मीडिया के प्रति । एक दिन के लिए मशीन ।
    7. अगले दिन, एजेंटों/छोटे luciferase परख प्रदर्शन करने से पहले प्रत्येक अच्छी तरह से 10 µ एम के एक अंतिम एकाग्रता में हिप्पो मार्ग को विनियमित अणुओं, 1-4 ज जोड़ें ।
      नोट: के लिए सबसे छोटे अणुओं/एजेंट, एक 4 h उपचार पर 10 µ m सेल व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करता है । एक कम एकाग्रता का उपयोग किया जाता है, तो उपचार समय की एक लंबी अवधि के लिए बढ़ाया जा सकता है ।
  2. Luciferase परख
    1. इन विट्रो luciferase परख
      1. कोशिकाओं से मीडिया को पूरी तरह से महाप्राण । एक अच्छी तरह से में 1x पंजाबियों के १०० µ एल के साथ कोशिकाओं को धो लें । महाप्राण पूरी तरह से ।
      2. 1x पीएलबी के 20 µ एल जोड़ें (के रूप में कदम 1.2.1.1 में वर्णित तैयार) ९६ के प्रत्येक कुआं में अच्छी तरह से प्लेटें ।
      3. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोमल कमाल के साथ एक कमाल का मंच पर संस्कृति प्लेट रखें ।
      4. ध्यान से एक अच्छी तरह से और पिपेट ऊपर और नीचे 3x मिश्रण में LARII रिएजेंट के 20 µ एल हस्तांतरण ।
      5. प्लेट को तुरंत प्लेट में रखें-रीडिंग luminometer और पढ़ना शुरू करें ।
    2. लिविंग सेल luciferase परख
      1. मेक 11x डी-luciferin स्टॉक निम्नानुसार: भंग १.५ डी के मिलीग्राम-luciferin पाउडर सामान्य संस्कृति मीडिया के 1 मिलीलीटर में.
      2. 11x डी के 10 µ एल हस्तांतरण-luciferin में एक अच्छी तरह से और यह जो पहले से ही में अच्छी तरह से है मीडिया के साथ मिश्रण ।
      3. 10 मिनट के लिए मशीन में कोशिकाओं को बदलें ।
      4. luminometer में थाली रखें और पढ़ना आरंभ करें ।
        नोट: यदि संकेत तीव्रता पर्याप्त मजबूत नहीं है डी-luciferin की इस एकाग्रता में, डी-luciferin शेयर के एक और 10 µ एल कोशिकाओं को जोड़ा जा सकता है ।

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Representative Results

लाटों-बी एस अलग जीन के साथ cotransfected था लाटों गतिविधि पर उनके प्रभाव का मूल्यांकन (चित्रा 3) । इस प्रयोग में, Renilla एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । याप की क्षणिक अभिव्यक्ति-5SA, याप का एक गठन सक्रिय रूप, याप transcriptional लक्ष्यों के स्तर में वृद्धि का कारण बनता है और एक स्थापित प्रतिक्रिया मार्ग25के माध्यम से लाटों कळेनासे गतिविधि में एक बाद में वृद्धि. MST, हिप्पो मार्ग (चित्रा 1) में लाटों के ऊपर उत्प्रेरक, यह भी है कि अधिक संवेदी संकेत तीव्रता बढ़ जाती है । हालांकि, VEGFR एक्सप्रेस, जो PI3K/MAPK संकेतन ट्रिगर, लाटों रोकता है और लाटों-बी एस के संकेत तीव्रता कम हो जाती है ।

दूसरे प्रोटोकॉल में, लाटों-बी एस HEK293AD में transfected था और, अभिकर्मक के बाद 24 घंटे, कोशिकाओं ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में पारित किया गया । ४० एच अभिकर्मक के बाद, कोशिकाओं को एक luciferase परख (चित्रा 4) के बाद संकेत हिप्पो के विभिंन ज्ञात छोटे अणु नियामकों के साथ इलाज किया गया । VEGFR, PI 3-कळेनासे, और सेलुलर ऊर्जा स्तर लाटों कळेनासे24के तीन ज्ञात नकारात्मक नियामकों हैं । इस प्रयोग में, GDS0941, एक PI 3-कळेनासे अवरोध करनेवाला, axitinib और SU4312, VEGFR के अवरोधकों, और 2-D ग्लूकोज, जो ग्लूकोज चयापचय और एटीपी उत्पादन के एक निषेध द्वारा ऊर्जा तनाव का कारण बनता है, लाटों-बी एस को सक्रिय करने के लिए इस्तेमाल किया गया. व्युत्क्रम, LPA, S1P, और टीपीए लाटों-बी एस को बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया गया । इस प्रयोग से पता चलता है कि लाटों-बी एस दोनों सक्रियण और लाटों कळेनासे गतिविधि पर एक छोटे अणु के निषेध प्रभाव को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

समाधान A
pcdna 3.1-लुका-NLuc-YAP15 1 μL (५० एनजी)
pcdna 3.1-लुका-14-3-3-CLuc 1 μL (५० एनजी)
प्लाज्मिड एक उंमीदवार जीन व्यक्त (जैसे MST) 1 μL (४०० एनजी)
या खाली सदिश (जैसे pcdna 3.1-लुका)
Renilla वेक्टर (pRL-TK) (ऐच्छिक) 1 μL (20 एनजी)
DMEM (कोई सीरम/ ३४ μL
कुल मात्रा ३८ μL
हल B
बहुलक-आधारित अभिकर्मक रिएजेंट १.५ μL
(कुल μg डीएनए के साथ 3:1 अनुपात)
DMEM (कोई सीरम/ ३६.५ μL
कुल मात्रा ३८ μL

तालिका 1: समाधान a और B का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल एक बहुलक-आधारित अभिकर्मक एजेंट लाटों-बी एस के साथ हिप्पो मार्ग के एक ख्यात नियामक की जांच के लिए ।

समाधान A
pcdna 3.1-लुका-NLuc-YAP15 10 μL (3 μg)
pcdna 3.1-लुका-14-3-3-CLuc 10 μL (3 μg)
DMEM (कोई सीरम/ २३० μL
कुल मात्रा २५० μL
हल B
बहुलक-आधारित अभिकर्मक रिएजेंट 18 μL
(कुल μg डीएनए के साथ 3:1 अनुपात)
DMEM (कोई सीरम/ २३२ μL
कुल मात्रा २५० μL

तालिका 2: समाधान एक और बी का उपयोग कर एक बहुलक-स्क्रीनिंग के लिए अभिकर्मक एजेंट आधारित हिप्पो लाटों-बी एस का उपयोग मार्ग के नियामकों की पहचान करने के लिए प्रोटोकॉल ।

Figure 1
चित्रा 1: स्तनधारियों में हिप्पो मार्ग । हिप्पो मार्ग phosphorylating और बाधा याप और TAZ द्वारा अंग आकार को प्रतिबंधित करता है । जब हिप्पो मार्ग सक्रिय है, SAV, LATS1/2, और भीड़ phosphorylated और MST1/2 द्वारा सक्रिय कर रहे हैं । आपन LATS1/2 phosphorylates याप/TAZ पर रोपा serine-युक्त साइटों । 14-3-3 phosphorylated याप/TAZ के साथ इंटरैक्ट करता है, जिससे उनके नाभिकीय स्थानीयकरण और TEADs के माध्यम से बहावीय जीन लक्ष्यों के सह-transactivation में बाधा होती है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: लाटों-बी एस भाजित-प्रोटीन पूरक परख luciferase पर आधारित है । Luciferase एन-और सी टर्मिनस डोमेन (NLuc और CLuc) क्रमशः याप-S127 और 14-3-3 आसपास के 15 अमीनो अम्ल से जुड़े होते हैं । YAP15/14-3-3 लाटों के बाद बाध्यकारी फास्फारिलीकरण luciferase पूरकता और bioluminescence संकेत उत्सर्जन को बढ़ावा देता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एक प्रतिनिधि लाटों गतिविधि पर एक जीन के प्रभाव का मूल्यांकन प्रयोग से परिणाम । इस HEK293AD कोशिकाओं में अन्य जीनों के साथ अकेले या एक साथ व्यक्त किया जा सकता है लाटों कळेनासे गतिविधि पर उनके प्रभाव की जांच करने के लिए (± एसडी मतलब; n = 3, * *p < 0.01, * * *p < 0.001) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: HEK293AD कोशिकाओं में लाटों गतिविधि पर छोटे अणुओं के प्रभाव का मूल्यांकन एक प्रतिनिधि प्रयोग से परिणाम. HEK293AD कोशिकाओं लाटों-बी एस के साथ transfected और निंनलिखित दवाओं के साथ इलाज किया गया: PI3K अवरोध करनेवाला (GDC0941), 4 ज के लिए 10 माइक्रोन; VEGFR अवरोध करनेवाला (axitinib), 4 ज के लिए 10 माइक्रोन; 2-deoxyglucose, 1 ज के लिए 25 मिमी; LPA, 1 ज के लिए 10 माइक्रोन; sphingosine-1-phosphophate (S1P), 1 ज के लिए 1 माइक्रोन; 12-O-tetradecanoylphorbol-13-एसीटेट (टीपीए), 1 ज के लिए 5 एनएम; VEGFR अवरोध करनेवाला (SU4312), 4 एच के लिए 10 माइक्रोन (± एसडी मतलब; n = 3, * *p < 0.01, * * *p < 0.001) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

जबकि हिप्पो मार्ग विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और हिप्पो मार्ग के dysregulation6कैंसर की ओर जाता है, कैसे हिप्पो मार्ग विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में विनियमित है पूरी तरह से समझ नहीं है । इसके अलावा, कोर हिप्पो घटकों की गतिविधि का आकलन करने के लिए कोई मात्रात्मक और वास्तविक समय प्रणाली किया गया है । हाल ही में, हम विकसित और हिप्पो मार्ग24में लाटों कळेनासे गतिविधि को मापने के लिए एक उपंयास का सत्यापन किया । यह केवल मात्रात्मक और सही ढंग से रहने वाले हिप्पो कोशिकाओं में गतिविधि के लिए लेकिन यह भी कैंसर थेरेपी के लिए हिप्पो मार्ग को लक्षित दवाओं की स्क्रीन के लिए निगरानी के लिए न केवल इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, इस पर आधारित है, जो सेंसर की खोज के लिए नेतृत्व कर सकते है उपंयास जीन के विनियमन के लिए जिंमेदार हिप्पो मार्ग । कैंसर में संकेत हिप्पो के महत्व को देखते हुए, अन्य जीन और हिप्पो मार्ग के बीच महत्वपूर्ण crosstalk खोजने के लिए सभी कैंसर जीव के लिए शुरू करने के लिए एक मूल्यवान अध्ययन किया जाएगा । इसलिए, इस उपसेंसर क्षमता कैंसर के वर्तमान उपचार में नवाचारों बनाने के लिए और कैंसर के सफल उपचार के लिए एक उपयोगी नई चिकित्सीय रणनीति प्रदान कर सकता है ।

लाटों-बी एस का उपयोग करते समय विचार किया जाना चाहिए कि कई महत्वपूर्ण बिंदुओं रहे हैं. सबसे पहले, हमारे अनुभव में, लाटों-बी एस सबसे बड़ी संवेदनशीलता है जब अभिकर्मक के लिए इस्तेमाल plasmids बैक्टीरिया से ताजा निकाले जाते हैं । दूसरा, कोशिकाओं में लाटों-बी एस plasmids transfected की मात्रा लाटों-बी एस संवेदनशीलता और संकेत तीव्रता को प्रभावित करेगा. प्लाज्मिड डीएनए की राशि लाटों-बी एस के लिए ४०० एनजी/टुकड़ा करने के लिए और एक 12 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से ब्याज की जीन के लिए ६०० एनजी के लिए बढ़ाया जा सकता है । सामांय में, अधिक प्लाज्मिड का उपयोग एक उच्च संकेत तीव्रता लेकिन कम संवेदनशीलता दे देंगे । तीसरा, सेल प्रवाह लाटों-बी एस संकेत पृष्ठभूमि को प्रभावित कर सकते हैं । प्रभावित करने के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं में संकेत हिप्पो की अच्छी तरह से स्थापित भूमिका के साथ संगत है, हम उच्च प्रवाह के साथ कोशिकाओं अंतर्जात लाटों के सक्रियण के कारण एक उच्च पृष्ठभूमि लाटों-बी एस संकेत है कि देखा है । तदनुसार, विरल चढ़ाया कोशिकाओं को एक कम लाटों-बी एस पृष्ठभूमि संकेत दिखाते हैं । इष्टतम सेल प्रवाह प्रयोग के प्रयोजन के आधार पर चुना जा सकता है (लाटों अवरोध को देख के लिए उच्च प्रवाह; कम लाटों सक्रियण देख के लिए प्रवाह) । चौथा, Renilla अभिकर्मक दक्षता के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और हार्ड-transfect कोशिकाओं के लिए (जैसे, MCF10A), अभिकर्मक एजेंट: डीएनए अनुपात 4:1 को संशोधित किया जा सकता है । अंत में, हम दृढ़ता से अनुशंसा करते हैं cotransfecting MST2 एक सकारात्मक नियंत्रण और याप-S127A के रूप में एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में हर बार के लिए उपयोग किया जाता है.

हर उपकरण की अपनी सीमाएं हैं । लाटों-बी एस एक अंतर्जात प्रोटीन के कृत्रिम सब्सट्रेट है, जो हमेशा ब्याज की प्रोटीन का सच सब्सट्रेट प्रतिस्पर्धा कर सकते हैं । इस आशय का एक बफर प्रभाव के रूप में जाना जाता है । उच्च संकेत तीव्रता और कम अभिव्यक्ति के स्तर के साथ इस समस्या को दूर करने में मदद कर सकता है के साथ अधिक सेंसर में सुधार । एक और सीमा है कि प्रतिक्रिया रास्ते लाटों-बी एस से डेटा की व्याख्या जटिल हो सकता है । कई रैखिक और गैर रेखीय संकेत रास्ते कि संभावना लाटों-बी एस संकेत को प्रभावित बातचीत कर रहे हैं । लाटों-बी एस केवल लाटों कळेनासे गतिविधि पर एक उत्तेजना के संचई प्रभाव को दर्शाता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए, तथापि, कि सीमा लाटों-बी एस के लिए अद्वितीय नहीं है बल्कि सामांयतः आणविक जीवविज्ञान के अध्ययन में सामना करना पड़ा है । इस प्रकार, लाटों-बी एस डेटा एकाधिक प्रमाण outweighs प्रयोगों के संदर्भ में व्याख्या की जानी चाहिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (CIHR # 119325, १४८६२९) और कनाडा के स्तन कैंसर फाउंडेशन (CBCF) XY करने के लिए । टा वाणीर कनाडा स्नातक छात्रवृत्ति और ओंटारियो अंतर्राष्ट्रीय स्नातक छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है । HJJVR विज्ञान और प्रौद्योगिकी के एक महारानी एलिजाबेथ द्वितीय स्नातक छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin-EDTA  Life Technologies 2520056 0.25%
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F1051
DMEM Sigma D6429-500ml DMEM with high glucose 
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122
PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent  Signagen SL100688.5
5x Passive lysis buffer Promega E194A 30 ml
Dual-Glo® Luciferase Assay System Promega E2940 100 ml kit
20/20 luminometer Turner Biosystems 998-2036 Single tube reader luminometer
GloMax®Navigator with dual injectors Promega GM2010 96-well plates reader luminometer

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक १३९ लाटों लाटों हिप्पो मार्ग भाजित luciferase परख सेल संस्कृति दवा स्क्रीनिंग कळेनासे
एक Luciferase आधारित बड़े ट्यूमर का उपयोग कर मार्ग गतिविधि संकेत हिप्पो की निगरानी (लाटों)-संवेदी
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Azad, T., Nouri, K., Janse van Rensburg, H. J., Hao, Y., Yang, X. Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor (LATS) Biosensor. J. Vis. Exp. (139), e58416, doi:10.3791/58416 (2018).

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